Name: biomimetic materials to characterize bacteria-host interactions
Uploaded: 2015-11-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 22 s
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The authors would like to thank members of the Krachler group for critical reading of the manuscript. DHS, DV and AMK were funded by the Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BB/L007916/1), FA was funded by a Republic of Iraq Ministry of Higher Education and Scientific Research Scholarship and NPS was funded by a CONICYT Scholarship.

1. Chemische Kopplung von Proteinen an Perlpolymerisates <ol><li> Thiol-Amin-Richtungskopplungs Hinweis: Dieses Protokoll ist für Kopplung von Cystein enthaltenden Proteinen zu Amin-funktionalisierten Polymerkügelchen mit Sulfosuccinimidyl-4- (p maleimidophenyl) butyrat (Sulfo-SMPB) als Vernetzungsmittel (1). <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/53400/53400fig1.jpg" /> Abbildung 1. Vernetzungsstrategie für gerichtete Thiol-Amin-Kupplung von Proteinen an Polymerkügelchen verwendet. Aminmodifizierten Polystyrol-Kügelchen sind mit Sulfo-SMPB aktiviert. Die Maleimid reagiert mit freien Cysteine ​​zu koppeln, Proteine, um Perlen gerichtet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53400/53400fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <ol><li> Herstellung der Reagenzien: <ol><li> Vorbereitung PBS (100 mM Natriumphosphat, 150 mM NaCl, pH 7,0) und Autoklaven. </li&gt; <li> Bereiten Sie eine 100x Lager (0,5 M oder 287 mg / ml in PBS) von TCEP (Tris (2-Carboxyethyl) phosphin) unmittelbar vor der Verwendung. </li><li> Bereiten Sie eine 5x Lager (10 mM bzw. 4,58 mg / ml in dH 2 O) von Sulfo-SMPB unmittelbar vor der Verwendung. </li><li> Bereiten Sie eine 10-faches (500 mM oder 88 mg / ml in PBS, pH 7,0) von Cystein unmittelbar vor der Verwendung. </li></ol></li><li> Bead-Aktivierung: <ol><li> Mischen die Perlensuspension durch sanftes Invertieren und Übertragen der erforderlichen Menge an Perlensuspension (beispielsweise 12 ml) in ein steriles 1,5-ml-Röhrchen mit 1 ml sterilem PBS, pH 7,0. </li><li> Gently Pipette auf und ab, um die Perlen und Pellet durch Zentrifugation in einer Mikrozentrifuge (2 min bei 16.000 × g) waschen. </li><li> Den Überstand mit einer Pipette und entsorgen Sie vorsichtig entfernen. Resuspendieren der Wulst Pellet in 1 ml frischem sterilem PBS und wiederholen Sie den Waschschritt. Resuspendieren Wulst Pellet in 0,8 ml PBS. </li><li> Fügen Sie 200 ml frisch hergestellte 10 mM Sulfo-SMPB, um eine endgültige concent gebenration von 2 mm. </li><li> Inkubieren der Perlen-Suspension für 1 h bei 25 ° C auf einem rotierenden Rad. </li></ol></li><li> Protein-Reduktion: <ol><li> Während der Inkubationszeit der Aktivierungsschritt vorzubereiten, die das Protein die folgenden Kupplungsschritt so kann sie sofort an die aktivierten Beads zugesetzt werden. Anmerkung: Obwohl diese Reduktionsschritt nicht immer für GST (Glutathion-S-Transferase) Fusionsproteine ​​erforderlich ist, wird empfohlen, eine hohe Kopplungseffizienz zu gewährleisten. <ol><li> Überprüfen der Proteinkonzentration und stellen sie auf die Endkonzentration für die Kupplungsreaktion erforderlich. Anmerkung: 6 mM Protein in PBS, und ein Volumen von 1 ml werden in der Regel verwendet. </li><li> In TCEP Lager, um eine Endkonzentration von 5 mM zu ergeben. Inkubieren der Lösung für 30 min bei RT. Anmerkung: Das Reaktionsgemisch kann direkt für die folgende Kupplungsreaktion verwendet werden. </li><li> Behalten eine kleine Menge (einige ml) der Proteinlösung für die Bestimmung der pro<html> Proteinkonzentration und Berechnung des Kopplungseffizienz (siehe Abschnitt 2). </li></ol></li></ol></li><li> Protein-Kupplungsschritt: <ol><li> Pellet die aktivierten Beads durch Zentrifugation (2 min, 16.000 xg in einer Mikrozentrifuge) und wasche das Pellet einmal in 1 ml frischer steriler PBS. </li><li> Das Pellet in die vorbereitete Proteinlösung (zum Beispiel 1 ml), um das gewünschte Proteinkonzentration zu ergeben. Achtung: Die Proteinkonzentration während der Kupplungsschritt wird auf die durchschnittliche Kupplungseffizienz (siehe Abschnitt 2 zur Bestimmung der Kopplungseffizienz) und der gewünschten Kupplungsdichte (wie in 1.1.4.3 berechnet) abhängen. Der Wirkungsgrad etwa 85%, und die gewünschte Endkonzentration 5 mM im 10x Perlensuspension, so Proteinkonzentration während der Kupplungsstufe sollte ungefähr 6 mm betragen. </li><li> Berechnung der Kupplungsdichte unter Verwendung der folgenden Formel: jpg &quot;/&gt; wobei ρ c Kupplungsdichte [Anzahl der Protein-Moleküle / nm 2], Protein konzentrierter Proteinkonzentration [mg / ml] Protein M w Proteinmolekulargewicht [da], Wulst konz Perlenkonzentration [Anzahl der Perlen / L], d Perlendurchmesser [nm 2] Avogadro-Zahl </li><li> Verwenden Sie die Kupplungsdichte, um die durchschnittliche Ligand Abstand berechnen: <img alt="Gleichung 2" src="/files/ftp_upload/53400/53400eq2.jpg" /></li><li> Inkubieren der protein Bead-Suspension 2 h bei 25 ° C auf einem rotierenden Rad. Hinweis: EinigeProteine ​​können nicht stabil sein bei RT. In diesen Fällen kann die Reaktion bei 4 ° CO / N ausgeführt werden. </li><li> Deaktivieren verbleibenden aktivierten Gruppen auf den Perlen durch Zugabe von Cystein-Lager bis zu einer Endkonzentration von 50 mM und Inkubation der Suspension für 30 min bei 25 ° C auf einem rotierenden Rad. Pellet die Beads durch Zentrifugation (2 min, 16.000 xg in einer Mikrozentrifuge). </li><li> Halten Sie den Überstand zur Bestimmung der Proteinkonzentration und Berechnung des Kopplungseffizienz (siehe Abschnitt 2). </li><li> Zweimaliges Waschen der Bead-Pellet mit 1 ml PBS und resuspendieren in 1 ml frischem PBS, um das Endprodukt zu ergeben. Hinweis: Das obige Protokoll wird in der Regel geben, 1 ml gekoppelten Protein, in einer Endkonzentration von 5 mM Protein, das als 10x Lager für nachfolgende Experimente (siehe Abschnitt 3) verwendet werden kann. </li><li> Um in Abschnitt 3 des Protokolls gehen, arbeiten mit 100 ml / ml Bead Lager, oder in einer Endkonzentration von 500 nM Protein. Hinweis: Ein guter Ausgangspunkt für diese procedure ist 2 × 10 12 Perlen / ml sein, was zu einer durchschnittlichen Kupplungsdichte von 3 × 10 -4 Proteine ​​/ nm 2 oder einem mittleren Abstand von 57 nm auf einem Kügelchen von 2 mm Durchmesser. </li></ol></li></ol></li><li> Thiol-Carboxy Richtungskopplungs Hinweis: Dieses Protokoll ist für die Kopplung Cystein enthaltenden Proteinen an carboxylfunktionalisierten Polystyrolperlen. Die Carboxylgruppe zunächst mit 1-Ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimid (EDC) / N-Hydroxysuccinimid (NHS), modifizierte Amin und anschließend vernetzt mit Sulfo-SMPB (Figur 2) aktiviert wird. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/53400/53400fig2.jpg" /> Abbildung 2. Vernetzungsstrategie für gerichtete Thiol-carboxyl Kopplung von Proteinen an Polymerkügelchen verwendet. Carboxylierte Polystyrolkügelchen werden zunächst mit EDC aktiviert und mit NHS modifiziert, um eine semistabile NHS-Ester zu bilden. Nachfolgende Amin-Kopplung ethylenediAmin führt zu einer freien Amingruppe, die sich mit Sulfo-SMPB reagiert. Maleimid aktivierte Kügelchen können dann mit freien Cysteinen reagieren paar Proteine, um Perlen gerichtet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53400/53400fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <ol><li> Herstellung der Reagenzien: <ol><li> Vorbereitung PBS (100 mM Natriumphosphat, 150 mM NaCl, pH 7,0) und Autoklaven. </li><li> Bereiten Sie eine 100x Lager (0,5 M oder 287 mg / ml in PBS,) von TCEP unmittelbar vor der Verwendung. </li><li> Bereiten Sie eine 10-faches (20 mM oder 4 mg / ml in PBS) EDC (1-Ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimid) unmittelbar vor der Verwendung. </li><li> Bereiten Sie eine 10-faches (50 mM, oder 6 mg / ml in PBS) des NHS (N-Hydroxysuccinimid) unmittelbar vor der Verwendung. </li><li> Bereiten Sie eine 5x Lager (10 mM bzw. 4,58 mg / ml in dH 2 O) von Sulfo-SMPB unmittelbar vor der Verwendung. </li><li> Bereiten Sie eine 10-faches (500 mM oder 88 mg / ml in PBS, pH 7,0) von Cystein sofort bevor Gebrauch. </li></ol></li><li> Bead-Aktivierung: <ol><li> Mischungsperlensuspension durch sanftes Invertieren und Übertragen der erforderlichen Menge an Perlensuspension (beispielsweise 12 ml) in ein steriles 1,5-ml-Röhrchen mit 1 ml sterilem PBS, pH 7,0. </li><li> Gently Pipette auf und ab, um die Perlen und Pellet durch Zentrifugation in einer Mikrozentrifuge (2 min bei 16.000 × g) waschen. </li><li> Den Überstand mit einer Pipette und entsorgen Sie vorsichtig entfernen. </li><li> Resuspendieren der Wulst Pellet in 1 ml frischem sterilem PBS und wiederholen Sie den Waschschritt. </li><li> Resuspendieren Wulst Pellet in 0,8 ml PBS. </li><li> 100 ml 10-fach EDC Lager (2 mM Endkonzentration) und sofort 100 ml 10x NHS-Stammlösung (5 mM Endkonzentration) auf die Partikelsuspension. </li><li> Inkubieren der Perlen-Suspension für 30 min bei 25 ° C auf einem rotierenden Rad. </li><li> Einmal zu waschen Kügelchen in 1 ml PBS und resuspendieren in 0,8 ml frischem sterilem PBS. </li><li> In 200 ml Ethylendiamin und incUbate die Perlensuspension 1 Stunde bei 25 ° C auf einem rotierenden Rad. </li><li> Einmal zu waschen Perlen mit 1 ml PBS und Resuspendieren der Kügelchen in 0,8 ml frischem PBS. </li><li> Gehen Sie aus dem Abschnitt 1.1.2.4 (Wulst Aktivierung mit Sulfo-SMPB) wie in Abschnitt 1.1.2 beschrieben und folgen Sie den Rest des in Abschnitt 1.1 (Thiol-Amin-Richtungskopplungs) beschriebenen Protokoll. Führen Proteinpräparat und Protein-Kopplungsschritte in einer Weise identisch zu denen in Abschnitt 1.1 beschrieben. Hinweis: Die typische Kopplungseffizienz unter Verwendung dieses Protokolls ist etwas niedriger im Vergleich zum Abschnitt 1.1, also die anfängliche Proteinkonzentration entsprechend anpassen, um die gleiche Kopplungsdichte zu erreichen (ca. 75%.). </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Bestimmung der Kopplungseffizienz Hinweis: Um festzustellen, Proteinkonzentration, verwenden Sie Bradford-Reagenz 10 und kolorimetrische Assays wie folgt: <ol><li> Vorsichtig umdrehen Bradford-Reagenz bis e<html> Nsure Homogenität des Reagens. </li><li> Unter Verwendung einer 10 mg / ml BSA-Stammlösung, prepare protein Normen für Konzentrationen von 0,1 bis 1,5 mg / ml BSA in Puffer. </li><li> Man 250 ml Bradford Reagenz in die Vertiefungen einer Platte mit 96 Vertiefungen. Vorbereitung genug Vertiefungen für alle Proben, Proteinstandards und negative Kontrollen (nur Puffer). </li><li> 5 ml der Proteinprobe (Proteinstandards oder Puffer für die Negativkontrolle), um das Reagenz in der 96-Well-Platte. </li><li> Inkubieren der Platte auf einem Orbitalschüttler bei Raumtemperatur für 10 min. </li><li> Messung der Extinktion bei 595 nm mit einem Plattenlesegerät. </li><li> Generieren Sie eine Standardkurve der BSA-Konzentration gegen die A595 nm und nutzen diese, um Proteinkonzentrationen in der Aus- und Überstandsproben zu bestimmen. </li><li> Wird die Konzentration des gekoppelten Proteins wie folgt: <img alt="Gleichung 3" src="/files/ftp_upload/53400/53400eq3.jpg" /></li><li> Berechnung der Kopplungseffizienz als: 00eq4.jpg &quot;/&gt; </li></ol> 3. Verwendung von Bead-gekoppelter Adhäsine in Konkurrenztests <ol><li> Vorbereitung: <ol><li> Samen 1 ml pro Vertiefung von HeLa-Zellen bei einer Konzentration von 150.000 Zellen / ml in eine Platte mit 24 Vertiefungen einen Tag vor der Kompetitionsassay, sodass die Zellen etwa 80% Konfluenz vor dem Beginn des Experiments zu erreichen. </li><li> Richten Sie jeden experimentellen Zustand in dreifacher Ausfertigung. Fügen Brunnen für die negativen Kontrollen (keine Bakterien während der Konkurrenz-Assays hinzugefügt), positive Kontrollen (Kontrollkügelchen, um die Fusion-Tag nur während Kompetitionsassays hinzugefügt gekoppelt) und Lyse Kontrollen (Zytotoxizität Experimente). </li><li> Impfen eine 5 ml marine LB (MLB) Kultur mit einer frischen Kolonie V. parahaemolyticus und wachsen O / N bei 30 ° C, zu zittern. </li><li> Bereiten Sie ausreichend Kügelchen gekoppelt MAM, wie in Kapitel 1 (Kupplung) beschrieben. Lassen Sie für 100 ml 10x Korn Stock pro Vertiefung. </li></ol></li><li> Competition Assay: <ol><li> Am Tag der competitIonen-Experiment messen die OD 600 der Bakterienkultur. </li><li> Bereiten Infektion Medien durch Bakterienkulturen in farblose DMEM ohne Zusätze verdünnt, auf 37 ° C vorgewärmt, mit 10% v / v Perlensuspension (entweder Adhäsin-gekoppelten Kügelchen oder Kontrollkügelchen), zu einer MOI von 10. Bereiten Sie 1 ml geben / gut, und 10-20% Überschussvolumen pro Probe. Anmerkung: Bei den oben genannten Bedingungen (24-Well-Platte, V. parahaemolyticus, MOI 10), das notwendige Volumen des O / N-Kultur zu je Vertiefung (ml / ml) ist als 3 / OD 600 der Kultur Höhe berechnet. Zum Beispiel wird 1 ml Infektionsmedium enthält typischerweise 100 ml Partikelsuspension, ein paar ml Bakterienkultur und bis zu 1 ml mit farblosen, nicht ergänzten DMEM hergestellt werden. </li><li> Entfernen alte Medium aus den Vertiefungen und waschen kultivierten HeLa-Zellen durch Zugabe von 1 ml sterilem PBS vorgewärmt auf 37 ° C zu jeder Vertiefung. </li><li> Entfernen PBS und 1 ml Infektionsmedium pro Vertiefung. Auch die Kontrollen eingestellt, durch Zugabe von Lösungen containing Steuer Perlen und Bakterien (positive Kontrolle) oder Adhäsin Perlen und keine Bakterien (negative Kontrollen) oder DMEM, das 0,1% Triton X-100 (Lyse-Steuerung, nur für Zytotoxizität Messungen erforderlich). </li><li> Inkubieren der Platte in einem Gewebekultur-Inkubator bei 37 ° C für die gewünschte Zeitdauer (zB 4 Stunden auf Cytotoxizität Messungen oder 1 Stunde auf Haftung Messungen). Anmerkung: sind bakterielle Adhäsion und Zytotoxizität auf Wirtszellen können als Auslesungen für die Wirksamkeit der Hemmung verwendet werden. Wenn die Zeitpunkte der Zytotoxizität und Haftungsmessungen übereinstimmen, können beide Tests durchgeführt unter Verwendung von Proben aus der gleichen gut, da Zytotoxizität wird mit dem Kulturüberstand und Befestigungs Assays verwenden Proben aus der restlichen Zellschicht abgeleitet wird, bestimmt. </li></ol></li><li> Zytotoxizität Messungen: <ol><li> Zu angegebenen Zeitpunkten (zB 4 Stunden nach der Infektion), entfernen Sie dreimal 200 ml von jedem 24-Loch und Transfer zumeine 96-Well-Platte. </li><li> Spin 96-Well-Platten bei 1500 × g, 5 min und Transfer 100 ml aus jeder Vertiefung in ein frisches 96-Well-Platte. 100 ml der bei der Infektionsexperimente Frisch Vertiefungen der Platte mit 96 Vertiefungen in dreifacher Ausführung verwendeten Medien (diese werden als Rohlinge verwendet werden). </li><li> Durchführung der Laktat-Dehydrogenase (LDH) Freisetzungstest unter Verwendung eines LDH Zytotoxizität Nachweiskits und nach den Anweisungen des Herstellers. <ol><li> Kurz gesagt, die Berechnung der Menge an Reagenz in Schritten von 25 benötigt (zB wenn 62 Proben gemessen werden sollen, machen genug Reagenz-Mix für 75 etc.). </li><li> Zum Beispiel für 100 Proben, mischen 11,25 ml Reagenz A mit 250 ul Reagenz B. umkehren, nicht vortexen Schaumbildung zu vermeiden. </li><li> Setzen Sie die Mischung in einem Behälter in der Lage sein, mit einer Mehrkanal-Pipette pipettiert werden. 100 l Reagenzienmix zu jeder Probe. </li><li> Inkubieren Platte bei RT und die Extinktion bei 490 nm auf einem Plattenleser bei 10, 20, 30 min. </li&gt; <li> Analysieren des Datensatzes, für die die Absorption der Lyse Kontrollprobe hoch ist, aber immer noch innerhalb des linearen Bereichs des Plattenlesers (typischerweise 2-3 Extinktionseinheiten). </li><li> Express-Ergebnisse als% Zytotoxizität, nach der folgenden Formel für die Umrechnung: <img alt="Gleichung 5" src="/files/ftp_upload/53400/53400eq5.jpg" /></li></ol></li></ol></li><li> Die Messung der bakteriellen Adhäsion: <ol><li> Bei den angegebenen Zeitpunkten (beispielsweise 1 Stunde nach der Infektion), das Medium entfernt, der Zellschicht. </li><li> Die Zellschicht gründlich mit steriler, vorgewärmten PBS (mindestens 3-4 Wäschen von jeweils 1 ml PBS), um alle nicht-anhaftenden Zellen zu entfernen. </li><li> Lyse von Wirtszellen durch Zugabe von 1 ml einer sterilen 1% v / v Triton X-100-Lösung in PBS pro Vertiefung. Inkubieren der Platte bei 37 ° C für 5 min. </li><li> Pipettieren Sie jede Probe nach oben und unten mehrere Male, bevor die Übertragung der Inhalt der Vertiefungen bis 1,5-ml-Röhrchen zu trennen. Bereiten Sie das 10-fache serielle Verdünnungen von Probenin sterile PBS (zB verwenden 100 ml Probe und 900 ml PBS). </li><li> Platte 100 ml von jeder Probe auf MLB Agar und verteilt unter Verwendung einer Zelle Treuer. Optimieren Sie die je nach Bakterienstämme und Zeitpunkt bis zum Teller Verdünnung. Hinweis: Für die beschriebenen Versuchsaufbau, geben 10 5 oder 10 6 fachen Verdünnungen eine geeignete Anzahl von KBE. </li><li> Platten bei 37 ° CO / N und aufzuzählen Bakterien durch Koloniezählung. </li></ol></li></ol>

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	<li>Lim, J., Stones, D. H., Hawley, C. A., Watson, C. A., Krachler, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multivalent+Adhesion+Molecule+7+clusters+act+as+signaling+platform+for+host+cellular+GTPase+activation+and+facilitate+epithelial+barrier+dysfunction.">Multivalent Adhesion Molecule 7 clusters act as signaling platform for host cellular GTPase activation and facilitate epithelial barrier dysfunction.</a> PLoS Pathog. 10 (9), e1004421 (2014).</li><li>Krachler, A. M., Ham, H., Orth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outer+membrane+adhesion+factor+multivalent+adhesion+molecule+7+initiates+host+cell+binding+during+infection+by+gram-negative+pathogens.">Outer membrane adhesion factor multivalent adhesion molecule 7 initiates host cell binding during infection by gram-negative pathogens.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 108 (28), 11614-11619 (2011).</li><li>Krachler, A. M., Orth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+characterization+of+the+interaction+between+bacterial+adhesin+multivalent+adhesion+molecule+7+(MAM7)+protein+and+its+host+cell+ligands.">Functional characterization of the interaction between bacterial adhesin multivalent adhesion molecule 7 (MAM7) protein and its host cell ligands.</a> J Biol Chem. 286 (45), 38939-38947 (2011).</li><li>Joh, D., Speziale, P., Gurusiddappa, S., Manor, J., Hook, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+specificities+of+the+staphylococcal+and+streptococcal+fibronectin-binding+microbial+surface+components+recognizing+adhesive+matrix+molecules.">Multiple specificities of the staphylococcal and streptococcal fibronectin-binding microbial surface components recognizing adhesive matrix molecules.</a> Eur J Biochem. 258 (2), 897-905 (1998).</li><li>Bingham, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structures+of+fibronectin-binding+sites+from+Staphylococcus+aureus+FnBPA+in+complex+with+fibronectin+domains.">Crystal structures of fibronectin-binding sites from Staphylococcus aureus FnBPA in complex with fibronectin domains.</a> Proc Natl Acad Sci U.S.A. 105 (34), 12254-12258 (2008).</li><li>Ensenberger, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+interactions+between+F1+adhesin+of+Streptococcus+pyogenes+and+N-terminal+modules+of+fibronectin.">Specific interactions between F1 adhesin of Streptococcus pyogenes and N-terminal modules of fibronectin.</a> J Biol Chem. 276 (38), 35606-35613 (2001).</li><li>Hawley, C. A., Watson, C. A., Orth, K., Krachler, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+MAM7+peptide-based+inhibitor+of+Staphylococcus+aureus+adhesion+does+not+interfere+with+in+vitro+host+cell+function.">A MAM7 peptide-based inhibitor of Staphylococcus aureus adhesion does not interfere with in vitro host cell function.</a> PLoS One. 8 (11), e81216 (2013).</li><li>Krachler, A. M., Ham, H., Orth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Turnabout+is+fair+play:+use+of+the+bacterial+Multivalent+Adhesion+Molecule+7+as+an+antimicrobial+agent.">Turnabout is fair play: use of the bacterial Multivalent Adhesion Molecule 7 as an antimicrobial agent.</a> Virulence. 3 (1), 68-71 (2012).</li><li>Krachler, A. M., Mende, K., Murray, C., Orth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+characterization+of+multivalent+adhesion+molecule+7-based+inhibition+of+multidrug-resistant+bacteria+isolated+from+wounded+military+personnel.">In vitro characterization of multivalent adhesion molecule 7-based inhibition of multidrug-resistant bacteria isolated from wounded military personnel.</a> Virulence. 3 (4), 389-399 (2012).</li><li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding.">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Hier beschreiben wir zwei Protokolle, die zum Koppeln thiolhaltigen Proteine ​​verwendet werden können, um Amin- oder Carboxylat-modifizierten Polystyrolperlen sind. Wegen der Leichtigkeit der Verfahrensweise, Thiol-Amin-Kopplung bevorzugt, aber abhängig von dem gewünschten Wulst Spezifikation (Durchmesser, Fluoreszenzeigenschaften) kann die Verwendung von Amin-funktionalisierten Kügelchen nicht möglich sein, und wir haben deshalb enthalten ein Protokoll, das den Carbonsäureester umwandeln - in eine Amin-Einheit für den Forscher die größtmögliche Flexibilität bei der Wahl des Gerüsts zu geben. Obwohl beide Thiol-Amin und Thiol-carboxyl Kupplungs Arbeit für jeden Cystein Protein Richtkoppler enthält (dh die Immobilisierung des Proteins pro seinem N-Terminus, imitiert surface display) erfordert eine Protein ohne Cysteinreste, wird diese als eine GST-Fusion hergestellt Protein oder dass enthält ein Nebenstelle eingeführt einzigen terminalen Cysteinrest Mutagenese. Wenn mehrere reaktive Cysteine ​​enthalten sindinnerhalb des Proteins, wird dieser zufällige Immobilisierung der Proteinfunktion beeinträchtigen könnten führen. Viele bakterielle Adhäsine weiß Cysteine ​​enthalten, nicht natürlich. Für andere kann diese durch ortsgerichtete Mutagenese entfernt werden, obwohl dies umfangreiche Untersuchungen erfordert, um sicherzustellen, nativen Struktur und Funktion in der Mutante erhalten. GST-Fusionsproteine ​​können gereinigte GST-Tag an Kügelchen gekoppelt sind, wie eine geeignete Negativkontrolle verwendet werden. Verwendung entkoppelt Kügelchen als Kontrolle sollte vermieden werden, da diese oft eine höhere Neigung zu verklumpen oder sich an Zellen nicht-spezifisch. Eine vereinfachte Version der Protokoll 1.2., Nur mit EDC kann zu koppeln Proteinen an Carboxylgruppen funktionalisierten Polymerkügelchen verwendet werden, jedoch ist in diesem Fall Kopplung erfolgt über primäre Amine in dem Protein und garantiert deshalb nicht Richtungskopplung. TCEP als Reduktionsmittel darf nicht mit anderen kommerziell erhältlichen und üblichen Reduktionsmitteln, wie zum Beispiel dithiothr ersetzt werdeneitol (DTT) oder 2-Mercaptoethanol (BME), da die in ihnen enthaltenen Thiole mit Protein-Kopplung in der Thiol-Maleimid Kopplungsschritt konkurrieren. PBS kann mit anderen Puffer ersetzt werden, aber mit den folgenden Überlegungen: Puffer möglicherweise nicht primäre Amine enthalten (so Tris-Puffer enthält, sind nicht geeignet). Verwendung von Puffern, die sehr gering (&lt;10 mm) Salzkonzentrationen führt zu Verklumpung Auffädeln und sollten ebenfalls vermieden werden. Proteinreinheit ist auch ein wichtiger Faktor, der bei diesem Verfahren entstehen, sowie die Daten von hoher Qualität zu erreichen, sollte reine Proteine ​​verwendet werden. Wir routinemßig zu reinigen Proteine ​​in mehreren Schritten, darunter mindestens eine Affinitätsreinigung und Gelfiltrationsschritt, aber in einigen Fällen Ionenaustauschchromatographie in einem dritten Schritt erfolgt. Als Folge ist die Reinheit von Proteinen für die Kopplung verwendet wird, ist üblicherweise 90% oder höher, wie durch SDS-PAGE beurteilt. Es wird empfohlen, Protein-Konzentrationen sowohl in der anfänglichen Reaktionsmischung sowie th bestimmene Stand nach Beendigung der Reaktion. Dies wird helfen, die scheinbare Konzentration der Kügelchen gekoppelten Proteins und damit Kopplungsdichte zu bestimmen. Bestimmung der beiden Werte ermöglicht auch die Berechnung der Kopplungseffizienz. Dies kann berücksichtigt werden, wenn die Vorbereitung der Ausgangsproteinlösung in nachfolgenden Reaktionen, um die gewünschte Endkonzentration zu erzielen, und Kupplungsdichte berücksichtigt werden. Bradford-Reagenz ist insbesondere zur Bestimmung der Proteinkonzentration geeignet vor und nach der Kupplungsreaktion, da keine der Substanzen in der Reaktions stört die Farbstoffkomplexbildung bei den verwendeten Konzentrationen. Niedrigeren Proteinkonzentrationen, die verwendet werden sollen, kann dieses Verfahren müssen durch eine empfindlichere Nachweismethode ersetzt jedoch Aufmerksamkeit ist auf die Tatsache hat es mit den in der Kopplungsreaktion enthaltenen Substanzen kompatibel sind gezahlt. Es wird auch empfohlen, um frisch zubereiteten Reagenzien zu verwenden und zu handhaben pulverförmigen Reagenzien mit Sorgfalt (zB Shopin einem verschlossenen Behälter und mit Siliciumdioxidperlen, um die Reagenzien Feuchtigkeit zeichnen), da die Qualität der Reagenzien wird die Kopplungseffizienz beeinflussen zu vermeiden. Wenn die Kopplungseffizienz geringer als erwartet ist, umfassen mögliche Abhilfen Erhöhung der anfänglichen Wulst und Proteinkonzentrationen. Falls höhere Konzentrationen verwendet werden, muss die Konzentration von Kopplungsreagenzien proportional erhöht, um eine ausreichende molaren Überschuss sicherzustellen. Ändern von Korn / Protein-Konzentrationen in der Regel eine bessere Schritt hin zu Optimierung, anstatt die Reaktionszeiten. Da die Protokolle für die Wulst Kopplung sind langwierig, wir gemeinhin bereiten eine große Charge des Materials. Aliquots der Suspension in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei -20 ° C mehrere Monate gelagert werden. Aufgetauten Aliquots sollten nicht eingefroren werden und bei 4 ° C gelagert und innerhalb von 1-2 Tagen verwendet werden. Dies wird jedoch mit der Art und Stabilität der so sollte auf eine kleine Charge zunächst getestet werden verwendeten Proteins variieren. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Bead-gekoppelter Adhäsine kann für viele Anwendungen verwendet werden, wie unten diskutiert. Dieses Protokoll beschrieben einen Test, der üblicherweise verwendet wird, um die Hemmung der bakteriellen Bindung und Pathogen-vermittelten Zytotoxizität auf Wirtszellen zu messen. Der Test wird üblicherweise durchgeführt, um die Kapazität der Kügelchen gekoppelt MAMs kompetitiv inhibiert Infektion von HeLa-Epithelzellen mit dem Meeresfoodborne pathogen Vibrio parahaemolyticus zu messen, entweder mit einer Abnahme der bakteriellen Bindung an die Wirtszellen oder reduzierte Zytotoxizität als Auslese . In beiden Fällen, die Vorbereitung und kompetitive Assays nach dem gleichen Protokoll. Je nach dem Auslesen verschiedener Stämme von V. parahaemolyticus verwendet werden: die zytotoxische Stamm POR1 zur Zytotoxizität Messungen verwendet, während die nicht-zytotoxischen Stamm POR2 zum Messen der bakteriellen Adhäsion verwendet, da Zelltod und Zellablösung beeinträchtigt das Verfahren zur Quantifizierung hefteten Bakterien. Zunächst compebewerb Experimente wurden als schrittweise Protokoll, bei dem Wirtszellen wurden zunächst mit Perlen vor der Zugabe von Bakterien präinkubiert eingestellt. Für V. parahaemolyticus und dem Wulst bestimmungsgemäßer Verwendung (2 &amp; mgr; m-Perlen zu MAM7 gekoppelt) können beide Perlen und Bakterien zur gleichen Zeit, ohne die Änderungen in der resultierenden Zytotoxizität hinzugefügt werden. Das heißt, in diesem Versuchsaufbau, Perlen outcompete Bakterien Wirtszelle verbindlich. In Abhängigkeit von der Bakterienart und Wulstgeometrie verwendet wird, kann es gute Gründe für die Aufrechterhaltung der Wulst Adhäsion und bakterielle Infektion als zwei getrennte Stufen. Beispielsweise um Zellen mit nicht-beweglichen Bakterien zu infizieren, werden die Platten üblicherweise nach der Zugabe der Infektion Medium zentrifugiert. Jedoch sollte Zentrifugation von Platten enthaltenden Suspensionen Wulst vermieden werden, da dies zu einer sehr ungleichmäßigen Verteilung der Perlen auf die Zellschicht. Wenn kleinere Partikelgrößen verwendet werden, werden Kügelchen länger dauern, bis auf der Zelloberfläche zu regeln, in welchem ​​Fall suffizient Zeit sollte für Korn Anbringung vor der Infektion zugelassen. Wenn bakterielle Adhäsion wird als ein Auslesen verwendet wird, sollten die Proben zu den Zeitpunkten genommen werden, wo Wirtszellen nicht wesentlich von der infizierenden Stamm beschädigt, wie Zellablösung und Lyse kann die Quantifizierung der angehefteten Bakterien beeinträchtigen. Statt Aufzählen bakterielle Adhäsion durch Verdünnungsausstrichtest können Proben alternativ zur Abbildung (Abbildung 5) verarbeitet werden. In diesem Fall sollte der Gewebekultur von Zellen auf Glasdeckgläschen ausgesät werden, anstatt direkt in die Vertiefungen. Zusätzlich können fluoreszierende Kügelchen und Bakterien ein Fluoreszenzprotein exprimieren, verwendet werden, zusammen mit einer Infektion spezifischen Wirtszellmarker. Zum Beispiel werden Kompetitionsexperimente üblicherweise unter Verwendung von fluoreszierenden roten Rhodamin-Phalloidin, die Wirtszellen &quot;Aktin-Zytoskelett zu färben und zu bewerten morphologische Veränderungen, die sich aus der Infektion zusammen mit fluoreszierenden blauen Perlen und fluoreszierende abgebildetgrün (GFP-exprimierenden oder SYTO18 gefärbt) Bakterien. Eine Reihe von Kügelchen gekoppelt Adhäsine, einschließlich Staphylococcus aureus FnBPA, Streptococcus pyogenes F1 FUD und Vibrio parahaemolyticus MAM wurden als biomimetische Materialien verwendet worden, um die Haftung, Adhäsionsinhibierung und den Beitrag der Adhäsion zu untersuchen Pathogen-vermittelten Zytotoxizität 1, 7, 8. Einer der Vorteile der Verwendung dieses Ansatzes ist die einfache Visualisierung der Befestigungs Ereignisse, da die Polymerperlen als Gerüste verwendet werden, sind in einer breiten Palette von Farben (beispielsweise blau, fluoreszierend rot, blau, grün, orange). Somit direkte Markierung von Proteinen, die mit der Funktion beeinträchtigen können, vermieden werden. Weiterhin werden die Oberflächenkupplungs ahmt das mehrwertige Anzeige Adhäsine auf der bakteriellen Oberfläche reflektiert damit eine physiologisch relevante Konformation im Vergleich zu löslichen Proteinen. Im Vergleich zu Studien mit intakten Bakterien oder bacterial-Mutanten, umgeht der Wulst Ansatz Probleme mit Bakterienwachstum verbunden. B. Langzeit (zB O / N) Studien über die bakterielle Adhäsion an Zellen mit intakten Bakterien beherbergen werden oft durch bakterielle Begleitwachstumserscheinungen gefährdet - Ansäuern des Wachstumsmediums und Nährstoffraubbau negativ auf Wirtszellen und bakteriellen Replikations letztendlich Kompromisse Abbildungsqualität. In jüngerer Zeit ist die Verwendung von Kügelchen gekoppelt Adhäsine wurde erweitert, um ihre Verwendung als Mittel zur Affinitätsreinigungen von Wirtszellfaktoren in Signalprozesse nachgeschalteten bakteriellen Befestigung beteiligt sind. V. parahaemolyticus MAM7, über die Bindung an Phosphatidsäuren in der Membran der Wirtszelle, löst RhoA Aktivierung und Aktin Umlagerungen 1, 3. MAM-gekoppelten Kügelchen verwendet werden, um zu reinigen und zu identifizieren Proteine ​​in den Signalisierungs Plattformen als Folge MAM-Wirtszelle zusammengebaut beteiligten Bindung. Seit Perlendurch einen kurzen Zentrifugationsschritt vom Überstand abgetrennt werden und das Protein von Interesse kovalent gekoppelt ist, ist dies ein gutes Verfahren, um eine Trennung von verunreinigenden Proteinen zu erreichen und zu bereichern relevanten Protein-Komplexe, die für Downstream-Anwendungen wie Proteomik oder Western verwendet werden können, Blotting.

Dissecting the interactions between bacterial adhesins and host surface receptors at the host-pathogen interface is an essential step towards our understanding of the underlying mechanisms driving bacterial adhesion. Ultimately, this will help us to identify strategies to interfere with these processes during infections. In conducting such studies, we often face a dilemma: Biochemical and biophysical analysis of the molecular mechanisms of adhesin binding requires their separation from other cell wall components, which may interfere with adhesion events. On the other hand, the use of recombinant soluble proteins over-simplifies the adhesion event, by disregarding protein anchoring in the bacterial cell wall and multivalency of binding achieved through bacterial surface display. Equally, from the host cell&#8217;s perspective, encountering and binding to single adhesin molecules does not always have the same impact in terms of plasma membrane organization, membrane fluidity and receptor clustering1 and this, ultimately, makes it difficult to evaluate the impact of adhesion on host cellular signaling and the outcome of bacteria-host interactions. 
Recently a method was devised, whereby recombinant purified adhesins or adhesin fragments are directionally and covalently coupled to polymer particles similar in size to bacteria, thus mimicking bacterial surface display. This approach has been used on a range of different adhesins, from Gram-negative Multivalent Adhesion Molecules (MAMs)2, 3, to Gram-positive adhesins including Staphylococcus aureus fibronectin binding protein (FnBPA)4, 5 and Streptococcus pyogenes F1 6, 7. This method has allowed the dissection of adhesin fragments important for host cell binding, identification of host surface receptors and determination of their behavior on the host cell surface, while taking both binding affinity and avidity into consideration 1, 8. Additionally, this approach has been used to investigate the efficacy of immobilized adhesins and derivatives as inhibitors of host-pathogen interactions 8, 9. It has been demonstrated that surface coupled derivatives of the Vibrio parahaemolyticus Multivalent Adhesion Molecule (MAM) 7 can be used to attenuate a range of bacterial infections in vitro, including those caused by multidrug-resistant pathogens such as Acinetobacter baumannii and methicillin-resistant S. aureus (MRSA) 7, 9. 
Herein, we describe different chemistries which can be used to immobilize adhesins to commercially available functionalized polystyrene particles. Due to the wide array of available surface functionalities, labels and particle sizes, these are a useful scaffold for the production of bacteriomimetic materials to investigate adhesin-host interactions. We further describe methods for the initial characterization of the coupling reaction, and for the calculation of important properties of the resulting materials. Finally, the use of bead-coupled adhesins as competitive inhibitors of in vitro bacterial infections is discussed as an example of their application, as well as the future scope and limitations of this approach.

<table><tbody><tr><td>Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP)</td><td>Sigma</td><td>646547</td><td>Danger; corrosive&lt;br/&gt; can be bought as solution or freshly prepared</td></tr><tr><td>Sulfosuccinimidyl 4-(p-maleimidophenyl)butyrate (Sulfo-SMPB)</td><td>Fisher</td><td>PN22317</td><td>Danger; toxic</td></tr><tr><td>L-cysteine</td><td>Sigma</td><td>30089</td><td>Danger; toxic</td></tr><tr><td>Latex beads, amine-modified polystyrene, fluorescent blue - aqueous suspension, 2.0&amp;nbsp;&amp;mu;m mean particle size</td><td>Sigma</td><td>L0280</td><td>harmful;&lt;br/&gt; a range of alternative particle sizes and colors is available</td></tr><tr><td>1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide (EDC)</td><td>Thermo scientific</td><td>22980</td><td></td></tr><tr><td>N-hydroxysuccinimide (NHS)</td><td>Thermo scientific</td><td>24500</td><td></td></tr><tr><td>Carboxylate-modified polystyrene beads</td><td>Sigma</td><td>CLB9</td><td>harmful;&lt;br/&gt; a range of alternative particle sizes and colors is available</td></tr><tr><td>Ethylenediamine</td><td>Sigma</td><td>E26266</td><td>Danger; flammable, corrosive, toxic, sensitizing</td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td><td>Promega</td><td>W3841</td><td></td></tr><tr><td>Bradford reagent</td><td>Sigma</td><td>B6916</td><td>Danger; corrosive and toxic</td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Modified Eagle&amp;rsquo;s Medium - high glucose - With 4,500 mg/L glucose and sodium bicarbonate, without&amp;nbsp;L-glutamine, sodium pyruvate, and phenol red, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture</td><td>Sigma</td><td>D1145</td><td>for infection experiments</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma</td><td>D6429</td><td>for maintenance of cultured host cells</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum, heat inactivated</td><td>Sigma</td><td>F9665</td><td>supplement for tissue culture medium</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin -&lt;br/&gt; Solution stabilized, with 10,000 units penicillin and 10&amp;nbsp;mg streptomycin/mL, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture</td><td>Sigma</td><td>F9665</td><td>supplement for tissue culture medium</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>LDH Cytotoxicity detection kit</td><td>Takara</td><td>MK401</td><td></td></tr><tr><td>Plasticware</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>reagent reservoirs (25ml)</td><td>SLS</td><td>F267660</td><td></td></tr><tr><td>24-well plates</td><td>Greiner</td><td>662160</td><td></td></tr><tr><td>96-well plates</td><td>Greiner</td><td>655182</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>haemocytometer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>microcentrifuge</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>plate reader</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>tissue culture facilities</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>multichannel pipette</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

biomimetic materials to characterize bacteria-host interactions

Bacterial attachment to host cells is one of the earliest events during bacterial colonization of host tissues and thus a key step during infection. The biochemical and functional characterization of adhesins mediating these initial bacteria-host interactions is often compromised by the presence of other bacterial factors, such as cell wall components or secreted molecules, which interfere with the analysis. This protocol describes the production and use of biomimetic materials, consisting of pure recombinant adhesins chemically coupled to commercially available, functionalized polystyrene beads, which have been used successfully to dissect the biochemical and functional interactions between individual bacterial adhesins and host cell receptors. Protocols for different coupling chemistries, allowing directional immobilization of recombinant adhesins on polymer scaffolds, and for assessment of the coupling efficiency of the resulting &#8220;bacteriomimetic&#8221; materials are also discussed. We further describe how these materials can be used as a tool to inhibit pathogen mediated cytotoxicity and discuss scope, limitations and further applications of this approach in studying bacterial - host interactions.

Die V. parahaemolyticus Adhäsin MAM7 enthält sieben Tandemsäugetierzell Eintrag (MCE) Domänen in Anerkennung der Host-Oberflächenrezeptoren beteiligt. Wir verwendeten Polystyrolkügelchen, um rekombinantes gekoppelt, gereinigten Fragmente umfasst entweder alle sieben Tandem MCE-Domains (MAM7) oder nur die erste MCE Domain (MAM1), um die Fähigkeit dieser Materialien, mit V. Wettbewerb testen parahaemolyticus für Wirtszellenbindung und die resultierende Wirksamkeit dieser Materialien als Haftinhibitoren. HeLa-Zellen wurden mit V. infiziert parahaemolyticus Stamm POR1 und Zytotoxizität von in vitro-Infektion wurde nach 4 h (Figur 3) untersucht. Behandlung von HeLa-Zellen mit 0,1% Triton X-100 (positive Lyse Kontrolle) führte zu einer vollständigen Zellyse angezeigt infizierte Zellen sehr geringe Zytotoxizität. In vitro-Infektion von unbehandelten Zellen mit POR1 führte zu sehr hohen Niveaus der Zelllyse, und das wurde von MAM7-co gehemmtupled Perlen aber nicht MAM1 gekoppelte oder GST-gekoppelten Kontrollkügelchen (Abbildung 3). <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/53400/53400fig3.jpg" /> Abbildung 3. Charakterisierung von Vibrio parahaemolyticus induzierte Zytotoxizität in Epithelzellen während der Konkurrenz-Assays. Die Zellen wurden mit V. behandelt parahaemolyticus (Vp), angedeutet mit (+) oder keine Bakterien (-) in Gegenwart von verschiedenen konkurrierenden Einheiten (Komp.), wie angegeben. Dazu gehörten entweder keine comp. (-), MAM7 Perlen (MAM7), MAM1 Perlen (MAM1) oder GST Kontrollkügelchen (GST). Als Kontrollen wurden Zellen, die entweder mit Triton X-100 (Triton-Lyse-Kontrolle) behandelt bzw. links nicht infizierten (uninf). LDH-Freisetzung nach 4 h wurde wie in Kapitel 3 beschrieben, gemessen und die Ergebnisse zu Triton Kontrollen (100%) und Rohlinge (0%), wie oben beschrieben normalisiert. Die Ergebnisse sind Mittelwerte ± SEM von Dreifachversuche. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53400/53400fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> Aufzählung V. parahaemolyticus entweder unbehandelten HeLa-Zellen oder Zellen mit MAM7-, MAM1- oder GST Steuer Perlen, inkubiert befestigt gezeigt, dass MAM7-Perlen, aber nicht MAM1- oder GST-Kontrollkügelchen outcompete V. parahaemolyticus zur Befestigung Zelloberflächenrezeptoren (Figur 4) zu hosten. <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/53400/53400fig4.jpg" /> Abbildung 4. Charakterisierung von bakteriellen Befestigung während der Konkurrenzexperimente. HeLa-Zellen wurden mit V. infiziert parahaemolyticus POR2 (Vp +), in Abwesenheit (-) oder in Gegenwart von konkurrierenden Einheiten wie folgt: MAM7 Kügelchen (MAM7) MAM1 Kügelchen (MAM1) oder GST Kontrollkügelchen (GST) (vgl.). Bakterielle Adhäsion wurde nach 1 Stunde gemessen,<html> im Abschnitt 3. Ergebnisse sind Mittelwerte ± SEM von Dreifachversuche. Mittel (vlnr in CFU / ml) sind 2,3010 6, 1,5310 5, 6 2,0510, 2,1210 6. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53400/53400fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> Adhäsine Fluorophor markierten Kügelchen gekoppelt resultieren in der Erzeugung von Materialien, die bakterielle Adhäsion imitieren an Wirtszellen und sind leistungsstarke Werkzeuge für die zelluläre Bildgebung (Abbildung 5). Verwendung MAM7 gekoppelten fluoreszierenden blauen Perlen, dadurch wir den Prozess der MAM7-vermittelte Bindung an Epithelzellen. Befestigung MAM7 an Wirtszellen in Folge Aktin Umlagerungen und die Bildung von Stressfasern, die Co-visualisiert mit Rhodamin-Phalloidin auf F-Actin (5B) Fleck waren. _upload / 53400 / 53400fig5.jpg &quot;/&gt; Abbildung 5. Herstellung und die Verwendung von Fluorophor zur Bildgebung markiert biomimetische Perlen. (A) Die Aussetzung der fluoreszierenden blauen biomimetische Perlen (rechts Rohr, 10x Lager) und Puffersteuerung (links Rohr). (B) Befestigung MAM7-gekoppelten Kügelchen, um Hela Zellen führt zu Aktin Umlagerungen und Stressfaserbildung. Befestigung von fluoreszierenden blauen Perlen und daraus resultierende Aktin-Stressfasern (rot, mit Rhodamin-Phalloidin gefärbt) wurden durch Mikroskopie abgebildet. Bar, 10 &amp; mgr; m. Bilder im Feld B wurden von Lim et al. 1 angepasst und unter der Creative Commons Attribution Lizenz reproduziert werden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53400/53400fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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Biomimetic Materials to Characterize Bacteria-host Interactions

Bacterial attachment to host cells is a key step during host colonization and infection. This protocol describes the generation of polymer-coupled recombinant adhesins as biomimetic materials which allow analysis of the contribution of individual adhesins to these processes, independent of other bacterial factors.

Biomimetische Materialien zu den Bakterien-Wirt-Interaktionen Charakterisieren

Bacterial attachment to host cells is one of the earliest events during bacterial colonization of host tissues and thus a key step during infection. The ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

9.3K Aufrufe.  University of Birmingham. Bacterial attachment to host cells is a key step during host colonization and infection. This protocol describes the generation of polymer-coupled recombinant adhesins as biomimetic materials which allow analysis of the contribution of individual adhesins to these processes, independent of other bacterial factors. 

Serie: Biomimetic Materials to Characterize Bacteria-host Interactions

Assessing the Viability of a Synthetic Bacterial Consortium on the In Vitro Gut Host-microbe Interface

The interplay between host and microbiota has been long recognized and extensively described. The mouth is similar to other sections of the gastrointestinal tract, as resident microbiota occurs and prevents colonisation by exogenous bacteria. Indeed, more than 600 species of bacteria are found in the oral cavity, and a single individual may carry around 100 different at any time. Oral bacteria possess the ability to adhere to the various niches in the oral ecosystem, thus becoming integrated within the resident microbial communities, and favouring growth and survival. However, the flow of bacteria into the gut during swallowing has been proposed to disturb the balance of the gut microbiota. In fact, oral administration of P. gingivalis shifted bacterial composition in the ileal microflora. We used a synthetic community as a simplified representation of the natural oral ecosystem, to elucidate the survival and viability of oral bacteria subjected to simulated gastrointestinal transit conditions. Fourteen species were selected, subjected to in vitro salivary, gastric, and intestinal digestion processes, and presented to a multicompartment cell model containing Caco-2 and HT29-MTX cells to simulate the gut mucosal epithelium. This model served to unravel the impact of swallowed bacteria on cells involved in the enterohepatic circulation. Using synthetic communities allows for controllability and reproducibility. Thus, this methodology can be adapted to assess pathogen viability and subsequent inflammation-associated changes, colonization capacity of probiotic mixtures, and ultimately, potential bacterial impact on the presystemic circulation.

Assessing the Viability of a Synthetic Bacterial Consortium on the In Vitro Gut Host-microbe Interface

Gut host-microbe interactions were assessed using a novel approach combining a synthetic oral community, in vitro gastrointestinal digestion, and a model of the small intestine epithelium. We present a method that can be adapted to evaluate cell invasion of pathogens and multi-species biofilms, or even to test probiotic formulations&#39; survivability.

Beurteilung der Lebensfähigkeit eines synthetischen bakterielle Konsortiums auf der In-vitro- Darm Host-Mikrobe Oberfläche

The interplay between host and microbiota has been long recognized and extensively described. The mouth is similar to other sections of the ...

Forschung

Biochemie

Porphyromonas gingivalis as a Model Organism for Assessing Interaction of Anaerobic Bacteria with Host Cells

Anaerobic bacteria far outnumber aerobes in many human niches such as the gut, mouth, and vagina. Furthermore, anaerobic infections are common and frequently of indigenous origin. The ability of some anaerobic pathogens to invade human cells gives them adaptive measures to escape innate immunity as well as to modulate host cell behavior. However, ensuring that the anaerobic bacteria are live during experimental investigation of the events may pose challenges. Porphyromonas gingivalis, a Gram-negative anaerobe, is capable of invading a variety of eukaryotic non-phagocytic cells. This article outlines how to successfully culture and assess the ability of P. gingivalis to invade human umbilical vein endothelial cells (HUVECs). Two protocols were developed: one to measure bacteria that can successfully invade and survive within the host, and the other to visualize bacteria interacting with host cells. These techniques necessitate the use of an anaerobic chamber to supply P. gingivalis with an anaerobic environment for optimal growth.
The first protocol is based on the antibiotic protection assay, which is largely used to study the invasion of host cells by bacteria. However, the antibiotic protection assay is limited; only intracellular bacteria that are culturable following antibiotic treatment and host cell lysis are measured. To assess all bacteria interacting with host cells, both live and dead, we developed a protocol that uses fluorescent microscopy to examine host-pathogen interaction. Bacteria are fluorescently labeled with 2&#39;,7&#39;-Bis-(2-carboxyethyl)-5-(and-6)-carboxyfluorescein acetoxymethyl ester (BCECF-AM) and used to infect eukaryotic cells under anaerobic conditions. Following fixing with paraformaldehyde and permeabilization with 0.2% Triton X-100, host cells are labeled with TRITC phalloidin and DAPI to label the cell cytoskeleton and nucleus, respectively. Multiple images taken at different focal points (Z-stack) are obtained for temporal-spatial visualization of bacteria. Methods used in this study can be applied to any cultivable anaerobe and any eukaryotic cell type.

Porphyromonas gingivalis as a Model Organism for Assessing Interaction of Anaerobic Bacteria with Host Cells

This article presents two protocols: one to measure anaerobic bacteria that can successfully invade and survive within the host, and the other to visualize anaerobic bacteria interacting with host cells. This study can be applied to any cultivable anaerobe and any eukaryotic cell type.

Porphyromonas gingivalis als Modellorganismus für die Beurteilung der Interaktion von anaeroben Bakterien mit Wirtszellen

Anaerobic bacteria far outnumber aerobes in many human niches such as the gut, mouth, and vagina. Furthermore, anaerobic infections are common and ...

Immunologie und Infektion

Investigation of Microbial Cooperation via Imaging Mass Spectrometry Analysis of Bacterial Colonies Grown on Agar and in Tissue During Infection

Understanding the metabolic consequences of microbial interactions that occur during infection presents a unique challenge to the field of biomedical imaging. Matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI) imaging mass spectrometry represents a label-free, in situ imaging modality capable of generating spatial maps for a wide variety of metabolites. While thinly sectioned tissue samples are now routinely analyzed via this technology, imaging mass spectrometry analyses of non-traditional substrates, such as bacterial colonies commonly grown on agar in microbiology research, remain challenging due to the high water content and uneven topography of these samples. This paper demonstrates a sample preparation workflow to allow for imaging mass spectrometry analyses of these sample types. This process is exemplified using bacterial co-culture macrocolonies of two gastrointestinal pathogens: Clostridioides difficile and Enterococcus faecalis. Studying microbial interactions in this well-defined agar environment is also shown to complement tissue studies aimed at understanding microbial metabolic cooperation between these two pathogenic organisms in mouse models of infection. Imaging mass spectrometry analyses of the amino acid metabolites arginine and ornithine are presented as representative data. This method is broadly applicable to other analytes, microbial pathogens or diseases, and tissue types where a spatial measure of cellular or tissue biochemistry is desired.

Investigation of Microbial Cooperation via Imaging Mass Spectrometry Analysis of Bacterial Colonies Grown on Agar and in Tissue During Infection

A novel sample preparation method is demonstrated for the analysis of agar-based, bacterial macrocolonies via matrix-assisted laser desorption/ionization imaging mass spectrometry.

Untersuchung der mikrobiellen Kooperation mittels bildgebender Massenspektrometrie-Analyse von Bakterienkolonien, die während der Infektion auf Agar und im Gewebe gezüchtet wurden

Understanding the metabolic consequences of microbial interactions that occur during infection presents a unique challenge to the field of biomedical ...

High Throughput Co-culture Assays for the Investigation of Microbial Interactions

The study of interactions between microorganisms has led to numerous discoveries, from novel antimicrobials to insights in microbial ecology. Many approaches used for the study of microbial interactions require specialized equipment and are expensive and time intensive. This paper presents a protocol for co-culture interaction assays that are inexpensive, scalable to large sample numbers, and easily adaptable to numerous experimental designs. Microorganisms are cultured together, with each well representing one pairwise combination of microorganisms. A test organism is cultured on one side of each well and first incubated in monoculture. Subsequently, target organisms are simultaneously inoculated onto the opposite side of each well using a 3D-printed inoculation stamp. After co-culture, the completed assays are scored for visual phenotypes, such as growth or inhibition. These assays can be used to confirm phenotypes or identify patterns among isolates of interest. Using this simple and effective method, users can analyze combinations of microorganisms rapidly and efficiently. This co-culture approach is applicable to antibiotic discovery as well as culture-based microbiome research and has already been successfully applied to both applications.

The co-culture interaction assays presented in this protocol are inexpensive, high throughput, and simple. These assays can be used to observe microbial interactions in co-culture, identify interaction patterns, and characterize the inhibitory potential of a microbial strain of interest against human and environmental pathogens.

High Throughput Co-Culture Assays für die Untersuchung mikrobieller Wechselwirkungen

The study of interactions between microorganisms has led to numerous discoveries, from novel antimicrobials to insights in microbial ecology. Many ...

Kinetic Visualization of Single-Cell Interspecies Bacterial Interactions

Polymicrobial communities are ubiquitous in nature, yet studying their interactions at the single-cell level is difficult. Thus, a microscopy-based method has been developed for observing interspecies interactions between two bacterial pathogens. The use of this method to interrogate interactions between a motile Gram-negative pathogen, Pseudomonas aeruginosa and a non-motile Gram-positive pathogen, Staphylococcus aureus is demonstrated here. This protocol consists of co-inoculating each species between a coverslip and an agarose pad, which maintains the cells in a single plane and allows for visualization of bacterial behaviors in both space and time.
Furthermore, the time-lapse microscopy demonstrated here is ideal for visualizing the early interactions that take place between two or more bacterial species, including changes in bacterial species motility in monoculture and in coculture with other species. Due to the nature of the limited sample space in the microscopy setup, this protocol is less applicable for studying later interactions between bacterial species once cell populations are too high. However, there are several different applications of the protocol which include the use of staining for imaging live and dead bacterial cells, quantification of gene or protein expression through fluorescent reporters, and tracking bacterial cell movement in both single species and multispecies experiments.

This live-bacterial cell imaging protocol allows for visualization of interactions between multiple bacterial species at the single-cell level over time. Time-lapse imaging allows for observation of each bacterial species in monoculture or coculture to interrogate interspecies interactions in multispecies bacterial communities, including individual cell motility and viability.

Kinetische Visualisierung von einzelzelligen Interspezies-Bakterien-Wechselwirkungen

Polymicrobial communities are ubiquitous in nature, yet studying their interactions at the single-cell level is difficult. Thus, a microscopy-based method ...

Visualization of Gut Microbiota-host Interactions via Fluorescence In Situ Hybridization, Lectin Staining, and Imaging

Measuring the localization of microbes within their in vivo context is an essential step in revealing the functional relationships between the microbiota and the vertebrate gut. The spatial landscape of the gut microbiota is tightly controlled by physical features - intestinal mucus, crypts, and folds - and is affected by host-controlled properties such as pH, oxygen availability, and immune factors. These properties limit the ability of commensal microbes and pathogens alike to colonize the gut stably. At the micron-scale, microbial organization determines the close-range interactions between different microbes as well as the interactions between microbes and their host. These interactions then affect large-scale organ function and host health.
This protocol enables the visualization of the gut microbiota spatial organization from distances between cells to organ-wide scales. The method is based on fixing gut tissues while preserving intestinal structure and mucus properties. The fixed samples are then embedded, sectioned, and stained to highlight specific bacterial species through fluorescence in situ hybridization (FISH). Host features, such as mucus and host cell components, are labeled with fluorescently labeled lectins. Finally, the stained sections are imaged using a confocal microscope utilizing tile-scan imaging at high magnification to bridge the micron to centimeter length scales. This type of imaging can be applied to intestinal sections from animal models and biopsies from human tissues to determine the biogeography of the microbiota in the gut in health and disease.

Visualization of Gut Microbiota-host Interactions via Fluorescence In Situ Hybridization, Lectin Staining, and Imaging

This streamlined protocol details a workflow to detect and image bacteria in complex tissue samples, from fixing the tissue to staining microbes with fluorescent in situ hybridization.

Visualisierung von Darmmikrobiota-Wirt-Interaktionen durch Fluoreszenz-In-situ-Hybridisierung , Lektinfärbung und Bildgebung

Measuring the localization of microbes within their in vivo context is an essential step in revealing the functional relationships between the microbiota ...

Automated, High-Throughput Detection of Bacterial Adherence to Host Cells

Identification of emerging bacterial pathogens is critical for human health and security. Bacterial adherence to host cells is an essential step in bacterial infections and constitutes a hallmark of potential threat. Therefore, examining the adherence of bacteria to host cells can be used as a component of bacterial threat assessment. A standard method for enumerating bacterial adherence to host cells is to co-incubate bacteria with host cells, harvest the adherent bacteria, plate the harvested cells on solid media, and then count the resultant colony forming units (CFU). Alternatively, bacterial adherence to host cells can be evaluated using immunofluorescence microscopy-based approaches. However, conventional strategies for implementing these approaches are time-consuming and inefficient. Here, a recently developed automated fluorescence microscopy-based imaging method is described. When combined with high-throughput image processing and statistical analysis, the method enables rapid quantification of bacteria that adhere to host cells. Two bacterial species, Gram-negative Pseudomonas aeruginosa and Gram-positive Listeria monocytogenes and corresponding negative controls, were tested to demonstrate the protocol. The results show that this approach rapidly and accurately enumerates adherent bacteria and significantly reduces experimental workloads and timelines.

Detection of host-bacterial pathogen interactions based on phenotypic adherence using high-throughput fluorescence labeling imaging along with automated statistical analysis methods enables rapid evaluation of potential bacterial interactions with host cells.

Automatisierter Hochdurchsatz-Nachweis der bakteriellen Adhärenz an Wirtszellen

Identification of emerging bacterial pathogens is critical for human health and security. Bacterial adherence to host cells is an essential step in ...

Using Coculture to Detect Chemically Mediated Interspecies Interactions

In nature, bacteria rarely exist in isolation; they are instead surrounded by a diverse array of other microorganisms that alter the local environment by secreting metabolites. These metabolites have the potential to modulate the physiology and differentiation of their microbial neighbors and are likely important factors in the establishment and maintenance of complex microbial communities. We have developed a fluorescence-based coculture screen to identify such chemically mediated microbial interactions. The screen involves combining a fluorescent transcriptional reporter strain with environmental microbes on solid media and allowing the colonies to grow in coculture. The fluorescent transcriptional reporter is designed so that the chosen bacterial strain fluoresces when it is expressing a particular phenotype of interest (i.e. biofilm formation, sporulation, virulence factor production, etc.) Screening is performed under growth conditions where this phenotype is not expressed (and therefore the reporter strain is typically nonfluorescent). When an environmental microbe secretes a metabolite that activates this phenotype, it diffuses through the agar and activates the fluorescent reporter construct. This allows the inducing-metabolite-producing microbe to be detected: they are the nonfluorescent colonies most proximal to the fluorescent colonies. Thus, this screen allows the identification of environmental microbes that produce diffusible metabolites that activate a particular physiological response in a reporter strain. This publication discusses how to: a) select appropriate coculture screening conditions, b) prepare the reporter and environmental microbes for screening, c) perform the coculture screen, d) isolate putative inducing organisms, and e) confirm their activity in a secondary screen. We developed this method to screen for soil organisms that activate biofilm matrix-production in Bacillus subtilis; however, we also discuss considerations for applying this approach to other genetically tractable bacteria.

Bacteria produce secreted compounds that have the potential to affect the physiology of their microbial neighbors. Here we describe a coculture screen that allows detection of such chemically mediated interspecies interactions by mixing soil microbes with fluorescent transcriptional reporter strains of Bacillus subtilis on solid media.

Mit Cokultur zur Erkennung chemisch vermittelte Interspezies-Interaktionen

In nature, bacteria rarely exist in isolation; they are instead surrounded by a diverse array of other microorganisms that alter the local environment by ...

Biologie

Organotypic Tissue Model Systems for Investigating Host-Pathogen Interactions In Vitro

Recapitulating the host-pathogen interface at the epithelial or mucosal barrier in vitro remains a challenging prospect for infection biologists. While in-house grown 2D epithelial monolayers lack true representation of the in vivo situation, commercially available tissue models are often overlooked due to their cost and practicality. However, with careful planning, such models provide reproducible platforms for a vast array of different applications. Here, we report the use of epithelial models that can be utilized for a wide variety of experimental purposes to investigate host-pathogen interactions in various ecological niches, such as the oral cavity, skin, and vaginal mucosa. From simple planktonic cells to complex biofilm co-culture, epithelial models are used to assess microbial adherence and invasion, and to evaluate the host response at a transcriptional and/or protein level, with scope for more detailed profiling using different omics approaches. Furthermore, these biological systems can be used as more accurate test beds for evaluating conventional and novel antimicrobial activity in a complex host-pathogen microenvironment in vitro. The protocols described herein document how models are handled upon arrival and prepared in the laboratory for co-culture stimulation with biofilm communities. The methods detail how experimental outputs are achieved from the model systems, including the processing of tissue, the co-culture setup, and data generation. These experiments include host gene expression through single- and multiplex qPCR analyses and inflammatory protein detection using ELISAs. In conclusion, epithelial models provide useful in vitro systems for preclinical investigatory studies into simple or complex host-pathogen interactions.

The present protocol outlines the application of organotypic tissue models for investigating host-pathogen interactions in vitro. Specifically, the model system described uses a multi-layered oral epithelium exposed to microorganisms associated with biofilms (dental plaque) within the context of oral health versus disease.

Organotypische Gewebemodellsysteme zur Untersuchung von Wirt-Erreger-Interaktionen in vitro

Recapitulating the host-pathogen interface at the epithelial or mucosal barrier in vitro remains a challenging prospect for infection biologists. While ...

Measuring the Migration and Biofilm Formation of Various Bacteria

As microbes that thrive in the host body primarily have adaptive abilities that facilitate their survival, methods for classifying and identifying their nature would be beneficial in facilitating their characterization. Currently, most studies focus only on one specific characterization method; however, the isolation and identification of microorganisms from the host is a continuous process and usually requires several combinatorial characterization methods. Herein, we describe methods of identifying the microbial biofilm-forming ability, the microbial respiration state, and their chemotaxis behavior. The methods are used to identify five microbes, three of which were isolated from the bone tissue of Sprague-Dawley (SD) rats (Corynebacterium stationis, Staphylococcus cohnii subsp. urealyticus, and Enterococcus faecalis) and two from the American Type Culture Collection (ATCC)-Staphylococcus aureus ATCC 25923&#160;and Enterococcus faecalis V583. The microbes isolated from the SD rat bone tissue include the gram-positive microbes. These microbes have adapted to thrive under stressful and nutrient-limiting environments within the bone matrix. This article aims to provide the readers with the specific know-how of determining the nature and behavior of the isolated microbes within a laboratory setting.

Here, we present a practical method for the isolation and identification of microorganisms within the host. In this way, the physicochemical properties of microorganisms and possible ways of living in the host are clearly described.

As microbes that thrive in the host body primarily have adaptive abilities that facilitate their survival, methods for classifying and identifying their ...