This research was supported by the NIH Common Fund and Intramural Research Program of the National Institute of Arthritis, Musculoskeletal, and Skin Diseases.

1. Vorbereitung der Basalmembranmatrix und Beschichtung von Kunststoffartikel <ol><li> Das tiefgefrorene Basalmembranmatrix Lager von -20 ° C auf Eis aufgetaut und über Nacht bei 4 ° C. </li><li> Nach dem Auftauen Pipette 2 mg Aliquots von Basalmembranmatrix in vorgekühlte Eppendorf-Röhrchen. Bewahren Sie diese bei -20 ° C, bis sie benötigt. </li><li> Um Basalmembranmatrix beschichteten Platten vorbereiten, tauen ein Aliquot auf Eis bis zum letzten Stück Eis in den Eppendorf-Röhrchen ausgeblendet wird (in der Regel innerhalb von ca. 2 h). </li><li> Nach dem Auftauen hinzuzufügen Basalmembranmatrix bis 12 ml kaltem (4 ° C) DMEM / F12, um Basalmembranmatrix Beschichtungslösung herzustellen. </li><li> Hinzufügen Basalmembranmatrix Lösung des geeigneten Kulturgefäß. Für eine Platte mit 6 Vertiefungen, zu verzichten 1 ml pro Vertiefung. Schwenken Sie die Platte, um sicherzustellen, die Basalmembran-Matrix-Lösung vollständig bedeckt jede Vertiefung. </li><li> Parafilm verschließen Basalmembranmatrix beschichteten Platte / Schale, und Inkubation bei room Temperatur 1 Stunde vor der Verwendung. Alternativ Shop Basalmembranmatrix beschichteten Platten / Geschirr bei 4 ° C lagern und innerhalb von 2 Wochen nach Beschichtung. HINWEIS: Fügen Sie Zusatz DMEM / F12 mit dem Basalmembranmatrix beschichteten Platte / Schale um ein Austrocknen zu verhindern. Vor der Verwendung 4 ° C gelagert Basalmembranmatrix beschichteten Platte / Schale, legen Sie sie in einem biologischen Sicherheitsschrank und lassen Sie ihn auf Raumtemperatur für mindestens 30 Minuten zu kommen. </li><li> Aspirat Basalmembranmatrix vollständig vor der Zugabe von Medium und Zellen. </li></ol> 2. Herstellung von E8 Medium <ol><li> Bereiten E8 Kulturmedium durch Auftauen E8 Ergänzung über Nacht bei 4 ° C. </li><li> Entfernen 10 ml E8 Grundmedium aus der 500 ml Lager und entsorgen. </li><li> Pipettieren Sie die gesamte 10 ml Fläschchen mit E8 Ergänzung direkt in 490 ml E8 Grundmedium. Nicht warmen komplette E8 Medium in einem 37 ° C Wasserbad, als wiederholte Temperaturschwankungen können die bFGF im comple abbauente E8 Medium. </li><li> Verwenden Sie vollständige E8 Medium innerhalb von 2 Wochen nach der Zugabe der Ergänzung. </li></ol> 3. Auftauen von iPS-Zellen <ol><li> Entfernen Sie ein Fläschchen mit gefrorenen iPS-Zellen aus flüssigem Stickstoff und auf Trockeneis. </li><li> Schnell auftauen das Fläschchen in einem 37 ° C Wasserbad; Schwenken Sie die Durchstechflasche in das Wasserbad, bis nur noch ein winziges Fragment des Eises bleibt. </li><li> Sprühen Sie die Flasche mit 70% Ethanol und Transfer zu einem biologischen Sicherheitsschrank. </li><li> 1 ml Raumtemperatur E8 Medium tropfenweise direkt in das Fläschchen. </li><li> Mit einem 2 ml Pipette die Zellsuspension unter Rühren in 9 ml E8 Medium in einem 15 ml konischen Röhrchen. Schwenken Sie den Schlauch häufig, um sicherzustellen, dass die Zellen und das Medium gut mischen schnell. </li><li> Zentrifugiere die Zellen bei 200 g für 5 min. </li><li> Saugen Sie den Überstand und Zellpellet in einem geeigneten Volumen von E8 mit 10 &amp; mgr; Y-27632 ergänzt. </li><li> Fügen Sie die Zellen, um eine entsprechende Anzahl von Keller Membrane Matrix-beschichteten Vertiefungen und in ein 37 ° C, 5% CO 2 -Inkubator über Nacht. Es wird empfohlen, mindestens 0,2 x 10 6 iPSC pro Vertiefung einer 6-Well-Platte Platte auf eine schnelle Wiederherstellung nach dem Auftauen zu ermöglichen. </li></ol> 4. Wartung und Routine Passagieren von iPS-Zellen <ol><li> Aktualisieren E8 Medium täglich. </li><li> Überwachen der Morphologie und der Konfluenz der Zellen mit einem inversen Mikroskop. iPS-Zellen von hoher Qualität wachsen in flache Kolonien mit deutlichen Grenzen; Einzelkolonien besitzen eine &quot;pflastersteinartigen&quot; Aussehen. </li><li> Passage die iPS-Zellen, wenn sie zu erreichen ~ 70% Konfluenz. </li><li> Bereiten Sie eine EDTA Passagieren Lösung durch Zugabe von 0,9 g NaCl und 500 ul 0,5 M EDTA zu 500 ml DPBS. Gut mischen, um NaCl und Vakuumfilter lösen, um zu sterilisieren. Erwärmen eines Aliquots der Passagierung Lösung in einem 37 ° C Wasserbad vor Passagierung. </li><li> Um den Durchgang, absaugen verbrauchten Kulturmedium und wäscht die Zellen einmal mit einem gleichen Volumen von warmem passaging Lösung. Aspirate und Pipetten genug EDTA Passagierung Lösung zur Beschichtung der Zellen (1 ml pro Vertiefung einer Platte mit 6 Vertiefungen). </li><li> Legen Sie die Zellen unter einem inversen Mikroskop und beobachten Sie die iPSC Kolonien. Das Auftreten von Löchern in Kolonien und hob Grenzen sollte deutlich werden innerhalb von 2 bis 5 Minuten. </li><li> Sorgfältig absaugen EDTA Passagieren Lösung. </li><li> Unter Verwendung einer 10 ml Pipette verzichtet 4 ml E8 Medium (bei Verwendung einer Platte mit 6 Vertiefungen) unter hohem Druck direkt in jeder Vertiefung passagiert werden. </li><li> Sammeln Sie die iPSC Klumpen und aufgeteilt in eine entsprechende Anzahl von Vertiefungen in Abhängigkeit von der Split-Verhältnis von 1: 8 bis 1:12. Nicht zu pipettieren, als Aufgliederung der Zellklumpen zu einer schlechten Rentabilität führen. </li><li> Die Platte wird in einem Brutkasten, und Rock die Platte hin und her und von Seite zu Seite mehrmals, um die Zellen zu dispergieren. </li></ol> 5. Herstellung von MEFs und iPS-Zellen für Tansfection <ol><li> 48 Stunden vor der transfection, Passage iPSCs bei ~ 1: 6 in vier oder mehr Vertiefungen einer Basalmembranmatrix beschichteten 6-Well-Platte, so dass sie zu 70% konfluent 2 Tage damit sein. </li><li> Am nächsten Tag auftauen DR4 MEFs in MEF Medium, das aus DMEM (hoher Glukose) mit 10% FBS und 1x MEM-NEAA ergänzt. </li><li> Platte DR4 MEFs in zwei 10-cm-Schalen bei ~ 2 x 10 4 Zellen / cm 2 beimpft und über Nacht bei 37 ° C. </li><li> Am Tag der Transfektion ändern MEF mittlere bis E8 mit 10 &amp; mgr; Y-27632 ergänzt 30 Minuten vor der Durchführung der Transfektion auf iPS-Zellen. </li><li> Optional: Wenn durchflusszytometrische Analyse von iPS-Zellen nach der Transfektion gewünscht ist, entfernen Sie einen Basalmembranmatrix beschichteten Platte von 4 ° C und bei Raumtemperatur. </li><li> Optional: 4 h vor der Transfektion ergänzen vorge Transfektion iPSC Kultur Y-27632 in einer Endkonzentration von 10 uM. </li></ol> 6. Gentle-Zelle Dissoziation Reagenz Behandlung einnd Transfektion von iPS-Zellen mit einem Elektroporationssystem <ol><li> Entfernen P3 primären Zell Transfektionslösung von 4 ° C und lassen Sie ihn auf Raumtemperatur kommen ~ 30 min. Fügen Sie die gesamte 100 ul Ergänzung zur Transfektion Lösung vor der Verwendung. </li><li> Warm sanfte-Zelldissoziation Reagenz in einem 37 ° C Wasserbad. </li><li> Erhalten AAVS1 TALENS (PZT-AAVS1-L1 und PZT-AAVS1-R1) und AAVS1-CAG-EGFP Geber von -20 ° C. </li><li> IPS-Zellen zu entfernen aus dem Inkubator und einmal mit DPBS waschen. </li><li> 1 ml der sanfte-Zelldissoziation Reagenz pro Vertiefung und inkubieren iPS-Zellen bei 37 ° C für 5 Minuten oder bis mehr als 50% der Zellen aus dem Kulturgefäß dissoziiert. </li><li> Pipettieren Sie die Zellen nach oben und unten ein paar Mal mit einer p1000-Pipette, um alle verbleibenden Zellen aus dem Kulturgefäß zu distanzieren und zu brechen iPSC Klumpen. </li><li> 2 ml E8 Medium in jede Vertiefung und Pipette auf und ab mehrmals mit einer 10 ml Pipette nach Fürther disaggregieren Zellklumpen in einzelne Zellen HINWEIS: Die Transfektionseffizienz sinkt deutlich, wenn Zellklumpen nicht ausreichend aufgeschlüsselt. </li><li> Sammeln iPSCs in einem 15 ml konischen Röhrchen und Zentrifugieren bei 100 × g für 3 min. </li><li> Überstand wird abgesaugt und die Zellen in einer minimalen Menge von E8 Medium. </li><li> Zähle die Zellen mit einem Hämozytometer nach der Anwendung eines Vitalfarbstoffes wie 0,4% Trypan blau. Stellen Sie sicher, dass die Zellen ausreichend dissoziiert beim Zählen (1-3 Zellen pro &quot;Klumpen&quot;). </li><li> Verzichtet werden 3 x 10 6 Zellen in jeweils zwei 15 ml konischen Röhrchen und zentrifugieren Sie es bei 100 × g für 3 min. HINWEIS: Zentrifugation bei niedriger Geschwindigkeit reduziert die Zellstress und ermöglicht eine einfache Resuspension von iPS-Zellen vor der Elektroporation. </li><li> Stellen Sie die Elektroporation System auf den Zelltyp-spezifische Programm für die humane embryonale Stammzelllinie H9 (Programm CB-150). </li><li> Nach dem Zentrifugieren den Überstand aspirieren vom cell Pellets. Um ein Pellet, mit 10 ug des HR Spender als Kontrollprobe. Zu den weiteren Pellet hinzufügen 10 ug des HR Spender, zusammen mit 5 ug jedes TALEN (PZT-AAVS1-L1 und PZT-AAVS1-R1) als Versuchsprobe. </li><li> Resuspendieren jedes Zellpellet in 100 ul P3 primären Zell Transfektionslösung und übertragen in eine Küvette. </li><li> Führen Sie die Transfektion und sofort fügen 500 ul Raumtemperatur E8 Medium zu jeder Küvette. </li><li> Übertragen Sie die transfizierten iPSCs tropfenweise zu einer 10-cm-Schale mit DR4 MEFs in Schritt 5.4 vorbereitet. </li><li> Optional: Fügen Sie einige Tropfen aus jedem Experiment in eine Vertiefung einer Basalmembranmatrix beschichtete Platte mit 6 Vertiefungen, wenn Durchflusszytometrie anaylsis der Transfektionseffizienz gewünscht wird. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte von 6,15 bis 6,17, beide Proben zu beenden. Am folgenden Tag, waschen Sie die Zellen mit DPBS zweimal und schalten Kulturmedium zu NutriStem, die iPSC Kultur auf Feeder unterstützt besser als E8 erscheint. </li><li> TrAnsient EGFP-Expression Peaks bei 48 bis 72 Stunden nach der Transfektion; beurteilen Transfektionseffizienz nach Wunsch. </li></ol> 7. Puromycin Auswahl der Targeted iPSCs <ol><li> Beginnen Puromycin-Selektion 72 Stunden nach der Transfektion, wenn die iPS-Zellen zu erreichen 70% Konfluenz. </li><li> Für NCRM5 iPSCs beginnen Puromycin-Selektion bei 0,5 ug / ml Puromycin (1/2 der vollen Dosis) in NutriStem Kulturmedium verdünnt. Die optimale Puromycin Konzentration von 0,25 bis 1 &amp; mgr; g / mIL einigen iPSC Linien variieren. </li><li> Kultur iPS-Zellen in NutriStem + 0,5 ug / ml Puromycin für 3 Tage, erfrischend das Medium täglich. </li><li> Nach 3 Tagen, erhöhen die Konzentration von Puromycin bis 1 ug / ml. </li><li> Kultur iPS-Zellen unter 1 ug / ml Puromycin-Selektion für weitere 7 bis 8 Tage, oder bis deutliche Kolonien erscheinen groß genug für Kolonie Kommissionierung. </li></ol> 8. Kolonie Kommissionierung und Ausbau von gezielten iPSCs <ol><li> Verwenden BasalmembranMatrix zu beschichten, eine Platte mit 96 Vertiefungen durch Dispensieren 50 ul Basalmembranmatrix Beschichtungslösung (2 mg Basalmembranmatrix in 12 ml DMEM / F12 verdünnt) in jede Vertiefung. Bewahren Sie die Platte bei 4 ° C über Nacht vor dem Gebrauch. </li><li> Nachdem man die Basalmembranmatrix beschichteten Platte auf Raumtemperatur kommen, saugen Sie den Basalmembranmatrix zubereitet, und 100 &amp; mgr; E8 mit 10 &amp; mgr; Y-27632 in jede Vertiefung ergänzt. </li><li> Ein inverses Mikroskop in einem biologischen Sicherheitsschrank und Spray leicht mit 70% EtOH zu sterilisieren. </li><li> Ziehen Sie ein Glas Pasteur Pipette über einem Bunsenbrenner, eine ideale Kolonie-Picking-Tool, das einen kleinen &quot;Haken&quot; an der Spitze zu erhalten. Sterilisieren mit 70% EtOH, und legen Sie in der Haube, um zu trocknen. </li><li> Entfernen Sie die Schale mit gezielten iPSC Kolonien aus dem Inkubator, und legen Sie in die Haube unter dem Mikroskop. </li><li> Wählen iPSCs durch Verfolgung einen Kreis um die Kolonie Grenze der Kolonie-Picking-Tool.</li><li> Verwenden Sie den &quot;Haken&quot; der Kolonie Kommissionierung Werkzeug vorsichtig abkratzen und entfernen Sie die iPSC Kolonie von der Oberfläche der Platte. Bei größeren Kolonien, Zeichnen eines X mit dem Kolonie-Picking-Tool zu Quartal die Kolonie wird das Zellwachstum nach erneuter Beschichtung zu erleichtern. </li><li> Sobald Zellklumpen sind freistehend und frei schwebend, mit einem p200 Pipette eingestellt auf ~ 30 &amp; mgr; l, um die iPS-Zellen zu sammeln. Plattenzellen direkt in die 96-Well-Platte. </li><li> Optional: mit einem p20-Pipette, um ~ 5 &amp; mgr; l eingestellt, um die iPS-Zellen in ein Eppendorf-Röhrchen zu sammeln, dann fügen Sie 50 ul sanft-Zelldissoziation Reagenz für 5 min bei 37 ° C verdaut. Nach der Verdauung, fügen Sie 500 ul E8 Medium in die Eppendorf-Röhrchen, um die sanfte-Zelldissoziation Reagenz verdünnen und Spin-down der Zellen bei 200 xg in einer Standardtischmikrozentrifuge 5 min. Dann saugen die meisten mittel- und verlassen ~ 30 &amp; mgr; l zu resuspendieren und übertragen Sie die Zellen in 96-Well-Platte. HINWEIS: DieseAnsatz wird die Dissoziation des Zellklumpen und schnelle Expansion des abgeholt Kolonie zu erleichtern. </li><li> Weiter Kolonieaufnahme bis eine ausreichende Anzahl von iPSC Kolonien wurden gesammelt (etwa 20-30 Kolonien pro Experiment wird empfohlen). </li><li> Nach Kolonie Kommissionierung, legen Sie die Platte mit 96 Vertiefungen in einem Inkubator über Nacht. Aktualisieren mit kompletter E8 Medium am nächsten Tag, und Kultur, bis ~ 70% konfluent. </li><li> Passage-Zellen aus dem 96-Loch in eine 24-Loch, dann in eine 6-Loch, wie in Schritten von 4,5 bis 4,10 beschrieben. HINWEIS: die Volumina der EDTA-Lösung und E8 Medium sollte bei der Verwendung von Brunnen kleiner als eine Platte mit 6 Vertiefungen entsprechend zu reduzieren. </li><li> Beurteilen Sie Targeting den Erfolg von Anschluss PCR und Southern-Blot-Analyse, gezielte Kassette Integration und das Fehlen von nach dem Zufallsprinzip eingefügt Vektoren 16 zu bestätigen. </li></ol>

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Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Die wichtigsten Schritte für die erfolgreiche Erzeugung von AAVS1 Safe-Harbour gezielte menschlichen iPS-Zellen sind: (1) der effizienten Erbringung von TALEN und Donorplasmiden in iPS-Zellen durch Transfektion; (2) Optimierung der Dissoziation von iPS-Zellen in einzelne Zellen vor der Transfektion und Beschichtungs-Dichte nach der Transfektion; (3) Optimierung der Dosis und der Zeit der Medikamentenauswahl basierend auf dem Wachstum von iPSC Leitung; (4) sorgfältig seziert und Kommissionierung gezielte Kolonien und d...

Die Fähigkeit, menschliche Körperzellen in embryonale Stammzellen-ähnliche pluripotenten Stammzellen umprogrammieren (iPS) wurde zuerst von Takahashi et al entdeckt. 2007 1. Humane dermale Fibroblasten, die mit Retroviren exprimieren vier Transkriptionsfaktoren transduziert (die so genannt Yamanaka Faktoren Oct3 / 4, Sox2, c-Myc und Klf4) gezeigt wurden hoch ähnlich menschliche embryonale Stammzellen (hES) auf der Grundlage der Morphologie, Proliferation, Genexpression und epigenetische Zustand zu sein; entscheidend ist, sind ebenfalls iPSCs und zur Differenzierung zu Zellen von allen drei Keimschichten 1. Die Proliferationspotential und Differenzierung Kapazität von iPS-Zellen macht sie sehr attraktiv Werkzeuge; durch Umprogrammieren Zellen von Patienten mit bestimmten Krankheiten, iPSCs sowohl in vitro Krankheitsmodellsystemen und als potentielle Therapeutika verwendet werden. Zu letzterem Zweck müssen mehrere Probleme, bevor das volle Potenzial von iPS-Zellen behandelt werdenin einer klinischen Umgebung realisiert werden kann; das tumorigene Potential von in vitro kultivierten hESCs und iPSCs, die Verwendung von xenogenen Derivate während Umprogrammierung und Zellerhaltung, und die Notwendigkeit der transplantierten Zellen in vivo zu verfolgen sind entscheidende Hürden für die klinische Anwendung von pluripotenten Stammzellen (Bewertet von Hentze et al. 2). Eine ideale Lösung für den Bedarf für die Verfolgung von differenzierten Zellen nach Transplantation würde eine visuell detektierbare Markierung, Resists Silencing und Buntheit unabhängig von der Anwendung. Robust und nachhaltig Ausdruck der integrierten Transgene ist am leichtesten erreichbar sind, wenn exogene DNA in die Safe-Harbour-Loci eingeführt; das heißt, Genomorte, die ausreicht, die Transkription eines integrierten Vektor zu ermöglichen, während gleichzeitig die Minderung Perturbationen Expression benachbarter Gene in 3. Ein solcher Ort, der sehr gut charakterisiert ist seit seiner Entdeckung ist das Adeno-assoziierte Virus integration Site 1 (AAVS1), in dem ersten Intron des Proteinphosphatase 1 regulatorischen Untereinheit 12C (PPP1R12C) -Gen. Dieser Locus wurde gezeigt, nicht nur aufrechterhalten und robuste Expression von integrierten Transgenen durch ausgedehnte Zeit in der Kultur und in vitro Differenzierung 3 zu ermöglichen, sondern auch zum Schutz der umgebenden Gene von Transkriptionsstörungs 4; Beide Funktionen werden angenommen, dass aufgrund der Anwesenheit von endogenen Chromatin Isolatorelemente flankieren den AAVS1 Website 5. Fortschritte in der Genom-Engineering-Tools über nur den letzten zehn Jahren haben die Leichtigkeit und Effizienz, mit der genetischen Manipulationen in jedem Zelltyp erreicht werden erheblich erleichtert. Während frühe erfolgreiche Experimente angeführten überaus niedrige Niveaus von endogenen homologen Rekombination (HR) mit einer eingebrachten Geber für das Gen-Targeting in WSR 6,7 erreichen, wird die Verwendung von ortsspezifischen Nukleasen, wie beispielsweise Zinkfinger-Nucleasen (ZFNs), daß signinifikant induzieren homologe Rekombination durch die Erzeugung einer doppelsträngigen DNA-Bruch hat den Wirkungsgrad solcher Experimente 8,9 stark erhöht. Die Umnutzung der beiden Transkriptionsaktivator ähnlichen Effektoren (Erzählungen) von pflanzenpathogenen Xanthomonas Gattungen und die prokaryotischen Cluster regelmäßig beabstandeten kurzen palindromischen Repeats (CRISPR) / Cas9 System in effiziente ortsspezifische Designer-Nukleasen hat Gen-Targeting in pluripotente Stammzellen aus einem zugänglichen und praxisnahe Methodik 10-13. Eine kürzlich durchgeführte Papier beschrieben, ein effizientes Verfahren für die stabile Integration eines grün fluoreszierenden Reporterkassette in die AAVS1 Safe-Harbour-Locus in menschlichen iPS-Zellen unter Verwendung von TALE Nukleasen (Talens) 14. Diese gezielten iPSCs behielten ihre Fluoreszenz selbst nachdem eine gerichtete Differenzierung zu Herzmuskelzellen und die Transplantation in einem Mausmodell für Myokardinfarkt (MI), ein starker Hinweis für die Nützlichkeit solcherstabil fluoreszierende pluripotenten Stammzellen 14. Gezielt Kolonien zu erhalten, wurde ein Gen-Trap-Verfahren verwendet, wobei ein Spleiß-Akzeptor (SA), plaziert 2A selbstspaltende Peptidsequenz, die das Puromycin-N-Acetyl-Transferase (PAC) Gen unter der Kontrolle des endogenen Promotors PPP1R12C; also nur iPS, die die DNA-Donor am AAVS1 Locus integriert haben äußern PAC, wodurch sie auswählbar auf Puromycin-Resistenz beruht; (Figur 1, 15). Dieses Protokoll beschreibt die Verfahren zur Erzeugung von AAVS1-GFP-iPS-Zellen berichtet in der jüngsten Papier 14, das den Prozess der Transfektion von iPS-Zellen mit Talens und ein 9,8 kb Spender, um ein 4,2 kb DNA-Fragment in die AAVS1 Safe-Harbour-Locus zu integrieren, die Auswahl iPS-Zellen auf Basis von Puromycin-Resistenz und Kommissionierung Kolonien klonalen Expansion. Die hierin beschriebenen Techniken können auf viele Genomtechnik-Experimente angewendet werden.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1437">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:588px;">NAME OF MATERIAL/EQUIPMENT</td>
			<td style="width:123px;">COMPANY</td>
			<td style="width:123px;">CATALOG #</td>
			<td style="width:603px;">COMMENTS/DESCRIPTION</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, *LDEV-Free, 10mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354230</td>
			<td>Store at -20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM/F-12</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11320-033</td>
			<td>Store at 4&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Costar 6 Well Clear TC-Treated Multiple Well Plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Essential 8 Medium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A1517001</td>
			<td>Store basal medium at 4&#176;C. Store supplement at -20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Y-27632 dihydrochloride</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1254</td>
			<td>Store at room temp. Once dissolved in H2O, store at -20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5886-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15575-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DPBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14190-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100mm TC-Treated Culture Dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DR4 MEF 2M IRR - Academic</td>
			<td>GlobalStem</td>
			<td>GSC-6204G</td>
			<td>Store in liquid Nitrogen.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM, high glucose, pyruvate</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11995-040</td>
			<td>Store at 4&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Defined Fetal Bovine Serum, US Origin</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30070.03</td>
			<td>Store at -20&#176;C. Thaw at 4&#176;C overnight and aliquot. Store aliquots at -20&#176;C until needed.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11140-050</td>
			<td>Store at 4&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4D-Nucleofector Core unit&#160;</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>AAF-1001B</td>
			<td>part of the electroporation system</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4D-Nucleofector X unit&#160;</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>AAF-1001X</td>
			<td>part of the electroporation system</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit L (24 RCT)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>V4XP-3024</td>
			<td>Upon arrival, remove Primary Cell Solution and supplement and store at 4&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A1110501</td>
			<td>Store at -20&#176;C. Thaw overnight at 4&#176;C and warm an aliquot in a 37&#176;C water bath before use.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NutriStem XF/FF Culture Medium</td>
			<td>Stemgent</td>
			<td>01-0005</td>
			<td>Store at -20&#176;C. Thaw overnight at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AAVS1 TALENs (pZT-AAVS1-L1 and pZT-AAVS1-R1)</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>52637 and 52638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AAVS1-CAG-EGFP Homologous Recombination donor</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>22212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Puromycin Dihydrochloride</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A11138-03</td>
			<td>Store at -20&#176;C. Prepare working aliquots of 1 mg/mL in ddH2O.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Disposable Borosilicate Glass Pasteur Pipets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-20A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sorvall Legend XTR (Refrigerated), 120V 60Hz</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75-004-521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TX-750 4 &#215; 750mL Swinging Bucket Rotor</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75003607</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypan Blue Solution, 0.4%</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

transfection, selection, and colony-picking of human induced pluripotent stem cells talen-targeted with a gfp gene into the aavs1 safe harbor

Targeted transgene addition can provide persistent gene expression while circumventing the gene silencing and insertional mutagenesis caused by viral vector mediated random integration. This protocol describes a universal and efficient transgene targeted addition platform in human iPSCs based on utilization of validated open-source TALENs and a gene-trap-like donor to deliver transgenes into a safe harbor locus. Importantly, effective gene editing is rate-limited by the delivery efficiency of gene editing vectors. Therefore, this protocol first focuses on preparation of iPSCs for transfection to achieve high nuclear delivery efficiency. When iPSCs are dissociated into single cells using a gentle-cell dissociation reagent and transfected using an optimized program, >50% cells can be induced to take up the large gene editing vectors. Because the AAVS1 locus is located in the intron of an active gene (PPP1R12C), a splicing acceptor (SA)-linked puromycin resistant gene (PAC) was used to select targeted iPSCs while excluding random integration-only and untransfected cells. This strategy greatly increases the chance of obtaining targeted clones, and can be used in other active gene targeting experiments as well. Two weeks after puromycin selection at the dose adjusted for the specific iPSC line, clones are ready to be picked by manual dissection of large, isolated colonies into smaller pieces that are transferred to fresh medium in a smaller well for further expansion and genetic and functional screening. One can follow this protocol to readily obtain multiple GFP reporter iPSC lines that are useful for in vivo and in vitro imaging and cell isolation.

Eine Visualisierung des Protokolls ist in Abbildung 2, mit Zeiten, in denen iPS-Zellen sind in unterschiedlichen Medium entweder grün oder blau E8 für NutriStem hervorgehoben kultiviert. Es ist wichtig, nur hochwertige iPS-Zellen zu transfizieren; untersuchen Kulturschalen ganz routinemäßige Wartung und prüfen, ob iPS Kulturen enthalten hauptsächlich verschiedene Kolonien die mit einem Kopfsteinpflaster-ähnliche Morphologie (3A); differenzierten Zellen sollten nicht mehr als 10% ...

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Transfection, Selection, and Colony-picking of Human Induced Pluripotent Stem Cells TALEN-targeted with a GFP Gene into the AAVS1 Safe Harbor

TALEN-mediated gene editing at the safe harbor AAVS1 locus enables high-efficiency transgene addition in human iPSCs. This protocol describes the procedures for preparing iPSCs for TALEN and donor vector delivery, transfecting iPSCs, and selecting and isolating iPSC clones to achieve targeted integration of a GFP gene to generate reporter lines.

Transfektion, Selektion und Colony-Picking für Menschen induzierten pluripotenten Stammzellen mit einem GFP-Gen in die AAVS1 Safe Harbor TALEN ziel

Targeted transgene addition can provide persistent gene expression while circumventing the gene silencing and insertional mutagenesis caused by viral ...

transfection-selection-colony-picking-human-induced-pluripotent-stem

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

19.3K Aufrufe.  National Institutes of Health. TALEN-mediated gene editing at the safe harbor AAVS1 locus enables high-efficiency transgene addition in human iPSCs. This protocol describes the procedures for preparing iPSCs for TALEN and donor vector delivery, transfecting iPSCs, and selecting and isolating iPSC clones to achieve targeted integration of a GFP gene to generate reporter lines.

Serie: Transfection, Selection, and Colony-picking of Human Induced Pluripotent Stem Cells TALEN-targeted with a GFP Gene into the AAVS1 Safe Harbor

Three-dimensional Quantification of Dendritic Spines from Pyramidal Neurons Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Dendritic spines are small protrusions that correspond to the post-synaptic compartments of excitatory synapses in the central nervous system. They are distributed along the dendrites. Their morphology is largely dependent on neuronal activity, and they are dynamic. Dendritic spines express glutamatergic receptors (AMPA and NMDA receptors) on their surface and at the levels of postsynaptic densities. Each spine allows the neuron to control its state and local activity independently. Spine morphologies have been extensively studied in glutamatergic pyramidal cells of the brain cortex, using both in vivo approaches and neuronal cultures obtained from rodent tissues. Neuropathological conditions can be associated to altered spine induction and maturation, as shown in rodent cultured neurons and one-dimensional quantitative analysis 1. The present study describes a protocol for the 3D quantitative analysis of spine morphologies using human cortical neurons derived from neural stem cells (late cortical progenitors). These cells were initially obtained from induced&#160;pluripotent stem cells. This protocol allows the analysis of spine morphologies at different culture periods, and with possible comparison between induced&#160;pluripotent stem cells obtained from control individuals with those obtained from patients with psychiatric diseases.

Dendritic spines of pyramidal neurons are the sites of most excitatory synapses in mammalian brain cortex. This method describes a 3D quantitative analysis of spine morphologies in human cortical pyramidal glutamatergic neurons derived from induced&#160;pluripotent stem cells.

Dreidimensionale Quantifizierung der dendritischen Dornen von Pyramidenzellen aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen

Dendritic spines are small protrusions that correspond to the post-synaptic compartments of excitatory synapses in the central nervous system. They are ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Cultivate Primary Nasal Epithelial Cells from Children and Reprogram into Induced Pluripotent Stem Cells

Nasal epithelial cells (NECs) are the part of the airways that respond to air pollutants and are the first cells infected with respiratory viruses. They are also involved in many airway diseases through their innate immune response and interaction with immune and airway stromal cells. NECs are of particular interest for studies in children due to their accessibility during clinical visits. Human induced pluripotent stem cells (iPSCs) have been generated from multiple cell types and are a powerful tool for modeling human development and disease, as well as for their potential applications in regenerative medicine. This is the first protocol to lay out methods for successful generation of iPSCs from NECs derived from pediatric participants for research purposes. It describes how to obtain nasal epithelial cells from children, how to generate primary NEC cultures from these samples, and how to reprogram primary NECs into well-characterized iPSCs. Nasal mucosa samples are useful in epidemiological studies related to the effects of air pollution in children, and provide an important tool for studying airway disease. Primary nasal cells and iPSCs derived from them can be a tool for providing unlimited material for patient-specific research in diverse areas of airway epithelial biology, including asthma and COPD research.

This publication demonstrates methods for successful sampling and culture of nasal epithelial mucosa from children, and reprogramming these cells to induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs).

Pflegen Primäre Nasenepithelzellen von Kindern und umprogrammieren in induzierte pluripotente Stammzellen

Nasal epithelial cells (NECs) are the part of the airways that respond to air pollutants and are the first cells infected with respiratory viruses. They ...

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

The placenta is the first organ to develop during embryogenesis and is required for the survival of the developing embryo. The placenta is comprised of various trophoblastic cells that differentiate from the extra-embryonic trophectoderm cells of the preimplantation blastocyst. As such, our understanding of the early differentiation events of the human placenta is limited because of ethical and legal restrictions on the isolation and manipulation of human embryogenesis. Human pluripotent stem cells (hPSCs) are a robust model system for investigating human development and can also be differentiated in vitro into trophoblastic cells that express markers of the various trophoblast cell types. Here, we present a detailed protocol for differentiating hPSCs into trophoblastic cells using bone morphogenic protein 4 and inhibitors of the Activin/Nodal signaling pathways. This protocol generates various trophoblast cell types that can be transfected with siRNAs for investigating loss-of-function phenotypes or can be infected with pathogens. Additionally, hPSCs can be genetically modified and then differentiated into trophoblast progenitors for gain-of-function analyses. This in vitro differentiation method for generating human trophoblasts starting from hPSCs overcomes the ethical and legal restrictions of working with early human embryos, and this system can be used for a variety of applications, including drug discovery and stem cell research.

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

Here, we present a protocol to efficiently generate human trophoblastic cells from human pluripotent stem cells using bone morphogenic protein 4 and inhibitors of the Activin/Nodal pathways. This method is suitable for the efficient differentiation of human pluripotent stem cells and can generate large quantities of cells for genetic manipulation.

In vitro Differenzierung von humanen pluripotenten Zellen in Trophoblastische Stammzellen

The placenta is the first organ to develop during embryogenesis and is required for the survival of the developing embryo. The placenta is comprised of ...

Protocol for the Differentiation of Human Induced Pluripotent Stem Cells into Mixed Cultures of Neurons and Glia for Neurotoxicity Testing

Human pluripotent stem cells can differentiate into various cell types that can be applied to human-based in vitro toxicity assays. One major advantage is that the reprogramming of somatic cells to produce human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) avoids the ethical and legislative issues related to the use of human embryonic stem cells (hESCs). HiPSCs can be expanded and efficiently differentiated into different types of neuronal and glial cells, serving as test systems for toxicity testing and, in particular, for the assessment of different pathways involved in neurotoxicity. This work describes a protocol for the differentiation of hiPSCs into mixed cultures of neuronal and glial cells. The signaling pathways that are regulated and/or activated by neuronal differentiation are defined. This information is critical to the application of the cell model to the new toxicity testing paradigm, in which chemicals are assessed based on their ability to perturb biological pathways. As a proof of concept, rotenone, an inhibitor of mitochondrial respiratory complex I, was used to assess the activation of the Nrf2 signaling pathway, a key regulator of the antioxidant-response-element-(ARE)-driven cellular defense mechanism against oxidative stress.

Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) are considered a powerful tool for drug and chemical screening and for the development of new in vitro models for toxicity testing, including neurotoxicity. Here, a detailed protocol for the differentiation of hiPSCs into neurons and glia is described.

Protokoll zur Differenzierung von human induzierten pluripotenten Stammzellen in Mischkulturen von Neuronen und Glia für Neurotoxizitätstests

Human pluripotent stem cells can differentiate into various cell types that can be applied to human-based in vitro toxicity assays. One major advantage is ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing a detailed and thorough protocol is to clearly demonstrate each step and to make this readily available to researchers in the field. This protocol results in a homogenous layer of RPE with minimal or no manual dissection needed. The method presented here has been shown to be effective for induced pluripotent stem cells (iPSC) and human embryonic stem cells. Additionally, we describe methods for cryopreservation of intermediate cell banks that allow long-term storage. RPE generated using this protocol might be useful for iPSC disease-in-a-dish modeling or clinical application.

This protocol describes how to produce retinal pigment epithelial cells (RPE) from pluripotent stem cells. The method uses a combination of growth factors and small molecules to direct the differentiation of stem cells into immature RPE in fourteen days and mature, functional RPE after three months.

Schnelle, gezielte Differenzierung der retinalen Pigment epithelialen Zellen aus menschlichen embryonalen oder induzierte pluripotente Stammzellen

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Hepatocyte-like Cells for Drug Discovery

The ability to differentiate human induced pluripotent stem cells (iPSCs) into hepatocyte-like cells (HLCs) provides new opportunities to study inborn errors in hepatic metabolism. However, to provide a platform that supports the identification of small molecules that can potentially be used to treat liver disease, the procedure requires a culture format that is compatible with screening thousands of compounds. Here, we describe a protocol using completely defined culture conditions, which allow the reproducible differentiation of human iPSCs to hepatocyte-like cells in 96-well tissue culture plates. We also provide an example of using the platform to screen compounds for their ability to lower Apolipoprotein B (APOB) produced from iPSC-derived hepatocytes generated from a familial hypercholesterolemia patient. The availability of a platform that is compatible with drug discovery should allow researchers to identify novel therapeutics for diseases that affect the liver.

The protocol presented here describes a platform for identifying small molecules for the treatment of liver disease. A step-by-step description is presented detailing how to differentiate iPSCs into cells with hepatocyte characteristics in 96-well plates, and to use the cells to screen for small molecules with potential therapeutic activity.

Menschen mit induzierten pluripotenten Stammzellen gewonnenen Hepatozyten-ähnliche Zellen für die Wirkstoffforschung

The ability to differentiate human induced pluripotent stem cells (iPSCs) into hepatocyte-like cells (HLCs) provides new opportunities to study inborn ...

A Familial Hypercholesterolemia Human Liver Chimeric Mouse Model Using Induced Pluripotent Stem Cell-derived Hepatocytes

Familial hypercholesterolemia (FH) is mostly caused by low-density lipoprotein receptor (LDLR) mutations and results in an increased risk of early-onset cardiovascular disease due to marked elevation of LDL cholesterol (LDL-C) in blood. Statins are the first line of lipid-lowering drugs for treating FH and other types of hypercholesterolemia, but new approaches are emerging, in particular PCSK9 antibodies, which are now being tested in clinical trials. To explore novel therapeutic approaches for FH, either new drugs or new formulations, we need appropriate in vivo models. However, differences in the lipid metabolic profiles compared to humans are a key problem of the available animal models of FH. To address this issue, we have generated a human liver chimeric mouse model using FH induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived hepatocytes (iHeps). We used Ldlr-/-/Rag2-/-/Il2rg-/- (LRG) mice to avoid immune rejection of transplanted human cells and to assess the effect of LDLR-deficient iHeps in an LDLR null background. Transplanted FH iHeps could repopulate 5-10% of the LRG mouse liver based on human albumin staining. Moreover, the engrafted iHeps responded to lipid-lowering drugs and recapitulated clinical observations of increased efficacy of PCSK9 antibodies compared to statins. Our human liver chimeric model could thus be useful for preclinical testing of new therapies to FH. Using the same protocol, similar human liver chimeric mice for other FH genetic variants, or mutations corresponding to other inherited liver diseases, may also be generated.

Here, we present a protocol to generate a human liver chimeric mouse model of familial hypercholesterolemia using human induced pluripotent stem cell-derived hepatocytes. This is a valuable model for testing new therapies for hypercholesterolemia.

Eine familiäre Hypercholesterinämie menschlichen Leber chimärer Maus-Modell mit induzierten pluripotenten Stammzellen gewonnenen Hepatozyten

Familial hypercholesterolemia (FH) is mostly caused by low-density lipoprotein receptor (LDLR) mutations and results in an increased risk of early-onset ...

RNA-based Reprogramming of Human Primary Fibroblasts into Induced Pluripotent Stem Cells

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) have proven to be a valuable tool to study human development and disease. Further advancing iPSCs as a regenerative therapeutic requires a safe, robust, and expedient reprogramming protocol. Here, we present a clinically relevant, step-by-step protocol for the extremely high-efficiency reprogramming of human dermal fibroblasts into iPSCs using a non-integrating approach. The core of the protocol consists of expressing pluripotency factors (SOX2, KLF4, cMYC, LIN28A, NANOG, OCT4-MyoD fusion) from in vitro transcribed messenger RNAs synthesized with modified nucleotides (modified mRNAs). The reprogramming modified mRNAs are transfected into primary fibroblasts every 48 h together with mature embryonic stem cell-specific microRNA-367/302 mimics for two weeks. The resulting iPSC colonies can then be isolated and directly expanded in feeder-free conditions. To maximize efficiency and consistency of our reprogramming protocol across fibroblast samples, we have optimized various parameters including the RNA transfection regimen, timing of transfections, culture conditions, and seeding densities. Importantly, our method generates high-quality iPSCs from most fibroblast sources, including difficult-to-reprogram diseased, aged, and/or senescent samples.

Here we describe a clinically relevant, high-efficiency, feeder-free method to reprogram human primary fibroblasts into induced pluripotent stem cells using modified mRNAs encoding reprogramming factors and mature microRNA-367/302 mimics. Also included are methods to assess reprogramming efficiency, expand clonal iPSC colonies, and confirm expression of the pluripotency marker TRA-1-60.

RNA-basierten Reprogrammierung von menschlichen primäre Fibroblasten in induzierte pluripotente Stammzellen

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) have proven to be a valuable tool to study human development and disease. Further advancing iPSCs as a regenerative ...

Efficient Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Liver Cells

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver failure&#8212;which can be caused by chronic alcohol intake, hepatitis, acute poisoning, or other insults&#8212;is a severe condition that can culminate in bleeding, jaundice, coma, and eventually death. However, approaches to treat liver failure, as well as studies of liver function and disease, have been stymied in part by the lack of a plentiful supply of human liver cells. To this end, this protocol details the efficient differentiation of human pluripotent stem cells (hPSCs) into hepatocyte-like cells, guided by a developmental roadmap that describes how liver fate is specified across six consecutive differentiation steps. By manipulating developmental signaling pathways to promote liver differentiation and to explicitly suppress the formation of unwanted cell fates, this method efficiently generates populations of human liver bud progenitors and hepatocyte-like cells by days 6 and 18 of PSC differentiation, respectively. This is achieved through the temporally-precise control of developmental signaling pathways, exerted by small molecules and growth factors in a serum-free culture medium. Differentiation in this system occurs in monolayers and yields hepatocyte-like cells that express characteristic hepatocyte enzymes and have the ability to engraft a mouse model of chronic liver failure. The ability to efficiently generate large numbers of human liver cells in vitro has ramifications for treatment of liver failure, for drug screening, and for mechanistic studies of liver disease.

This protocol details a monolayer, serum-free method to efficiently generate hepatocyte-like cells from human pluripotent stem cells (hPSCs) in 18 days. This entails six steps as hPSCs sequentially differentiate into intermediate cell-types such as the primitive streak, definitive endoderm, posterior foregut and liver bud progenitors before forming hepatocyte-like cells.

Effiziente Differenzierung menschlicher pluripotenter Stammzellen in Leberzellen

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver ...

Generation of 3D Skin Organoid from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

The skin is the body&#8217;s largest organ and has many functions. The skin acts as a physical barrier and protector of the body and regulates bodily functions. Biomimetics is the imitation of the models, systems, and elements of nature for the purpose of solving complex human problems1. Skin biomimetics is a useful tool for in vitro disease research and in vivo regenerative medicine. Human induced pluripotent stem cells (iPSCs) have the characteristic of unlimited proliferation and the ability of differentiation to three germ layers. Human iPSCs are generated from various primary cells, such as blood cells, keratinocytes, fibroblasts, and more. Among them, cord blood mononuclear cells (CBMCs) have emerged as an alternative cell source from the perspective of allogeneic regenerative medicine. CBMCs are useful in regenerative medicine because human leukocyte antigen (HLA) typing is essential to the cell banking system. We provide a method for the differentiation of CBMC-iPSCs into keratinocytes and fibroblasts and for generation of a 3D skin organoid. CBMC-iPSC-derived keratinocytes and fibroblasts have characteristics similar to a primary cell line. The 3D skin organoids are generated by overlaying an epidermal layer onto a dermal layer. By transplanting this 3D skin organoid, a humanized mice model is generated. This study shows that a 3D human iPSC-derived skin organoid may be a novel, alternative tool for dermatologic research in vitro and in vivo.

We propose a protocol that shows how to differentiate induced pluripotent stem cell-derived keratinocytes and fibroblasts and generate a 3D skin organoid, using these keratinocytes and fibroblasts. This protocol contains an additional step of generating a humanized mice model. The technique presented here will improve dermatologic research.

Generation von 3D Haut organoide aus Cord Blood-abgeleitete induzierte pluripotente Stammzellen

The skin is the body&#8217;s largest organ and has many functions. The skin acts as a physical barrier and protector of the body and regulates bodily ...