Ulusal Kanser Enstitüsü hibe 1R03CA172923 kısmen desteklenmiştir.

Etik Beyanı: Araştırmaya farelerin kullanımı, temel biyoloji veya hastalığın nihai tedaviye yönelik insan anlayışı ilerletmek olabilir durumlarda kabul edilebilir. 1. Sipariş <ol><li> Satın alma dişi C57BL / 6 fareleri (6 yaş - 8 hafta), grup başına 5 fare. fareler için birkaç gün ayarlamak için izin ver. </li></ol> B16-BL6 hücrelerinin 2. Hazırlık <ol><li> steril bir başlık 37 derecelik kuvöz ve yerden hücre kültür plakaları çıkarın. Plakalar, B16-BL6 murin melanom hücreleri ile yaklaşık% 70 konfluent olmalıdır. Daha büyük bir izdiham hücreleri metastatik potansiyeli değiştirebilir. </li><li> 1 dakika boyunca bekletin, plaka başına 1 ml% 0.05 tripsin-EDTA ekleyin ve sonra tripsin-medya çözümü aspire. </li><li> plaka başına tripsin 1 ml ilave edilir ve 10 dakika boyunca inkübatör plakaları döndürür. </li><li> Steril kaput inkübatör plakaları hareket sonra serumsuz Rosewell Park Memorial Institute Mediu&#39;nun 4 ml eklemekHer plaka için M (RPMI). </li><li> steril, motorlu pipetle hücreler toplanır. Hücreleri yukarı kırmak için, çok hafif bir açıyla basılı ucu, plakanın alt karşı hücreleri çıkarın. Aksi takdirde çıkarma iğne tıkanmasına neden olabilecek hücre kümeleri, yeterli ayrılmasını sağlamak amacıyla birkaç kez tekrarlayın. Hatırlamak ve 50 ml konik tüp aktarın. </li><li> Hücre yoğunluğu belirlemek için bir hemasitometre kullanarak. Sabit B16-BL6 hücrelerinin toplam sayısını tutulması, serumsuz RPMI miktarını belirlemek 0, 0.065, 0.015, 0.25 ve 0.5 milyon hücre / ml nihai konsantrasyonları elde etmek için gerekli. </li><li> Eşit 15 ml konik tüpler 50 ml tüp medya bölmeyin. 5 dakika boyunca 2,250 x g&#39;de konik tüpler santrifüjleyin. medya süzün. serumsuz RPMI uygun bir hacmi ilave edin ve hemasitometre ile arzu edilen hücre yoğunluğu teyit etmektedir. Ek RPMI ekleme veya iplik ve buna göre daha küçük bir düzeyde hacim içinde yeniden süspanse edilerek densities- ayarlayın. </li><li> Kısım 500 ulbuz üzerinde etiketli 1.8 ml tüpler içine her bir hücre süspansiyonu. </li></ol> 3. Kuyruk Ven Enjeksiyon <ol><li> kuyruk tarafından düzenlenen bir fare, alın ve fare süzgeç içine arka önce onu yönlendirir. Bunun dışında kuyruk ile sabitleyicinin ana odasındaki gövde ile, süzgeç sonuna doğru fareyi çekin. Fare güvenli olana kadar itmeye devam süzgeç-piston yerleştirin. </li><li> yanal kuyruk venleri bir yukarı baktığından emin 90 derece gibi fare döndürün. bir alkol takımını kullanarak, şiddetle kuyruk ven en görünür olduğu durumlarda, fare kuyruğunun tarafını temizlemek. Not: İyi bir aydınlatma B57BL / 6J fareler üzerinde etkili kuyruk ven görünüm için esastır. Isı lambaları ya da ısıtılmış ameliyat yastıkları, gerekli olmasa da, aynı zamanda kuyruk ven hacmini arttırarak yardımcı olacaktır. </li><li> Bir steril kültür kaput, 2.000.000 hücre / ml&#39;lik bir tüp hücre kültür ortamında 300 ul toplar. s Flicking, iğne ters çevirinide ve şırınga kabarcıklar çıkarmak için, dalgıç bastırıyor. 250 ul son hacim elde etmek için kültür-RPMI çıkarın. </li><li> baskın olmayan el ile fare kuyruğu uzatın. baskın olmayan el işaret parmağı ile yükseltilmiş kuyruk yakın ucuna, ve başparmak ile depresif kuyruk distal kısmı ile kuyruk tutun. Not: Bu şekilde, kuyruk damarından, lateral bir pozisyonda tutulur, kuyruk daha uzak kısmında mümkün olan bir uyumlu girişle, engelleyicinin yüzeyine paraleldir. </li><li> ile başlayan bir dakika aşağı doğru bir açıyla, distal ucuna doğru, kuyruk damar içine iğne takın ve daha sonra (iğne şırınga göreli piston ucunu düşürücü) daha fazla ekleme üzerine kuyruk damarından açısını maç için iğne ayarlamak . </li><li> kuyruk damar içine iğne yaklaşık 1 cm yerleştirin. yerleştirildikten sonra iğne sabit tutarak, pistonu itmek başlar. Not: iğne kuyruk ven ise ve iğne ucu not medya damar içine engellenmeden akması gerektiğini engel. Etkili enjeksiyonu, damar kan açıklık ile karakterize edilir. Orada direnç, ya da bir kabarcık enjeksiyon yerinde oluşturmak için başlarsa, iğne kaldırmak ve kuyruk damarından boyunca daha yakın bir yerde tekrar deneyin. </li><li> damardan iğne çıkarın ve atın. herhangi bir kanamayı durdurmak için giriş sitesine karşı gazlı bez tutun. </li><li> süzgeç pistonu çıkarın ve alıcı kafese fareyi koyun. </li><li> Diğer tüm konsantrasyonları için tekrarlayın. Not:. Akciğer odak kuruluş yaklaşık 2 alır - değişkenlik hücre hattı ve odaklar istenen boyutuna bağlı olarak, 3 hafta 9 Bu arada, fareler aşırı nefes nefese gibi, erken ötenazi garanti verebilir belirtiler açısından takip edilmelidir. </li></ol> 4. Akciğer Foci Sayma <ol><li> CO2 bir CO2 odası içinde yerleştirilmesi ve% 100 açığa fare Euthanize </sub&gt; 5 dakika boyunca dakikada odası hacminin% 10-30 olarak tanıttı. Bir servikal dislokasyon ile izleyin. </li><li> Strafor fareyi splay. cerrahi makas kullanarak, sternum boyunca bir cerrahi kesi oluşturun. </li><li> sternum kesi üstünden ve kaburga kafesinin açığa fare omuzlara doğru dallanma, hem iki ek kesiler olun. </li><li> akciğer ve kalp açığa gövde gelen göğüs kafesini kaldırmak için, iki kesim, sternum yan kenarları boyunca her olun. </li><li> cerrahi cımbız ile kalbi Holding, fare kalbi ve akciğerleri serbest, yemek borusu ve soluk borusunu kesti. Daha iyi görünüm için, 10X büyütme, bir mikroskop altında yerleştirin. </li><li> Sadece iki akciğerleri bırakarak, akciğerlerden kalbin parçalara ayır ve timus çıkarın. </li><li> Diseksiyon kapsamı altında akciğerler ile, akciğer odakları saymak başlar. Her odakları akciğerlerin yüzeyinde dairesel, kahverengi sırnaşma olarak görünmelidir. <ol><li> İçinfareler arasındaki tutarlılık, bir lobun yüzeyinde odaklarının sayısını ve o lob ters çevirin. Dört lobların her yapıyor ayrı ayrı kolay sayım için izin verir. </li></ol></li><li> kalıntılarını atmak, aksi halde, Kaydet ve IHC performans eğer akciğerlere düzeltmek. </li></ol>

<ol>
	<li>Chaffer, C. L., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+perspective+on+cancer+cell+metastasis.">A perspective on cancer cell metastasis.</a> Science. 331, 1559-1564 (2011).</li><li>Kalluri, R., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+basics+of+epithelial-mesenchymal+transition.">The basics of epithelial-mesenchymal transition.</a> J Clin Invest. 119 (6), 1420-1428 (2009).</li><li>Stetler-Stevenson, W. G., Aznavoorian, S., Liotta, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+cell+interactions+with+the+extracellular+matrix+during+invasion+and+metastasis.">Tumor cell interactions with the extracellular matrix during invasion and metastasis.</a> Annu Rev Cell Biol. 9, 541-573 (1993).</li><li>Allard, W. J., Matera, J., Miller, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+cells+circulate+in+the+peripheral+blood+of+all+major+carcinomas+but+not+in+healthy+subjects+or+patients+with+nonmalignant+disease.">Tumor cells circulate in the peripheral blood of all major carcinomas but not in healthy subjects or patients with nonmalignant disease.</a> Clin Cancer Res. 10, 6897-6904 (2004).</li><li>Dunn, G. P., Bruce, A. T., Ikeda, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+immunoediting:+from+iimmunosurveillance+to+tumor+escape.">Cancer immunoediting: from iimmunosurveillance to tumor escape.</a> Nat Immunol. 3, 991-998 (2002).</li><li>Hugo, H., Ackland, M. L., Blick, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial-mesenchymal+and+mesenchymal-epithelial+transition+in+carcinoma+progression.">Epithelial-mesenchymal and mesenchymal-epithelial transition in carcinoma progression.</a> J Cell Physiol. 213, 374-383 (2007).</li><li>Kang, Y., Massague, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial-mesenchymal+transitions:+Twist+in+development+and+metastasis.">Epithelial-mesenchymal transitions: Twist in development and metastasis.</a> Cell. 118, 277-279 (2004).</li><li>Hodi, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+survival+with+Ipilimumab+in+patients+with+metastatic+melanoma.">Improved survival with Ipilimumab in patients with metastatic melanoma.</a> NEJM. 363 (13), 711-723 (2002).</li><li>Ekwueme, D. U., Guy, G. P., Li, C., Rim, S. H., Parelkar, P., Chen, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+health+burden+and+economic+costs+of+cutaneous+melanoma+motality+by+race/ethnicity-United+States.">The health burden and economic costs of cutaneous melanoma motality by race/ethnicity-United States.</a> J. Am. Acad. Dermatol. 65, 133-143 (2011).</li><li>Alizadeh, A. M., Shiri, S., Farsinejad, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metastasis+review:+from+bench+to+bedside.">Metastasis review: from bench to bedside.</a> Tumor. Bio.Volume. 35, 8483-8523 (2014).</li><li>Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+metastasis+predetermined.">Is metastasis predetermined.</a> Mol. Oncol. 1 (3), 263-264 (2007).</li><li>Ishiguro, T., Nakajima, M., Naito, M., Muto, T., Tsuruo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+genes+differentially+expressed+in+B16+murine+melanoma+sublines+with+different+metastatic+potentials.">Identification of genes differentially expressed in B16 murine melanoma sublines with different metastatic potentials.</a> Cancer Res. 56 (4), 875-879 (1996).</li><li>Clark, E. A., Todd, R. G., Lander, E. S., Hynes, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+analysis+of+metastasis+reveals+an+essential+role+for+RhoC.">Genomic analysis of metastasis reveals an essential role for RhoC.</a> Nature. 406, 532-535 (2000).</li><li>Terranova, V. P., Hic, S., Diflorio, R. M., Lyall, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+cell+metastasis.">Tumor cell metastasis.</a> Crit. Rev. Oncol. Hematol. 5 (2), 87-114 (1986).</li><li>Elkin, M., Vlodavsky, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tail+vein+assay+of+cancer+metastasis.">Tail vein assay of cancer metastasis.</a> Curr Protoc in Cell Biol. , (2001).</li><li>Hagedorn, H. G., Bachmeier, B. E., Nerlich, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+degradation+of+basement+membranes+and+extracellular+matrix+and+their+regulation+by+TGF-beta+in+invasive+carcinomas+(Review).">Synthesis and degradation of basement membranes and extracellular matrix and their regulation by TGF-beta in invasive carcinomas (Review).</a> Int. J. Oncol. 18 (4), 669-681 (2001).</li><li>Hart, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+selection+and+characterization+of+an+invasive+variant+of+the+B16+melanoma.">The selection and characterization of an invasive variant of the B16 melanoma.</a> Am J Pathol. 97 (3), 587-600 (1979).</li><li>Overwijk, W. W., Restifo, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N.P.+B16+as+a+Mouse+Model+for+Human+Melanoma.">N.P. B16 as a Mouse Model for Human Melanoma.</a> Curr Protoc Immunol. 20 (1), (2001).</li></ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarları olduğunu beyan ederim.

Uzak yerlere kılcal yatak kendilerini kurarak bazen, birincil büyüme siteleri kaçmasına metastaz temsil ve kan ya da lenf sistemi gibi yollarla göç bir kuyruk damar enjeksiyonu gelen dolaşan tümör hücrelerinin. 14 protokol yukarıda açıklanan ikincil bir model olarak hizmet vermektedir metastaz. Enjekte B16-BL6 hücrelerinin ideal bir sayıda, deneyci kanser hücre metastazı üzerinde uygulanan ilaç veya bağışıklık hücre nüfus, post-nötralizasyon göreceli etkisini belirlemek olabilir. Bu protokol sınırlamaları vardır. Dolaşımdaki tümör hücrelerinin özellikleri için seçilmiş ve majör histokompatibilite kompleks sınıfı 1 moleküllerinin düşük düzeylerine sahip, bu yüzden imünojenik olan edilmiştir. 12 ayrıca, metastaz sayıda ani ve kümelenmiş bir giriş hastalarda normal senaryosunda aksine nerede metastatik tümör hücrelerinin küçük numaralarprimer tümör konumundan uzun bir zaman süresi içinde dağıtır. Buna ek olarak, intravenöz olarak ortaya tümör hücreleri doku kültüründen ve bir primer tümör kökenlidir. Bu nedenle, bu hücreler, hücre yapışması, göçü, bağışıklık tanıma ve alıcı organı kurulması değişiklikler sonucu ikincil metastazlar benzemez. 15,16 Alternatif bir protokol primer tümörlerin üretimi ve elde edilen &quot;kendiliğinden&quot; pulmoner metastazların analizi için B16 / BL6 deri altından enjeksiyonu olabilir. Bu &quot;kendiliğinden&quot; metastaz kendi &quot;deneysel&quot; muadillerine göre daha heterojenitesini ihtiva bulunmuştur, daha yakından insan hastaların bu bulundu. protokol metastaz üzerinde deneysel bir bileşiğin etkisini belirlemek için onun yetenek kısıtlamaktadır. bir yanal kuyruk damarı enjeksiyonu ile, kan dolaşımına enjekte melanom hücrelerinin sayısı saat ile yaklaşık olarak hesaplanabiliremocytometer. &quot;Spontane&quot; metastaz ile, ancak, akciğer odakları ortaya çıkan sayısında ek değişken ekleyerek, tümörler arasında daha farklılıklar bulunmaktadır. 16 Sonuç olarak, kuyruk ven B16-BL6 fare melanom modeli metastaz bir tedavi veya immünoterapi etkisini belirlemek için basit bir modeli temsil etmektedir. intravenöz dolaşımdaki tümör hücrelerini enjekte ederek, araştırmacılar bir ölçüde, hastalar sonrası metastaz için, çoğaltabilirsiniz. Kanser hastalarında metastatik tümör hücrelerinin yıkıcı etkilerini göz önüne alındığında, bu model metastaz çok adımlı süreci anlamak için güçlü bir araçtır.

Metastaz malignitesi olan hastalarda önemli bir ölüm nedenidir. kanser hücrelerinin metastaz yayılması işlemi tam olarak bilinmemektedir, ancak metastaz, adaptasyon yerinde damar komşu dokulara yayılması, intravasation lenfatiklerin ve damar sistemi, yaşam süresinde ve translokasyon dolaşım sistemi içinde, ekstravazasyonu dahil olmak üzere çeşitli aşamaları içerir gözükeceği çoğalması ve ikincil tümörlerin oluşumu ile yeni yerinde yeni yeni sitenin mikroçevresinin ve kolonizasyon. 1 bu biyolojik olayların her metastatik tümör hücrelerinin dönüşümü, yayılmasını ve hayatta kalma içerir. Örneğin, hücre dışı matris ile başarılı bir etkileşim ile birlikte mezenkimal fenotip tümör hücresi epitel fenotipinin dönüşüm, invazyon ve vücudun diğer bölgelerinde metastaz olanak tanımaktadır. 2,3 Ayrıca, bu metastatik hücrelerbünyesinde bir uzak yerinde implante edildiğinde dolaşan kan içinde hayatta ve ev sahibi bağışıklık gözetim kaçınmak gerekir. 4,5 Nihayet, tümör hücreleri ikincil tümörler çoğalmaya ve oluşturmak için kendi mikroçevresinin uyum sağlamak zorundadır. 6,7 nedenle metastaz kanser hastaları arasında yaygın bir olgu olmasına rağmen, metastatik tümör hücrelerinin terapötik müdahale için uygun olan açığına birden alanlar var. Melanom immünojenik doğası ve immunoterapi son faiz göz önüne alındığında, melanom için modeller. Gittikçe yararlıdır yalnız Amerika Birleşik Devletleri&#39;nde 8, melanom yılda yaklaşık 9.000 ölüm nedenidir. Melanom metastazı 9 Ortak yerleri, beyin kemikler , karaciğer ve akciğer. uzak bölgelere metastaz çoğunluğu kan yoluyla ortaya çıkar. Kandaki dolaşan tümör hücrelerinin bağışıklık açıklığını kaçmasına distal organ bir kılcal yatak ulaşmalıdır vebaşarılı bir şekilde kendilerini oluşturulması için kan damarı endotel hücreleri ile işgal. 4-7,10, 11 metastaz yaygın ve öldürücü olayları taklit etmek, fare B16-BL6 hücre hattı oluşturuldu. Ebeveyn C57BL / 6 melanom hücre hattı B16-F0 bir decedent, B16-BL6 mesane membran penetrasyonu 6 arda seçimleri ve ardından (B16-F10 sonuçlanır) damar içi enjeksiyon ile ilgili akciğer metastazı 10 birbirini takip eden seçimleri, son ürünüdür. Bu nedenle 12, bu da özellikle damar içine enjekte edildiği zaman farelerde metastaz odakları kurulması için güvenilir bir melanom hücre hattıdır. 13 implantasyon ve B16 / BL6 hücrelerinin büyümesini sağlamak için iki veya daha fazla hafta ardından B57BL / 6 fare kuyruk venine B16-BL6 hücrelerinin yeterli miktarda, enjeksiyonundan sonra, metastatik odaklar akciğerlerde oluşturacaktır. Diseksiyon mikroskobu ile ötanazi ve incelenmesi üzerine, sayısıBireysel odaklar mevcut belirlenebilir. enjekte B16-BL6 hücrelerinin sayısı akciğer yüzeyi üzerinde oluşturulmuş odaklarının sayısı ile ilişkilidir gibi bu da, bir doz-metastazı etkisi oluşturmak için de kullanılabilir. Bu model bilinmektedir metastatik hücrelerin soruşturma akciğer, karaciğer veya başka bir organda hızlı ve öngörülebilir yayılmasını ve kurulmasını kolaylaştırmak, kan dolaşımına doğrudan tanıtıldı &quot;deneysel metastaz&quot; olarak bilinir. Bu tümör hücreleri genellikle deri altına implante edilir &quot;spontane metastaz,&quot; aksine, ve organik kanser hücrelerini döken gelen metastaz kaynaklanmaktadır. 14,15 Farelerin kuyruk venleri içine B16 / BL6 hücrelerinin, uygun bir miktarı enjekte edilmesi önemlidir. Çok sayıda ve akciğer metastazları ile ele alınacaktır ve komşu odaklar birbirinden ayırt olacaktır. Çok az ve terapötik bir maddenin etkisi nedeniyle doğal değişkenlere ayırt edilemez olacakenjeksiyonlar arasında ations. C57BL / 6 farelerinin akciğerlerinde üzerine odaklar optimal sayısı elde etmek için, hesaba bireyin ayırt edilebilirliğini çekerken akciğer yüzeyine yerleşik metastatik odaklarının miktarı ile enjekte edilen hücrelerin sayısı ilişkilendirmek için gerekli olan odaklar. Bu protokol, C57BL / 6 fareleri için metastatik kemirgen melanoma modeli gösterecektir.

<table><tbody><tr><td>Trypsin</td><td>Corning</td><td>MT25052CV</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium</td><td>Corning</td><td>MT15040CM</td><td></td></tr><tr><td>Phase Contraast Hemacytometer</td><td>Hausser</td><td>02-671-54</td><td></td></tr><tr><td>Micro-Fine IV Insulin Syringes</td><td>BD</td><td>14-829-1D</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Alcohol Prep Pads</td><td>Fisherbrand</td><td>22-363-750</td><td></td></tr><tr><td>Mouse Restrainer</td><td>Braintree Scientific</td><td>NC9999969</td><td>Restrainer choice depends on age/size of mice</td></tr><tr><td>Heating Pad</td><td>Harry Schein</td><td>NC0012697</td><td>Optional</td></tr></tbody></table>

injection of syngeneic murine melanoma cells to determine their metastatic potential in the lungs

Approximately 90% of human cancer deaths are linked to metastasis. Despite the prevalence and relative harm of metastasis, therapeutics for treatment or prevention are lacking. We report a method for the establishment of pulmonary metastases in mice, useful for the study of this phenomenon. Tail vein injection of B57BL/6J mice with B16-BL6 is among the most used models for melanoma metastases. Some of the circulating tumor cells establish themselves in the lungs of the mouse, creating "experimental" metastatic foci. With this model it is possible to measure the relative effects of therapeutic agents on the development of cancer metastasis. The difference in enumerated lung foci between treated and untreated mice indicates the efficacy of metastases neutralization. However, prior to the investigation of a therapeutic agent, it is necessary to determine an optimal number of injected B16-BL6 cells for the quantitative analysis of metastatic foci. Injection of too many cells may result in an overabundance of metastatic foci, impairing proper quantification and overwhelming the effects of anti-cancer therapies, while injection of too few cells will hinder the comparison between treated and controls.

görsel inceleme üzerine, yüzey odaklarda varyasyonu görülmektedir. bir mikroskop altında tümörlerin sayısını sayma enjekte tümör hücrelerinin sayısı ve elde edilen sayısı ve sayılabilir odaklar arasındaki doğrusal bir ilişki verim gerekir. Enjekte edilebilir hücrelerin optimal numarasını kullanarak, hedef, 62.500 hücre / ml 125.000 hücreleri onlar / Şekil 1A 500,000 hücre / ml&#39;de, ve çok seyrek kapsamadığı şekilde, akciğerler tamamen kapalı olmayan bir olup mi. Bu, doğrusal bir korelasyon (Şekil 1B) nicelleştirilebilmektedir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/54039/54039fig1.jpg" /> Kuyruk Ven Kaynaklanan Şekil 1. Akciğer Foci B16 / BL6 Hücreleri Enjekte. (A) Akciğer odakları (oklar altında temsili odaklar) kahverengi dairesel kitleler olarak C57BL / 6 farelerden alınan akciğerlerin yüzeyinde görülebilir. dens olarak(Her görüntünün üzerinde) enjekte hücre kültürü lık yani (her görüntünün altında) akciğer odaklar ortaya çıkan karşılık gelen sayıda yapar artırır. enjekte edilen hücrelerin en yüksek yoğunlukta fareden akciğerler, akciğer odaklarının en büyük görsel kapsama sahiptir. Ölçek çubukları 20 mm temsil etmektedir. Hücre kültürü yoğunluğunun akciğer odakları nisbetle (B) Numaralama. Hemasitometre tarafından belirlenen 125,000 hücre / ml&#39;nin üzerinde yaklaşık doğrusal bir ilişki vardır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54039/54039fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Injection of Syngeneic Murine Melanoma Cells to Determine Their Metastatic Potential in the Lungs at JoVE.com

Injection of Syngeneic Murine Melanoma Cells to Determine Their Metastatic Potential in the Lungs

Metastasis plays a profound role in the virulence of cancer, accounting for an estimated 90% of deaths. We report a protocol for a metastatic melanoma model in mice that is useful for determining the efficacy of therapeutic agents against this clinical phenomenon.

Singenik Fare Melanom Hücreleri Enjeksiyon Akciğerler Onların Metastatik Potansiyeli belirleme

Approximately 90% of human cancer deaths are linked to metastasis.  Despite the prevalence and relative harm of metastasis, therapeutics for treatment or ...

injection-syngeneic-murine-melanoma-cells-to-determine-their

Research

JoVE Journal

Medicine

17.6K Görüntüleme.  Beth Israel Deaconess Medical Center & Harvard Medical School. Metastasis plays a profound role in the virulence of cancer, accounting for an estimated 90% of deaths. We report a protocol for a metastatic melanoma model in mice that is useful for determining the efficacy of therapeutic agents against this clinical phenomenon.

Video: Injection of Syngeneic Murine Melanoma Cells to Determine Their Metastatic Potential in the Lungs

Experimental Metastasis Assay

Metastasis is the leading cause of death in cancer patients. To understand the mechanism of metastasis, an experimental metastasis assay was established using immunodeficient mice. This article delineates the procedures involved in this assay, including sample preparation, intravenous injection, and culturing cells from lung metastases. Briefly, a pre-determined number of human cancer cells were prepared in vitro and directly injected into the circulation of immunodeficient mice through their tail veins. A small number of cells survive the turbulence in the circulation and grow as metastases in internal organs, such as lung. The injected mice are dissected after a certain period. The tissue distribution of metastases is determined under a dissecting microscope. The number of metastases in a specific tissue is counted and it directly correlates with the metastatic ability of the injected cancer cells. The arisen metastases are isolated and cultured in vitro as cell lines, which often show enhanced metastatic abilities than the parental line when injected again into immunodeficient mice. These highly metastatic derivatives become useful tools for identifying genes or molecular pathways that regulate metastatic progression.

This article describes the procedures of an experimental metastasis assay that is used to determine the metastatic potential of human cancer cell lines.

Deneysel metastaz Testi

Metastasis is the leading cause of death in cancer patients.  To understand the mechanism of metastasis, an experimental metastasis assay was established ...

Tıp

Combined Use of Tail Vein Metastasis Assays and Real-Time In Vivo Imaging to Quantify Breast Cancer Metastatic Colonization and Burden in the Lungs

Metastasis is the main cause of cancer-related deaths and there are limited therapeutic options for patients with metastatic disease. The identification and testing of novel therapeutic targets that will facilitate the development of better treatments for metastatic disease requires preclinical in vivo models. Demonstrated here is a syngeneic mouse model for assaying breast cancer metastatic colonization and subsequent growth. Metastatic cancer cells are stably transduced with viral vectors encoding firefly luciferase and ZsGreen proteins. Candidate genes are then stably manipulated in luciferase/ZsGreen-expressing cancer cells and then the cells are injected into mice via the lateral tail vein to assay metastatic colonization and growth. An in vivo imaging device is then used to measure the bioluminescence or fluorescence of the tumor cells in the living animals to quantify changes in metastatic burden over time. The expression of the fluorescent protein allows the number and size of metastases in the lungs to be quantified at the end of the experiment without the need for sectioning or histological staining. This approach offers a relatively quick and easy way to test the role of candidate genes in metastatic colonization and growth, and provides a great deal more information than traditional tail vein metastasis assays. Using this approach, we show that simultaneous knockdown of Yes associated protein (YAP) and transcriptional co-activator with a PDZ-binding motif (TAZ) in breast cancer cells leads to reduced metastatic burden in the lungs and that this reduced burden is the result of significantly impaired metastatic colonization and reduced growth of metastases.

The described approach combines experimental tail vein metastasis assays with in vivo live animal imaging to allow real-time monitoring of breast cancer metastasis formation and growth in addition to the quantification of metastasis number and size in the lungs.

Kuyruk Ven Metastaz Tahlilleri ve Gerçek Zamanlı Vivo Görüntüleme Kombine Kullanımı Meme Kanseri Metastatik Kolonizasyon ve Yük Akciğerlerde Quantify için

Metastasis is the main cause of cancer-related deaths and there are limited therapeutic options for patients with metastatic disease. The identification ...

Kanser Araştırmaları

Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells

Metastasis, the primary cause of morbidity and mortality for most cancer patients, can be challenging to model preclinically in mice. Few spontaneous metastasis models are available. Thus, the experimental metastasis model involving tail-vein injection of suitable cell lines is a mainstay of metastasis research. When cancer cells are injected into the lateral tail-vein, the lung is their preferred site of colonization. A potential limitation of this technique is the accurate quantification of the metastatic lung tumor burden. While some investigators count macrometastases of a pre-defined size and/or include micrometastases following sectioning of tissue, others determine the area of metastatic lesions relative to normal tissue area. Both of these quantification methods can be exceedingly difficult when the metastatic burden is high. Herein, we demonstrate an intravenous injection model of lung metastasis followed by an advanced method for quantifying metastatic tumor burden using image analysis software. This process allows for investigation of multiple end-point parameters, including average metastasis size, total number of metastases, and total metastasis area, to provide a comprehensive analysis. Furthermore, this method has been reviewed by a veterinary pathologist board-certified by the American College of Veterinary Pathologists (SEK) to ensure accuracy.

Intravenous injection of cancer cells is often used in metastasis research, but the metastatic tumor burden can be difficult to analyze. Herein, we demonstrate a tail-vein injection model of metastasis and include a novel approach to analyze the resulting metastatic lung tumor burden.

Tümör Hücrelerinin Lateral Kuyruk-Damar Enjeksiyonu Sonrasında Akciğer Metastazının Patolojik Analizi

Metastasis, the primary cause of morbidity and mortality for most cancer patients, can be challenging to model preclinically in mice. Few spontaneous ...

Analysis of Lymph Node Volume by Ultra-High-Frequency Ultrasound Imaging in the Braf/Pten Genetically Engineered Mouse Model of Melanoma

Tyr::CreER+,BrafCA/+,Ptenlox/lox&#160;genetically engineered mice (Braf/Pten mice) are widely used as an in vivo model of metastatic melanoma. Once a primary tumor has been induced by tamoxifen treatment, an increase in metastatic burden is observed within 4-6 weeks after induction. This paper shows how Ultra-High-Frequency UltraSound (UHFUS) imaging can be exploited to monitor the increase in metastatic involvement of the inguinal lymph nodes by measuring the increase in their volume.
The UHFUS system is used to scan anesthetized mice with a UHFUS linear probe (22-55 MHz, axial resolution 40 &#181;m). B-mode images from the inguinal lymph nodes (both left and right sides) are acquired in a short-axis view, positioning the animals in dorsal recumbency. Ultrasound records are acquired using a 44 &#181;m step size on a motorized mechanical arm. Afterward, two-dimensional (2D) B-mode acquisitions are imported into the software platform for ultrasound image post-processing, and inguinal lymph nodes are identified and segmented semi-automatically in the acquired cross-sectional 2D images. Finally, a total reconstruction of the three-dimensional (3D) volume is automatically obtained along with the rendering of the lymph node volume, which is also expressed as an absolute measurement.
This non-invasive in vivo technique is very well tolerated and allows the scheduling of multiple imaging sessions on the same experimental animal over 2 weeks. It is, therefore, ideal to assess the impact of pharmacological treatment on metastatic disease.

Melanoma is a very aggressive disease that quickly spreads to other organs. This protocol describes the application of ultra-high-frequency ultrasound imaging, coupled with 3D rendering, to monitor the volume of the inguinal lymph nodes in the Braf/Pten mouse model of metastatic melanoma.

Braf/Pten Genetiği Mühendisliğiyle Tasarlanmış Melanom Fare Modelinde Ultra Yüksek Frekanslı Ultrason Görüntüleme ile Lenf Düğümü Hacminin Analizi

Tyr::CreER+,BrafCA/+,Ptenlox/lox&#160;genetically engineered mice (Braf/Pten mice) are widely used as an in vivo model of metastatic melanoma. Once a ...

An Orthotopic Murine Model of Human Prostate Cancer Metastasis

Our laboratory has developed a novel orthotopic implantation model of human prostate cancer (PCa). As PCa death is not due to the primary tumor, but rather the formation of distinct metastasis, the ability to effectively model this progression pre-clinically is of high value. In this model, cells are directly implanted into the ventral lobe of the prostate in Balb/c athymic mice, and allowed to progress for 4-6 weeks. At experiment termination, several distinct endpoints can be measured, such as size and molecular characterization of the primary tumor, the presence and quantification of circulating tumor cells in the blood and bone marrow, and formation of metastasis to the lung. In addition to a variety of endpoints, this model provides a picture of a cells ability to invade and escape the primary organ, enter and survive in the circulatory system, and implant and grow in a secondary site. This model has been used effectively to measure metastatic response to both changes in protein expression as well as to response to small molecule therapeutics, in a short turnaround time.

This orthotopic model of human prostate cancer allows for quantification of tumor size, circulating tumor cells, and formation of distinct metastasis to the lung. As cells must escape the primary organ, enter the blood stream, and implant into a secondary site, this model effectively recapitulates the scenario in humans.

İnsan Prostat Kanser metastaz Ortotopik fare modeli

Our laboratory has developed a novel orthotopic implantation model of  human prostate cancer (PCa). As PCa death is not due to the primary tumor, but  ...

A Robust Discovery Platform for the Identification of Novel Mediators of Melanoma Metastasis

Metastasis is a complex process, requiring cells to overcome barriers that are only incompletely modeled by in vitro assays. A systematic workflow was established using robust, reproducible in vivo models and standardized methods to identify novel players in melanoma metastasis. This approach allows for data inference at specific experimental stages to precisely characterize a gene's role in metastasis. Models are established by introducing genetically modified melanoma cells via intracardiac, intradermal, or subcutaneous injections into mice, followed by monitoring with serial in vivo imaging. Once preestablished endpoints are reached, primary tumors and/or metastases-bearing organs are harvested and processed for various analyses. Tumor cells can be sorted and subjected to any of several 'omics' platforms, including single-cell RNA sequencing. Organs undergo imaging and immunohistopathological analyses to quantify the overall burden of metastases and map their specific anatomic location. This optimized pipeline, including standardized protocols for engraftment, monitoring, tissue harvesting, processing, and analysis, can be adopted for patient-derived, short-term cultures and established human and murine cell lines of various solid cancer types.

This article describes a workflow of techniques employed for testing novel candidate mediators of melanoma metastasis and their mechanism(s) of action.

Melanom Metastazının Yeni Arabulucularının Belirlenmesi için Sağlam Bir Keşif Platformu

Metastasis is a complex process, requiring cells to overcome barriers that are only incompletely modeled by in vitro assays. A systematic workflow was ...

In Vivo Imaging to Measure Spontaneous Lung Metastasis of Orthotopically-injected Breast Tumor Cells

Metastasis remains the primary cause of cancer-related death. The succession of events that characterize the metastatic cascade presents multiple opportunities for therapeutic intervention, and the ability to accurately model them in mice is critical to evaluate their effects. Here, a step-by-step protocol is presented for the establishment of orthotopic primary breast tumors and the subsequent monitoring of the establishment and growth of metastatic lesions in the lung using in vivo bioluminescence imaging. This methodology allows for the evaluation of treatment or its biological effects along the entire range of metastatic development, from primary tumor escape to outgrowth in the lungs. Breast orthotopic tumors are generated in mice via injection of a luciferase-labeled cell suspension in the 4th mammary gland. Tumors are allowed to grow and disseminate for a specific amount of time and are then surgically resected. Upon resection, spontaneous lung metastasis is detected, and the growth over time is monitored using in vivo bioluminescence imaging. At the desired experimental endpoint, lung tissue can be collected for downstream analysis. The treatment of established, clinically evident metastasis is critical to improve outcomes for stage IV cancer patients, and it can be evaluated through tail vein models of experimental lung metastasis. However, metastatic dissemination occurs early in breast cancer, and many patients have latent, subclinical disseminated disease after surgery. Utilization of spontaneous models such as this one provides the opportunity to study the whole spectrum of the disease, especially the systemic effects driven by treatment of the primary tumor such as pre-metastatic niche priming, and evaluate treatments on dormant and subclinical disease after surgery.

<meta charset="utf8"></head><body>Ortotopik Olarak Enjekte Edilen Meme Tümörü Hücrelerinin Spontan Akciğer Metastazını Ölçmek için İn Vivo Görüntüleme

The manuscript describes a methodology for the establishment as well as longitudinal growth monitoring of spontaneous lung metastasis from orthotopically-injected breast tumors, amenable to intervention at all stages of the metastatic cascade.

In vivo (İn canlı) Ortotopik Olarak Enjekte Edilen Meme Tümörü Hücrelerinin Spontan Akciğer Metastazını Ölçmek için Görüntüleme

Metastasis remains the primary cause of cancer-related death. The succession of events that characterize the metastatic cascade presents multiple ...

Primary Tumor and MEF Cell Isolation to Study Lung Metastasis

In breast tumorigenesis, the metastatic stage of the disease poses the greatest threat to the affected individual. Normal breast cells with altered genotypes now possess the ability to invade and survive in other tissues. In this protocol, mouse mammary tumors are removed and primary cells are prepared from tumors. The cells isolated from this procedure are then available for gene profiling experiments. For successful metastasis, these cells must be able to intravasate, survive in circulation, extravasate to distant organs, and survive in that new organ system. The lungs are the typical target of breast cancer metastasis. A set of genes have been discovered that mediates the selectivity of metastasis to the lung. Here we describe a method of studying lung metastasis from a genetically engineered mouse model.. Furthermore, another protocol for analyzing mouse embryonic fibroblasts (MEFs) from the mouse embryo is included. MEF cells from the same animal type provide a clue of non-cancer cell gene expression. Together, these techniques are useful in studying mouse mammary tumorigenesis, its associated signaling mechanisms and pathways of the abnormalities in embryos.

The goal of this protocol is to study breast tumorigenesis. With this technique, mouse mammary tumors are removed and primary cells are prepared from tumors. A lung extraction protocol is included for studying lung metastasis. Furthermore, another protocol for analyzing mouse embryonic fibroblasts from the mouse embryo is included.

Primer Tümör ve Akciğer Metastazı Eğitim için MEF Hücre İzolasyonu

In breast tumorigenesis, the metastatic stage of the disease poses the greatest threat to the affected individual. Normal breast cells with altered ...

Ex vivo Live Imaging of Lung Metastasis and Their Microenvironment

Metastasis is a major cause for cancer-related morbidity and mortality. Metastasis is a multistep process and due to its complexity, the exact cellular and molecular processes that govern metastatic dissemination and growth are still elusive. Live imaging allows visualization of the dynamic and spatial interactions of cells and their microenvironment. Solid tumors commonly metastasize to the lungs. However, the anatomical location of the lungs poses a challenge to intravital imaging. This protocol provides a relatively simple and quick method for ex vivo live imaging of the dynamic interactions between tumor cells and their surrounding stroma within lung metastasis. Using this method, the motility of cancer cells as well as interactions between cancer cells and stromal cells in their microenvironment can be visualized in real time for several hours. By using transgenic fluorescent reporter mice, a fluorescent cell line, injectable fluorescently labeled molecules and/or antibodies, multiple components of the lung microenvironment can be visualized, such as blood vessels and immune cells. To image the different cell types, a spinning disk confocal microscope that allows long-term continuous imaging with rapid, four-color image acquisition has been used. Time-lapse movies compiled from images collected over multiple positions and focal planes show interactions between live metastatic and immune cells for at least 4 hr. This technique can be further used to test chemotherapy or targeted therapy. Moreover, this method could be adapted for the study of other lung-related pathologies that may affect the lung microenvironment.

Ex vivo Live Imaging of Lung Metastasis and Their Microenvironment

We describe a relatively simple method for ex vivo live imaging of the tumor cell-stroma interactions within lung metastasis, utilizing fluorescent reporters in mice. Using spinning-disk confocal microscopy, this technique enables visualization of live cells for at least 4 hr and could be adapted to study other inflammatory lung conditions.

Ex Akciğer Metastaz ve Bunların mikroçevresinin Canlı Görüntüleme vivo

Metastasis is a major cause for cancer-related morbidity and mortality. Metastasis is a multistep process and due to its complexity, the exact cellular ...

Singenik Fare Melanom Hücreleri Enjeksiyon Akciğerler Onların Metastatik Potansiyeli belirleme

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Deneysel metastaz Testi

Kuyruk Ven Metastaz Tahlilleri ve Gerçek Zamanlı Vivo Görüntüleme Kombine Kullanımı Meme Kanseri Metastatik Kolonizasyon ve Yük Akciğerlerde Quantify için

Tümör Hücrelerinin Lateral Kuyruk-Damar Enjeksiyonu Sonrasında Akciğer Metastazının Patolojik Analizi

Braf/Pten Genetiği Mühendisliğiyle Tasarlanmış Melanom Fare Modelinde Ultra Yüksek Frekanslı Ultrason Görüntüleme ile Lenf Düğümü Hacminin Analizi

İnsan Prostat Kanser metastaz Ortotopik fare modeli

Melanom Metastazının Yeni Arabulucularının Belirlenmesi için Sağlam Bir Keşif Platformu

In vivo (İn canlı) Ortotopik Olarak Enjekte Edilen Meme Tümörü Hücrelerinin Spontan Akciğer Metastazını Ölçmek için Görüntüleme

In vivo (İn canlı) Ortotopik Olarak Enjekte Edilen Meme Tümörü Hücrelerinin Spontan Akciğer Metastazını Ölçmek için Görüntüleme

Primer Tümör ve Akciğer Metastazı Eğitim için MEF Hücre İzolasyonu

Ex Akciğer Metastaz ve Bunların mikroçevresinin Canlı Görüntüleme vivo