Diese Arbeit wurde unterstützt durch Zuschüsse aus dem Nationalen Institut für Ernährung und Landwirtschaft, US Department of Agriculture, preis ILLU-698-909 (ZME) und Pfizer, Inc (ZME) unterstützt. Sein Inhalt ist allein in der Verantwortung der Autoren und spiegeln nicht zwangsläufig die offizielle Einstellung der US-Landwirtschaftsministerium vertreten.

1. Herstellung von RNA-Proben Seq <ol><li> Zellkultur und Behandlung <ol><li> Kultur die MCF7 - Zellen in einer verbesserten MEM (IMEM) und Phenol-rot - Medium mit 10% Hitze inaktiv FBS, 1% Penicillin / Streptomycin bei 37 ° C in befeuchteten 5% CO 2 -Atmosphäre. Hinweis: Der gleiche Zelllinie und Zellkulturbedingung wird während der gesamten Studie verwendet. </li><li> Seed 100.000 MCF7-Zellen pro Well in 6-Well-Platten. Haben Sie für jede Behandlung Triplikaten. Am Tag 3 , das Medium zu entfernen und 2 ml frisches Medium hinzu , mit oder ohne 10 -8 M E2 zu jeder Vertiefung. Inkubieren der Platten für 24 h in 37 ° C in befeuchteter 5% CO 2 -Atmosphäre. </li><li> Um die Zellen zu ernten, 1 ml RNA-Isolierung Reagenz (Säure Guanidiniumthiocyanat-Phenol-Chloroform) in jede Vertiefung und Inkubation für 5 min bei Raumtemperatur (RT). Dann sammeln Sie die Zelle Lysatreagens durch Pipettieren und Ablagerung in 1,5-ml-Röhrchen </li></ol></li><li> RNA-Isolierung <ol><li> In 200 ul chloroform in 1 ml Zelllysat Reagenz (1.1.3) und Vortex für 10 Sekunden. Inkubieren bei Raumtemperatur für 5 min. Zentrifuge Proben bei 16.000 xg für 15 min bei 4 ° C. Nach der Zentrifugation übertragen die wßrige Phase (oben) in ein neues Röhrchen, ohne die anderen Phasen zu stören. </li><li> Hinzufügen, 500 &amp; mgr; l 100% Isopropanol in ein neues Röhrchen mit der übertragenen wässrigen Phase und durch Invertieren mischen. Inkubieren bei -20 ° C über Nacht. Zentrifugiere die Proben bei 16.000 xg für 10 min bei 4 ° C. Beobachten ein Pellet am Boden des Röhrchens. Überstand verwerfen und waschen Sie das Pellet mit 750 &amp; mgr; l RNase-freiem 70% Ethanol durch kurze Wirbel. </li><li> Zentrifuge Proben bei 6.000 xg für 5 min bei 4 ° C. Entfernen des Überstandes und Zentrifugieren der Probe bei 16.000 × g für 1 min bei 4 ° C die gesamte verbleibende Ethanol zu sammeln. Entfernen Sie die verbleibende Ethanol mit einer Pipette mit einem Gel-Ladespitze und legen Sie die Rohre nach oben Seite nach unten an der Luft trocknen für 10 min. Man löst das Pellet in 20-50 ul DEPC behandeltem Wasser DEPENding von der Größe der Pellets. </li></ol></li><li> Reinige die RNA unter Verwendung von RNA clean-up - Kit nach dem Protokoll 4. Messen Sie die RNA - Konzentration einen Fluorometrie basierten Assay - Kit nach dem Protokoll 9. HINWEIS: OD bei 260 nm wird getroffen, um die RNA-Konzentration und das Verhältnis von OD bei 260 nm und 280 nm werden verwendet, um zu bestimmen, um die Reinheit der Probe zu bestimmen. Es wird empfohlen, die RNA-Qualitätsprüfung Bio-Analysator Assay. </li><li> Nehmen Sie etwa 0,5 bis 1 ug gereinigte RNA für die Sequenzierung. HINWEIS: Biotech - Center bereitet die Sequenzierungsbibliotheken und führt Paired-End - Sequenzierung lesen Methoden bisher 2 detailliert mit. </li></ol> 2. Herstellung von ChIP-Seq Probe <ol><li> Zellkultur und Behandlung <ol><li> Seed 500.000 MCF7 Zellen pro 10 cm Platte in einem Wachstumsmedium. HINWEIS: Bei allen Pull-Down-16 Platten verwendet wurden. Am Tag 3 , das Medium zu entfernen und 5 ml frisches Medium hinzu , mit oder ohne 10 -8 M E2 zu jeTeller. Behandlung der Zellen für 45 min (37 ° C in befeuchteter 5% CO 2 -Atmosphäre). </li></ol></li><li> Cross und Zellernte <ol><li> In 250 ul 37% Formaldehyd in 5 ml Medium Chromatin zu vernetzen, Inkubation für 15 Minuten bei Raumtemperatur. Stoppen Sie die Vernetzung von Zellen mit 5 ml eiskaltem 1x MEM Waschen. </li><li> Ernte der Zellen in 250 ul Zelllyse-Puffer (10 mM EDTA, 50 mM Tri-HCl, 1% SDS, 0,5% N, N-dimethyldodecan-1-Aminoxid) pro Platte. </li></ol></li><li> Fragmentation von Chromatin <ol><li> Beschallen die Zellen für 30 sec x 8 bei amp von 30 bis erforderlichen Chromatin Größen erreichen. Kühlen Sie jede Probe auf Eis nach einer Beschallung von 30 sec. </li><li> Zentrifuge bei 16 000 xg für 10 min bei 4 ° C, und den Überstand vorsichtig pipettieren, ohne an der Unterseite des Pellets zu stören. </li><li> Nehmen Sie ein 5 - ul - Aliquot des Überstandes, und überprüfen Sie die DNA - Größe durch Elektrophorese durch 1,5% Agarose - Gel , wie zuvor 10 beschrieben. Die ideale Größevon DNA sollte zwischen 200-500 bp sein. </li></ol></li><li> Chromatin Immunopräzipitation <ol><li> Sparen Sie 25 ul Zelllysat als Eingabe. In einem 50-ml-Röhrchen, mischen 4 ml Zelllysat mit 20 ml IP-Puffer (2 mM EDTA, 100 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl und 0,5% Triton X), ERa-Antikörper (500 &amp; mgr; l F10 und 500 &amp; mgr; l HC- 20), und 500 &amp; mgr; l ProtA und protg Proteinbeschichtung magnetischen Kügelchen. Inkubieren der Mischung durch Rotation bei 4 ° C über Nacht, die Bildung von Chromatin- Antikörper-Komplexes zu ermöglichen. </li></ol></li><li> Wäscht und Reverse-Vernetzung <ol><li> Verwenden Sie einen magnetischen stehen die magnetischen Kügelchen auf der magnetisierten Seite zu sammeln, um die Waschpuffer zu entfernen. </li><li> Waschen der magnetischen Kügelchen in 25 ml Waschpuffer I (2 mM EDTA, 20 mM Tris HCl, 01% SDS, 1% Triton X, und 150 mM NaCl). Um gründlich die magnetischen Kügelchen waschen, ohne DNA-Protein-Komplexe zu stören, werden 25 ml Waschpuffer langsam auf das Rohr an der Seite dann die Rohre umkehren, bis alle magnetischen Kügelchen gemischt gut wi sindth die Waschpuffer ohne als Pellet erscheinen. Als Alternative verwenden Sie den Rotator das Rohr zu invertieren. Sie nicht die Proben verwirbeln. Waschen Sie die magnetischen Kügelchen die gleiche Methode in den folgenden Schritten. </li><li> Waschen der magnetischen Kügelchen in 25 ml Waschpuffer II (2 mM EDTA, 20 mM Tris HCl, 01% SDS, 1% Triton X, und 500 mM NaCl). </li><li> Waschen der magnetischen Kügelchen in 25 ml Waschpuffer III (1,6 mM EDTA, 10 mM Tris HCl, 1% NP-40, 1% Dexycholate und 250 mM LiCl). </li><li> Waschen der magnetischen Kügelchen in 25 ml 1x TE-Puffer (1 mM EDTA und 10 mM Tris HCl) zweimal. </li><li> Eluieren der DNA in 500 &amp; mgr; l Elutionspuffer (1% SDS und 10 mM NaHCO 3) und dann zuzuteilen , die 500 &amp; mgr; l DNA - Elution in 4 Röhrchen. Für die DNA von den Eingängen, DNA in 125 &amp; mgr; l Elutionspuffer eluiert. </li><li> Die Röhrchen bei 65 ° C über Nacht auf einem Heizblock. Decken Sie die Rohre auf dem Heizblock mit Aluminiumfolie die Wärme auch über alle Rohre zu halten. Legen Sie ein Gewicht auf den Rohren, damit sie nicht zu öffnen. &lt;/ Li&gt; </ol></li><li> DNA-Isolierung <ol><li> Kühlen Sie die Röhrchen bei RT für 5 min. Isolieren von DNA aus den Pull-Down-Proben unter Verwendung von ChIP DNA-Extraktions-Kit. Folgen Sie den Anweisungen des Herstellers. <ol><li> Erwärmen Sie den Elutionspuffer bei 65 ° C. Hinzufügen, 625 &amp; mgr; l zu jedem Röhrchen Bindungspuffer. Wenn der Niederschlag bildet, fügen Sie eine weitere 250 &amp; mgr; l Bindungspuffer, bis die Lösung klar ist. </li><li> Legen Sie die Probe auf die Säule und Zentrifuge bei 16.000 × g für 30 Sekunden. Waschen Sie die Probe mit 250 ul Waschpuffer. Denken Sie daran, Ethanol zu dem Waschpuffer hinzuzufügen, wenn es erstmals zu verwenden. Wiederholen Sie die Wäsche. </li><li> Eluieren der DNA in 15 &amp; mgr; l Elutionspuffer. Kombinieren Sie die DNA von derselben nach unten ziehen von 4 Röhrchen etwa 55 &amp; mgr; l DNA zu erreichen. </li></ol></li><li> Isolieren Sie die Input-DNA eine DNA Purification Kit. <ol><li> Erwärmen Sie den Elutionspuffer bei 65 ° C. In 625 &amp; mgr; l Bindungspuffer in jedes Röhrchen und Inkubation für 10 min. Legen Sie die Probe auf die Säule in einem 2 ml collectiauf dem Rohr. </li><li> Waschen Sie die Probe mit 750 &amp; mgr; l Waschpuffer, Zentrifuge bei 16.000 xg für 1 min. Wiederholen Zentrifugieren alle verbleibenden Puffer zu entfernen. Eluieren der DNA in 30 ul EB. </li></ol></li><li> Messen Sie die DNA - Konzentration unter Verwendung eines kommerziellen Fluorochrom Assay mit Modification 11. <ol><li> Verdünnen Sie den 20x TE-Puffer in 1x TE als Assay-Puffer zur Verdünnung der Reagenzien und DNA-Proben. Nehmen Sie 5 ul isolierte DNA und verdünnen Sie es in 50 &amp; mgr; l in 1x TE. </li><li> Von 2 ug / ml DNA-Stammlösung mit einer DNA-Standard von leer auf 1, 10, 100, 1000 &amp; mgr; g / ml bis hin zu machen. In einer 96-Well-Platte, weisen 25 ul jeder Standard sowie DNA-Verdünnung in zweifacher Ausfertigung. (Dreifacher Ausführung für Standard empfohlen.) </li><li> Bereiten Sie die Arbeits Reagenz durch eine 200-fache Verdünnung von dsDNA Reagenz in 1x TE-Puffer in Kunststoffrohr zu machen. Decken Sie die Arbeits Reagenzlösung mit Aluminiumfolie zu Licht zu vermeiden. In 200 ul Arbeits Reagenz in jeder Probe. Imcubate für 5 min bei Raumtemperatur. Die Platte mit Aluminiumfolie Licht vermeiden. </li><li> Messen Sie die Fluoreszenz der Proben eines Fluoreszenzplattenleser (Anregung bei 480 nm, Emission 520 nm) verwendet wird. Generieren Sie die DNA-Standardkurve der Fluoreszenz im Vergleich zu DNA-Konzentration. Bestimmung der Konzentrationen der Proben auf der erzeugten DNA-Standardkurve berechnet. </li></ol></li></ol></li><li> Überprüfung von ChIP Experiment Mit qPCR <ol><li> Nehmen Sie 2 ul isolierte DNA und in 20 &amp; mgr; l in Wasser verdünnt. Stellen Sie die qPCR Reaktion in dreifacher Ausfertigung bis 2,5 &amp; mgr; l DNA-Verdünnung Mischen, 5 ul Green I PCR Master-Mix, 1 ul Primer und 1,5 ul Nuclease freies Wasser. </li><li> Führen Sie die qPCR mit dem Fast Real-Time-PCR-System mit dem folgenden Programm: Schritt 1: 95 ° C für 60 sec, Schritt 2: 95 ° C für 10 sec, 60 ° C für 60 Sekunden, wiederholen Sie Schritt 2 39 mal. </li></ol></li><li> Senden 10 ng DNA-Probe zu Biotech Zentrum für die Sequenzierung. HINWEIS: Die Biotech Zentrum bereitet die ChIP DNA in Bibliotheken nach Anweisung und führt Einzel lesen Sequenzierungsverfahren detailliert zuvor 2. </li></ol> 3. Metabolomics Assay Probenvorbereitung <ol><li> Zellkultur und Behandlung <ol><li> Seed 400.000 MCF7 Zellen pro 10 cm Platte in einem Wachstumsmedium. Für jede Behandlung vorbereiten drei Proben. Verwenden zwei Platten in jeder Probe genug Zellen zum Nachweis zu erhalten. Am Tag 3 , das Medium zu entfernen und 5 ml frisches Medium hinzu , mit oder ohne 10 -8 M E2 zu den Zellen. Behandlung der Zellen für 24 h (37 ° C in befeuchteter 5% CO 2 -Atmosphäre). </li></ol></li><li> Beispielsammlung <ol><li> 5 ml eiskaltem 1x PBS an die Platte absaugen PBS nachdem die Platte mehrmals kurz zu kippen. Wiederholen Sie zweimal, und entfernen Sie so viel PBS wie möglich nach der letzten Wäsche. </li><li> In 750 ul vorge kaltem Aceton zu jeder Platte und die Zellen kratzen. Kombinieren der Zellen in Aceton aus zwei Platten inin ein 2-ml-Röhrchen auf Eis. </li><li> Zellzahl für die Normalisierung <ol><li> Für jede Behandlung, verwenden Sie zwei zusätzliche Platten für die Zell Quantifizierung. DE-befestigen Sie die Zellen von der Platte, 2 ml HE - Puffer (1x HBSS, 10 mM HEPES, 0,075% NaHCO 3 und 1 mM EDTA) in jeder Platte und Inkubation für 5 min. </li><li> Sammeln und gut mischen die Zellen durch Zellen in der HE-Puffer pipettiert. Verwenden Sie insgesamt 20 ul Zell-Lösung die Zellzahl unter Verwendung einer Zählkammer zu zählen. </li></ol></li></ol></li><li> Lagern Sie die Proben bei -80 ° C vor zum Metabolomics Zentrum schicken zu identifizieren und zu quantifizieren, die Metaboliten Gaschromatographie-Massenspektrometrie (GC-MS) Analyse. </li></ol> 4. Integrative Analyse <ol><li> RNA-Seq Datenanalyse: <ol><li> Führen Sie Qualitätsprüfung von fastq Dateien mit FastQC: Lesen QC (http://galaxy.illinois.edu) <ol><li> Wählen Sie FastQC: Lesen unter dem Werkzeug von NGS: QC und Manipulation. Laden Sie die Rohdatendatei von der aktuellen history. HINWEIS: Es wird empfohlen, einen Titel zu geben, für die Ausgabedatei Sie daran zu erinnern, was der Job für war, da es möglicherweise mehrere Ausgänge sein. </li></ol></li><li> Ausführen und die Ausgabedatei unter der Geschichte erscheinen. Wiederholen Sie den Vorgang für jede Sequenz-Datei. Trim-Adapter mit Clip unter NGS: FastX Toolkit. </li><li> Richten Sie liest hg19 Tophat2 Verwendung mit RefSeq Genom Referenz Anmerkung 12 (Standardwerte). <ol><li> Wählen Sie Tophat2 unter Werkzeug von NGS: RNA-Analyse. Geben Sie die Bibliothek gepaart Typ (Single-End vs Paired-End). </li><li> Laden Sie die Eingabe fastq Datei aus der aktuellen Geschichte. Wählen Sie das Referenzgenom. Wählen Sie Standardeinstellungen. Oder Sie verwenden die Vollparameterliste zu ändern. </li><li> Führen und es wird zwei Ausgabedateien erzeugen: Die eine ist UCSC Planum von Kreuzungen; eine andere ist eine Liste von Leseausrichtungen in BAM-Format. </li></ol></li><li> Laden Sie BAM-Dateien Sequenzierungsdaten-Analyse-Tool. Berechnen Expressionswerte mit Quantifizierung Werkzeug. </li><li> Identifizieren unterschiedlich up-regulierte Gene mithilfe von Expression Analysis Tool mit Standardwerten und mehrfache Änderung&gt; 2 und p-Wert &lt;0,05. Ebenso identifizieren differentiell nach unten reguliert Gene Expression Analysis Tool mit Standardwerten und mehrfache Änderung &lt;0,5 und p-Wert &lt;0,05. </li></ol></li><li> ChIP-Seq Datenanalyse: <ol><li> Richten Sie fastq Liest zu hg19 mit Bowtie2 13 (Standardwerte) in der Galaxie. <ol><li> Wählen Sie Bowtie2 unter dem Werkzeug von NSC: Mapping. Überprüfen Sie, ob die Bibliothek Mate-paarigen (Single-End vs Paired-End). Laden Sie die fastq Datei aus der aktuellen Geschichte. </li><li> Wählen Sie das Referenzgenom. Verwenden Sie die Standard-Parametereinstellungen. Ausführen und es wird die Ausgabedatei erzeugen mit zugeordneten Sequenz als BAM-Datei liest. Wiederholen Sie den Vorgang für jede Folge-Datei. </li></ol></li><li> Identifizieren Peaks unter Verwendung von MACS 14 ein p-Wert Cutoff von 6.0e-7 und FDR von 0,01, wie zuvor 2 beschrieben. </li></ol&gt; </li><li> Metabolomics Datenanalyse: <ol><li> Konvertieren chemischen Namen von Metaboliten KEGG_IDs. </li><li> Identifizieren unterschiedlich reguliert Metaboliten von Ebenen erfasst Fahrzeug Vergleich vs. E2 behandelten Proben (eine 2 - fach cut-off in dieser Studie verwendet wurde). </li></ol></li><li> Integrative Analyse: <ol><li> Identifizieren Gene, die ERa-Bindungsstellen mit Sequenzierungsdaten-Analyse-Tool haben. Übersetzen Regions Gene Funktion unter Verwendung von 20 kb als Abstands cut-off. </li><li> Identifizieren differentiell Up- und Down-regulierte Gene von RNA-Seq - Daten - Analyse unter Verwendung fache Änderung&gt; 2 und mehrfache Änderung &lt;0,5, jeweils mit dem p-Wert &lt;0,05 als abgeschnitten. Vergleichen Sie die Liste der ERa-Bindungsstelle enthält Gene mit Venn-Diagramm Vergleich. </li><li> Mit Metscape 15 Modul von Cytoscape Verwenden Sie diese Liste E2 moduliert Stoffwechselwege zu identifizieren. <ol><li> Metscape Modul von Anwendungen Durch die Auswahl, wählen Sie Netzwerk aufbauen und dann bas-Weged Option. </li><li> Wählen Sie den Organismus (Mensch). Wählen Sie Datendatei von E2 ungeregelte Verbindung Liste (KEGG ID) und E2 hochreguliert Gen-Liste. </li><li> Wählen Sie -Reaktion -Enzym-Gene als Netzwerk-Typ-Verbindung. Wählen Sie Verbindung / Gene wie die Abfrage. </li><li> Bauen Netzwerk. Wiederholen Sie die E2 herunterreguliert Verbindung und Gene verwendet. </li></ol></li></ol></li></ol>

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	<li>Hamilton, K. J., Arao, Y., Korach, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogen+hormone+physiology:+reproductive+findings+from+estrogen+receptor+mutant+mice.">Estrogen hormone physiology: reproductive findings from estrogen receptor mutant mice.</a> Reprod Biol. 14 (1), 3-8 (2014).</li><li>Madak-Erdogan, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+genomics+of+gene+and+metabolic+regulation+by+estrogen+receptors+alpha+and+beta,+and+their+coregulators.">Integrative genomics of gene and metabolic regulation by estrogen receptors alpha and beta, and their coregulators.</a> Mol Syst Biol. 9, 676 (2013).</li><li>Gong, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptomic+analysis+identifies+gene+networks+regulated+by+estrogen+receptor+alpha+(ERalpha)+and+ERbeta+that+control+distinct+effects+of+different+botanical+estrogens.">Transcriptomic analysis identifies gene networks regulated by estrogen receptor alpha (ERalpha) and ERbeta that control distinct effects of different botanical estrogens.</a> Nucl Recept Signal. 12, e001 (2014).</li><li>Bergamaschi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+forkhead+transcription+factor+FOXM1+promotes+endocrine+resistance+and+invasiveness+in+estrogen+receptor-positive+breast+cancer+by+expansion+of+stem-like+cancer+cells.">The forkhead transcription factor FOXM1 promotes endocrine resistance and invasiveness in estrogen receptor-positive breast cancer by expansion of stem-like cancer cells.</a> Breast Cancer Res. 16 (5), 436 (2014).</li><li>Madak-Erdogan, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+and+extranuclear+pathway+inputs+in+the+regulation+of+global+gene+expression+by+estrogen+receptors.">Nuclear and extranuclear pathway inputs in the regulation of global gene expression by estrogen receptors.</a> Mol Endocrinol. 22 (9), 2116-2127 (2008).</li><li>Madak-Erdogan, Z., Lupien, M., Stossi, F., Brown, M., Katzenellenbogen, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+collaboration+of+estrogen+receptor+alpha+and+extracellular+signal-regulated+kinase+2+in+regulating+gene+and+proliferation+programs.">Genomic collaboration of estrogen receptor alpha and extracellular signal-regulated kinase 2 in regulating gene and proliferation programs.</a> Mol Cell Biol. 31, 226-236 (2011).</li><li>Madak-Erdogan, Z., Ventrella, R., Petry, L., Katzenellenbogen, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+roles+for+ERK5+and+cofilin+as+critical+mediators+linking+ERalpha-driven+transcription,+actin+reorganization,+and+invasiveness+in+breast+cancer.">Novel roles for ERK5 and cofilin as critical mediators linking ERalpha-driven transcription, actin reorganization, and invasiveness in breast cancer.</a> Mol Cancer Res. 12 (5), 714-727 (2014).</li><li>Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-Seq:+a+revolutionary+tool+for+transcriptomics.">RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics.</a> Nat Rev Genet. 10 (1), 57-63 (2009).</li><li>Invitrogen. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Quant-iT&#8482; PicoGreen &#174; dsDNA Reagent and Kits. , (2008).</li><li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agarose+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+DNA+fragments.">Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments.</a> J Vis Exp. (62), (2012).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Quant-iT&#8482; Assays for high-throughput quantitation of DNA, RNA, and oligos. , (2006).</li><li>Kim, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TopHat2:+accurate+alignment+of+transcriptomes+in+the+presence+of+insertions,+deletions+and+gene+fusions.">TopHat2: accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions, deletions and gene fusions.</a> Genome Biol. 14 (4), R36 (2013).</li><li>Langdon, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Performance+of+genetic+programming+optimised+Bowtie2+on+genome+comparison+and+analytic+testing+(GCAT)+benchmarks.">Performance of genetic programming optimised Bowtie2 on genome comparison and analytic testing (GCAT) benchmarks.</a> BioData Min. 8, (2015).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Model-based+analysis+of+ChIP-Seq(MACS).">Model-based analysis of ChIP-Seq(MACS).</a> Genome Biol. 9 (9), R137 (2008).</li><li>Gao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metscape:+a+Cytoscape+plug-in+for+visualizing+and+interpreting+metabolomic+data+in+the+context+of+human+metabolic+networks.">Metscape: a Cytoscape plug-in for visualizing and interpreting metabolomic data in the context of human metabolic networks.</a> Bioinformatics. 26, 971-973 (2010).</li><li>Schroeder, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RIN:+an+RNA+integrity+number+for+assigning+integrity+values+to+RNA+measurements.">The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements.</a> BMC Mol Biol. 7 (3), (2006).</li><li>Mokry, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+double+fragmentation+ChIP-seq+provides+nucleotide+resolution+protein-DNA+binding+profiles.">Efficient double fragmentation ChIP-seq provides nucleotide resolution protein-DNA binding profiles.</a> PLoS One. 5 (11), e15092 (2010).</li><li>Park, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChIP-seq:+advantages+and+challenges+of+a+maturing+technology.">ChIP-seq: advantages and challenges of a maturing technology.</a> Nat Rev Genet. 10, 669-680 (2009).</li><li>Landt, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChIP-seq+guidelines+and+practices+of+the+ENCODE+and+modENCODE+consortia.">ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia.</a> Genome Res. 22 (9), 1813-1831 (2012).</li><li>Hah, N., Kraus, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hormone-regulated+transcriptomes:+lessons+learned+from+estrogen+signaling+pathways+in+breast+cancer+cells.">Hormone-regulated transcriptomes: lessons learned from estrogen signaling pathways in breast cancer cells.</a> Mol Cell Endocrinol. 382, 652-664 (2014).</li></ol>

University of Illinois erhielt einen Investigator Initiated Zuschuss von Pfizer Inc. ZME und YCZ erhielt Gehalts Unterstützung von diesen Zuschuss.

In dieser Arbeit haben wir beschrieben, Erzeugungs- und integrative Analyse von RNA-Seq, ChIP-Seq und metabolomics Daten von MCF-7-Zellen, die mit E2 behandelt werden. Wir entwickelten eine Reihe von Protokollen, die effizientesten Methoden und benutzerfreundlichen Soft-Ware zu verwenden strategizing, die biologisch relevante Entdeckung produzieren. Um unser Wissen, unsere ist die erste Studie -omics Daten aus drei verschiedenen Analysen und identifiziert neue Stoffwechselwege, die ERa direkt geregelt in Brustkrebszelle...

Östrogene sind wichtige Regulatoren von vielen physiologischen Prozessen in beiden Frauen und Männern einschließlich der reproduktiven Gewebe, metabolischen Gewebe, Gehirn und Knochen 1. Neben positiven Auswirkungen in diesen Geweben, treiben Östrogene auch Krebserkrankungen, die aus Brust und reproduktive Gewebe entstehen. Östrogene vor allem durch ERs arbeiten zelltypspezifische Effekte zu induzieren. Tief Sequenzierung von Transkripten von ERa geregelt unter Verwendung von RNA-Seq und genomweite ERa DNA-Bindungsstellen-Analyse ChIP-Seq Verwendung erwies sich als nützlich, um zu verstehen, wie ERa in verschiedenen Geweben und Krebsarten arbeitet, die aus ihnen entstehen. Wir und andere haben Profile veröffentlicht Genexpression assoziiert mit verschiedenen Rezeptoren (ER &amp; agr; vs ER &amp; bgr;) 2,3, verschiedene Liganden 3-5 und verschiedene Koregulatoren 2,4,6,7. RNA-Seq ist die wichtigste Methode, um die Transkriptom zu untersuchen, bietet eine höhere Präzision und Effizienz im Vergleich zu Microarray-based Genexpressionsanalyse 8. RNA , die aus Zelllinien 2-4,7, Geweben oder Tumorproben werden sequenziert, abgebildet erhältlich genomischen Baugruppen und unterschiedlich regulierte Gene identifiziert werden. Chromatin Immunopräzipitation (ChIP) verwendet, um den Transkriptionsfaktor und coregulator Chromatin Bindung an bekannten regulatorischen Bindungsstellen zu sezieren. ChIP-Seq (ChIP durch hohe Durchsatzsequenzierung gefolgt) bietet unvoreingenommene Erfassung des globalen Bindungsstellen. Metabolomics ist ein weiterer zunehmend verbreitetes System biologischen Ansatz, der quantitativ Maßnahmen, dynamische multiparametrischer Reaktion lebender Systeme auf verschiedene Reize einschließlich Chemikalien und genetischen Störungen. Durch globale metabolischen Profils durchgeführt wird, kann eine funktionelle Auslesen aus Zellen, Geweben und Blut erhalten werden. Darüber hinaus werden Informationen von Transkriptom Experimente spiegeln nicht immer tatsächlichen Veränderungen in der Höhe von Enzymen, die auf biochemischen Wege beitragen. KombinierteAnalyse von Daten Transkriptom und Metabolom ermöglicht es uns, mit den tatsächlichen Metaboliten Veränderungen Veränderungen in der Genexpression zu identifizieren und zu korrelieren. Die Nutzung der Informationen aus all diesen großen Maßstab Datensätze die mechanistischen Details liefern die Rolle von Transkriptionsfaktoren regulieren komplexer biologischer Systeme, vor allem diejenigen, die beziehen sich auf die menschliche Entwicklung und Krankheiten wie Krebs und Diabetes zu verstehen. Die komplexe Natur des Säugetiergenoms macht es schwierig, zu integrieren und zu interpretieren, in vollem Umfang die von den Transkriptom erhaltenen Daten, cistrome und Metabolom Experimente. Identifizieren funktionelle Bindungsereignisse, die, weil, sobald Bindungsstellen funktionell sind identifiziert Veränderungen in der Expression von Zielgenen ist wichtig, führen würde; anschließenden Analyse, einschließlich Transkriptionsbindungs ​​(TF) Motivanalyse, konnte mit einer höheren Genauigkeit durchgeführt werden. Dies führt zur Identifizierung von biologisch sinnvoll TF Kaskaden und Mechanismen. Auch direkte comparisauf der RNA-Seq und ChIP-Seq Versuche sind nicht immer möglich, da die Daten von jedem Experiment unterschiedlichen Skalen und Geräusche haben, und in einigen Fällen sinnvolle Signale werden von Bevölkerungs Rauschen verdeckt. Wir sind keine Kenntnis von einer Studie, die Informationen aus diesen drei unabhängigen, aber miteinander verbundene Ansätze integriert, um die direkte Stoffwechselregulation durch ERa bei Brustkrebs zu verstehen. Deshalb ist unser übergeordnetes Ziel in dieser Arbeit ist produktive Bindungsereignisse zu Genexpression und Metaboliten Veränderungen zu beziehen. Um dieses Ziel zu erreichen, integriert wir Daten von RNA-Seq, ChIP-Seq und Metabolomik Experimente und identifiziert jene Östrogen ERa Bindungsereignisse induziert, die zu Veränderungen der Genexpression in Stoffwechselwege führen würde. Zum ersten Mal bieten wir einen kompletten Satz von Protokollen (Abbildung 1) zur Erzeugung von ChIP-Seq, RNA-Seq und Metabolomik Profilierung und Durchführung integrative Analyse der Daten neue Gen - Schaltungen aufzudecken Stoffwechsel der Brust RegulierungKrebszelllinien.

<table><tbody><tr><td>Triglyceride Mix</td><td>Sigma</td><td>17810-1AMP-S</td><td></td></tr><tr><td>Oleic acid&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>O1257-10MG</td><td>Oleic Acid-Water Soluble powder&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>TRIzol Reagent</td><td>Life technologies&amp;nbsp;</td><td>15596-026</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Protein A</td><td>Life technologies&amp;nbsp;</td><td>10006D</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Protein G</td><td>Life technologies&amp;nbsp;</td><td>10007D</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR Purification Kit</td><td>QIAGEN</td><td>28106</td><td>DNA isolation of input sample&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>ZYMO ChIP-DNA Isolation kit&amp;nbsp;</td><td>Zymo Research&amp;nbsp;</td><td>D5205</td><td>ChIP DNA Clean &amp;amp; Concentrator</td></tr><tr><td>Quant-iT&amp;ordf; PicoGreen&amp;uml; dsDNA Assay Kit</td><td>Invitrogen&amp;nbsp;</td><td>P7589</td><td>DNA Quantitation</td></tr><tr><td>RNase-Free DNase Set</td><td>QIAGEN</td><td>79254</td><td>RNA purification</td></tr><tr><td>DEPC Treated Water&amp;nbsp;</td><td>LIFE TECH</td><td>462224</td><td>Dnase/Rnase Free</td></tr><tr><td>Model 120 Sonic Dismembrator</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>FB120110</td><td>With 1/8 probe&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;Fisher Scientific Sound Enclosure</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>FB-432-A</td><td>For sound reduction</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;Eppendorf Tubes 5.0 ml</td><td>Eppendorf&amp;nbsp;</td><td>0030 119.401</td><td>200 tubes (2 bags of 100 ea.)</td></tr><tr><td>Random Primer Mix&amp;nbsp;</td><td>NEB</td><td>S1330S</td><td></td></tr><tr><td>DNTP MIX</td><td>NEB</td><td>N0447S</td><td></td></tr><tr><td>M-MuLV Reverse Transcriptase</td><td>NEB</td><td>M0253S</td><td></td></tr><tr><td>FastStart SYBR Green Master</td><td>ROCHE</td><td>4673484001</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Fisher&amp;nbsp;</td><td>BP160100</td><td>1.5% agarose gel&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Qubit RNA HS Assay Kit</td><td>Life technologies&amp;nbsp;</td><td>Q32852</td><td>RNA quantification (100 assays)&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Formaldehyde</td><td>Sigma</td><td>F8775</td><td></td></tr><tr><td>Protease Inhibitor tablets&amp;nbsp;</td><td>Roche&amp;nbsp;</td><td>4693116001</td><td>Each tablet is sufficient for 10 ml lysis buffer</td></tr><tr><td>PhosSTOP Phosphatase Inhibitor Cocktail Tablets</td><td>Roche&amp;nbsp;</td><td>4906845001</td><td>Each tablet is sufficient for 10 ml lysis buffer</td></tr><tr><td>Qubit Assay Kits</td><td>Life technologies&amp;nbsp;</td><td>Q32850</td><td>For 100 assays</td></tr><tr><td>Automated cell counter</td><td>ORFLO</td><td>MXZ000</td><td></td></tr><tr><td>tube Rotator&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>10136-084</td><td></td></tr><tr><td>Victor X5 Multilple plate reader&amp;nbsp;</td><td>PerkinElmer</td><td>2030-0050</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge 5417R</td><td>Eppendorf</td><td>22621807</td><td></td></tr><tr><td>Magnetic Stand</td><td>Diagenode</td><td>B04000001&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Fast Real-time PCR system</td><td>Applied Science&amp;nbsp;</td><td>4351405</td><td></td></tr></tbody></table>

systems biology of metabolic regulation by estrogen receptor signaling in breast cancer

Mit dem Aufkommen der -omics nähert sich unser Verständnis der chronischen Krankheiten wie Krebs und metabolische Syndrom hat sich verbessert. Allerdings effektive Abbau von den Informationen in den großen Datenmengen, die von Genexpression Microarrays, deep sequencing Experimente oder metabolischen Profils erhalten werden ist wichtig, zu entdecken und dann effektiv die kritischen Regulatoren der erkrankten Zelle Phänotypen Ziel. Estrogen Receptor α (ERa) ist einer der Master-Transkriptionsfaktoren, die Gen-Programme regulieren, die für Östrogen-responsiven Brustkrebs wichtig sind. Um Rolle von ERa Signalisierung bei Brustkrebs Stoffwechsel zu verstehen, verwendeten wir transkriptomischen, cistromic und Metabolom-Daten aus MCF-7 mit Östradiol behandelten Zellen. In diesem Bericht beschrieben wir Generation von Proben für die RNA-Seq, ChIP-Seq und Metabolomik Experimente und die integrative Computeranalyse der erhaltenen Daten. Dieser Ansatz ist nützlich bei der Abgrenzung Roman Maulwurfdere Mechanismen und genregulatorischen Schaltungen, die durch einen bestimmten Transkriptionsfaktor, der Auswirkungen auf den Stoffwechsel von normalen oder erkrankten Zellen reguliert werden.

Transcriptomics Zur Analyse differentiell exprimierten Gene durch E2-Behandlung, wählten wir einen RNA-Seq-Experiment durchzuführen. Darüber hinaus Ebenen Informationen über mRNA zur Bereitstellung, RNA-Seq-Daten können auch in nicht-kodierende RNA (lange nicht-kodierenden RNAs, microRNAs) und alternative Spleißen Ereignisse zu überwachen Änderungen verwendet werden. Wir haben keine Informationen über die Analyse von nicht-kodierenden RNAs oder alternativ Gene transkribie...

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Systems Biology of Metabolic Regulation by Estrogen Receptor Signaling in Breast Cancer

Systembiologie der Stoffwechselregulation von Estrogen Receptor Signaling bei Brustkrebs

Integration of data from genome-wide sequencing experiments and metabolomics experiments is a challenge. In this paper we report, for the first time, generation, analysis and integration of transcriptome, cistrome and metabolome data from breast cancer cells treated with estradiol.

With the advent of the -omics approaches our understanding of the chronic diseases like cancer and metabolic syndrome has improved. However, effective ...

systems-biology-metabolic-regulation-estrogen-receptor-signaling

Research

JoVE Journal

Medicine

10.4K Aufrufe.  University of Illinois, Urbana-Champaign. Integration of data from genome-wide sequencing experiments and metabolomics experiments is a challenge. In this paper we report, for the first time, generation, analysis and integration of transcriptome, cistrome and metabolome data from breast cancer cells treated with estradiol. 

Serie: Systems Biology of Metabolic Regulation by Estrogen Receptor Signaling in Breast Cancer

An In Vivo Estrogen Deficiency Mouse Model for Screening Exogenous Estrogen Treatments of Cardiovascular Dysfunction After Menopause

Postmenopausal women are at greater risk of developing cardiovascular diseases than premenopausal women. Female mice ovariectomized (OVX) at weaning display increased atherosclerotic lesions in the aorta compared with female mice with intact ovarian function. However, laboratory models involving estrogen-deficient mice with atherosclerosis-prone status are lacking. This deficit is crucial because clinical estrogen deficiency in menopausal women may aggravate the incidence of pre-existing or ongoing lipid disruption and atherosclerosis. In this study, we establish an in vivo estrogen-deficient mouse model by bilateral ovariectomy via a double dorsal-lateral incision in apolipoprotein E (apoE)-/- mice. We then compare the effects of 17&#946;-estradiol and pseudoprotodioscin (PPD) (a phytoestrogen) perorally administered via hazelnut spread. We find that although PPD exerts some effect on reducing final body weight and plasma TG in OVX apoE-/- mice, it has anti-atherosclerotic and cardiac-protective capacities comparable with its 17&#946;-estradiol counterpart. PPD is a phytoestrogen that has been reported to exert anti-tumor properties. Thus, the proposed method is applicable for screening phytoestrogens via peroral administration to substitute for traditional hormone replacement therapy in postmenopausal women, which has been reported to have potentially deleterious tumorigenetic capacity. Peroral administration via hazelnut spread is noninvasive, rendering it widely applicable to many patients. This article contains step-by-step demonstrations of bilateral ovariectomy via the double dorsal-lateral incision in apoE-/- mice and peroral 17&#946;-estradiol or phytoestrogen hormone replacement via hazelnut spread. Plasma lipid and cardiovascular function analyses using echocardiography follow.

Clinically, estrogen deficiency in menopausal women may aggravate the incidence of lipid disruption and atherosclerosis. We established an in vivo estrogen deficiency model by bilateral ovariectomy via a double dorsal-lateral incision in apoE-/- mice. The mouse model is applicable for screening exogenous estrogen treatments of cardiovascular dysfunction after menopause.

Ein In Vivo Östrogen-Mangel-Maus-Modell zum Screening exogener Östrogen-Behandlungen von Kardiovaskulärer Dysfunktion nach den Wechseljahren

Postmenopausal women are at greater risk of developing cardiovascular diseases than premenopausal women. Female mice ovariectomized (OVX) at weaning ...

Forschung

Biochemie

Modeling Breast Cancer in Human Breast Tissue using a Microphysiological System

Breast cancer (BC) remains a leading cause of death for women. Despite more than $700 million invested in BC research annually, 97% of candidate BC drugs fail clinical trials. Therefore, new models are needed to improve our understanding of the disease. The NIH Microphysiological Systems (MPS) program was developed to improve the clinical translation of basic science discoveries and promising new therapeutic strategies. Here we present a method for generating MPS for breast cancers (BC-MPS). This model adapts a previously described approach of culturing primary human white adipose tissue (WAT) by sandwiching WAT between adipose-derived stem cell sheets (ASC)s. Novel aspects of our BC-MPS include seeding BC cells into non-diseased human breast tissue (HBT) containing native extracellular matrix, mature adipocytes, resident fibroblasts, and immune cells; and sandwiching the BC-HBT admixture between HBT-derived ASC sheets. The resulting BC-MPS is stable in culture ex vivo for at least 14 days. This model system contains multiple elements of the microenvironment that influence BC including adipocytes, stromal cells, immune cells, and the extracellular matrix. Thus BC-MPS can be used to study the interactions between BC and its microenvironment. 
We demonstrate the advantages of our BC-MPS by studying two BC behaviors known to influence cancer progression and metastasis: 1) BC motility and 2) BC-HBT metabolic crosstalk. While BC motility has previously been demonstrated using intravital imaging, BC-MPS allows for high-resolution time-lapse imaging using fluorescence microscopy over several days. Furthermore, while metabolic crosstalk was previously demonstrated using BC cells and murine pre-adipocytes differentiated into immature adipocytes, our BC-MPS model is the first system to demonstrate this crosstalk between primary human mammary adipocytes and BC cells in vitro.

This protocol describes the construction of an in vitro microphysiological system for studying breast cancer using primary human breast tissue with off the shelf materials.

Modellierung von Brustkrebs im menschlichen Brustgewebe mit einem mikrophysiologischen System

Breast cancer (BC) remains a leading cause of death for women. Despite more than $700 million invested in BC research annually, 97% of candidate BC drugs ...

Krebsforschung

Screening for Phytoestrogens using a Cell-based Estrogen Receptor  &#946; Reporter Assay

Plants are a source of food for many animals, and&#160;they can produce thousands of chemicals. Some of these compounds affect physiological processes in the vertebrates that consume them, such as endocrine function. Phytoestrogens, the most well studied endocrine-active phytochemicals, directly interact with the hypothalamo-pituitary gonadal axis of the vertebrate endocrine system. Here we present the novel use of a cell-based assay to screen plant extracts for the presence of compounds that have estrogenic biological activity. This assay uses mammalian cells engineered to highly express estrogen receptor beta (ER&#946;) and that have been transfected with a luciferase gene. Exposure to compounds with estrogenic activity results in the cells producing light. This assay is a reliable and simple way to test for biological estrogenic activity. It has several improvements over transient transfection assays, most notably, ease of use, the stability of the cells, and the sensitivity of the assay.

We have optimized a commercially available estrogen receptor &#946; reporter assay for screening human and nonhuman primate foods for estrogenic activity. We validated this assay by showing that the known estrogenic human food soy registers high, while other foods show no activity.

Screening auf Phytoöstrogene mit einem Zell-basierten Östrogen-Rezeptor β Reporter Assay

Plants are a source of food for many animals, and&#160;they can produce thousands of chemicals. Some of these compounds affect physiological processes in ...

Profiling of Estrogen-regulated MicroRNAs in Breast Cancer Cells

Estrogen plays vital roles in mammary gland development and breast cancer progression. It mediates its function by binding to and activating the estrogen receptors (ERs), ER&#945;, and ER&#946;. ER&#945; is frequently upregulated in breast cancer and drives the proliferation of breast cancer cells. The ERs function as transcription factors and regulate gene expression. Whereas ER&#945;&#39;s regulation of protein-coding genes is well established, its regulation of noncoding microRNA (miRNA) is less explored. miRNAs play a major role in the post-transcriptional regulation of genes, inhibiting their translation or degrading their mRNA. miRNAs can function as oncogenes or tumor suppressors&#160;and are also promising biomarkers. Among the miRNA assays available, microarray and quantitative real-time polymerase chain reaction (qPCR) have been extensively used to detect and quantify miRNA levels. To identify miRNAs regulated by estrogen signaling in breast cancer, their expression in ER&#945;-positive breast cancer cell lines were compared before and after estrogen-activation using both the &#181;Paraflo-microfluidic microarrays and Dual Labeled Probes-low density arrays. Results were validated using specific qPCR assays, applying both Cyanine dye-based and Dual Labeled Probes-based chemistry. Furthermore, a time-point assay was used to identify regulations over time. Advantages of the miRNA assay approach used in this study is that it enables a fast screening of mature miRNA regulations in numerous samples, even with limited sample amounts. The layout, including the specific conditions for cell culture and estrogen treatment, biological and technical replicates, and large-scale screening followed by in-depth confirmations using separate techniques, ensures a robust detection of miRNA regulations,&#160;and eliminates false positives and other artifacts. However, mutated or unknown miRNAs, or regulations at the primary and precursor transcript level, will not be detected. The method presented here represents a thorough investigation of estrogen-mediated miRNA regulation.

Molecular signaling through both estrogen and microRNAs are critical in breast cancer development and growth. Estrogen activates the estrogen receptors, which are transcription factors. Many transcription factors can regulate the expression of microRNAs, and estrogen-regulated microRNAs can be profiled using different large-scale techniques.

Profiling von Östrogen-regulierte MicroRNAs in Brustkrebszellen

Estrogen plays vital roles in mammary gland development and breast cancer progression. It mediates its function by binding to and activating the estrogen ...

Medizin

A Modified In vitro Invasion Assay to Determine the Potential Role of Hormones, Cytokines and/or Growth Factors in Mediating Cancer Cell Invasion

Blood serum serves as a chemoattractant towards which cancer cells migrate and invade, facilitating their intravasation into microvessels. However, the actual molecules towards which the cells migrate remain elusive. This modified invasion assay has been developed to identify targets which drive cell migration and invasion. This technique compares the invasion index under three conditions to determine whether a specific hormone, growth factor, or cytokine plays a role in mediating the invasive potential of a cancer cell. These conditions include i) normal fetal bovine serum (FBS), ii) charcoal-stripped FBS (CS-FBS), which removes hormones, growth factors, and cytokines and iii) CS-FBS + molecule (denoted &#8220;X&#8221;). A significant change in cell invasion with CS-FBS as compared to FBS, indicates the involvement of hormones, cytokines or growth factors in mediating the change. Individual molecules can then be added back to CS-FBS to assay their ability to reverse or rescue the invasion phenotype. Furthermore, two or more factors can be combined to evaluate the additive or synergistic effects of multiple molecules in driving or inhibiting invasion. Overall, this method enables the investigator to determine whether hormones, cytokines, and/or growth factors play a role in cell invasion by serving as chemoattractants or inhibitors of invasion for a particular type of cancer cell or a specific mutant. By identifying specific chemoattractants and inhibitors, this modified invasion assay may help to elucidate signaling pathways that direct cancer cell invasion.

A Modified In vitro Invasion Assay to Determine the Potential Role of Hormones, Cytokines and/or Growth Factors in Mediating Cancer Cell Invasion

This video article describes a modified in vitro method to examine the role of hormones, cytokines and/or growth factors in driving cancer cell invasion.

Eine modifizierte<em&gt; In-vitro-</em&gt; Invasion Assay, um die mögliche Rolle von Hormonen, Cytokinen und / oder Wachstumsfaktoren bei der Vermittlung der Invasion von Krebszellen fest,

Blood serum serves as a chemoattractant towards which cancer cells migrate and invade, facilitating their intravasation into microvessels. However, the ...

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

The study of hormone action in the human breast has been hampered by lack of adequate model systems. Upon in vitro culture, primary mammary epithelial cells tend to lose hormone receptor expression. Widely used hormone receptor positive breast cancer cell lines are of limited relevance to the in vivo situation. Here, we describe an ex vivo model to study hormone action in the human breast. Fresh human breast tissue specimens from surgical discard material such as reduction mammoplasties or mammectomies are mechanically and enzymatically digested to obtain tissue fragments containing ducts and lobules and multiple stromal cell types. These tissue microstructures kept in basal medium without growth factors preserve their intercellular contacts, the tissue architecture, and remain hormone responsive for several days. They are readily processed for RNA and protein extraction, histological analysis or stored in freezing medium. Fluorescence activated cell sorting (FACS) can be used to enrich for specific cell populations. This protocol provides a straightforward, standard approach for translational studies with highly complex, varied human specimens.

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

We have developed a novel ex vivo model to study hormone action in the human breast. It is based on tissue microstructures isolated from surgical breast tissue specimens which preserve tissue architecture, intercellular interactions, and paracrine signaling.

Ein<em&gt; Ex-vivo-</em&gt; Modell um die Hormonwirkung in der menschlichen Brust Studieren

The study of hormone action in the human breast has been hampered by lack of adequate model systems. Upon in vitro culture, primary mammary epithelial ...

Using 16&#945;-[18F]-Fluoro-17&#946;-Estradiol PET to Visualize Estrogen Receptor &#945; Expression in Human Breast Cancer Xenografts in Female Ovariectomized Mice

To demonstrate how estrogen receptor alpha (ER&#945;) positive breast cancer xenografts may be visualized in BALB/c nude mice using 16&#945;-[18F]-fluoro-17&#946;-estradiol (18F-FES) positron emission tomography (PET), ovariectomized BALB/c nude mice were injected with ER&#945;-positive breast cancer cells (MCF-7, 3 &#215; 106 cells; shoulder [n = 10] or 4th inguinal mammary fat pad [n = 10]) or ER&#945;-negative breast cancer cells (MDA-MB-231, 1 &#215; 106 cells; mammary fat pad [n = 5]). Mice harboring MCF-7 cells received subcutaneous injections of 20 &#181;g of 17&#946;-estradiol (20 &#181;g/20 &#181;L; corn oil:ethanol, 9:1) in the nape of their necks 2 days prior to cell injection, followed by daily injections five times per week for 5 weeks. Tumor volumes were measured according to the formula: (L*W2)/2 (L; length, W; width). Once tumor volumes reached approximately 100 mm3, 17&#946;-estradiol injections were halted 2 days prior to mice receiving 18F-FES for PET imaging to avoid competitive binding with ER&#945;. Upon 18F-FES administration via the lateral tail vein, PET/MRI was performed for 15 min at 1 h to 1.5 h post-injection. 18F-FES uptake was not observed in ER&#945;-negative, MDA-MB-231 tumor-bearing mice. 18F-FES uptake was most pronounced in mice harboring MCF-7 tumors in the shoulder. In MCF-7 tumors grown in the inguinal mammary fat pad, 18F-FES uptake was less visible, as the intestinal excretion pattern of 18F-FES obscured the radioactivity detectable in these tumors. To use 18F-FES PET as a tool to visualize ER&#945; expression in ER&#945;-positive breast xenografts, we demonstrate that the visibility of 18F-FES uptake is clear in tumors located away from the abdominal region of mice, such as in the shoulder.

Here, we demonstrate a protocol to use 16&#945;-[18F]-fluoro-17&#946;-estradiol (18F-FES) positron emission tomography (PET) as a tool to visualize ER&#945; expression in ER&#945;-positive breast xenografts.

Verwendung von 16α-[18F]-Fluor-17β-Estradiol PET zur Visualisierung der Östrogenrezeptor-α Expression in menschlichen Brustkrebs-Xenotransplantaten bei weiblichen ovariektomierten Mäusen

To demonstrate how estrogen receptor alpha (ER&#945;) positive breast cancer xenografts may be visualized in BALB/c nude mice using ...

Der Mechanismus von Salidrosid bei der Unterdrückung der Migration und Proliferation von MCF-7-Zellen

Exploring the Pharmacological Action and Molecular Mechanism of Salidroside in Inhibiting MCF-7 Cell Proliferation and Migration

Salidroside (Sal) contains anti-carcinogenic, anti-hypoxic, and anti-inflammatory pharmacological activities. However, its underlying anti-breast cancer mechanisms have been only incompletely elucidated. Hence, this protocol intended to decode the potential of Sal in regulating the PI3K-AKT-HIF-1&#945;-FoxO1 pathway in the malignant proliferation of human breast cancer MCF-7 cells. First, the pharmacological activity of Sal against MCF-7 was evaluated by CCK-8 and cell scratch assays. Moreover, the resistance of MCF-7 cells was measured by migration and Matrigel invasion assays. For cell apoptosis and cycle assays, MCF-7 cells were processed in steps with annexin V-FITC/PI and cell cycle-staining detection kits for flow cytometry analyses, respectively. The levels of reactive oxygen species (ROS) and Ca2+ were examined by DCFH-DA and Fluo-4 AM immunofluorescence staining. The activities of Na+-K+-ATPase and Ca2+-ATPase were determined using the corresponding commercial kits. The protein and gene expression levels in apoptosis and the PI3K-AKT-HIF-1&#945;-FoxO1 pathway were further determined using western blot and qRT-PCR analyses, respectively. We found that Sal treatment significantly restricted the proliferation, migration, and invasion of MCF-7 cells with dose-dependent effects. Meanwhile, Sal administration also dramatically forced MCF-7 cells to undergo apoptosis and cell cycle arrest. The immunofluorescence tests showed that Sal observably stimulated ROS and Ca2+ production in MCF-7 cells. Further data confirmed that Sal promoted the expression levels of pro-apoptotic proteins, Bax, Bim, cleaved caspase-9/7/3, and their corresponding genes. Consistently, Sal intervention prominently reduced the expression of the Bcl-2, p-PI3K/PI3K, p-AKT/AKT, mTOR, HIF-1&#945;, and FoxO1 proteins and their corresponding genes. In conclusion, Sal can be used as a potential herb-derived compound for treating breast cancer, as it may reduce the malignant proliferation, migration, and invasion of MCF-7 cells by inhibiting the PI3K-AKT-HIF-1&#945;-FoxO1 pathway.

Autor im Rampenlicht: Erforschung der molekularen Mechanismen von Salidrosid bei der Behandlung von Brustkrebs 

The present protocol describesa comprehensive strategy for evaluating the pharmacological action and mechanism of salidroside in inhibiting MCF-7 cell proliferation and migration.

Erforschung der pharmakologischen Wirkung und des molekularen Mechanismus von Salidrosid bei der Hemmung der Proliferation und Migration von MCF-7-Zellen

Salidroside (Sal) contains anti-carcinogenic, anti-hypoxic, and anti-inflammatory pharmacological activities. However, its underlying anti-breast cancer ...

Systembiologie der Stoffwechselregulation von Estrogen Receptor Signaling bei Brustkrebs

Zusammenfassung

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Ein In Vivo Östrogen-Mangel-Maus-Modell zum Screening exogener Östrogen-Behandlungen von Kardiovaskulärer Dysfunktion nach den Wechseljahren

Modellierung von Brustkrebs im menschlichen Brustgewebe mit einem mikrophysiologischen System

Screening auf Phytoöstrogene mit einem Zell-basierten Östrogen-Rezeptor β Reporter Assay

Profiling von Östrogen-regulierte MicroRNAs in Brustkrebszellen

Eine modifizierte

Ein

Verwendung von 16α-[18F]-Fluor-17β-Estradiol PET zur Visualisierung der Östrogenrezeptor-α Expression in menschlichen Brustkrebs-Xenotransplantaten bei weiblichen ovariektomierten Mäusen

Erforschung der pharmakologischen Wirkung und des molekularen Mechanismus von Salidrosid bei der Hemmung der Proliferation und Migration von MCF-7-Zellen

Erforschung der pharmakologischen Wirkung und des molekularen Mechanismus von Salidrosid bei der Hemmung der Proliferation und Migration von MCF-7-Zellen

Erforschung der pharmakologischen Wirkung und des molekularen Mechanismus von Salidrosid bei der Hemmung der Proliferation und Migration von MCF-7-Zellen