Unser Protokoll bietet einen einfachen und schnellen Ansatz für die primäre Fibroblastenisolierung mit einem klaren Fokus auf die Vermeidung von Bakterienkontamination, was ein riesiges Problem sein kann. Vor allem für Anfänger. Der Hauptvorteil unserer Technik ist ihre Einfachheit.
Da es keine umfangreichen manuellen Fähigkeiten oder Erfahrungen erfordert und es kann leicht von jedem innerhalb einer kurzen Ausbildungszeit erlernt werden. Präsentiert wird die Technik von Manja Newe, einer Technikerin aus dem Out-Labor. Vor Beginn der Zerlegung, ziehen Sie zwei Paar Einweghandschuhe, eine über dem anderen.
Und fixieren Sie die Maus auf einem Polystyrol-Pad. Desinfizieren Sie das Fell mit 70% Ethanol, um sicherzustellen, dass das Tier eingeweicht ist. Und verwenden Sie Ethanol sterilisierte chirurgische Zangen und atraumatische Schere, um die Haut direkt über dem Urogenitaltrakt zu bechern.
Schneiden Sie drei bis vier Zentimeter entlang der Mittellinie vom ersten Schnitt bis zum Hals, Hinzufügen von Reliefschnitten an den Gliedmaßen. Und fixieren Sie die Haut an das Pad, um einen optimalen Zugang zur Muskulatur zu erreichen, die die Bauchhöhle bedeckt. Dann desinfizieren Sie die Bauchmuskulatur zweimal mit frischem 70%Ethanol.
Wenn das Ethanol getrocknet ist, entfernen Sie das erste Paar Handschuhe. Und verwenden Sie einen neuen sterilen Satz von Zangen und Schere, um die Muskelschicht zu schneiden, um die Bauchhöhle und den Thorax zu öffnen. Um die von Interesse interessierten Organe zu entfernen, greifen Sie vorsichtig jedes Organ mit den chirurgischen Zangen, ohne das Gewebe zu durchbohren.
Und verwenden Sie die Schere, um die zuliefernden Blutgefäße in der Nähe des Einstiegspunkts des Organs sorgfältig zu schneiden. Legen Sie jedes Organ in eine Röhre aus sterilem, kaltem PBS und schließen Sie das Rohr fest. Platzieren Sie jede Röhre auf nassem Eis, während die Organe gesammelt werden.
Wenn alle Organe geerntet sind, sprühen Sie die Rohre mit 70% Ethanol, bevor Sie sie in eine sterile Zellkulturhaube legen. Mit einem frischen Paar Handschuhen, verwenden Sie sterile Zange, um jedes Organ auf die Hälfte einer sterilen sechs Zentimeter Petrischale zu übertragen. Und waschen Sie die Organe kurz mit frischem PBS, um überschüssiges Blut zu entfernen.
Übertragen Sie die vorspülenden Organe auf die zweite Hälfte jeder Petrischale und entfernen Sie die überschüssige PBS. Mit zwei sterilen Skalpellen zerkleinern Sie die Organe in ein bis zwei Millimeter Fragmente. Und verwenden Sie einen sterilen Spachtel, um die Gewebestücke in neue, individuelle, sterile, 15 Milliliter-Röhren zu übertragen.
Fügen Sie zwei Milliliter 0,25%Trypsin Lösung zu jeder Röhre. Und legen Sie die Röhren fünf Minuten lang in einen Zellkultur-Inkubator bei 37 Grad Celsius. Am Ende der Inkubation wirbeln die Röhren mit etwa 1400 Umdrehungen pro Minute für zehn Sekunden.
Und die Trypsin-Reaktion mit vier Millilitern eines geeigneten Kulturmediums, ergänzt durch fetales Kalbsserum pro Tube, aufhalten. Als Nächstes fügen Sie jedem Rohr das entsprechende Volumen der Kollagenase-Mischlösung hinzu. Und legen Sie die Rohre in einem 37 Grad Celsius Ultraschall-Wasserbad für 10 Minuten.
Am Ende der Beschallung, sanft wirbeln die Rohre für 10 Sekunden. Bevor Sie die Schläuche für 10 Minuten wieder in das Ultraschall-Wasserbad legen. Am Ende der zweiten Beschallung wirbeln die Röhren für 10 weitere Sekunden.
Und desinfizieren Sie die Rohre mit 70% Ethanol. Filtern Sie die Zellsuspensionen in der Zellkulturhaube durch einzelne 40-Mikrometer-Siebe in ein neues, steriles 15-Milliliter-Rohr. Und sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation.
Die Pellets in einem Milliliter frischem Medium pro Tube wieder aufhängen. Und sehen Sie die Zellen in geeigneten Zellkulturgefäßen bei entsprechender Beschichtungsdichte. Platzieren Sie dann die Zellen über Nacht im Zellkultur-Inkubator.
Am nächsten Morgen waschen Sie jede Kultur dreimal mit PBS, bevor Sie frisches Medium hinzufügen und die Zellen in den Inkubator zurückbringen. Mit diesem Protokoll können lebensfähige Fibroblasten für den Einsatz in nachfolgenden Experimenten gewonnen werden. Wie aminofluoreszierende Färbung oder Proliferationsexperimente.
Erwachsene Fibroblasten sind flache, spindelförmige Zellen mit mehreren zellulären Prozessen, die typischerweise in Monolayern wachsen. Deutliche morphologische Unterschiede in Fibroblastenpopulationen aus verschiedenen Organen können jedoch beobachtet werden. Zum Beispiel sind renale Fibroblasten kleiner und wachsen mit höheren Dichten als Herz-, Lungen- oder Leberfibroblasten.
Die isolierten Fibroblasten weisen hohe Proliferationsraten auf und erreichen nach etwa sechs Tagen einen optischen Zusammenfluss von mehr als 90 %. Hier kann ein differenzierter Myofibroblast mit ausgeprägten Alpha-Glattmuskel-Aktin-Mikrofilamenten beobachtet werden. Diese Zellen sind in Hülle und Fülle in den Herz-, Nieren-, Leber- und Lungenzellkulturen zu finden.
Während nur etwa 20 bis 30 Prozent der isolierten und kultivierten Zellen geordnete, angeordnete, alpha glatte Muskelaktin Mikrofilamente ausdrücken, sind praktisch alle Zellen nach sieben Tagen in der Kultur positiv für Vimentin und Discoidin Domain Receptor 2. Das Wichtigste, was Sie sich merken sollten, ist, die richtige Technik während des gesamten Verfahrens zu verwenden, da eine Kontamination von Bakterien vermieden werden muss. Nach der primären Fibroblastenisolation können die Zellen für alle Arten von Psychiatrieexperimenten und Charakterisierungen verwendet werden.
Wie z. B. proliferationsfähigkeit der immunzytären Chemie oder Wundheilungsessays oder molekularbiologische Bewertungen.
