Bei neonatalen Erkrankungen wie der Kardiomyopathie hat die regenerative Therapie mit induzierten pluripotenten Stammzellen-abgeleiteten Zellen ein enormes Potenzial. Jedoch, In-vitro-beschleunigtes Zellwachstum führt zu DNA-Schäden durch angesammelte Metaboliten wie reaktive Sauerstoffspezies. Eine Transplantation dieser DNA-geschädigten Zellen würde zu einer schlechten Transplantation und Regeneration des Organs führen.
Vor der Transplantation sollte die Qualität der Zellen bewertet werden. Hier stellen wir zwei Schritt-für-Schritt-Protokolle zur Bewertung der DNA-Schäden in Stammzellen zur Verfügung. Die Verfahren werden Jessica Miller, eine Forscherin, Nikhil Mardhekar, ein Forscher, und Vasanthi Rajasekaran, ein Labortechniker, demonstrieren.
Um zu beginnen, legen Sie 500 Milligramm niedrigschmelzende Agarose in 100 Milliliter DNA-RNA-freies Wasser. Die Flasche in einer Mikrowelle erhitzen, bis sich die Agarose auflöst. Dann legen Sie die Flasche in ein 37-Grad-Celsius-Wasserbad, bis sie benötigt wird.
Um vorbeschichtete Kometenschlitten vorzubereiten, legen Sie ein paar Tropfen 0,5%Agarose auf eine Glasrutsche. Die Agarose sofort zu einer dünnen Schicht Agarose-Beschichtung mit einem Deckslip ausbreiten. Arbeiten Sie unter schlechten Lichtverhältnissen, um ultraviolette Licht-induzierte Zellschäden zu vermeiden, mischen Sie 10 Mikroliter Zellsuspension und 90 Mikroliter Agarose-Lösung in einem Rohr.
Legen Sie das Rohr in ein 37-Grad-Celsius-Wasserbad, um eine Erstarrung der Agarose zu verhindern. Mischen Sie die Lösung, ohne Luftblasen einzuführen, und Pipette 70 Mikroliter pro Punkt auf den vorbeschichteten Kometenschlitten. Mit einer Pipettenspitze die Zellagarosemischung zu einer dünnen Schicht verteilen.
Platzieren Sie die Rutsche 15 Minuten lang bei vier Grad Celsius. In einem Container die Folie vollständig in einen kaltlysepuffer nauchen. Stellen Sie den Behälter eine Stunde lang bei vier Grad Celsius in senfdark.
Ersetzen Sie den Lysepuffer durch eine kalte alkalische Lösung. Stellen Sie sicher, dass die Folien vollständig untergetaucht sind. Nachdem Sie den Behälter bei vier Grad Celsius für weitere 30 Minuten im Dunkeln gelassen haben, legen Sie die Rutsche in einen horizontalen Elektrophoresetank.
Füllen Sie den Tank mit kaltem alkalischen Elektrophoresepuffer, bis die Dias vollständig untergetaucht sind. 15 bis 30 Minuten Spannung bei einem Volt pro Zentimeter antragen. In einem Behälter, vollständig untertauchen die Rutsche in kaltes deionisiertes Wasser.
Nach zwei Minuten das entionisierte Wasser entfernen und frisches entionisiertes Wasser hinzufügen, und wiederholen Sie diesen Schritt dann ein zweites Mal. Als nächstes ersetzen Sie das entionisierte Wasser durch kaltes 70%Ethanol. Nach fünf Minuten den Schlitten vorsichtig entfernen, ohne ihn zu kippen und die Luft trocknen zu lassen.
Nach dem Trocknen 100 Mikroliter verdünnter DNA-Farbstoff an jedem Punkt hinzufügen und 15 Minuten bei Raumtemperatur warten. Mit einem FITC-Filter in einem Epifluoreszenzmikroskop können Sie insgesamt 50 bis 100 Kometen pro Probe fotografieren. Kultur iPS-abgeleitete Kardiomyozyten, wie im Textprotokoll beschrieben.
Um die iPS-abgeleiteten Kardiomyozyten in Kammerrutschen zu sehen, entsorgen Sie zuerst das Kulturmedium aus den Brunnen und waschen Sie die Zellen dreimal mit PBS. Fügen Sie einen Milliliter 0,25%Trypsin pro Brunnen hinzu und brüten bei 37 Grad Celsius für fünf Minuten. Überprüfen Sie die Platte unter dem Mikroskop auf Zellablösung.
Fügen Sie dann einen Milliliter CMM hinzu, um das Trypsin zu stoppen. Legen Sie die Zellsuspension in ein 15-Milliliter-Rohr und eine Zentrifuge für fünf Minuten bei vier Grad Celsius und 200 mal g. Verwerfen Sie das Medium, fügen Sie einen Milliliter KMG hinzu, und setzen Sie die Zellen erneut aus.
Zählen Sie die Zellen und passen Sie die Zellenzahl an, um zwei Millionen Zellen in 1,6 Milliliter CMM zu erhalten. Jetzt samen 200 Mikroliter Zellsuspension pro Brunnen der Acht-Well-Kammerrutsche. Tippen Sie sanft auf die Folie, um die Zellen um den Brunnen zu verteilen.
Inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius. Für die iPS-abgeleitete Behandlung von Cardiomyozyten Doxorubicin entsorgen Sie das Kulturmedium aus den iPS-abgeleiteten Kardiomyozytenbrunnen und waschen Sie die Zellen mit PBS. Behandeln Sie die Zellen mit einmikromolarem Doxorubicin für vier Stunden bei 37 Grad Celsius.
Das Medium ansaugen und die Zellen mit PBS waschen. Um eine Immunkennzeichnung durchzuführen, waschen Sie die Zellen dreimal mit PBS und fügen Sie jedem Brunnen 200 Mikroliter frisch zubereitetes 4%Paraformaldehyd hinzu. Fixieren Sie die Zellen für 20 Minuten im Dunkeln bei Raumtemperatur.
Nach dem Waschen der Zellen mit PBS 200 Mikroliter Sperrpuffer pro Brunnen hinzufügen und 30 Minuten in einer befeuchteten Kammer bei Raumtemperatur blockieren. Entfernen Sie den Blockierpuffer und fügen Sie 200 Mikroliter Primärantikörperlösung hinzu. Nach 45 Minuten Inkubation in einer dunklen befeuchteten Kammer bei Raumtemperatur die Brunnen dreimal mit PBS waschen.
Entfernen Sie die PBS und fügen Sie 200 Mikroliter sekundären Antikörper-Mix. 45 Minuten in einer dunklen befeuchteten Kammer bei Raumtemperatur inkubieren. Dann waschen Sie die Brunnen dreimal mit PBS.
Waschen Sie mit entionisiertem Wasser, bevor Sie die Dias mit Antifade montieren. Legen Sie ein Deckglas, und lagern Sie die Dias im Dunkeln bei vier Grad Celsius. Nehmen Sie mit einem konfokalen Mikroskop drei bis fünf Bilder von Zufallsfeldern pro Probe und fahren Sie mit der Bildanalyse fort.
Um die DNA-Schadensreaktionsschwerpunkte zu zählen, laden Sie CellProfiler herunter und installieren Sie es. Wählen Sie Datei, Import, Pipeline aus der Datei aus, und wählen Sie die Pipelinedatei mit dem Namen puncti gamma-H2AX aus. Ziehen Sie den Ordner mit den erfassten Bildern von gamma-H2AX-Fozien zur Analyse in das Dateilistenfenster im Abschnitt Bilder der Eingabemodule.
Folgen Sie dann den Anweisungen, wie im Textprotokoll gezeigt. Um die Parameter für die Bilder festzulegen, ziehen Sie das gewünschte Bild zur Analyse in die Dateiliste. Wählen Sie unter Eingabemodulen Bilder aus.
Wählen Sie auch in Eingabemodulen Metadaten aus, und wählen Sie dann Namen und Typen aus. Wählen Sie für Gruppen nein aus. Wenn Sie in Analysemodulen arbeiten, wählen Sie Farbe in Grau aus.
Wählen Sie dann glatt aus, wählen Sie primäre Objekte identifizieren aus, und wählen Sie erneut glatt aus. Wählen Sie als Nächstes Features verbessern oder unterdrücken aus, und wählen Sie dann primäre Objekte identifizieren aus. Wenn Sie immer noch in Analysemodulen arbeiten, wählen Sie Beziehungsobjekte aus, klassifizieren Sie dann Objekte, und wählen Sie schließlich den Export in die Kalkulationstabelle aus.
Klicken Sie im unteren linken Bereich auf Bilder analysieren, um die Bildanalyse durchzuführen. Nach erfolgreichem Abschluss der Analyse werden mehrere Bilder generiert. Beachten Sie die CSV-Datei, die generiert und an der entsprechenden Stelle auf dem Computer gespeichert wird.
Diese Datei enthält die quantitativen Daten für die weitere Analyse. In der Tabelle, die mein Experimentbild genannt wird, wird Spalte B die Anzahl der Kerne haben, die bis zu fünf Punkti haben, und Spalte D hat die Anzahl der Kerne, die mehr als fünf Punkti haben. Fügen Sie die Spalten B und D hinzu, um die Gesamtzahl der Kerne abzuerhalten.
Wiederholen Sie diese Schritte für alle Bilder, und ändern Sie den Dateinamen meines Experiments vor jeder Analyse. Repräsentative Mikrographien von Kometen aus doxobehandelten und nicht behandelten iPS-Zellen werden hier gezeigt. In iPS-Zellen wurde eine Basalmenge an DNA-Schäden gefunden, ausgedrückt als Bruchteil der DNA-Schäden und des Schwanzmoments.
Die Doxo-Behandlung erhöhte jedoch wie erwartet die DNA-Schäden in iPS-Zellen, was darauf hindeutet, dass der Kometentest zur Beurteilung der DNA-Integrität in pluripotenten Stammzellen verwendet werden kann. Repräsentative Mikrographien der Gamma-H2AX-Immunolabeling werden hier bei geringerer Vergrößerung und höherer Vergrößerung gezeigt. Bei der Kontrolle von iPS-abgeleiteten Kardiomyozyten hatten mehr als 90% der Zellen weniger als fünf DDR-Brennpunkte pro Kern.
Und insgesamt hatten weniger als 10% der Zellen mehr als sechs DDR-Brennpunkte pro Kern. Bei iPS-abgeleiteten Kardiomyozyten, die sechs Monate lang kultiviert wurden, hatten weniger als 90% der Zellen bis zu fünf DDR-Brennpunkte pro Kerne, und insgesamt hatten mehr als 13% der Zellen mehr als sechs DDR-Brennpunkte pro Kern. Während in den doxo-behandelten iPS-abgeleiteten Kardiomyozyten weniger als 80% der Zellen bis zu fünf DDR-Brennpunkte pro Kern hatten.
Und insgesamt hatten etwa 24% der Zellen mehr als sechs DDR-Brennpunkte pro Kern. Diese Daten deuten darauf hin, dass eine verlängerte iPS-abgeleitete Kardiomyozytenzellkultur und Doxo-Behandlung signifikante DNA-Schäden verursachten, wodurch sie für eine Zelltransplantation ungeeignet waren. Es ist sehr wichtig, Variablen beim Mischen der Zellsuspension zu vermeiden, da dies die Elektrophorese beeinflussen könnte.
Nach diesem Verfahren können Sie die Kometenassays und die Immunlabeling-Verfahren mit Zellen verschiedener Typen durchführen. Diese Techniken ermöglichen es, Zellen verschiedener Art auf DNA-Schäden zu untersuchen, bevor sie in Zelltransplantationsstudien verwendet werden.
