Unterstützt durch ein National Cancer Institute Zuschuss 1R03CA172923 teilweise.

Ethik-Statement: Die Verwendung von Mäusen in der Forschung ist nur dann akzeptabel, in Fällen, in denen es die menschliche Verständnis der grundlegenden Biologie oder zur endgültigen Behandlung von Krankheiten voranbringen könnten. 1. Bestellung <ol><li> Kauf weiblichen C57BL / 6-Mäuse (Alter von 6 - 8 Wochen), 5 Mäuse pro Gruppe. Erlauben mehrere Tage für die Mäuse einzustellen. </li></ol> 2. Herstellung von B16-BL6 Zellen <ol><li> Entfernen Zellkulturplatten aus einem 37-Grad-Inkubator und in einer sterilen Haube. Platten sollten etwa 70% konfluent mit B16-BL6 murine Melanom-Zellen sein. Eine größere Zusammenfluß können die Zellen metastatische Potential verändern. </li><li> 1 ml 0,05% Trypsin-EDTA pro Platte, lassen für 1 Minute sitzen, und dann die Trypsin-Media-Lösung absaugen. </li><li> 1 ml Trypsin pro Platte und Rückplatten in den Inkubator für 10 min. </li><li> die Platten aus dem Inkubator in die sterile Haube, 4 ml Serum-freien Rosewell Park Memorial Institute Mediu Nach dem Umzugm (RPMI) zu jeder Platte. </li><li> Sammeln Sie die Zellen mit einer sterilen, motorisierten Pipette. Eject-Zellen gegen die Unterseite der Platte, mit der Spitze in einem sehr kleinen Winkel gedrückt, um die Zellen aufzubrechen. Mehrmals wiederholen, um eine ausreichende Trennung von Zellklumpen zu gewährleisten, die sonst die Auswurf Nadel verstopfen könnten. Erinnere und Transfer zu einem 50 ml konischen Röhrchen. </li><li> Verwenden Sie ein Hämozytometer die Zelldichte zu bestimmen. Halten der Gesamtanzahl von B16-BL6 Zellen konstant das Volumen der serumfreien RPMI bestimmen benötigt Endkonzentrationen von 0, 0,065, 0,015, 0,25 und 0,5 Millionen Zellen / ml zu erreichen. </li><li> Ebenso Aliquotierung die Medien in der 50-ml-Tube zu 15 ml konischen Röhrchen. Zentrifugiere die konische Röhrchen bei 2.250 xg für 5 min. Dekantiert die Medien. Fügen Sie ein geeignetes Volumen von Serum-freiem RPMI und bestätigen Sie die gewünschte Zelldichte über Hemacytometer. Stellen Sie densities- durch Hinzufügen zusätzlicher RPMI oder Spinnen und Resuspendieren in einem kleineren volumen- entsprechend. </li><li> Aliquot 500 uljeder Zellsuspension in beschriftete 1,8 ml Röhrchen auf Eis. </li></ol> 3. Schwanzveneninjektion <ol><li> Nehmen Sie eine Maus, am Schwanz gehalten, und führen Sie ihn rück zuerst in die Maus Verzögerer. Mit dem Rumpf in der Hauptkammer des Verzögerer, mit dem Schwanz außerhalb, ziehen Sie die Maus gegen Ende des Verzögerer. Legen Sie die Verzögerer-Kolben, weiter zu drücken, bis die Maus sicher ist. </li><li> Drehen Sie die Maus um 90 Grad, so dass eine der seitlichen Schwanzvenen nach oben zeigt. Mit einem Alkoholtupfer reinigen kräftig auf die Seite der Schwanz der Maus, insbesondere dort, wo die Schwanzvene am deutlichsten sichtbar. Hinweis: Eine gute Beleuchtung für eine effektive Schwanzvene Visualisierung auf B57BL / 6J Mäuse wesentlich ist. Heizlampen oder erhitzte Chirurgie Pads, während die nicht erforderlich ist, wird auch dazu beitragen, indem das Volumen der Schwanzvene zu erhöhen. </li><li> In einem sterilen Kulturhaube, sammeln 300 ul Zellkulturmedien von den 2 Millionen Zellen / ml Röhrchen. Kehren Sie die Nadel, blätterte die side und den Kolben drückt, um Blasen aus der Spritze auszustoßen. Auszuwerfen Kultur RPMI in einem Endvolumen von 250 ul zu ergeben. </li><li> Ziehen Sie die Maus-Leitwerk mit nicht-dominanten Hand. Halten den Schwanz mit dem proximalen Ende des Endstücks mit dem Zeigefinger der nicht-dominanten Hand erhöht, und der distale Teil des Schwanzes mit dem Daumen niedergedrückt. Hinweis: Auf diese Weise wird die Schwanzvene in einer seitlichen Position gehalten wird, parallel zu der Verzögerer Oberfläche, mit einem kongruenten Eintrag möglich, in der mehr distalen Teil des Schwanzes. </li><li> Führen Sie die Nadel in die Schwanzvene, zum distalen Ende hin, in einer Minute Winkel nach unten zu beginnen, und dann stellen Sie die Nadel den Winkel der Schwanzvene bei weiterem Einführen (Senkung Kolbenende der Spritze relativ zur Nadel) zu entsprechen . </li><li> Führen Sie die Nadel ca. 1 cm in die Schwanzvene. Nach dem Einsetzen beginnen den Kolben zu drücken, wobei die Nadel stabil zu halten. Hinweis: Wenn die Nadel in die Schwanzvene ist und das Ende der Nadel not behindert die Medien ungehindert in die Vene fließen sollte. Effektive Injektion wird durch Blut-Clearance von der Vene aus. Wenn es Widerstand gibt, oder eine Blase beginnt an der Stelle in Injektion zu bilden, entfernen Sie die Nadel und versuchen Sie es erneut an einer proximalen Stelle entlang der Schwanzvene. </li><li> Entfernen Sie die Nadel aus der Vene und entsorgen. Halten Sie Gaze gegen die Eintrittsstelle eine Blutung zu stoppen. </li><li> Entfernen Sie den Kolben aus der Verzögerer und legen Sie die Maus in den Empfänger Käfig. </li><li> Wiederholen Sie dies für alle anderen Konzentrationen. . Hinweis: Lungenherde Einrichtung dauert ca. 2 - 3 Wochen, mit Variabilität je nach Zelllinie und die gewünschte Größe der Brennpunkte 9 In der Zwischenzeit Mäuse sollten für Symptome beobachtet werden , die früh Euthanasie, wie übermäßige Keuchen rechtfertigen könnte. </li></ol> 4. Zählen der Lung Foci <ol><li> Euthanize der Maus durch in einem CO 2 Kammer platziert und Belichten auf 100% CO 2 </sub&gt; eingeführt bei 10-30% der Kammervolumen pro Minute für 5 min. Folgen Sie mit einem Genickbruch. </li><li> Spreizen Sie die Maus auf Styropor. Mit chirurgische Scheren, erstellen Sie einen chirurgischen Schnitt entlang des Brustbeins. </li><li> Bilden zwei zusätzliche Einschnitte, die beide von der Oberseite des Brustbeins Inzision und gegenüber den Schultern der Maus Verzweigungs, den Brustkorb ausgesetzt wird. </li><li> Machen Sie zwei Schnitte, die jeweils entlang der seitlichen Seiten des Brustbeins, den Brustkorb vom Rumpf zu entfernen, die Lungen und das Herz aussetzt. </li><li> das Herz mit chirurgischen Pinzette halten, schneiden Sie die Speiseröhre und Luftröhre, das Herz und die Lungen von der Maus zu befreien. Legen Sie unter einem Binokular, bei 10-facher Vergrößerung, für eine bessere Visualisierung. </li><li> Präparieren Sie das Herz von den Lungen und den Thymus zu entfernen, nur die beiden Lungen zu verlassen. </li><li> Mit den Lungen unter einem Binokular, beginnen die Lungenherde zu zählen. Jede Foci sollte als kreisförmiger, braun obtrusion auf der Oberfläche der Lunge auftreten. <ol><li> FürKonsistenz zwischen Mäusen, die Anzahl der Foci auf der Oberfläche eines Lappens zählen und dann diese Lappen invertieren. jeder der vier Lappen tun können einzeln für eine einfachere Zählen. </li></ol></li><li> Speichern und die Lunge festsetzen, wenn der IHC mit, andernfalls verwerfen die Reste. </li></ol>

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W., Restifo, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N.P.+B16+as+a+Mouse+Model+for+Human+Melanoma.">N.P. B16 as a Mouse Model for Human Melanoma.</a> Curr Protoc Immunol. 20 (1), (2001).</li></ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.

Zirkulierende Tumorzellen von einem Schwanzveneninjektion die Metastasen darstellen, die Websites von primären Wachstum entziehen und wandern durch Routen wie Blut oder lymphatischen Systems, gelegentlich selbst in den kapillaren Betten von entfernten Standorten zu etablieren. 14 Die oben beschriebenen Protokoll dient als Modell für die Sekundär Metastasen. Mit einer optimalen Anzahl von B16-BL6-Zellen injiziert, kann Experimentatoren bestimmen die relative Wirkung eines verabreichten Arzneimittels oder Immunzellpopulation, post-Neutralisierung, auf Metastasierung von Krebszellen. Dieses Protokoll hat seine Grenzen. Die zirkulierenden Tumorzellen wurden für ihre Fähigkeit ausgewählt , zu metastasieren und sind daher nicht immunogen, geringere Mengen an Haupthistokompatibilitäts mit komplexen Klasse 1 - Moleküle. 12 Ferner ist die plötzliche und gruppierten Einführung einer großen Anzahl von Metastasen im Gegensatz zu dem typischen Szenario ist bei Patienten , wo eine kleine Anzahl von metastatischen Tumorzelleneinen verlängerten Zeitraum aus der primären Tumorlokalisation dissipieren über. Zusätzlich werden die intravenös eingeführten Tumorzellen aus der Gewebekultur und nicht die von einem Primärtumor Ursprungs. Daher sind diese Zellen im Gegensatz zu den sekundären Metastasen , die sich aus Veränderungen in der Zelladhäsion führen, Migration, Immunerkennung und Empfängerorgan Einrichtung. 15,16 Ein alternatives Protokoll würde für die Erzeugung von Primärtumoren und der Analyse der resultierenden &quot;spontanen&quot; Lungenmetastasen die subkutane Injektion von B16 / BL6 sein. Diese &quot;spontane&quot; Metastasen gefunden wurden, um mehr Heterogenität als ihre &quot;experimentell&quot; Pendants enthalten, genauer die der menschlichen Patienten entsprechen. Das Protokoll ist die Begrenzung in seiner Fähigkeit, den Einfluss einer experimentellen Verbindung auf die Metastase zu bestimmen. Mit einer seitlichen Schwanzveneninjektion, die Anzahl von Melanomen in den Blutstrom injizierten Zellen über h approximierenemocytometer. Mit &quot;spontanen&quot; Metastasierung jedoch gibt es eine größere Heterogenität zwischen Tumoren, Hinzufügen eine zusätzliche Variable für die Anzahl der Lungenherde entstehen. 16 Zusammenfassend stellt die Schwanzvene B16-BL6 murine Melanommodell ein einfaches Modell des Einflusses einer Behandlung oder Immuntherapie auf Metastase zu bestimmen. Durch intravenöse Injektion zirkulierende Tumorzellen können Forscher replizieren, zu einem gewissen Grad Patienten post Metastasierung. Betrachtet man die zerstörerischen Auswirkungen des metastasierten Tumorzellen in den Krebspatienten, dieses Modell ist ein leistungsfähiges Werkzeug, um die mehrstufiger Prozess der Metastasierung zu verstehen.

Metastasierung ist eine der Hauptursachen für Todesfälle bei Patienten mit malignen Erkrankungen. Der Prozess der metastatischen Verbreitung von Krebszellen ist wenig verstanden, aber scheint mehrere Schritte beinhalten, einschließlich Invasion benachbarter Gewebe, intravasation in die Lymphgefäße und Blutgefäße, das Überleben und Translokation innerhalb des Kreislaufsystems, Extravasation aus dem Gefäßsystem am Ort der Metastasierung, Adaptation Jede dieser biologischen Ereignisse an den neuen Mikroumgebung der neuen Website und Kolonisation am neuen Standort durch die Proliferation und Bildung von sekundären Tumoren. 1 umfassen die Transformation, die Verbreitung und das Überleben von metastasierenden Tumorzellen. Zum Beispiel kann die Umwandlung des epithelialen Phänotyps der Tumorzelle in einen mesenchymalen Phänotypen, verbunden mit der erfolgreichen Wechselwirkung mit der extrazellulären Matrix, damit sie benachbarte Gewebe einzudringen und sich auf andere Teile des Körpers metastasieren. 2,3 Darüber hinaus können diese metastatischen Zelleninnerhalb des zirkulierenden Blutstrom und entziehen Immunüberwachung vom Host überleben muss. 4,5 Wenn schließlich an einer entfernten Stelle im Körper implantiert, müssen die Tumorzellen zu ihrer Mikroumgebung um Sekundärtumoren zu proliferieren und bilden anzupassen. 6,7 Deshalb , obwohl Metastasierung ein häufiges Phänomen bei Krebspatienten ist, haben metastasierten Tumorzellen mehrere Bereiche der Verwundbarkeit, die therapeutische Intervention zugänglich sind. In Anbetracht der immunogene Natur des Melanoms, und die jüngste Interesse an Immuntherapien, Modelle für Melanome sind immer nützlich. 8 In den Vereinigten Staaten allein ist das Melanom die Ursache von schätzungsweise 9.000 Todesfälle pro Jahr. 9 Gemeinsame Positionen von Melanom - Metastasen sind Knochen, Gehirn , Leber und Lunge. Die Mehrheit von Metastasen zu entfernten Stellen auftreten, durch den Blutkreislauf. Zirkulierende Tumorzellen im Blut muss Immunclearance entziehen, ein kapillares Bett eines distalen Organ erreichen unddringen durch die Endothelzellen des Blutgefäßes, um sich erfolgreich zu etablieren. 4-7,10, 11 Zur Nachahmung wurde die gemeinsamen und virulent Phänomene der Metastasierung, die Maus-B16-BL6-Zelllinie erstellt. A decedent der parentalen C57BL / 6 Melanomzelllinie B16-F0, B16-BL6 ist das Endprodukt von 10 aufeinander folgenden Selektionen für Lungenmetastasen von intravenöser Injektion (resultierend in B16-F10), gefolgt von 6 aufeinanderfolgenden Auswahlen für Blasenmembranpenetration. 12 als solches ist es ein zuverlässiges Melanomzelllinie für die Einrichtung von metastatischen Foci in der Maus, insbesondere bei intravenöser Injektion. 13 Nach dem Einspritzen einer ausreichenden Menge von B16-BL6-Zellen in die Schwanzvene einer B57BL / 6-Maus, gefolgt von zwei oder mehr Wochen der Implantation und das Wachstum der B16 / BL6 Zellen zu ermöglichen, wird Metastasenherde in der Lunge bilden. Nach Euthanasie und die Überprüfung durch Sezieren Mikroskopie, die Zahl dereinzelne Brennpunkte vorhanden quantifiziert werden können. Dies wiederum kann verwendet werden, um eine Dosis-Metastase Wirkung herzustellen, da die Anzahl der injizierten B16-BL6 Zellen, die mit der Anzahl von Foci korreliert auf der Oberfläche der Lunge gebildet. Dieses Modell wird als &quot;experimentelle Metastasierung&quot;, bekannt, bei denen bekannt-metastatischen Zellen direkt in den Blutstrom eingeführt werden, eine rasche und vorhersehbare Verbreitung und Etablierung in der Lunge, Leber oder andere Organe der Untersuchung zu erleichtern. Dies steht im Gegensatz zu &quot;spontanen Metastasierung&quot; , wo Tumorzellen implantiert werden, oft subkutan und Metastasen stammen aus kontrolliert biologischem Krebszellen zu vergießen. 14,15 Es ist wichtig, eine geeignete Menge an B16 / BL6-Zellen in die Schwanzvenen der Mäuse zu injizieren. Zu viele, und die Lungen werden mit Metastasen und benachbarten Brennpunkte werden voneinander nicht zu unterscheiden abgedeckt sein. Zu wenig, und der Einfluss eines therapeutischen Mittels wird aufgrund inhärenter vari ununterscheidbar seintionen zwischen den Injektionen. Um eine optimale Anzahl von Foci in den Lungen der C57BL / 6-Mäusen zu erhalten, ist es notwendig, die Anzahl der injizierten Zellen mit der Menge von etablierten metastasierenden Foci auf der Oberfläche der Lunge, während unter Berücksichtigung der Unterscheidbarkeit der einzelnen zu korrelieren Brennpunkte. Dieses Protokoll wird ein metastasierendem murine Melanommodell für C57BL / 6-Mäuse zeigen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1227">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:377px;">Trypsin</td>
			<td style="width:275px;">Corning</td>
			<td style="width:288px;">MT25052CV</td>
			<td style="width:287px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RPMI 1640 Medium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>MT15040CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phase Contraast Hemacytometer</td>
			<td>Hausser</td>
			<td>02-671-54</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micro-Fine IV Insulin Syringes</td>
			<td>BD</td>
			<td>14-829-1D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sterile Alcohol Prep Pads</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>22-363-750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse Restrainer</td>
			<td>Braintree Scientific</td>
			<td>NC9999969</td>
			<td>Restrainer choice depends on age/size of mice</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Heating Pad</td>
			<td>Harry Schein</td>
			<td>NC0012697</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

injection of syngeneic murine melanoma cells to determine their metastatic potential in the lungs

Approximately 90% of human cancer deaths are linked to metastasis. Despite the prevalence and relative harm of metastasis, therapeutics for treatment or prevention are lacking. We report a method for the establishment of pulmonary metastases in mice, useful for the study of this phenomenon. Tail vein injection of B57BL/6J mice with B16-BL6 is among the most used models for melanoma metastases. Some of the circulating tumor cells establish themselves in the lungs of the mouse, creating "experimental" metastatic foci. With this model it is possible to measure the relative effects of therapeutic agents on the development of cancer metastasis. The difference in enumerated lung foci between treated and untreated mice indicates the efficacy of metastases neutralization. However, prior to the investigation of a therapeutic agent, it is necessary to determine an optimal number of injected B16-BL6 cells for the quantitative analysis of metastatic foci. Injection of too many cells may result in an overabundance of metastatic foci, impairing proper quantification and overwhelming the effects of anti-cancer therapies, while injection of too few cells will hinder the comparison between treated and controls.

Bei Sichtprüfung ist die Variation in der Oberflächen Foci evident. Zählen der Anzahl von Tumoren unter einem Präpariermikroskop sollte eine lineare Beziehung zwischen der Anzahl der injizierten Tumorzellen und die Anzahl der daraus resultierenden und zählbar Foci ergeben. Verwendung einer optimalen Anzahl von injizierbaren Zellen ist das Ziel , eine , wenn die Lunge nicht vollständig abgedeckt, da sie auf 500.000 Zellen / ml in 1A sind, und nicht zu dünn bedeckt ist , wie sie bei 62.500 Zellen / ml und 125.000 Zellen / ml. Dies ist auch quantifizierbar durch lineare Korrelation (1B). <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/54039/54039fig1.jpg" /> Abbildung 1. Lung Foci Resultierend aus Schwanzvene injiziert B16 / BL6 Zellen. (A) Lung Foci auf der Oberfläche der Lungen von C57BL / 6 - Mäuse als braune Kreis Massen (repräsentative Foki unter Pfeile) visualisiert werden. Da die Höhlenkeit der Zellkultur injiziert (über jedem Bild) erhöht, so die entsprechende Anzahl tut Lungenherde resultierenden (unter jedem Bild). Die Lungen aus der Maus mit der höchsten Dichte der injizierten Zellen hat die größte optische Abdeckung von Lungenherde. Maßstabsbalken repräsentieren 20 mm. (B) Enumeration der Lunge Brennpunkte relativ zu der Zellkulturdichte. Es ist eine annähernd lineare Beziehung über 125.000 Zellen / ml, wie durch Hämocytometer bestimmt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54039/54039fig1large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54039/54039fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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Injection of Syngeneic Murine Melanoma Cells to Determine Their Metastatic Potential in the Lungs

Metastasis plays a profound role in the virulence of cancer, accounting for an estimated 90% of deaths. We report a protocol for a metastatic melanoma model in mice that is useful for determining the efficacy of therapeutic agents against this clinical phenomenon.

Die Injektion von syngenen murinen Melanomzellen ihre metastatische Potential in der Lunge zu bestimmen

Approximately 90% of human cancer deaths are linked to metastasis.  Despite the prevalence and relative harm of metastasis, therapeutics for treatment or ...

injection-syngeneic-murine-melanoma-cells-to-determine-their

Research

JoVE Journal

Medicine

17.5K Aufrufe.  Beth Israel Deaconess Medical Center & Harvard Medical School. Metastasis plays a profound role in the virulence of cancer, accounting for an estimated 90% of deaths. We report a protocol for a metastatic melanoma model in mice that is useful for determining the efficacy of therapeutic agents against this clinical phenomenon.

Serie: Injection of Syngeneic Murine Melanoma Cells to Determine Their Metastatic Potential in the Lungs

An In Vitro System to Study Tumor Dormancy and the Switch to Metastatic Growth

Recurrence of breast cancer often follows a long latent period in which there are no signs of cancer, and metastases may not become clinically apparent until many years after removal of the primary tumor and adjuvant therapy. A likely explanation of this phenomenon is that tumor cells have seeded metastatic sites, are resistant to conventional therapies, and remain dormant for long periods of time 1-4.
The existence of dormant cancer cells at secondary sites has been described previously as quiescent solitary cells that neither proliferate nor undergo apoptosis 5-7. Moreover, these solitary cells has been shown to disseminate from the primary tumor at an early stage of disease progression 8-10 and reside growth-arrested in the patients' bone marrow, blood and lymph nodes 1,4,11. Therefore, understanding mechanisms that regulate dormancy or the switch to a proliferative state is critical for discovering novel targets and interventions to prevent disease recurrence. However, unraveling the mechanisms regulating the switch from tumor dormancy to metastatic growth has been hampered by the lack of available model systems.
in vivo and ex vivo model systems to study metastatic progression of tumor cells have been described previously 1,12-14. However these model systems have not provided in real time and in a high throughput manner mechanistic insights into what triggers the emergence of solitary dormant tumor cells to proliferate as metastatic disease. We have recently developed a 3D in vitro system to model the in vivo growth characteristics of cells that exhibit either dormant (D2.OR, MCF7, K7M2-AS.46) or proliferative (D2A1, MDA-MB-231, K7M2) metastatic behavior in vivo . We demonstrated that tumor cells that exhibit dormancy in vivo at a metastatic site remain quiescent when cultured in a 3-dimension (3D) basement membrane extract (BME), whereas cells highly metastatic in vivo readily proliferate in 3D culture after variable, but relatively short periods of quiescence. Importantly by utilizing the 3D in vitro model system we demonstrated for the first time that the ECM composition plays an important role in regulating whether dormant tumor cells will switch to a proliferative state and have confirmed this in in vivo studies15-17. Hence, the model system described in this report provides an in vitro method to model tumor dormancy and study the transition to proliferative growth induced by the microenvironment.

An In Vitro System to Study Tumor Dormancy and the Switch to Metastatic Growth

A modified 3-D in vitro system is presented in which growth characteristics of several tumor cell lines in reconstituted basement membrane correlate with the dormant or proliferative behavior of the tumor cells at a metastatic secondary site in vivo.

Ein In Vitro System zur Tumor Vegetationsruhe und die Umstellung auf Metastasen Study

Recurrence of breast cancer often follows a long latent period in which there are no signs of cancer, and metastases may not become clinically apparent ...

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Medizin

The Measurement and Treatment of Suppression in Amblyopia

Amblyopia, a developmental disorder of the visual cortex, is one of the leading causes of visual dysfunction in the working age population. Current estimates put the prevalence of amblyopia at approximately 1-3%1-3, the majority of cases being monocular2. Amblyopia is most frequently caused by ocular misalignment (strabismus), blur induced by unequal refractive error (anisometropia), and in some cases by form deprivation.
Although amblyopia is initially caused by abnormal visual input in infancy, once established, the visual deficit often remains when normal visual input has been restored using surgery and/or refractive correction. This is because amblyopia is the result of abnormal visual cortex development rather than a problem with the amblyopic eye itself4,5 . Amblyopia is characterized by both monocular and binocular deficits6,7 which include impaired visual acuity and poor or absent stereopsis respectively. The visual dysfunction in amblyopia is often associated with a strong suppression of the inputs from the amblyopic eye under binocular viewing conditions8. Recent work has indicated that suppression may play a central role in both the monocular and binocular deficits associated with amblyopia9,10 .
Current clinical tests for suppression tend to verify the presence or absence of suppression rather than giving a quantitative measurement of the degree of suppression. Here we describe a technique for measuring amblyopic suppression with a compact, portable device11,12 . The device consists of a laptop computer connected to a pair of virtual reality goggles. The novelty of the technique lies in the way we present visual stimuli to measure suppression. Stimuli are shown to the amblyopic eye at high contrast while the contrast of the stimuli shown to the non-amblyopic eye are varied. Patients perform a simple signal/noise task that allows for a precise measurement of the strength of excitatory binocular interactions. The contrast offset at which neither eye has a performance advantage is a measure of the "balance point" and is a direct measure of suppression. This technique has been validated psychophysically both in control13,14 and patient6,9,11 populations.
In addition to measuring suppression this technique also forms the basis of a novel form of treatment to decrease suppression over time and improve binocular and often monocular function in adult patients with amblyopia12,15,16 . This new treatment approach can be deployed either on the goggle system described above or on a specially modified iPod touch device15.

Amblyopia is a developmental disorder of the visual cortex that is often accompanied by strong suppression of one eye. We present a new technique for measuring and treating interocular suppression in patients with amblyopia that can be deployed using virtual reality goggles or a portable iPod Touch device.

Die Messung und Behandlung von Unterdrückung in Amblyopie

Amblyopia, a developmental disorder of the visual cortex, is one of the leading causes of visual dysfunction in the working age population. Current ...

Using Quantitative Real-time PCR to Determine Donor Cell Engraftment in a Competitive Murine Bone Marrow Transplantation Model

Murine bone marrow transplantation models provide an important tool in measuring hematopoietic stem cell (HSC) functions and determining genes/molecules that regulate HSCs. In these transplant model systems, the function of HSCs is determined by the ability of these cells to engraft and reconstitute lethally irradiated recipient mice. Commonly, the donor cell contribution/engraftment is measured by antibodies to donor- specific cell surface proteins using flow cytometry. However, this method heavily depends on the specificity and the ability of the cell surface marker to differentiate donor-derived cells from recipient-originated cells, which may not be available for all mouse strains. Considering the various backgrounds of genetically modified mouse strains in the market, this cell surface/ flow cytometry-based method has significant limitations especially in mouse strains that lack well-defined surface markers to separate donor cells from congenic recipient cells. Here, we reported a PCR-based technique to determine donor cell engraftment/contribution in transplant recipient mice. We transplanted male donor bone marrow HSCs to lethally irradiated congenic female mice. Peripheral blood samples were collected at different time points post transplantation. Bone marrow samples were obtained at the end of the experiments. Genomic DNA was isolated and the Y chromosome specific gene, Zfy1, was amplified using quantitative Real time PCR. The engraftment of male donor-derived cells in the female recipient mice was calculated against standard curve with known percentage of male vs. female DNAs. Bcl2 was used as a reference gene to normalize the total DNA amount. Our data suggested that this approach reliably determines donor cell engraftment and provides a useful, yet simple method in measuring hematopoietic cell reconstitution in murine bone marrow transplantation models. Our method can be routinely performed in most laboratories because no costly equipment such as flow cytometry is required.

Determining donor cell engraftment presents a challenge in mouse bone marrow transplant models that lack well-defined phenotypical markers. We described a methodology to quantify male donor cell engraftment in female transplant recipient mice. This method can be used in all mouse strains for the study of HSC functions.

Mittels quantitativer real-time PCR zum Donor Cell Engraftment in einem Competitive Murine Bone Marrow Transplantation Modell fest

Murine bone marrow transplantation models provide an important tool in measuring hematopoietic stem cell (HSC) functions and determining genes/molecules ...

Myocardial Infarction and Functional Outcome Assessment in Pigs

Introduction of newly discovered cardiovascular therapeutics into first-in-man trials depends on a strictly regulated ethical and legal roadmap. One important prerequisite is a good understanding of all safety and efficacy aspects obtained in a large animal model that validly reflect the human scenario of myocardial infarction (MI). Pigs are widely used in this regard since their cardiac size, hemodynamics, and coronary anatomy are close to that of humans. Here, we present an effective protocol for using the porcine MI model using a closed-chest coronary balloon occlusion of the left anterior descending artery (LAD), followed by reperfusion. This approach is based on 90 min of myocardial ischemia, inducing large left ventricle infarction of the anterior, septal and inferoseptal walls. Furthermore, we present protocols for various measures of outcome that provide a wide range of information on the heart, such as cardiac systolic and diastolic function, hemodynamics, coronary flow velocity, microvascular resistance, and infarct size. This protocol can be easily tailored to meet study specific requirements for the validation of novel cardioregenerative biologics at different stages (i.e. directly after the acute ischemic insult, in the subacute setting or even in the chronic MI once scar formation has been completed). This model therefore provides a useful translational tool to study MI, subsequent adverse remodeling, and the potential of novel cardioregenerative agents.

This protocol describes the porcine myocardial infarction (MI) model using a 90 min closed-chest coronary balloon occlusion of the left anterior descending artery (LAD), followed by reperfusion. Furthermore, the protocol for several outcome parameters, such as cardiac function, hemodynamics, microvascular resistance, and infarct size, are also presented.

Myokardinfarkt und Functional Outcome Assessment in Schweine

Introduction of newly discovered cardiovascular therapeutics into first-in-man trials depends on a strictly regulated ethical and legal roadmap. One ...

A Modified In vitro Invasion Assay to Determine the Potential Role of Hormones, Cytokines and/or Growth Factors in Mediating Cancer Cell Invasion

Blood serum serves as a chemoattractant towards which cancer cells migrate and invade, facilitating their intravasation into microvessels. However, the actual molecules towards which the cells migrate remain elusive. This modified invasion assay has been developed to identify targets which drive cell migration and invasion. This technique compares the invasion index under three conditions to determine whether a specific hormone, growth factor, or cytokine plays a role in mediating the invasive potential of a cancer cell. These conditions include i) normal fetal bovine serum (FBS), ii) charcoal-stripped FBS (CS-FBS), which removes hormones, growth factors, and cytokines and iii) CS-FBS + molecule (denoted &#8220;X&#8221;). A significant change in cell invasion with CS-FBS as compared to FBS, indicates the involvement of hormones, cytokines or growth factors in mediating the change. Individual molecules can then be added back to CS-FBS to assay their ability to reverse or rescue the invasion phenotype. Furthermore, two or more factors can be combined to evaluate the additive or synergistic effects of multiple molecules in driving or inhibiting invasion. Overall, this method enables the investigator to determine whether hormones, cytokines, and/or growth factors play a role in cell invasion by serving as chemoattractants or inhibitors of invasion for a particular type of cancer cell or a specific mutant. By identifying specific chemoattractants and inhibitors, this modified invasion assay may help to elucidate signaling pathways that direct cancer cell invasion.

A Modified In vitro Invasion Assay to Determine the Potential Role of Hormones, Cytokines and/or Growth Factors in Mediating Cancer Cell Invasion

This video article describes a modified in vitro method to examine the role of hormones, cytokines and/or growth factors in driving cancer cell invasion.

Eine modifizierte<em&gt; In-vitro-</em&gt; Invasion Assay, um die mögliche Rolle von Hormonen, Cytokinen und / oder Wachstumsfaktoren bei der Vermittlung der Invasion von Krebszellen fest,

Blood serum serves as a chemoattractant towards which cancer cells migrate and invade, facilitating their intravasation into microvessels. However, the ...

Focus Formation: A Cell-based Assay to Determine the Oncogenic Potential of a Gene

Malignant transformation of cells is typically associated with increased proliferation, loss of contact inhibition, acquisition of anchorage-independent growth potential, and the ability to form tumors in experimental animals1. In NIH 3T3 cells, the Ras signal transduction pathway is known to trigger many of these events, what is known as Ras transformation. The introduction of an overexpressed gene in NIH 3T3 cells may promote morphological transformation and loss of contact inhibition, which can help determine the oncogenic potential of that gene of interest. An assay that provides a straightforward method to assess one aspect of the transforming potential of an oncogene is the Focus Formation Assay (FFA)2. When NIH 3T3 cells divide normally in culture, they do so until they reach a confluent monolayer. However, in the presence of an overexpressed oncogene, these cells can begin to grow in dense, multilayered foci1 that can be visualized and quantified by crystal violet or Hema 3 staining. In this article we describe the FFA protocol with retroviral transduction of the gene of interest into NIH 3T3 cells, and how to quantify the number of foci through staining. Retroviral transduction offers a more efficient method of gene delivery than transfection, and the use of an ecotropic murine retrovirus provides a biosafety control when working with potential human oncogenes.

The Focus Formation Assay provides a straightforward method to assess the transforming potential of a candidate oncogene.

Fokus Formation: Ein Assay auf Zellbasis, um das onkogene Potential eines Gens zu bestimmen

Malignant transformation of cells is typically associated with increased proliferation, loss of contact inhibition, acquisition of anchorage-independent ...

Measurement of the Pressure-volume Curve in Mouse Lungs

In recent decades the mouse has become the primary animal model of a variety of lung diseases. In models of emphysema or fibrosis, the essential phenotypic changes are best assessed by measurement of the changes in lung elasticity. To best understand specific mechanisms underlying such pathologies in mice, it is essential to make functional measurements that can reflect the developing pathology. Although there are many ways to measure elasticity, the classical method is that of the total lung pressure-volume (PV) curve done over the whole range of lung volumes. This measurement has been made on adult lungs from nearly all mammalian species dating back almost 100 years, and such PV curves also played a major role in the discovery and understanding of the function of pulmonary surfactant in fetal lung development. Unfortunately, such total PV curves have not been widely reported in the mouse, despite the fact that they can provide useful information on the macroscopic effects of structural changes in the lung. Although partial PV curves measuring just the changes in lung volume are sometimes reported, without a measure of absolute volume, the nonlinear nature of the total PV curve makes these partial ones very difficult to interpret. In the present study, we describe a standardized way to measure the total PV curve. We have then tested the ability of these curves to detect changes in mouse lung structure in two common lung pathologies, emphysema and fibrosis. Results showed significant changes in several variables consistent with expected structural changes with these pathologies. This measurement of the lung PV curve in mice thus provides a straightforward means to monitor the progression of the pathophysiologic changes over time and the potential effect of therapeutic procedures.

Here we present a protocol to simply and reliably measure the lung pressure-volume curve in mice, showing that it is sufficiently sensitive to detect phenotypic parenchymal changes in two common lung pathologies, pulmonary fibrosis and emphysema. This metric provides a means to quantify the lung&#8217;s structural changes with developing pathology.

Die Messung der Druck-Volumen-Kurve in der Mäuselunge

In recent decades the mouse has become the primary animal model of a variety of lung diseases. In models of emphysema or fibrosis, the essential ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor initiation, metastasis and resistance to radio- and chemotherapy. Here we describe a specific methodology for culturing primary human pancreatic CSCs as tumor spheres in anchorage-independent conditions. Cells are grown in serum-free, non-adherent conditions in order to enrich for CSCs while their more differentiated progenies do not survive and proliferate during the initial phase following seeding of single cells. This assay can be used to estimate the percentage of CSCs present in a population of tumor cells. Both size (which can range from 35 to 250 micrometers) and number of tumor spheres formed represents CSC activity harbored in either bulk populations of cultured cancer cells or freshly harvested and digested tumors 1,2. Using this assay, we recently found that metformin selectively ablates pancreatic CSCs; a finding that was subsequently further corroborated by demonstrating diminished expression of pluripotency-associated genes/surface markers and reduced in vivo tumorigenicity of metformin-treated cells. As the final step for preclinical development we treated mice bearing established tumors with metformin and found significantly prolonged survival. Clinical studies testing the use of metformin in patients with PDAC are currently underway (e.g., NCT01210911, NCT01167738, and NCT01488552). Mechanistically, we found that metformin induces a fatal energy crisis in CSCs by enhancing reactive oxygen species (ROS) production and reducing mitochondrial transmembrane potential. In contrast, non-CSCs were not eliminated by metformin treatment, but rather underwent reversible cell cycle arrest. Therefore, our study serves as a successful example for the potential of in vitro sphere formation as a screening tool to identify compounds that potentially target CSCs, but this technique will require further in vitro and in vivo validation to eliminate false discoveries.

Pancreatic cancer stem cells (CSCs) can be expanded in vitro using the anchorage-independent sphere culture technique, which represents a powerful tool to study CSC biology and can serve as the first step to develop novel CSC-targeting therapies. Here the methodology for expanding, analyzing and targeting of pancreatic CSCs is provided.

Studieren Bauchspeicheldrüsenkrebs Stammzelleigenschaften für die Entwicklung neuer Behandlungsstrategien

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

A "Patient-Like" Orthotopic Syngeneic Mouse Model of Hepatocellular Carcinoma Metastasis

The majority of cancer-related deaths are caused by the metastasis of the cancer rather than the primary tumor itself. Yet, the underlying mechanisms of cancer metastasis are still unclear. Animal models are essential for elucidating the mechanisms and for evaluating novel strategies for the treatment of metastatic cancers. Here, an in-depth description of a &#8220;patient-like&#8221; orthotopic syngeneic mouse model for exploring the mechanisms of metastasis of solid organ tumors is provided. The survival surgical implantation of BNL 1ME A.7R.1 mouse hepatocellular carcinoma cells directly into the liver (the organ of origin) of the inbred wild-type immune competent laboratory mouse strain, BALB/c is described. The success and reproducibility of this methodology recommends it for widespread use in elucidating the biological mechanisms of solid organ cancer metastasis.

The metastatic spread of cancer is the major cause of cancer-related deaths. We provide an in-depth description of our survival surgery methodology for establishing a &#8220;patient-like&#8221; orthotopic syngeneic mouse model system for studying the mechanisms of metastasis in solid organ tumors.

Ein &quot;Patient-Like&quot; Orthotope Syngene Maus-Modell der Leberzellkarzinom Metastasen

The majority of cancer-related deaths are caused by the metastasis of the cancer rather than the primary tumor itself. Yet, the underlying mechanisms of ...

Isolation of Endothelial Progenitor Cells from Healthy Volunteers and Their Migratory Potential Influenced by Serum Samples After Cardiac Surgery

Endothelial progenitor cells (EPCs) are recruited from the bone marrow under pathological conditions like hypoxia and are crucially involved in the neovascularization of ischemic tissues. The origin, classification and characterization of EPCs are complex; notwithstanding, two prominent sub-types of EPCs have been established: so-called &#34;early&#34; EPCs (subsequently referred to as early-EPCs) and late-outgrowth EPCs (late-EPCs). They can be classified by biological properties as well as by their appearance during in vitro culture. While &#34;early&#34; EPCs appear in less than a week after culture of peripheral blood-derived mononuclear cells in EC-specific media, late-outgrowth EPCs can be found after 2-3 weeks. Late-outgrowth EPCs have been recognized to be directly involved in neovascularization, mainly through their ability to differentiate into mature endothelial cells, whereas &#34;early&#34; EPCs express various angiogenic factors as endogenous cargo to promote angiogenesis in a paracrine manner. During myocardial ischemia/reperfusion (I/R), various factors control the homing of EPCs to regions of blood vessel formation.
Macrophage migration inhibitory factor (MIF) is a chemokine-like pro-inflammatory and ubiquitously expressed cytokine and was recently described to function as key regulator of EPCs migration at physiological concentrations1. Interestingly, MIF is stored in intracellular pools and can rapidly be released into the blood stream after several stimuli (e.g. myocardial infarction). 
This protocol describes a method for the reliable isolation and culture of early-EPCs from adult human peripheral blood based on CD34-positive selection with subsequent culture in medium containing endothelial growth factors on fibronectin-coated plates for use in in vitro migration assays against serum samples of cardiac surgical patients. Furthermore, the migratory influence of MIF on chemotaxis of EPCs compared to other well-known angiogenesis-stimulating cytokines is demonstrated.

Endothelial progenitor cells (EPCs) are crucially involved in the neovascularization of ischemic tissues. This method describes the isolation of human EPCs from peripheral blood, as well as the identification of their migratory potential against serum samples of cardiac surgical patients.

Isolierung von endothelialen Vorläuferzellen von gesunden Freiwilligen und ihre Migratory Potential Beeinflusst von Serumproben nach einer Herzoperation

Endothelial progenitor cells (EPCs) are recruited from the bone marrow under pathological conditions like hypoxia and are crucially involved in the ...