Histone-Deacetylasen der Klasse 1 wie RpdA werden als mögliche neue Ziele für die Behandlung von Pilzinfektionen diskutiert. Für die weitere Charakterisierung sind jedoch gereinigte Enzymaktivitäten erforderlich. Der Hauptvorteil dieses Protokolls ist die schnelle und ausreichende Trennung von nativen TAP-markierten Komplexen zur Aktivitätsbestimmung in einem einzigen Schritt.
HDAC-Komplexe, die aus diesem Protokoll abgeleitet sind, können für das Wirksamkeitsscreening neuartiger pilzspezifischer Deactylase-Inhibitoren verwendet werden. Diese Methode bildet die Grundlage für die Extraktion und Reinigung von TAP-markierten Pilzproteinen, die als Ausgangspunkt für die Erstellung von Protokollen für andere Enzyme und Stämme verwendet werden könnten. Um dieses Verfahren zu beginnen, fügen Sie 10 Milliliter CSS zu jedem Kolben der vorbereiteten Conidia hinzu.
Jeden Kolben mit dem mitgelieferten Schraubverschluss fest schließen und kräftig schütteln. Danach verwenden Sie eine sterile Impfschleife, um alle verbleibenden Konidien vollständig abzukratzen. Passieren Sie die Conidia durch 40-Mikrometer-Zellsiebe, die auf ein Zentrifugenrohr gelegt werden, und sammeln Sie die Suspension von fünf der Kolben in einem Rohr.
Zentrifugieren Sie dann die Proben, um die Proben wie im Textprotokoll beschrieben zu kombinieren und zu verdünnen. Zuerst Käsetuch in einen Trichter auf einem Kolben. Filtern Sie die vorbereiteten Mycelia durch das Tuch und waschen Sie sie kurz mit entionisiertem Wasser.
Entfernen Sie so viel Feuchtigkeit wie möglich aus der Myzelelie, indem Sie das Käsetuch zwischen die Hände und dann zwischen den Papiertüchern drücken. Danach die getrocknete Mycelia als flache Platten in einen Kunststoffbecher mit Schraubdeckel geben. Mit flüssigem Stickstoff, Blitz-Einfrieren der Mycelia und speichern Sie es bei minus 80 Grad Celsius vor der Lyophilisierung.
Dann lyophilisieren die Mycelia über Nacht. Am nächsten Tag stoppen Sie den Gefriertrocknungsprozess, wenn die Temperatur der Myzelelie konstant bleibt. Entfernen Sie die Becher und versiegeln Sie sie sofort mit den mitgelieferten Schraubverschlüssen.
Zuerst 1,5 Gramm Mycelia und eine Schleifkugel in das Schleifglas einer Kugelmühle geben. Das Myzelpulver 30 Sekunden lang bei 25 Hertz schleifen und das Myzelpulver in ein 15-Milliliter-Zentrifugenrohr geben. Kippen Sie das Rohr, um das nachfolgende Mischen der Myzelelie mit dem Puffer zu ermöglichen, dann fügen Sie sechs Milliliter eiskalten Extraktionspuffer B250, einschließlich 1X Protease-Hemmer-Cocktail, pro Gramm Myzelpulver hinzu und mischen Sie mit einem kleinen Spachtel, bis eine vollständige Homogenisierung des Rohextrakts erreicht ist; halten Sie die Röhre fünf Minuten auf Eis.
Als nächstes das Rohr und ein Gleichgewichtsrohr in eine Zentrifuge geben und bei 40.000 mal g und bei vier Grad Celsius für mindestens 20 Minuten drehen. Legen Sie während der Zentrifugation eine 10-Milliliter Einwegchromatographie-Säule fest, um mit dem Ausgleich des IgG-Harzes zu beginnen. 300 Mikroliter gut resuspendiertes IgG-Harz in die Säule pfeifen.
Füllen Sie die Säule mit B250 auf 10 Milliliter und lassen Sie den Puffer durch schwerkraft fließen. Fügen Sie einen Milliliter B250 einschließlich 1X Protease-Hemmer-Cocktail und lassen Sie es durchfließen, dann stecken Sie den Boden der Säule. Entfernen Sie nach der Zentrifugation 10 Mikroliter des Überstandes für die SDS-PAGE-Analyse.
Legen Sie die Probe in eine 1,5-Milliliter-Röhre mit 40 Mikroliter Wasser und 12,5 Mikroliter 5X LSB. Mit einer serologischen Pipette den Überstand vorsichtig entfernen und auf die Säule mit den ausgeglichenen IgG-Perlen übertragen. Schließen Sie die Spalte, indem Sie die bereitgestellte Endkappe fest sichern.
Zunächst die Chromatographiesäule auf einem Drehmischer bei 10 Umdrehungen pro Minute und bei vier Grad Celsius für zwei bis vier Stunden inkubieren. Entfernen Sie danach die Kappe, und öffnen Sie die Spalte unten, um den Durchfluss zu erfassen. Um die Säule zu waschen, verwenden Sie einen Pipetter, um einen Milliliter Waschpuffer 250 zur Säulenkappe hinzuzufügen, um alle eingeschlossenen Perlen zu entfernen und diese Suspension in einem Flush auf das abgesetzte Harz zu übertragen, um die Perlen wieder auszusetzen.
Füllen Sie dann die Säule bis zur Spitze mit Waschpuffer 250 und schließen Sie sie mit einer Stapelkappe, die mit einer peristaltischen Pumpe verbunden ist. Starten Sie die peristaltische Pumpe und stellen Sie die Pumpe auf eine Durchflussrate von etwa ein bis fünf Milliliter pro Minute ein, wiederholen Sie diesen Waschvorgang für insgesamt vier Waschungen, und wiederholen Sie diesen Waschvorgang dann dreimal mit dem TEV-Ausgleichspuffer. Schließen Sie die Chromatographiespalte unten.
Setzen Sie die IgG-Perlen in einem Milliliter TEV-Spaltungspuffer aus und fügen Sie 20 Mikroliter 50-fachen Proteasehemmer-Cocktail sowie 10 Mikroliter TEV hinzu. Als nächstes kappen Sie die Säule und brüten auf einem Drehmischer bei 10 Umdrehungen pro Minute und bei vier Grad Celsius über Nacht, um die Proteinkomplexe zu lösen, die über den markierten HDAC gebunden sind. Öffnen Sie am nächsten Tag die Säule und sammeln Sie das Eluat in einem Zwei-Milliliter-Zentrifugenrohr.
Verwenden Sie 0,7 Milliliter TEV-Spaltungspuffer, um die Perlen von der Kappe zu entfernen und die Wand der Säule zu spülen. Legen Sie das Zwei-Milliliter-Zentrifugenrohr in ein 50-Milliliter-Zentrifugenrohr und legen Sie die Säule dann auf das offene Zwei-Milliliter-Rohr. Übertragen Sie diese ganze Baugruppe auf eine Tischzentrifuge und drehen Sie sie mit 300 mal g für zwei Minuten, um das TEV-Eluat zu erhalten.
In dieser Studie wird eine einstufige Anreicherung eines TAP-markierten HDAC der Klasse 1 aus dem fadenförmigen Pilz Aspergillus nidulans zur Beurteilung der In-vitro-Deaktylaseaktivität durchgeführt. Ein typisches Ergebnis hierfür zeigt deutlich die Wirksamkeit des ersten Affinitätsschritts, der bei der Tandemreinigung noch weiter erhöht wird. Die meisten der prominenten Proteine, die im Proteinextrakt und im Durchfluss enthalten sind, sind jedoch bereits im TEV-Eluat erschöpft.
Ein Immunoblot zeigt starke Signale, die bei ca. 120 Kilodalton enden, was CBP-markierten Volllängen-RpdA im TEV-Eluat, dem Calmodulin-Durchfluss und eluate Fraktionen entspricht. Hier wird ein repräsentativer Deaktylase-Aktivitätstest mit dem spezifischen HDAC-Hemmer Trichostatin A gezeigt. Die Empfindlichkeit der Aktivität bestätigt, dass die gemessenen Werte auf RpdA zurückzuführen sind und nicht durch unspezifische Proteaseaktivität verursacht werden.
Dies ist wichtig, da es darauf hinweist, dass die TEV-Protease, die in einer ziemlich hohen Konzentration vorhanden ist, den HDAC-Aktivitätstest nicht beeinträchtigt. Interessanterweise wird die HDAC-Aktivität nach dem zweiten Affinitätsreinigungsschritt CE im Vergleich zum TEV-Eluat signifikant reduziert. Um eine effiziente Proteinextraktion zu ermöglichen, stellen Sie sicher, dass Mycelia zu feinem Pulver gemahlen wird.
Dies ist besonders wichtig, wenn keine Maschine zur Verfügung steht und Mörtel und Stößel zum Schleifen verwendet werden. Die Zugabe des zweiten Affinitätsschritts zum Protokoll führt zu Brüchen, die rein genug für die Proteinidentifikation sind, aber auf der Massenspektrometrie durchgeführt werden. Achten Sie bei der Arbeit mit flüssigem Stickstoff darauf, Schutzbrillen und Schutzhandschuhe zu tragen, um Personenschäden zu vermeiden.
