Das hier beschriebene Projekt wurde durch einen Zuschuss von NIH / NCI (NCI-R01CA182506-01A1) sowie von der Robert H. Lurie Comprehensive Cancer Center unterstützt - Die Lefkofsky Family Foundation / Liz und Eric Lefkofsky Innovation Research Award Wir auf AV möchten Mitglieder des Labors (Carol O&#39;Callaghan und Elizabeth Anne Wayne) für das kritische Lesen und Bearbeiten dieses Manuskript zu danken.

1. In - vitro - Deacetylierung Assay <ol><li> Reinigung von SIRT2 <ol><li> Bereiten Sie eine 10 cm Kulturschale von HEK 293T - Zellen, die in 8 ml DMEM mit 10% FBS und Antibiotika , und in einem 37 ° C, 5% CO 2 Gewebekultur - Inkubator zu etwa 70% konfluent am nächsten Tag gezüchtet. </li><li> Am nächsten Tag, Co-transfizieren 4 ug pcdh-puro-GFP-SIRT2-Flag (lentivector in unserem Labor hergestellt), 4 ug pCMV dR8.2 dvpr (Verpackung Vektor) und 0,5 ug pCMV-VSV-G (Umschlag Vektor) 18 unter Verwendung von Polyethylenimin (PEI) mit einem Verhältnis von 3 &amp; mgr; l PEI / ug DNA. </li><li> Ändern Medien nach 12 Stunden. </li><li> Sammeln Überstand nach 36 bis 48 Stunden. </li><li> Entfernen Trümmer durch Zentrifugation bei 1.000 xg für 5 min bei 4 ° C. </li><li> Nach dem Filtrieren durch 0,22 um Filter, stellen Sie 1 ml Aliquots von Lentiviren SIRT2 und halten bei -80 ° C. </li><li> Auftau SIRT2 Lentivirus auf Eis (ist es wichtig, den Virus bei -80 ° C zu speichern, wenn das Virus nicht verwendet wird,). </li><li> Infect eine 6-Well-Platte von 80-90% konfluente HEK 293T-Zellen mit 1 ml von Lentivirus in Gegenwart von 8 ug / ml Polybren. </li><li> Platzieren virusinfizierten Zellen in 37 ° C-Inkubator bis zum nächsten Tag (24 h). </li><li> Ersetzen Medium nach 24 Stunden. </li><li> 48 Stunden nach der Infektion, überprüfen Infektionseffizienz durch den Nachweis GFP-positiven Zellen unter einem Fluoreszenzmikroskop. </li><li> Wenn Infektionseffizienz gut ist (mindestens 40-50% infizierte Zellen), ersetzen Medium mit Kulturmedium 2 ug / ml Puromycin mit über exprimierenden Zellen für eine stabile SIRT2 auszuwählen. Anmerkung: Dies dauert etwa 2 Wochen, und das Medium alle 3-4 Tage gewechselt wird. Nicht infizierte Zellen sterben über diese Selektionsperiode und nur mit dem SIRT2 Lentiviren wachsen infizierten Zellen. </li><li> Analysieren Expression von FLAG-markiertem SIRT2 durch Western-Blotting unter Verwendung eines Anti-Flag-Antikörper (1: 1000 Verdünnung) nach 40 Lauf ug Gesamtprotein auf einem 10% SDS-PAGE-Gel vor dem purif Ausgangsication Verfahren (empfohlen) 19,20. </li><li> Zur Reinigung aktive SIRT2, geteilte Zellen in Verhältnis 1: 3 durch Trypsinierung, um ausreichend Geschirr von HEK 293T-Zellen zu haben, stabil überexprimieren Flag-SIRT2 (Zehn 10-cm-Schalen wird die Reinigung von ausreichend Protein für nachfolgende Experimente erlauben). <ol><li> Um die Zellen trypsinize, Kulturmedium zu entfernen und Rest Serum beseitigen, indem Zellen mit sterilem DPBS gespült wurde. Langsam 2,5 ml einer Lösung, die 0,25% Trypsin-EDTA fügen Sie die Zellschicht zu bedecken, bei Raumtemperatur für 30 bis 45 Sekunden inkubiert. bei 37 ° C Nach der Trypsin-EDTA-Lösung zu entfernen, Inkubation, bis die Zellen zu lösen beginnen. Dann Kulturmedium hinzufügen und übertragen Zellen zu neuen Gerichten. </li></ol></li><li> Entfernen Kulturmedium, wasche die Zellen zweimal in PBS und sammle die Zellen durch Trypsinisierung gefolgt von einer Zentrifugation bei 1.000 xg für 10 min bei 4 ° C. </li><li> Lyse Zellpellet in 500 ul Lysepuffer A (20 mM HEPES pH 7,9, 18 mM KCl, 0,2 mM EGTA, 1,5 mM MgCl 2, 20% Glycerol, 0,1% NP-40) für 30 min bei 4 ° C unter ständiger Rotation einer Protease-Inhibitoren-Cocktail und 1 uM TSA einschließlich. </li><li> Zentrifuge bei 14.000 xg für 15 min bei 4 ° C und Überstand in ein neues Röhrchen. </li><li> Führen Immunpräzipitation eines Anti-Flag-Antikörpers, konjugiert an Agarose beads wie unten beschrieben. <ol><li> In 200-300 ul Anti-Flag-Antikörper konjugiert Perlen an das Proteinlysat an Agarose (10-20 mg Gesamtprotein). </li><li> Inkubieren über Nacht bei 4 ° C unter konstantem Rühren. </li><li> Sammeln Immunpräzipitate durch Zentrifugation bei 1.000 xg für 5 min bei 4 ° C. </li><li> Waschen des Pellets 5 mal mit 10 ml Lyse-Puffer A bei 1000 xg für 5 min bei 4 ° C. Nach jedem Waschen der Kügelchen pelletieren und den Überstand mit Puffer A ersetzen </li></ol></li><li> Bereiten Sie 1x Flag-Peptid-Lösung (einschließlich einer Protease-Inhibitoren-Cocktail und 1 uM TSA in PBS). </li><li> In 500 ul 1x Flag Peptid-e Lösung der Agarose-Kügelchen und 30 min bei 4 ° C unter ständiger Rotation inkubiert. </li><li> Sammeln Überstand durch Zentrifugation bei 6.000 × g für 2 min bei 4 ° C. </li><li> Wiederholen Sie vorherigen zwei Schritten. </li><li> Entfernen von Überstand Kügelchen unter Verwendung von Filterrohren und Zentrifugation bei 15.000 × g für 1 min bei 4 ° C. </li><li> Konzentrat eluierten Probe, bis die endgültige Proteinkonzentration 1 &amp; mgr; g / &amp; mgr; l unter Verwendung einer Ultrafiltrationsmembran. </li><li> Überprüfen Reinigungsprozess durch Ausführen einer Elektrophorese unter Verwendung von 1 &amp; mgr; g der eluierten Probe. </li><li> Stain Gel mit einem handelsüblichen Färbelösung SIRT2 Reinigung zu bestätigen. </li><li> Halten gereinigter SIRT2 bei -80 ° C. </li></ol></li><li> Reinigung von Acetylated Protein-Substrat <ol><li> Herstellung von 10 cm x 10 cm-Kulturschalen mit HEK 293T-Zellen etwa 70% konfluent am nächsten Tag. </li><li> Am nächsten Tag, Co-transfizieren Zellen mit 5 ug einer Flagge markiert Plasmidvektor expressing die Protein-Substrat sowie 5 ug des spezifischen Acetyl-Transferase, die das Protein unter Verwendung von PEI mit einem Verhältnis von 3 &amp; mgr; l PEI / ug DNA acetylieren kann. Hinweis: Wenn die spezifische Acetyl-Transferase ist nicht bekannt, Co-transfizieren mit einer Mischung aus bekannten Histon Acetyl-Transferase (HATs) wie p300, CBP, GCN5, Tip60 und PCAF. </li><li> Ändern Medium nach 12 Stunden. </li><li> Am Tag vor der Lyse der Zellen, Behandlung der Zellen mit 1 uM TSA und 2 mM Nicotinamid (NAM) über Nacht durch das Kulturmedium mit Medium ersetzt TSA / NAM enthält Acetylierung Konzentrationen des Proteins-Substrat zu maximieren, indem Deacetylasen gehemmt wird. </li><li> 48 h nach der Transfektion entfernen Kulturmedium, wasche die Zellen zweimal in PBS und sammle die Zellen durch Trypsinisierung gefolgt von einer Zentrifugation bei 1.000 xg für 10 min bei 4 ° C. </li><li> Lyse Zellpellet in 500 ul Lysepuffer A pro Schale (20 mM HEPES pH 7,9, 18 mM KCl, 0,2 mM EGTA, 1,5 mM MgCl2, 20% Glycerin, 0,1% NP-40) mit einer Protease inhibitors Cocktail, 1 uM TSA und 2 mM NAM für 30 min bei 4 ° C unter ständiger Rotation. </li><li> Zentrifuge bei 14.000 xg für 15 min bei 4 ° C und Überstand in ein neues Röhrchen. </li><li> Führen Immunpräzipitation eines Anti-Flag-Antikörpers, konjugiert an Agarose beads wie unten beschrieben. <ol><li> In 200-300 ul Anti-Flag-Antikörper konjugiert Perlen an das Proteinlysat an Agarose (10-20 mg Gesamtprotein). </li><li> Inkubieren über Nacht bei 4 ° C unter konstantem Rühren. </li><li> Sammeln Immunpräzipitate durch Zentrifugation bei 1.000 xg für 5 min bei 4 ° C. </li><li> Waschen Sie das Pellet 2 mal mit 10 ml Lyse-Puffer A bei 1000 xg für 5 min bei 4 ° C. Nach jedem Waschen der Kügelchen Pellet und der Überstand mit Lysepuffer A. ersetzen </li><li> Waschen Sie das Pellet 3 mal mit 10 ml Lysepuffer A ohne NAM bei 1.000 xg für 5 min bei 4 ° C. Nach jedem Waschen der Kügelchen Pellet und der Überstand mit Lysepuffer A. ersetzen Es ist important kein NAM zur Deacetylierungsreaktion zu übertragen. </li></ol></li><li> Bereiten Sie 1x Flag-Peptid-Lösung (einschließlich Protease-Inhibitoren und 1 uM TSA in PBS). </li><li> Hinzufügen 500 ul 1x Flag Peptidlösung an die Agarose-Kügelchen und Inkubation für 30 min bei 4 ° C unter ständiger Rotation. </li><li> Sammeln Überstand durch Zentrifugation bei 6.000 × g für 2 min bei 4 ° C. </li><li> Wiederholen Sie vorherigen zwei Schritten. </li><li> Entfernen von Überstand Kügelchen unter Verwendung von Filterrohren und Zentrifugation bei 15.000 × g für 1 min bei 4 ° C. </li><li> Verwendung einer Ultrafiltrationsmembran konzentriert eluierten Probe, bis die Proteinkonzentration 1 &amp; mgr; g / ul ist. </li><li> Führen Elektrophorese durch Ausführen von 1 &amp; mgr; l der eluierten Probe auf einem 4-12% SDS-PAGE-Gel. </li><li> Bestätigen Acetylierung von Protein-Substrat durch Western-Blotting Antikörper gegen Ac-K unter Verwendung von (1: 1000 Verdünnung) und dem Protein-Substrat (Verdünnung hängt von der spezifischen Antikörper verwendet wird). </li><li> Halten Sie purified acetyliertes Protein-Substrat bei -80 ° C. </li></ol></li><li> In - vitro - Deacetylierungsreaktion <ol><li> Bereiten Sie die Deacetylierung Puffer B (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl, 1 mM MgCl 2 0,5 uM TSA) </li><li> Vorbereitung 3 verschiedene Reaktionen in unterschiedlichen Röhren in 20 ul Endvolumen (Tabelle 1). </li><li> Fügen Sie zusätzliche Reaktionen Deacetylierung des Proteins-Substrat durch SIRT2 (optional) zu bestätigen. In 2 ug gereinigtes Deacetylierung Nullmutante SIRT2 (dies beschrieben durchgeführt werden kann in 1.1 unter Verwendung des Protokolls nach einem pcdh-puro-GFP-SIRT2 H187Y -Flagge lentivector verwenden) , um die Reaktion anstelle von Deacetylase aktiven SIRT2 oder fügen Sie 10 mM Nicotinamid (NAM ) zum Reaktions die Deacetylierung Aktivität von SIRT2 (Tabelle 1) zu hemmen. </li><li> Inkubieren Reaktionen 3 Stunden bei 30 ° C unter konstantem Rühren. </li><li> Stoppen Sie die Reaktion durch Zugabe von 20 ul 2x Probenpuffer und kochen Sie die Proben foder 10 min bei 95 ° C. </li><li> Führen Elektrophorese indem die Reaktionsmischung, die auf einem 4-12% SDS-PAGE - Gel und erfassen die Acetylierung Status des protein Substrat durch Western - Blotting unter Verwendung eines Anti Ac-K - Antikörper (1: 1000 Verdünnung) 19,20. </li></ol></li></ol> 2. In - vivo - Deacetylierung Assay <ol><li> SIRT2 Überexpression in kultivierten Zellen <ol><li> Bereiten Sie 10 cm Kulturschalen mit HEK 293T - Zellen , die stabil pcdh-puro-GFP-leeren Vektor, pcdh-puro-GFP-SIRT2-Flag und pcdh-puro-GFP-SIRT2 H187Y -Flagge überexprimieren (wie in 1.1 beschrieben) werden etwa 70 % konfluent. </li><li> Verwendung von 5 ug der genannten Vektoren oben unter Verwendung PEI in einem Verhältnis von 3 &amp; mgr; l PEI / ug DNA Alternativ bereiten 10 cm-Kulturschalen mit Zellen etwa 70% konfluent und transiente Überexpression durchzuführen. </li><li> Führen Western Blot von Gesamtzellextrakten eine Anti-Flag-Antikörper (1: 1000 Verdünnung) Überexpression von Flag-t nachweisenagged SIRT2 19. </li></ol></li><li> RNA-Interferenz zu Sturz SIRT2 in kultivierten Zellen <ol><li> Bereiten Sie eine 10 cm Kulturschale von HEK 293T-Zellen etwa 70% konfluent am nächsten Tag zu sein. </li><li> Am nächsten Tag, Co-transfizieren 4 ug pLKO1-puro-sh SIRT2 (lentivector) 19, 4 ug pCMV dR8.2 dvpr (Verpackung Vektor) und 0,5 ug pCMV-VSV-G (Umschlag Vektor) 18 unter Verwendung von Polyethylenimin (PEI) bei einem Verhältnis von 3 &amp; mgr; l PEI / ug DNA. Hinweis: Für SIRT2 Klopfen nach unten, wir einfache haarnadel shRNAs im pLKO.1 lentiviralen Vektor verwenden entworfen von RNAi Consortium (TRC). </li><li> Folgen Sie dem Verfahren , wie in 1.1 beschrieben shSIRT2 Lentiviren zu produzieren und zu infizieren Zielzellen SIRT2 zu Knockdown. </li><li> Führen Western Blot von Gesamtzellextrakten eine Anti SIRT2 Antikörper (1: 1000 Verdünnung) effizient SIRT2 Zuschlags zu demonstrieren , nachdem auf einem 10% SDS-PAGE - Gel 40 &amp; mgr; g Gesamtprotein ausgeführt wird . </li><li> Alternative,10 cm Kulturschalen mit Zellen etwa 70% konfluent vorbereiten und transiente Knockdown von SIRT2 führen siRNAs folgenden Anweisungen des Herstellers verwendet wird . </li><li> Führen Western Blot von Gesamtzellextrakten eine Anti SIRT2 Antikörper (1: 1000 Verdünnung) effizient SIRT2 Zuschlags zu demonstrieren , nachdem auf einem 10% SDS-PAGE - Gel 40 &amp; mgr; g Gesamtprotein ausgeführt wird . </li></ol></li><li> Immunpräzipitation und Immunoblotting zum Nachweis von Acetylated Levels in kultivierten Zellen <ol><li> 12 Stunden vor der Zellpellets aus entweder Zellen sammeln SIRT2 überexprimieren (siehe 2.1) oder SIRT2 umgeworfen Zellen (siehe 2.2), 1 hinzufügen , um TSA in das Kulturmedium nicht Klasse - III - Histon - Deacetylasen zu hemmen. </li><li> Entfernen Kulturmedium, wasche die Zellen zweimal in PBS und sammle die Zellen durch Trypsinisierung gefolgt von einer Zentrifugation bei 1.000 xg für 10 min bei 4 ° C. </li><li> 10 ml Lysepuffer A (20 mM HEPES pH 7,9, 18 mM KCl, 0,2 mM EGTA, 1,5mM MgCl 2, 20% Glycerol, 0,1% NP-40) mit einem Protease - Inhibitoren - Cocktail, 1 uM TSA und 2 mM NAM. </li><li> Inkubieren bei 4 ° C für 30 min unter konstanter Rotation. </li><li> Sammeln Überstand durch Zentrifugation bei 20.000 xg für 15 Minuten bei 4 ° C. </li><li> Berechnen Proteinkonzentration durch einen Bradford-Proteintest verwendet wird. </li><li> Transfer 1 mg Gesamtprotein in neue Röhrchen in einem Endvolumen von 1 ml Lysepuffer A. Verwenden Tabelle 2 als Referenz unter Verwendung von Protein - Proben von Zellen entweder überexprimieren SIRT2 oder nach SIRT2 Zuschlags vorzubereiten. </li><li> Durchführen einer Immunpräzipitation einen Antikörper gegen das spezifische Protein-Substrat unter Verwendung zusammen mit Protein A / G (40 &amp; mgr; l Bead-Aufschlämmung wird empfohlen). Alternativ können Sie auch eine Anti Ac-K-Antikörper konjugiert Perlen an Agarose (20 &amp; mgr; l Kügelchenaufschlämmung ist in der Regel genug), um alle acetylierte Proteine ​​Immunpräzipitation. </li><li> Inkubieren Proben bei 4 ° C unter constant Rotation über Nacht. </li><li> Sammeln Immunpräzipitate durch Zentrifugation bei 1000 × g für 2 min bei 4 ° C. </li><li> Waschen Perlen 5 mal mit 1 ml Puffer A bei 1000 xg für 2 Minuten bei 4 ° C. </li><li> Resuspendieren Perlen in 40 ul 2x Probenpuffer. </li><li> Boil Proben für 10 min bei 95 ° C. </li><li> Führen Elektrophorese durch die eluierten Proben ausgeführt wird (40 &amp; mgr; l aus Schritt 2.3.12) auf einem 4-12% SDS-PAGE Gel ohne die Perlen zu stören, während die eluierten Proben übertragen. </li><li> Erkennen acetylierten Ebenen des protein Substrat durch Western-Blotting unter Verwendung eines Anti-Ac-K-Antikörper (1: 1000 Verdünnung), wenn ein Protein-Substrat-spezifische Antikörper zur Immunpräzipitation verwendet wurde, oder ein spezifischer Antikörper gegen das Protein-Substrat (folgen Empfehlungen der spezifische Antikörper bezüglich Verdünnung), wenn anti Ac-K Perlen für die Immunpräzipitation verwendet wurden. </li></ol></li></ol>

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Z., Ho, L., Verdin, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+sirtuins:+regulators+of+protein+acylation+and+metabolism.">Mitochondrial sirtuins: regulators of protein acylation and metabolism.</a> Trends in Endocrinology and Metabolism: TEM. 23, 467-476 (2012).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Recent high throughput proteomic studies have established acetylation as a widespread PTM found not only in nucleus but also in cytoplasm and mitochondria 7,8,21-23. Taking into account the likelihood that many more acetylated proteins and sites might have been not detected due to several reasons, such as specificity of the anti-Ac-K antibodies used, the low abundance of the acetylated proteins, and the transient nature of the PTM, it is safe to predict that more acetylated proteins remain to be discovered in the future, highlighting the importance of reversible acetylation as a regulatory modification directing diverse cellular processes. Regardless of the magnitude of acetylation, identifying the deacetylases which can specifically deacetylate such protein-substrates is an important first step in unraveling the biology of protein acetylation and understanding the complexity of this phenomenon. Towards this direction, use of both in vitro and in vivo deacetylation assays are crucial and necessary to establish the regulatory interplay between deacetylases and their substrates.
Here we present an example of how deacetylation assays can be used in order for an acetylated protein to be considered as a legitimate deacetylation target of SIRT2. As it has already been mentioned, the sirtuin family of proteins consists of seven members which can be found in the cytoplasm, mitochondria, and nucleus 15. Given the increasing interest regarding the role of these proteins in the different subcellular compartments which can be associated with distinct cellular processes, the above described deacetylation assays can be used with slight modifications to identify new substrates for all different members of the sirtuin family. For example, when mitochondrial proteins are used in deacetylation assays related to SIRT3, it may be necessary to include a mitochondrial isolation step 24,25 between cell lysis and immunoprecipitation during the purification process for the in vitro deacetylation assay or during the in vivo deacetylation assay before detecting acetylated protein levels. In a similar way, when nuclear proteins need to be used as deacetylation targets in these assays, nuclear extracts following subcellular fractionation might be used for protein purification and the in vivo deacetylation assay. 
A critical step for executing the in vitro deacetylation assay is the successful purification of both the deacetylase and the acetylated protein-substrate. Verification of the cells overexpressing the deacetylase as well as the acetylated protein-substrate before the initiation of the purification step is highly recommended. Furthermore, detection of the purified proteins after running a small amount of the isolated proteins on an SDS-PAGE gel before the in vitro deacetylation reaction is also recommended. This will not only confirm the completion of the purification step but will help investigators to focus their efforts on optimizing the deacetylation reaction conditions for any given protein-substrate and deacetylase of interest in case of an unsuccessful deacetylation assay which may require changes in the enzyme-substrate ratio used. Of note, even if a positive deacetylation reaction is detected using the in vitro assay, further validation is required before any conclusion can be made regarding the establishment of a protein as a deacetylation target of a specific deacetylase. This limitation is due to the fact that the co-presence of the substrate and the deacetylase in the tube does not mean that both can be found in the same complex in cells or tissues. This implies that the deacetylation needs to be further validated in vivo. With the focus on the in vivo deacetylation assay, it is worth mentioning that the steady state acetylation levels of a given protein under the experimental conditions tested is a crucial factor in determining whether overexpression or knockdown experiments are more suitable to establish the functional interplay between a deacetylase and its substrate. High levels of acetylation may direct the experimental design towards overexpressing the specific deacetylase to detect a decrease in the acetylation levels. On the contrary, when low levels of acetylation are detected under normal conditions, increased acetylation after knocking down the specific deacetylase might establish the mechanistic connection between a deacetylase and its substrate. Taking all these together, it is clear that the deacetylation assays described in this protocol are necessary to link a deacetylase with its potential substrate.
The next challenges in the field of lysine acetylation dictate that deacetylation assays will be used in the future to address some of the missing links. The considerable gap between the large number of identified mitochondrial lysine sites and the few with a validated regulatory function 26 highlights the need to distinguish bona fide functional acetylation sites from what may be widespread spurious modifications. In vitro and in vivo deacetylation assays carried over by specific deacetylases may be further combined with small scale MS analysis to reveal specific target lysines on a tested substrate to distinguish functional acetylation sites from what may be non-regulatory acetylated lysines. In this regard, sites which are deacetylated due to the enzymatic activity of a sirtuin are more likely to play a functional role compared to sites that are not deacetylated. Another significant challenge is the examination of lysine acetylation in a physiological context. It seems very likely that the acetylation profile of a cell may vary under specific experimental conditions. In vivo deacetylation assays in cells under specific experimental conditions can provide further insight into the connection between the deacetylase and the potential substrate in physiological and pathophysiological scenarios depending on the cell type, or the exposure to specific signaling molecules and stressors. Such studies can establish the functional role of a deacetylation event in a physiological context and connect it to a phenotypic outcome or response. More importantly, deacetylation assays in combination with small scale MS analysis can further provide meaningful information regarding regulatory acetylated lysines under specific cellular conditions.
In conclusion, identification of the enzymes that deacetylate acetylated proteins and sites by using both in vitro and in vivo deacetylation assays will help to resolve the complexity of the acetylome and will contribute to better understanding of the regulatory role of acetylation under various physiological conditions.

Post-translational modifications (PTMs) regulate cell signaling networks allowing cells to rapidly respond to internal and external signals. Over the last few decades, many different PTMs playing a pivotal role in diverse processes have been identified but only a few have been studied extensively, such as phosphorylation, acetylation and ubiquitination 1-3. Focusing on acetylation, Allfrey et al. were the first to propose a role for histone acetylation in regulating gene transcription about 50 years ago 4. Research in this field has revealed that histone lysine acetylation modulates chromatin condensation and it is considered to be an epigenetic mark as part of the histone code 5. Although it took a long time until the discovery of tubulin as the first non-histone acetylation target 6, it is well established now that hundreds of eukaryotic proteins beyond histones can be acetylated and lysine acetylation has been recognized as a wide-spread PTM that may rival phosphorylation and ubiquitination in its prevalence 7-9. Interestingly, non-histone acetylated proteins can be signaling molecules in the cytoplasm, transcription factors in the nucleus, and metabolic enzymes in mitochondria, highlighting the significance of acetylation in regulating a plethora of cellular processes. 
The acetylation status of a protein depends on the coordinated and opposing function of lysine acetyltransferases (KATs) and lysine deacetylases (KDACs) which add and remove acetyl groups from proteins. The reversible acetylation of lysine, which involves neutralization of a positive charge 10, alters protein structure and it seems very likely to also alter enzymatic function in several cases 11-13. Focusing on KDACs, 18 proteins have been identified in the human and mouse genomes 14-16. Among them, mammalian sirtuins (also called class III histone lysine deacetylases) which are distinct from other members as they require NAD+ for their enzymatic function, have attracted extensive interest in this research field 16. In mammals, seven sirtuins (SIRT1-7) have been identified, each of them sharing a conserved 275-amino-acid catalytic core domain, which are mainly categorized according to their subcellular localization to the nucleus (SIRT1, 6, and 7), mitochondria (SIRT3, 4, and 5), or cytoplasm (SIRT2). SIRT1-3 have a robust deacetylation activity, while SIRT4 is reported to display ADP-ribosyltransferase activity, SIRT5 may function as a protein desuccinylase and demalonylase, and SIRT6 and SIRT7 display weak deacetylase activity but are involved in other types of acylations 17. In accordance with the significance of acetylation as a regulatory PTM modification involved in several cellular functions, sirtuins have also been implicated in a wide range of processes. After the first breakthrough studies establishing the role of sirtuins in life span extension, it has been shown that they are involved in diverse cellular functions including DNA repair, maintenance of genomic instability, apoptosis, response to stress and inflammation, control of energy efficiency, circadian clocks and metabolism, as well as contributing to the initiation and/or progression of age-related diseases such as cancer, neurodegeneration and type 2 diabetes 15,16.
Despite the significant progress in the field of sirtuin biology, more work remains to unravel undiscovered roles and functions through the identification of novel substrates. This is evidenced more emphatically by recent advances in high-resolution mass spectrometry (MS) based proteomics which have significantly increased the number of proteins found to be acetylated but most importantly have identified several different acetylated lysines in each protein, arguing that acetylation may be as wide-spread as other PTMs such as phosphorylation 7,8,17. Taking into consideration that specific deacetylases have not yet been identified for most of these acetylated proteins-substrates, it is reasonable to suggest that both in vitro and in vivo deacetylation assays are needed to confirm and establish an acetylated protein as a legitimate substrate of a specific deacetylase. In the experimental protocols described below, details will be given on how to perform both in vitro and in vivo deacetylation assays using SIRT2 as the specific deacetylase.

<table><tbody><tr><td>cell culture dishes</td><td>Denville Scientific Inc.</td><td>T1110 and T1115</td><td></td></tr><tr><td>pCDH-puro-GFP lentiviral vector</td><td>System Biosciences</td><td>CD513B-1</td><td></td></tr><tr><td>pCMV- dR8.2 dvpr (packaging vector)</td><td>Addgene</td><td>8455</td><td></td></tr><tr><td>pCMV-VSV-G (envelope vector)</td><td>Addgene</td><td>8454</td><td></td></tr><tr><td>polyethylenimine (PEI)&amp;nbsp;</td><td>Polysciences Inc.</td><td>24885</td><td>other transfection reagents can be used as well. PEI is cost effective and very efficient in transfecting 293T cells</td></tr><tr><td>0.22 &amp;mu;m filters</td><td>Denville Scientific Inc.</td><td>F5512</td><td></td></tr><tr><td>polybrene</td><td>Sigma</td><td>H9268</td><td></td></tr><tr><td>fluorescent microscope</td><td>Carl Zeiss MicroImaging Inc.</td><td>Axiovert 200</td><td></td></tr><tr><td>puromycin</td><td>Invivogen</td><td>A11138-03</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Corning</td><td>21-031-CM</td><td></td></tr><tr><td>anti-Flag antibody</td><td>Sigma</td><td>F3165</td><td></td></tr><tr><td>HEPES&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Sigma</td><td>74385</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>M9272</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>34596</td><td></td></tr><tr><td>protease inhibitors coctail 100x</td><td>Biotool</td><td>B14001</td><td></td></tr><tr><td>Trichostatin A (TSA)</td><td>Sigma</td><td>T8552</td><td>selective inhibitor of class I and II histone deacetylases (HDACs) but not class III HDACs (sirtuins)</td></tr><tr><td>anti-Flag agarose beads</td><td>Sigma</td><td>A2220</td><td></td></tr><tr><td>centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5417R</td><td></td></tr><tr><td>rotator</td><td>Thermo Scientific</td><td>415220Q</td><td></td></tr><tr><td>filter tubes</td><td>Millipore</td><td>UFC30HV00</td><td></td></tr><tr><td>Flag peptide&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>F3290</td><td></td></tr><tr><td>Vivaspin Centrifugal Concentrator</td><td>Sartorius Stedim Biotech S.A.</td><td>VS0102</td><td></td></tr><tr><td>SimplyBlue SafeStain solution&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>LC6060</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE LDS sample buffer (4x)</td><td>Life Techologies</td><td>NP0007</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl pH 7.5</td><td>Sigma</td><td>T5941</td><td></td></tr><tr><td>NAD&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt;</td><td>Sigma</td><td>N0632</td><td>required cofactor for sirtuins</td></tr><tr><td>nicotinamide (NAM)</td><td>Sigma</td><td>72340</td><td>selective inhibitor class III HDACs (sirtuins)</td></tr><tr><td>pLKO.1 lentiviral vector&amp;nbsp;</td><td>Addgene</td><td>8453</td><td></td></tr><tr><td>SIRT2 si RNA&amp;nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>GS22933</td><td></td></tr><tr><td>anti-SIRT2 antibody</td><td>Proteintech</td><td>15345-1-AP</td><td></td></tr><tr><td>Bradford protein assay</td><td>BIO-RAD</td><td>500-0006</td><td></td></tr><tr><td>anti Ac-K agarose beads</td><td>Immunechem</td><td>ICP0388</td><td></td></tr></tbody></table>

deacetylation assays to unravel the interplay between sirtuins (sirt2) and specific protein-substrates

Acetylation has emerged as an important post-translational modification (PTM) regulating a plethora of cellular processes and functions. This is further supported by recent findings in high-resolution mass spectrometry based proteomics showing that many new proteins and sites within these proteins can be acetylated. However the identity of the enzymes regulating these proteins and sites is often unknown. Among these enzymes, sirtuins, which belong to the class III histone lysine deacetylases, have attracted great interest as enzymes regulating the acetylome under different physiological or pathophysiological conditions. Here we describe methods to link SIRT2, the cytoplasmic sirtuin, with its substrates including both in vitro and in vivo deacetylation assays. These assays can be applied in studies focused on other members of the sirtuin family to unravel the specific role of sirtuins and are necessary in order to establish the regulatory interplay of specific deacetylases with their substrates as a first step to better understand the role of protein acetylation. Furthermore, such assays can be used to distinguish functional acetylation sites on a protein from what may be non-regulatory acetylated lysines, as well as to examine the interplay between a deacetylase and its substrate in a physiological context.

Um für ein Protein als eine legitime Deacetylierung Ziel für jedes Enzym mit Deacetylierung Aktivität sowohl in vitro als auch in vivo Assays Deacetylierung werden müssen , durchgeführt , um festzustellen , das Zusammenspiel zwischen der Deacetylase und ihr Substrat berücksichtigt werden. Für die in vitro - Deacetylase - Assay wird die Reinigung sowohl der Deacetylase und dem acetylierten Proteinsubstrat erforderlich ist , bevor der Assay durchgeführt werden kann. Hier nutzen wir die zytoplasmatische sirtuin SIRT2 als die spezifische Deacetylase sucht werden. SIRT2 ist ein Deacetylase-Enzym und die Verwendung einer Mutante, die das Deacetylase-Aktivität fehlt, ist hoch als negative Kontrolle für die Deacetylierung Assays empfohlen. Verwendung des Reinigungsverfahrens beschrieben in 1.1, sowohl SIRT2 und SIRT2 H187Y kann erfolgreich bei einer Endkonzentration von 1 ug / ul , gereinigt werden. Dies kann nach der gereinigten Proteine ​​auf einem Gel durch Färben, gefolgt Lauf bestätigt werden(1A, obere) sowie nach Western - Blotting unter Verwendung eines Anti-FLAG - Antikörper , da sowohl SIRT2 und SIRT2 H187Y markiert werden mit einem Flag - Peptid (2A, unten). Das gleiche Reinigungsverfahren können zur Reinigung des Proteinsubstrats mit einigen Modifikationen folgen. Das Protein muss acetyliert werden, bevor es für die Deacetylierung Assay verwendet werden, was bedeutet, dass es in Zellen gereinigt werden muss, die spezifische Acetyltransferase oder eine Mischung aus HATs der Lage, das Protein zu überexprimieren acetylieren. Verwendung des Reinigungsverfahrens in 1.2 beschrieben, kann das acetylierte Protein gereinigt werden (1B, oben). Um zu bestätigen , daß das Protein tatsächlich acetyliert ist und für die in vitro Deacetylierung Assay verwendet werden, Western Blotting eine anti Ac-K - Antikörpers erforderlich ist , erhöht acetyliert Niveaus des gereinigten Proteins in Zellen zu zeigen , die Acetyl-Transferasen (1B überexprimieren, lower). Nach erfolgreicher Proteinreinigung kann die in vitro - Assay Deacetylierung durchgeführt werden. Sirtuine, einschließlich SIRT2, sind Klasse III Histon - Lysin - Deacetylasen , die aus anderen Deacetylasen verschieden sind , wie sie NAD + für ihre enzymatische Funktion benötigen. In Übereinstimmung damit kann kein Deacetylierung durch Western - Blotting unter Verwendung eines Anti Ac-K - Antikörper in Abwesenheit von NAD +, unabhängig von der Anwesenheit von katalytisch aktiven SIRT2 (Figur 2, Spur 2 vs 1) detektiert werden. Im Gegenteil verringert acetylierten Ebenen des acetylierten Protein , wenn sowohl SIRT2 und NAD + in der Reaktion vorhanden sind , legen nahe , dass das Protein als ein Target für Deacetylierung SIRT2 betrachtet werden. Um können diese Ergebnisse, verschiedene negative Kontrollen zur Überprüfung verwendet werden. Zum Beispiel kann kein Unterschied in der Deacetylierung Niveaus des Proteins nachgewiesen werden , wenn eine Deacetylierung defizienten SIRT2 (H1 SIRT287Y) anstelle der katalytisch aktiven Wildtyp SIRT2 (Abbildung 2, Spur 5 vs 4). Ein ähnlicher Effekt kann, wenn impliziert eine gut etablierte sirtuin Inhibitor, NAM, hinzugefügt wird zu der Reaktionsmischung gesehen werden, daß die Abnahme in den acetylierten Niveaus des Proteins durch die Deacetylase-Aktivität der SIRT2 vermittelt wird. Aberrant Deacetylierung wird in verschiedenen zellulären Prozessen und altersbedingten Krankheiten beteiligt. Somit ist ein entscheidender Schritt, um unser Wissen über das Zusammenspiel zwischen einem Deacetylase und ihr Substrat in die Vertiefung ist diese Verbindung in den Zellen zu schaffen, wo dieses Phänomen eine physiologische Wirkung haben kann. Darüber hinaus ermöglicht die Überprüfung Deacetylierung in Zellkultursystemen in vivo die Untersuchung der Deacetylierung Ereignisses in einer Zelle oder einem Gewebe spezifischen Kontext , die leichter zu einem bestimmten Phänotyp oder Ausgang verbunden werden kann. Dies schließt die Möglichkeit , dass die in vitro DEAC nachgewiesenetylation Aktivität ist künstlich aufgrund des Vorhandenseins sowohl der Deacetylase und seinem Substrat in dem Rohr zur gleichen Zeit, die unter normalen physiologischen Bedingungen in den Zellen kann nie passieren. Für die in vivo Deacetylierung Assay Zellen sowohl SIRT2 und SIRT2 H187Y sowie das Proteinsubstrat überexprimieren kann in 2.1 und 2.2 beschrieben nach den Verfahren verwendet werden. Zellextrakte aus diesen Zellen hergestellt wird, kann bestätigt werden SIRT2, SIRT2 H187Y und das Proteinsubstrat durch Western - Blotting unter Verwendung spezifischer Antikörper zu exprimieren. In dem Test hier beschrieben, alle exogen exprimierten Proteine ​​sind für eine einfache durchgeführten Experimente markiert (Abbildung 3, untere Platte HA-markierte SIRT2 / SIRT2 H187Y und Mitteltafel zu erkennen Flag-markierten Proteinsubstrat zu erkennen). Um zu bestimmen, ob das Zielprotein ein Deacetylierung Substrat von SIRT2 ist, Immunopräzipitation erfolgt mit Hilfe eines Anti-Flag-Antikörper unter Verwendung des Zielproteins f nach unten ziehenollowed durch Western-Blot eine Anti Ac-K-Antikörper verwendet wird. Abnahme der acetylierten Niveaus des Proteins in Zellen SIRT2 (Abbildung 3 obere Platte, Bahn 3 vs 2) und Versagen exprimierenden zu acetyliert Niveaus in Zellen, die Deacetylase defizienten SIRT2 Mutante (Figur 3 obere Platte, Bahn 4 vs 3) beeinflussen lassen vermuten , dass das acetylierte Protein kann eine Deacetylierung Ziel der spezifischen Deacetylase in vivo sein. Dies kann weiter bestätigt werden , wenn SIRT2-vermittelte Deacetylierung nach der Behandlung von Zellen mit NAM (Abbildung 3 obere Platte, Spur 5 vs 3) zur Messung der spezifischen Deacetylase-Substrat - Achse in den untersuchten Zellen gehemmt wird. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/53563/53563fig1.jpg" /> Abbildung 1: Reinigung von sowohl der Deacetylase und dem acetylierten Protein-Substrat für die in vitro Assay verwendet werden Deacetylierung. (A) 1 ug sowohl SIRT2 und SIRT2 H187Y (Deacetylierung defekte Mutante) auf einem Gel nach dem Reinigungsprotokoll ausgeführt wurden , wie in 1.1 beschrieben. Das Gel wurde mit einem handelsüblichen Färbelösung gefärbt und nach Entfärben sowohl gereinigter Proteine ​​(oberen) nachgewiesen werden. Proteine ​​können nach der Übertragung in eine PVDF-Membran detektiert und Western-Blotting unter Verwendung eines Anti-Flag-Antikörper (niedriger). (B) 1 &amp; mgr; g Proteinsubstrat und hyper acetyliert Proteinsubstrat (alpha-Enolase wurde als SIRT2 Substrat auf Basis von Massenspektrometrie unpublizierte Daten erzeugt in unserem Labor verwendet) wurden auf einem Gel nach dem Reinigungsprotokoll laufen , wie in 1.2 beschrieben. Das Gel wurde mit einem handelsüblichen Färbelösung gefärbt und nach der Entfärbung, die gereinigte Proteinsubstrat kann (oben) nachgewiesen werden. Acetylierung kann nach der Übertragung in PVDF-Membran und Western-Blotting unter Verwendung eines Anti-Ac-K-Antikörper (mittlere) nachgewiesen werden. Gesamt p<html> roteins kann unter Verwendung eines Anti-Flag - Antikörper (untere) nachgewiesen werden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53563/53563fig1large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53563/53563fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/53563/53563fig2.jpg" /> Fig . 2: In vitro - Assay Deacetylierung Purified acetylierten Proteinsubstrat (alpha-Enolase) mit SIRT2 oder SIRT2 H187Y (Deacetylierung defekte Mutante) in Gegenwart von NAD + inkubiert (Spuren 4 und 5). Verminderte acetylierten Pegel werden durch Western - Blotting unter Verwendung eines Anti Ac-K - Antikörper in Gegenwart von SIRT2 aber nicht in Gegenwart von SIRT2 H187Y (Spur 4 vs 5) detektiert. Keine Deacetylierung Aktivität beobachtet wird , wenn NAD + nicht in der Reaktionsmischung (Spur 2 vs 4) enthalten oder wenn NAM zu dem Reaktionsgemisch gegeben (Spur 6 vs 4).: //www.jove.com/files/ftp_upload/53563/53563fig2large.jpg &quot;Target =&quot; _ blank &quot;&gt; Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/53563/53563fig3.jpg" /> Abb . 3: In - vivo - Deacetylierung Assay HEK293T Zellen , die stabil entweder SIRT2 oder SIRT2 H187Y überexprimierenden wurden kotransfiziert mit dem Proteinsubstrat (alpha-Enolase) und HATs die acetylierten Konzentrationen des Proteins zu erhöhen (Spur 2 vs 1). Deacetylierung wurde in vivo nach Immunpräzipitation mit einem Anti-Flag - Antikörper nach unten ziehen , das Proteinsubstrat und Western - Blot unter Verwendung eines Anti Ac-K - Antikörper geprüft. Die Acetylierung ist deutlich zurückgegangen in den SIRT2 überexprimierenden Zellen wie zum SIRT2 H187Y verglichen Zellen (Spur 3 vs 4) überexprimieren. Die SIRT2-vermittelte Deacetylierungdes Proteinsubstrat verhindert wird , wenn die Zellen mit NAM (Bahn 5 gegen 3) behandelt werden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53563/53563fig3large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53563/53563fig3large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> Die Reaktionen </td><td> 1 </td><td> 2 </td><td> 3 </td><td> 4 (optional) </td><td> 5 (optional) </td></tr><tr><td> gereinigtes acetyliertes Protein-Substrat (10 &amp; mgr; g) </td><td> + </td><td> + </td><td> + </td><td> + </td><td> + </td></tr><tr><td> Puffer B </td><td> + </td><td> + </td><td> + </td><td> + </td><td> + </td></tr><tr><td> gereinigtes SIRT2 (2 ug) </td><td> - </td><td> + </td><td> + </td><td> - </td><td> + </td></tr><tr><td> NAD + (1 mu) </td><td> - </td><td> - </td><td> + </td><td> + </td><td> +</td></tr><tr><td> gereinigtes SIRT2 H187Y (2 ug) </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> + </td><td> - </td></tr><tr><td> NAM (10 mM) </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> + </td></tr></tbody></table> Tabelle 1: Reaktionsbestandteile. <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> Proben </td><td> Überexpression </td><td> niederschlagen </td></tr><tr><td> 1 </td><td> pcdh-puro-GFP-leeren Vektor </td><td> pLKO1 leeren Vektor oder si ctr </td></tr><tr><td> 2 </td><td> pcdh-puro-GFP-SIRT2-Flagge </td><td> pLKO1 sh SIRT2 1 oder si SIRT2 1 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> pcdh-puro-GFP-SIRT2 H187Y -Flagge </td><td> pLKO1 sh SIRT2 2 oder si SIRT2 2 </td></tr></tbody></table> Tabelle 2: Die Proteinproben.

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Deacetylation Assays to Unravel the Interplay between Sirtuins SIRT2 and Specific Protein-substrates

This protocol describes the required steps to execute in vitro and in vivo deacetylation assays in order to establish the role of proteins as specific deacetylation substrates for sirtuins and further study the role of reversible - lysine acetylation as a post-translational modification.

Deacetylierung Assays zu entwirren, das Zusammenspiel zwischen Sirtuine (SIRT2) und spezifische Protein-Substrate

Acetylation has emerged as an important post-translational modification (PTM) regulating a plethora of cellular processes and functions. This is further ...

deacetylation-assays-to-unravel-interplay-between-sirtuins-sirt2

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Chemistry

Deacetylation Assays to Unravel the Interplay between Sirtuins (SIRT2) and Specific Protein-substrates

8.2K Aufrufe.  Feinberg School of Medicine, Northwestern University. This protocol describes the required steps to execute in vitro and in vivo deacetylation assays in order to establish the role of proteins as specific deacetylation substrates for sirtuins and further study the role of reversible - lysine acetylation as a post-translational modification.

Serie: Deacetylation Assays to Unravel the Interplay between Sirtuins SIRT2 and Specific Protein-substrates

In Vitro Ubiquitination and Deubiquitination Assays of Nucleosomal Histones

Ubiquitination is a post-translational modification that plays important roles in various signaling pathways and is notably involved in the coordination of chromatin function and DNA-associated processes. This modification involves a sequential action of several enzymes including E1 ubiquitin-activating, E2 ubiquitin-conjugating and E3 ubiquitin-ligase and is reversed by deubiquitinases (DUBs). Ubiquitination induces degradation of proteins or alteration of protein function including modulation of enzymatic activity, protein-protein interaction and subcellular localization. A critical step in demonstrating protein ubiquitination or deubiquitination is to perform in vitro reactions with purified components. Effective ubiquitination and deubiquitination reactions could be greatly impacted by the different components used, enzyme co-factors, buffer conditions, and the nature of the substrate.&#160; Here, we provide step-by-step protocols for conducting ubiquitination and deubiquitination reactions. We illustrate these reactions using minimal components of the mouse Polycomb Repressive Complex 1 (PRC1), BMI1, and RING1B, an E3 ubiquitin ligase that monoubiquitinates histone H2A on lysine 119. Deubiquitination of nucleosomal H2A is performed using a minimal Polycomb Repressive Deubiquitinase (PR-DUB) complex formed by the human deubiquitinase BAP1 and the DEUBiquitinase ADaptor (DEUBAD) domain of its co-factor ASXL2. These ubiquitination/deubiquitination assays can be conducted in the context of either recombinant nucleosomes reconstituted with bacteria-purified proteins or native nucleosomes purified from mammalian cells. We highlight the intricacies that can have a significant impact on these reactions and we propose that the general principles of these protocols can be swiftly adapted to other E3 ubiquitin ligases and deubiquitinases.

Ubiquitination is a post-translational modification that plays important roles in cellular processes and is tightly coordinated by deubiquitination. Defects in both reactions underlie human pathologies. We provide protocols for conducting ubiquitination and deubiquitination reaction in vitro using purified components.

In Vitro Ubiquitination und Deubiquitination Assays von Nucleleosomalhistones

Ubiquitination is a post-translational modification that plays important roles in various signaling pathways and is notably involved in the coordination ...

Forschung

Biochemie

Single-Step Enrichment of a TAP-Tagged Histone Deacetylase of the Filamentous Fungus Aspergillus nidulans for Enzymatic Activity Assay

Class 1 histone deacetylases (HDACs) like RpdA have gained importance as potential targets for treatment of fungal infections and for genome mining of fungal secondary metabolites. Inhibitor screening, however, requires purified enzyme activities. Since class 1 deacetylases exert their function as multiprotein complexes, they are usually not active when expressed as single polypeptides in bacteria. Therefore, endogenous complexes need to be isolated, which, when conventional techniques like ion exchange and size exclusion chromatography are applied, is laborious and time consuming. Tandem affinity purification has been developed as a tool to enrich multiprotein complexes from cells and thus turned out to be ideal for the isolation of endogenous enzymes. Here we provide a detailed protocol for the single-step enrichment of active RpdA complexes via the first purification step of C-terminally TAP-tagged RpdA from Aspergillus nidulans. The purified complexes may then be used for the subsequent inhibitor screening applying a deacetylase assay. The protein enrichment together with the enzymatic activity assay can be completed within two days.

Single-Step Enrichment of a TAP-Tagged Histone Deacetylase of the Filamentous Fungus Aspergillus nidulans for Enzymatic Activity Assay

Class 1 histone deacetylases (HDACs) like RpdA have gained importance as potential targets to treat fungal infections. Here we present a protocol for the specific enrichment of TAP-tagged RpdA combined with an HDAC activity assay that allows in vitro efficacy testing of histone deacetylase inhibitors.

Einschaltstige Bereicherung einer TAP-Tagged-Histon-Deacetylase des Filamentous Fungus Aspergillus nidulans für Enzymatische Aktivität Assay

Class 1 histone deacetylases (HDACs) like RpdA have gained importance as potential targets for treatment of fungal infections and for genome mining of ...

Assays for Validating Histone Acetyltransferase Inhibitors

Lysine acetyltransferases (KATs) catalyze acetylation of lysine residues on histones and other proteins to regulate chromatin dynamics and gene expression. KATs, such as CBP/p300, are under intense investigation as therapeutic targets due to their critical role in tumorigenesis of diverse cancers. The development of novel small molecule inhibitors targeting the histone acetyltransferase (HAT) function of KATs is challenging and requires robust assays that can validate the specificity and potency of potential inhibitors.
This article outlines a pipeline of three methods that provide rigorous in vitro validation for novel HAT inhibitors (HATi). These methods include a test tube HAT assay, Chromatin Hyperacetylation Inhibition (ChHAI) assay, and Chromatin Immunoprecipitation-quantitative PCR (ChIP-qPCR). In the HAT assay, recombinant HATs are incubated with histones in a test tube reaction, allowing for acetylation of specific lysine residues on the histone tails. This reaction can be blocked by a HATi and the relative levels of site-specific histone acetylation can be measured via immunoblotting. Inhibitors identified in the HAT assay need to be confirmed in the cellular environment.
The ChHAI assay uses immunoblotting to screen for novel HATi that attenuate the robust hyperacetylation of histones induced by a histone deacetylase inhibitor (HDACi). The addition of an HDACi is helpful because basal levels of histone acetylation can be difficult to detect via immunoblotting.
The HAT and ChHAI assays measure global changes in histone acetylation, but do not provide information regarding acetylation at specific genomic regions. Therefore, ChIP-qPCR is used to investigate the effects of HATi on histone acetylation levels at gene regulatory elements. This is accomplished through selective immunoprecipitation of histone-DNA complexes and analysis of the purified DNA through qPCR. Together, these three assays allow for the careful validation of the specificity, potency, and mechanism of action of novel HATi.

Inhibitors of histone acetyltransferases (HATs, also known as lysine acetyltransferases), such as CBP/p300, are potential therapeutics for treating cancer. However, rigorous methods for validating these inhibitors are needed. Three in vitro methods for validation include HAT assays with recombinant acetyltransferases, immunoblotting for histone acetylation in cell culture, and ChIP-qPCR.

Assays zur Validierung von Histon-Acetyltransferase-Inhibitoren

Lysine acetyltransferases (KATs) catalyze acetylation of lysine residues on histones and other proteins to regulate chromatin dynamics and gene ...

Krebsforschung

Detection of Protein S-Acylation using Acyl-Resin Assisted Capture

Protein S-acylation, also referred to as S-palmitoylation, is a reversible post-translational modification of cysteine residues with long-chain fatty acids via a labile thioester bond. S-acylation, which is emerging as a widespread regulatory mechanism, can modulate almost all aspects of the biological activity of proteins, from complex formation to protein trafficking and protein stability. The recent progress in understanding of the biological function of protein S-acylation was achieved largely due to the development of novel biochemical tools allowing robust and sensitive detection of protein S-acylation in a variety of biological samples. Here, we describe acyl resin-assisted capture (Acyl-RAC), a recently developed method based on selective capture of endogenously S-acylated proteins by thiol-reactive Sepharose beads. Compared to existing approaches, Acyl-RAC requires fewer steps and can yield more reliable results when coupled with mass spectrometry for identification of novel S-acylation targets. A major limitation in this technique is the lack of ability to discriminate between fatty acid species attached to cysteines via the same thioester bond.

Acyl-RAC (Acyl-Resin Assisted Capture) is a highly sensitive, reliable and easy to perform method to detect reversible lipid modification of cysteine residues (S-acylation) in a variety of biological samples.

Nachweis der Protein-S-Acylation mit Acyl-Resin Assisted Capture

Protein S-acylation, also referred to as S-palmitoylation, is a reversible post-translational modification of cysteine residues with long-chain fatty ...

A High-Throughput Enzyme-Coupled Activity Assay to Probe Small Molecule Interaction with the dNTPase SAMHD1

Sterile alpha motif and HD domain-containing protein 1 (SAMHD1) is a pivotal regulator of intracellular deoxynucleoside triphosphate (dNTP) pools, as this enzyme can hydrolyze dNTPs into their corresponding nucleosides and inorganic triphosphates. Due to its critical role in nucleotide metabolism, its association to several pathologies, and its role in therapy resistance, intense research is currently being carried out for a better understanding of both the regulation and cellular function of this enzyme. For this reason, development of simple and inexpensive high-throughput amenable methods to probe small molecule interaction with SAMHD1, such as allosteric regulators, substrates, or inhibitors, is vital. To this purpose, the enzyme-coupled malachite green assay is a simple and robust colorimetric assay that can be deployed in a 384-microwell plate format allowing the indirect measurement of SAMHD1 activity. As SAMHD1 releases the triphosphate group from nucleotide substrates, we can couple a pyrophosphatase activity to this reaction, thereby producing inorganic phosphate, which can be quantified by the malachite green reagent through the formation of a phosphomolybdate malachite green complex. Here, we show the application of this methodology to characterize known inhibitors of SAMHD1 and to decipher the mechanisms involved in SAMHD1 catalysis of non-canonical substrates and regulation by allosteric activators, exemplified by nucleoside-based anticancer drugs. Thus, the enzyme-coupled malachite green assay is a powerful tool to study SAMHD1, and furthermore, could also be utilized in the study of several enzymes which release phosphate species.

SAMHD1 is a deoxynucleoside triphosphate triphosphohydrolase with critical roles in human health and disease. Here we present a versatile enzyme-coupled SAMHD1 activity assay, deployed in a 384-well microplate format, that allows for the evaluation of small molecules and nucleotide analogues as SAMHD1 substrates, activators, and inhibitors.

Ein Hochdurchsatz-Assay mit enzymgekoppelter Aktivität zur Untersuchung der Wechselwirkung kleiner Moleküle mit der dNTPase SAMHD1

Sterile alpha motif and HD domain-containing protein 1 (SAMHD1) is a pivotal regulator of intracellular deoxynucleoside triphosphate (dNTP) pools, as this ...

Entwicklung eines Click-basierten Assays zum Screening der HAT1-Enzymaktivität

An Acetyl-Click Chemistry Assay to Measure Histone Acetyltransferase 1 Acetylation

HAT1, also known as Histone acetyltransferase 1, plays a crucial role in chromatin synthesis by stabilizing and acetylating nascent H4 before nucleosome assembly. It is required for tumor growth in various systems, making it a potential target for cancer treatment. To facilitate the identification of compounds that can inhibit HAT1 enzymatic activity, we have devised an acetyl-click assay for rapid screening. In this simple assay, we employ recombinant HAT1/Rbap46, which is purified from activated human cells. The method utilizes the acetyl-CoA analog 4-pentynoyl-CoA (4P) in a click-chemistry approach. This involves the enzymatic transfer of an alkyne handle through a HAT1-dependent acylation reaction to a biotinylated H4 N-terminal peptide. The captured peptide is then immobilized on neutravidin plates, followed by click-chemistry functionalization with biotin-azide. Subsequently, streptavidin-peroxidase recruitment is employed to oxidize amplex red, resulting in a quantitative fluorescent output. By introducing chemical inhibitors during the acylation reaction, we can quantify enzymatic inhibition based on a reduction of the fluorescence signal. Importantly, this reaction is scalable, allowing for high throughput screening of potential inhibitors for HAT1 enzymatic activity.

Autor im Rampenlicht: Entwicklung eines Acetyl-Click-Assays für das HAT1-Inhibitor-Screening

Quick and accurate chemical assays to screen for specific inhibitors are an important tool in the drug development arsenal. Here, we present a scalable acetyl-click chemistry assay to measure the inhibition of HAT1 acetylation activity.

Ein Acetyl-Click-Chemie-Assay zur Messung der Histon-Acetyltransferase-1-Acetylierung

HAT1, also known as Histone acetyltransferase 1, plays a crucial role in chromatin synthesis by stabilizing and acetylating nascent H4 before nucleosome ...

<meta charset="utf8"></head><body>Hochdurchsatz-Thermoshift-Assays für Protein-Liganden-Wechselwirkungen

Utilizing Thermal Shift Assay to Probe Substrate Binding to Selenoprotein O

Defining the biological importance of proteins with unknown functions poses a significant obstacle in understanding cellular processes. Although bioinformatic and structural predictions have contributed to the study of unknown proteins, in vitro experimental validations are often hampered by the optimal conditions and cofactors required for biochemical activity. Cofactor binding is not only essential for the activity of some enzymes but may also enhance the thermal stability of the protein. One practical application of this phenomenon lies in utilizing the change in thermal stability, as measured by alterations in the protein's melting temperature, to probe ligand binding. 
Thermal shift assay (TSA) can be used to analyze the binding of different ligands to the protein of interest or find a stabilizing condition to perform experiments such as X-ray crystallography. Here we will describe a protocol for TSA utilizing the pseudokinase, Selenoprotein O (SelO), for a simple and high-throughput method for testing metal and nucleotide binding. In contrast to canonical kinases, SelO binds ATP in an inverted orientation to catalyze the transfer of AMP to the hydroxyl side chains of proteins in a posttranslational modification known as protein AMPylation. By leveraging the shift in the melting temperatures, we provide crucial insights into the molecular interactions underlying SelO function.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor im Rampenlicht: Förderung struktureller und biochemischer Studien von Proteinen durch thermische Shift-Assays

Here, we present the thermal shift assay, a high-throughput, fluorescence-based technique used to investigate the binding of small molecules to proteins of interest.

Deacetylierung Assays zu entwirren, das Zusammenspiel zwischen Sirtuine (SIRT2) und spezifische Protein-Substrate

Zusammenfassung

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In Vitro Ubiquitination und Deubiquitination Assays von Nucleleosomalhistones

Einschaltstige Bereicherung einer TAP-Tagged-Histon-Deacetylase des Filamentous Fungus Aspergillus nidulans für Enzymatische Aktivität Assay

Assays zur Validierung von Histon-Acetyltransferase-Inhibitoren

Nachweis der Protein-S-Acylation mit Acyl-Resin Assisted Capture

Ein Hochdurchsatz-Assay mit enzymgekoppelter Aktivität zur Untersuchung der Wechselwirkung kleiner Moleküle mit der dNTPase SAMHD1

Ein Acetyl-Click-Chemie-Assay zur Messung der Histon-Acetyltransferase-1-Acetylierung

Ein Acetyl-Click-Chemie-Assay zur Messung der Histon-Acetyltransferase-1-Acetylierung

Ein Acetyl-Click-Chemie-Assay zur Messung der Histon-Acetyltransferase-1-Acetylierung

Verwendung eines Thermal-Shift-Assays zur Untersuchung der Substratbindung an das Selenoprotein O

Verwendung eines Thermal-Shift-Assays zur Untersuchung der Substratbindung an das Selenoprotein O