Dieses Protokoll ermöglicht es uns, sowohl stille als auch verletzungsinduzierte aktivierte Fibroblastenpopulationen mit signifikanter Reinheit zu isolieren. Der Hauptvorteil dieser Technik ist ihre Flexibilität für Improvisation. Für Strömungen sowie eine perlenbasierte Isolierung kann man Antikörper gegen kontaminierende Zellen integrieren, um sie aus den isolierten Zielzellen auszuschließen.
Diese Technik wird in erster Linie für die Herz-Fibroblasten-Isolierung verwendet. Jedoch, Es kann verwendet werden, um Fibroblasten aus anderen Geweben zu isolieren. Demonstriert wird dieses Verfahren von Meiling Melzer, einem Praktikanten, und David Beier, einem wissenschaftlichen Mitarbeiter aus meinem Labor.
Um eine Sechs-Brunnen-Platte für die Lagerung von sechs Herzen während der Sezieren vorzubereiten, geben Sie zwei Milliliter kalten KHB in jeden Brunnen, und legen Sie die Platte auf Eis. Sprühen Sie den Körper mit 70% Ethanol. Richten Sie es so aus, dass die ventrale Seite dem Experimentator zugewandt ist.
Pindienen Sie die Anhänge an, um Interferenzen zu vermeiden. Ohne die Leber zu durchbohren, die Bauchhaut und den Muskel aufschneiden. Schneiden Sie vertikal in Richtung des Brustbeins, vorsichtig öffnen Sie den Thorax, ohne das Herz zu durchstechen.
Als nächstes, weiter durch den Brustkorb schneiden, um das Herz zu entblößen. Heben Sie das Herz mit Zangen sanft aus der Brust und schneiden Sie alle Lungen oder überschüssiges Gewebe ab, das an der Außenseite des Herzens befestigt ist. Trennen Sie den linken Ventrikel.
Legen Sie den Ventrikel für jede Sezierstelle in einen separaten Brunnen der Sechs-Brunnen-Platte. Verwenden Sie zunächst Zangen, um die Herzkammer in KHB wiederholt zu quetschen und zu erregen, um überschüssiges Blut zu entfernen. Den Ventrikel auf eine saubere, sterile, 10 Zentimeter quadratische Platte übertragen.
Als nächstes, mit einer einschneidigen Klinge, schnell zerkleinern sie den Ventrikel in kleine Stücke. Fügen Sie einen Milliliter Kollagenase-Verdauungscocktail hinzu und weiter hacken. Wenn die Stücke klein genug sind, um sie mit einer Ein-Milliliter-Mikropipette zu übertragen, übertragen Sie sie in ein 50-Milliliter-Konikonrohr.
Waschen Sie den Teller zweimal mit zwei Milliliter Nader Cocktail, und übertragen Sie die Wäsche auf die Röhre. Inkubieren Sie das Rohr für 30 Minuten, und suspendieren Sie die Zellen, wie im Manuskript beschrieben, mit einer Fünf-Milliliter-Pipette. Nach der ersten Resuspension die Zellen für 15 Minuten inkubieren und mit einer 10-Milliliter-Pipette erneut suspendieren.
Legen Sie dann ein 40-Mikrometer-Zellsieb auf ein neues, 50-Milliliter-Konikonrohr und grundieren Sie das Sieb, indem Sie es mit ein bis zwei MilliliterkhB benetzen. Fügen Sie 25 Milliliter KHB in die Verdauungssuspension und resuspendieren. Filtern Sie die Aufhängung durch das Sieb und ersetzen Sie das Sieb nach Bedarf.
Zentrifugieren Sie das Filtrat bei 400 mal g und vier Grad Celsius für 10 Minuten. Entfernen Sie den Überstand, und setzen Sie das Pellet im 1x RBC-Lysepuffer mit fünf MilliliterPuffer pro Herz wieder auf. Nach dem Inkubieren der Suspension für zwei Minuten bei Raumtemperatur zentrieren Sie die Suspension bei 400 mal g für 10 Minuten bei Raumtemperatur.
Entfernen Sie den Überstand, und setzen Sie das Pellet dann in einem Milliliter KHB wieder aus. Fügen Sie dann neun Milliliter KHB in die Suspension. Filtern Sie die Suspension durch ein grundiertes 40-Mikrometer-Zellsieb in ein neues, 50-Milliliter-Konusrohr.
Zentrifugieren Sie das konische Rohr bei 400 mal g für 10 Minuten bei Raumtemperatur. Schließlich entfernen Sie den Überstand, und setzen Sie das Pellet in einem Milliliter Fibroblastenmedien oder PBS wieder aus. Nachdem die Zellnummer bestimmt wurde, können Fibroblasten mit drei verschiedenen im Manuskript beschriebenen Methoden aus der Suspension isoliert werden.
Um die Isolierung durch Differentialbeschichtung zu beginnen, bereiten Sie eine Sechs-Well-Platte vor, indem Sie jedem Brunnen zwei Milliliter Fibroblastenmedien hinzufügen. Wirbeln Sie die Platte, um die Brunnenböden zu bedecken. Wenn die Herzzellen der Maus in PBS suspendiert sind, zentrifugieren und setzen Sie sie in einem Milliliter Fibroblastenmedien pro Herz wieder auf.
Fügen Sie jedem Brunnen einen Milliliter Zellsuspension, das Äquivalent eines Herzens, hinzu. Wirbeln Sie die Platte, um Zellen gleichmäßig zu verteilen. Fügen Sie zusätzliche ein bis zwei Milliliter Fibroblastenmedien pro Brunnen für ein Gesamtvolumen von bis zu vier Milliliter pro Brunnen hinzu.
Vier Stunden lang bei 37 Grad Celsius inkubieren. Da die Fibroblasten selektiv an den Brunnen haften, können sie durch Entfernen und Entsorgen der Medien isoliert werden. Waschen Sie die verbleibenden angeschlossenen Zellen mit zwei MilliliterPBS, und fügen Sie dann zwei bis vier Milliliter sterile Fibroblastenmedien pro Brunnen hinzu.
Inkubieren Sie bei 37 Grad bis zum Einfließen, die Medien alle zwei bis vier Tage wechseln. Um mit der magnetischen Etikettierung und Trennung von CD45-positiven hämatopoetischen Zellen zu beginnen, zentrifugieren Sie fünf Minuten lang eine Suspension von Mausherzzellen bei 500 mal g. Entfernen Sie den Überstand, und setzen Sie das Zellpellet in einem Milliliter Ausgleichspuffer wieder auf.
Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer. Nachdem Sie die Zellen wieder zentrifugiert haben, setzen Sie das Zellpellet im Gleichgewichtspuffer wieder aus. CD45-positive Magnetperlen hinzufügen und gut mischen.
Mindestens 15 Minuten bei vier Grad Celsius inkubieren. Waschen Sie die Zellen, indem Sie Gleichgewichtspuffer und Zentrifugieren bei 500 mal g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius hinzufügen. Entfernen Sie den Überstand, und zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer.
Setzen Sie das Pellet im Ausgleichspuffer wieder aus. Passieren Sie die Suspension durch einen 40-Mikrometer-Filter, um zu verhindern, dass Zellaggregationen die Trennsäule verstopfen. Legen Sie als Nächstes eine Trennsäule in das Magnetfeld eines geeigneten Separators, und gleichnken Sie die Säule mit mindestens drei MilliliterPBS.
Gießen Sie die Zellsuspension durch die Säule und sammeln Sie den Durchfluss, der die nicht beschrifteten Zellen enthält, in einem 15-Milliliter-Konikonröhre. Waschen Sie die Säule dreimal mit drei Millilitern Ausgleichspuffer, und kombinieren Sie die Wäsche mit dem Durchfluss. Entfernen Sie die Spalte aus dem Trennzeichen, und platzieren Sie die Spalte auf einem 15-Milliliter-Konikonrohr.
Um die beschrifteten CD45-positiven Zellen zu löschen, pipette fünf Milliliter Äquilibrationspuffer in die Spalte, und tauchen Sie die Spalte fest. Zentrifugieren Sie das Rohr des Eluenten und das Rohr des Durchflusses bei 500 mal g. Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer.
Um die Isolierung abzuschließen, folgen Sie den Protokollen im Manuskript für die CD31-positiven Endothelzellen und die MEFSK4-positiven Fibroblasten, die dem Protokoll für die CD45-positiven Zellen ähneln. Die fluoreszeszaktivierte Zellsortierung wurde an einzelzellen durchgeführt, die nach einem Myokardinfarkt aus Alpha-SMA-GFP-Mausherzen isoliert wurden. Ein repräsentatives Gating-Schema zeigt GFP-positive Zellen, die CD31, CD45 oder AN2 koexieren.
In den verletzten Mausherzen exprimierte ein kleiner Prozentsatz der Endothelzellen und hämatopoetischen Zellen GFP. GFP-positive/CD31-negative/CD45-negative Zellen drückten jedoch keinen Pericytenmarker aus. GFP-positive Zellen exprimiert alpha-SMA, Kollagen ein Alpha ein, Periostin, und Vimentin.
Unverletzte Fibroblasten, die durch selektive Adhäsion isoliert wurden, exprimiert enden Vimentin, zeigten aber keine Expression von Alpha-SMA, Periostin oder Kollagen ein Alpha- Sowohl unverletzte als auch aktivierte Fibroblasten exprimiert das MEFSK4-Antigen. Sowohl unverletzte Fibroblasten, isoliert durch selektive Adhäsion, als auch Myofibroblasten, isoliert und sortiert von Alpha-SMA-GFP-Mäusen, zeigten eine Fähigkeit, kollagen zu veranern.
Es ist wichtig, das Gewebe vor der Inkubation gründlich zu zerkleinern. Vor der Perlentrennung ist es wichtig, die Suspension durch einen 40-Mikrometer-Filter zu leiten, um Zellaggregationen zu verhindern. Die mit dieser Methode gereinigten Zellen könnten mit magnetischen Perlen, die mit pericytspezifischen Antikörpern verbunden sind, weiter gereinigt werden, um ein hohes Reinheitsniveau zu gewährleisten.
Mit der Verfügbarkeit neuer perlenkonjugierter Antikörper sowie transgener Mäuse kann man diese Techniken nutzen, um unterschiedliche Zellpopulationen zu isolieren und zu untersuchen, nicht nur Fibroblasten.
