Dieses Protokoll erleichtert die Isolierung funktionell unterschiedlicher Fibroblasten-Teilmengen von der menschlichen Haut durch FAC-Sortierung basierend auf der Zelloberflächenmarker-Expression. Zum ersten Mal können Papillen und retikuläre Fibroblasten ohne In-vitro-Manipulation direkt von der Haut isoliert werden. Dies ist ein enormer Fortschritt im Vergleich zu zuvor etablierten Isolationsmethoden mit Explant-Kulturen.
Dermale Fibroblasten-Untermengen bieten unter otostatischen Bedingungen unterschiedliche Funktionen. Mit diesem Tool ist es möglich, funktionelle Unterschiede in Hautpathologien, einschließlich Krebs oder entzündlichen Hauterkrankungen, zu untersuchen. Da der Umgang mit dem menschlichen Gewebe eine gewisse Praxis erfordert, um zufriedenstellende Zellerträge zu erzielen, möchten wir eine visuelle Demonstration bieten, um diesen Prozess zu erleichtern und zu beschleunigen.
Um die Volldicke dermis vorzubereiten, legen Sie ein Stück menschliche Haut auf ein dickes Filterpapier mit der Epidermis nach unten gerichtet. Halten Sie die Epidermis fest mit Zangen, und kratzen Sie die subkutane Fettschicht mit einem Skalpell ab. Dann schneiden Sie das Gewebe in fünf Millimeter breite Streifen, bevor Sie es in eine Petrischale geben.
Um die Dermis in Papillar- und Netzschichten zu teilen, legen Sie ein Stück Haut auf ein dickes Filterpapier mit der Epidermis nach oben. Halten Sie die Haut fest an den Rändern mit Zangen, und schneiden Sie einen Abschnitt von 300 Mikrometer Dicke mit einem elektrischen Dermatome. Übertragen Sie die erste Schicht, die aus Epidermis und Papillendermis besteht, auf eine Petrischale.
Fahren Sie dann sofort fort, um die Epidermis und Dermis zu trennen, oder fügen Sie 1x PBS hinzu, um das Gewebe vor dem Austrocknen zu bewahren. Als nächstes stellen Sie das Dermamaufem auf eine Schnittdicke von 700 Mikrometern ein und schneiden Sie die verbleibende Ndermis in Scheiben. Legen Sie die obere Scheibe, die als die obere Reikulicular dermis definiert ist, in eine separate Petrischale.
Anschließend die subkutane Fettschicht mit einem Skalpell von der restlichen unteren retikulären dermalen Schicht abkratzen und entsorgen. Sammeln Sie die unteren netzförmigen Dermis in einer anderen Petrischale. Fahren Sie sofort mit dem enzymatischen Verdauungsverfahren fort, oder fügen Sie 1x PBS hinzu, um das Gewebe vor dem Austrocknen zu bewahren.
Um die enzymatische Verdauung durchzuführen, legen Sie die Fünf-Millimeter-Hautstreifen oder die Epidermis/Papillardermis mit der Epidermis nach oben in eine Petrischale mit 10 Millilitern der dissoziierenden Enzymlösung. Dann die Petrischale bei 37 Grad Celsius für eine Stunde bebrüten. Nach der Inkubation die Epidermis/Papillardermis auf den Deckel der Petrischale übertragen.
Trennen Sie die Epidermis von der oberen Dermis mit zwei Zangen, die jeweils die Kante der Dermis halten. Anschließend jede dermale Schicht so gründlich wie möglich zerkleinern. Je kleiner die Stücke, desto besser die Gewebeverdauung.
Dann bereiten Sie die Verdauungsmischung vor. Übertragen Sie das gehackte Gewebe mit 10 Millimetern der vorbereiteten Verdauungsmischung in ein 50-Millimeter-Rohr. Inkubieren Sie das Gewebe bei 37 Grad Celsius für eine Stunde unter Rührung.
Invertieren Sie die Röhre mehrmals während der Verdauung. Um eine einzellige Suspension vorzubereiten, stoppen Sie die enzymatische Gewebeverdauung, indem Sie dem verdauten Gewebe auf Eis 10 Milliliter Fibroblastenmedium hinzufügen. Als nächstes gießen Sie den Inhalt jeder Röhre durch ein normales steriles Edelstahl-Teesieb, und sammeln Sie die Zellsuspension in einer sauberen Petrischale.
Waschen Sie das Sieb mit Medium, und zerkleinern Sie die unverdauten Gewebestücke mit der Kante eines Spritzenkolbens. Anschließend wird die gesammelte Zellsuspension durch ein 70-Mikrometer-Zellsieb in ein 50-Milliliter-Rohr pipet. Spülen Sie das Zellsieb mit Medium, und sammeln Sie den Fluss durch das gleiche Rohr.
Dann zentrifugieren Sie das Rohr bei 500 mal g bei vier Grad Celsius für 10 Minuten. Entfernen Sie den Überstand, und waschen Sie das Zellpellet mit fünf Milliliter Fibroblastenmedium. Wiederholen Sie den Zentrifugationsschritt erneut.
Danach entfernen Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet in einem Milliliter ACK Erythrozytenlysepuffer wieder auf. Lassen Sie die Zellen etwa eine Minute bei Umgebungstemperatur im Lysepuffer. Beenden Sie dann die Lyse, indem Sie neun Milliliter 1x PBS mit 10%FCS hinzufügen.
Zentrifugieren Sie das Rohr wieder bei 500 mal g bei vier Grad Celsius für fünf Minuten, und entsorgen Sie den Überstand anschließend. Nachdem die Zellen für die FAC-Sortierung nach Standardprotokollen gefärbt wurden, sortieren Sie drei Fibroblasten-Subpopulationen in separate Mikrozentrifugenröhren, die entweder mit 350 Mikroliterlysepuffer für die RNA-Isolierung oder 350 Mikroliter Fibroblasten-Wachstumsmedium für die Zellkultur gefüllt sind. Die Rohre sofort umkehren und entweder die Lysepufferrohre in flüssigen Stickstoff geben oder die Fibroblasten-Wachstumsmediumröhren auf Eis legen.
Nach FACS, drehen Sie die Zellen bei 500 mal g für drei Minuten bei vier Grad Celsius. Dann, Platte eine gleiche Menge von Zellen in Fibroblasten Wachstumsmedium in einer 24-Well-Zell-Kulturschale, und lassen Sie sie wachsen, bis sie 70% Konfluenz erreichen. Ersetzen Sie als Nächstes das kultivierte Zellmedium durch das Adipozytendifferenzierungsmedium, und lassen Sie die Zellen 14 Tage lang unterscheiden.
Fixieren Sie die Zellen am Differenzierungstag 14 20 Minuten lang mit 4%PFA. Waschen Sie die Brunnen mit 60%isopropanol, und lassen Sie es vollständig verdampfen. Dann färben Sie die Zellen mit fünf Millimolaren gefiltertem Öl Rot O für 20 Minuten.
Nach 20 Minuten die gebeizten Zellen viermal mit destilliertem Wasser waschen. Stellen Sie die in Wasser getauchten Zellen mit einem invertierten Mikroskop bei 10-facher Vergrößerung mit durchlässigem Licht ab. Dieses Protokoll ermöglicht die Identifizierung von drei Fibroblastenpopulationen in der menschlichen Haut, die mit unterschiedlichen intradermalen Lokalisationen, Genexpressionsprofilen und Funktionen aufkommt.
FAP-positive CD90-negative werden in der Papillendermis angereichert, während FAP-positive CD90-positive und FAP-negative CD90-positive in der Reikulären dermis reichlicher sind. Alle drei sortierten Subpopulationen zeigen sieben Tage lang eine typische Fibroblastenmorphologie auf Kultur. Interessanterweise verhalten sie sich in einem Adipogenese-Assay anders.
Nach 14 Tagen kulturbilden sich FAP-positive CD90-negative nicht in Adipozyten, während FAP-positive CD90-positive und FAP-negative CD90-positive cd90-positive leicht Adipogenese erleiden. Die Profilerstellung der Genexpression zeigt, dass FAP-positive CD90-negative Zellen hohe Konzentrationen von Markern ausdrücken, die häufig papillaren Fibroblasten wie CD26, NTN und PDPN zugeschrieben werden, während CD90-positive Zellen die bekannten Retikulivmarker wie CD36, glatter Muskelakt in hohem Niveau und PPAR-Gamma ausdrücken. Wir schlussfolgern, dass FAP-positive CD90-negative Zellen zu den Papillen- und CD90-positiven Zellen zur Netzlinie gehören.
Die Verdauung funktioniert am besten, wenn die dermalen Stücke gründlich gehackt und in einer ausreichenden Menge an Verdauungsmedium inkubiert werden. Dermal-Fibroblasten-Untermengen sind funktional vielfältig. Die Erforschung ihrer Funktion im Zusammenhang mit der Pathogenese von Krankheiten wird den Weg für neue diagnostische und therapeutische Interventionen ebnen.
