In dieser Studie wurde eine chirurgische Manipulation eingeführt, um das thorakale DRG in anästhesierten Mäusen für die In-vivo-Kalziumbildgebung zusammen mit der synchronisierten Elektrokardiogrammaufzeichnung freizulegen. Auf diese Weise versuchen wir zu beantworten, ob die Akupunktur an PC6 am Foramen das DRG-Neuron aktivieren und gleichzeitig das Elektrokardiogramm regulieren kann. Zu den Techniken, die derzeit in Akupunkturstudien verwendet werden, gehören in vivo oder vitro Elektrophysiologie, neuronales Tracing und verschiedene Strategien in Kombination mit Optogenetik und Chemogenetik.
Die in vivo Calcium-Bildgebung, die in dieser Studie vorgestellt wurde, hilft dabei, die durch Akupunktur induzierten Aktivitäten von DRG-Neuronenpopulationen in verschiedenen Tiermodellen durch dynamische und Echtzeit-Aufzeichnungen besser zu verstehen. Aufgrund der physiologischen Krümmung der Brustwirbelsäule an den thorakalen ein bis fünf Wirbelsegmenten sind Thorax-DRGs nur schwer freizulegen. Darüber hinaus führen die Einflüsse von Herz- und Lungenrhythmen dazu, dass die Fixierung von thorakalen DRGs eine Herausforderung darstellt.
Andernfalls sind die Atemanästhesie und die stundenlange Zustandserhaltung der Mäuse nicht einfach. In vivo Calcium-Imaging zeigt die Aktivität bestimmter Neuronenpopulationen mit Hilfe gentechnischer Mäuse. Dies ist das erste Mal, dass die thorakalen DRG-Neuronen in vivo beobachtet wurden.
Dieser Ansatz ermöglicht die Beobachtung neuronaler Aktivitäten, die durch somatische oder viszerale Stimulationen hervorgerufen werden, sowie deren Wechselwirkung. Unser Labor hat Methoden für die In-vivo-Calciumbildgebung von thorakaler und lumbaler DRG entwickelt, und in Zukunft werden wir die Rezeptoren überprüfen, die mit den auslösenden Faktoren der Akupunktur, der Überempfindlichkeit der Accupointur, den Wechselwirkungen zwischen der somatischen Akupunkturstimulation und den viszeralen Eingängen zusammenhängen. Nachdem Sie eine Tracheotomie an einer anästhesierten Maus durchgeführt haben, legen Sie die Maus in Bauchlage auf ein beheiztes Pad.
Machen Sie einen zwei Zentimeter langen Längsschnitt in der Mitte des Nackens, der sich von den sechs Halswirbeln bis zu den drei Brustwirbeln erstreckt. Trennen Sie vorsichtig die Fett- und Überwinterungsdrüsen an der vorderen Seite der Brustwirbel der Maus und vermeiden Sie dabei die Blutgefäße unter den Drüsen. Schneide mit einer Federschere durch die Haut- und Muskelschichten, einschließlich des Trapezmuskels.
Führen Sie einen Retraktor zwischen die Muskeln ein, um die weitere Exposition zu erleichtern. Entferne die Muskeln, die an der Kopfklemme befestigt sind, und den geraden Teil der langen Nackenmuskulatur, wodurch die Dornfortsätze des Brustmuskels freigelegt werden. Verschieben Sie die Muskeln semispinalis und spinalis, um den Wirbelbogen von C6 nach T3 freizulegen. Durchtrennen Sie die Verbindung zwischen der Wirbelbogenplatte und dem Gelenkfortsatz des Brustwirbels.
Verwenden Sie eine feine Pinzette, um die linken und rechten Gelenkfortsätze und die Brustfortsätze des Brustgelenks sorgfältig zu entfernen. Entfernen Sie das darüber liegende Bindegewebe. Legen Sie vorsichtig entweder das linke oder das rechte thorakale Ganglion dorsal oder DRG frei, um die Integrität des Epineuriums auf der gewählten Seite sicherzustellen.
Legen Sie einen kleinen, in warmer Kochsalzlösung getränkten Wattebausch über die freiliegende DRG, um die Feuchtigkeit zu erhalten. Verbinden Sie das EKG-Gerät mit dem Minuspol an der rechten oberen Extremität, dem Erdungskabel an der rechten unteren Extremität und dem Pluspol an der linken unteren Extremität. Platzieren Sie die Maus mit einem Heizkissen auf der Bühne der benutzerdefinierten Wirbelsäulenklemme.
Befestigen Sie die Maus mit zwei Clips, die an den Gelenkfortsätzen des sechsten und des dritten Brustkorbs befestigt sind. Positionieren Sie die Wirbelsäulenklemme mit der gesicherten Maus unter dem konfokalen Mikroskop. Platzieren Sie das Luftobjektiv mit 10x/0,32 langem Arbeitsabstand über dem freiliegenden Thorax-1 DRG.
Stellen Sie die Schrittweite auf 25 Mikrometer und eine Auflösung von 512 x 512 oder 1.024 x 1.024 Pixel ein. Passen Sie die Z-Achse des Tisches nach oben und unten an und erfassen Sie den gesamten thorakalen 1 DRG. Wenden Sie eine Bürstenstimulation auf die obere Extremität der Maus an und beurteilen Sie die Reaktionsfähigkeit der abgebildeten DRG-Neuronen.
Führen Sie periphere Nervenstimulationen bei PC6-Stimulation mit einem Stimulator durch. Unter Ausgangsbedingungen zeigten die meisten Neuronen im thorakalen 1 DRG keine GFP-Fluoreszenz. Die somatische Stimulation führte zu einem schnellen und vorübergehenden Anstieg der GCaMP-Fluoreszenz mit einer Zunahme der Anzahl und Intensität von GFP.
Periphere Nervenstimulationen bei PC6-Anwendung führten zu ähnlichen Veränderungen der GCaMP-Fluoreszenz wie somatische Stimulation. Die Neuronen wurden nach der Verfolgung mit einer Bildgebungssoftware innerhalb eines einzigen thorakalen 1 DRG markiert und nummeriert. Neuronen, die Änderungen der Fluoreszenzintensität von mehr als 130 % des F0-Schwellenwerts zeigten, wurden als positive Reaktionen gewertet.
Das Histogramm zeigte die unterschiedlichen Durchmesser der Neuronen, die auf periphere Nervenstimulationen an PC6 ansprechen. Die peripheren Nervenstimulationen bei PC6-Stimulation zeigten eine erhöhte Herzfrequenz.
