The authors would like to thank members of the Krachler group for critical reading of the manuscript. DHS, DV and AMK were funded by the Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BB/L007916/1), FA was funded by a Republic of Iraq Ministry of Higher Education and Scientific Research Scholarship and NPS was funded by a CONICYT Scholarship.

1. Chemische Kopplung von Proteinen an Perlpolymerisates <ol><li> Thiol-Amin-Richtungskopplungs Hinweis: Dieses Protokoll ist für Kopplung von Cystein enthaltenden Proteinen zu Amin-funktionalisierten Polymerkügelchen mit Sulfosuccinimidyl-4- (p maleimidophenyl) butyrat (Sulfo-SMPB) als Vernetzungsmittel (1). <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/53400/53400fig1.jpg" /> Abbildung 1. Vernetzungsstrategie für gerichtete Thiol-Amin-Kupplung von Proteinen an Polymerkügelchen verwendet. Aminmodifizierten Polystyrol-Kügelchen sind mit Sulfo-SMPB aktiviert. Die Maleimid reagiert mit freien Cysteine ​​zu koppeln, Proteine, um Perlen gerichtet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53400/53400fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <ol><li> Herstellung der Reagenzien: <ol><li> Vorbereitung PBS (100 mM Natriumphosphat, 150 mM NaCl, pH 7,0) und Autoklaven. </li&gt; <li> Bereiten Sie eine 100x Lager (0,5 M oder 287 mg / ml in PBS) von TCEP (Tris (2-Carboxyethyl) phosphin) unmittelbar vor der Verwendung. </li><li> Bereiten Sie eine 5x Lager (10 mM bzw. 4,58 mg / ml in dH 2 O) von Sulfo-SMPB unmittelbar vor der Verwendung. </li><li> Bereiten Sie eine 10-faches (500 mM oder 88 mg / ml in PBS, pH 7,0) von Cystein unmittelbar vor der Verwendung. </li></ol></li><li> Bead-Aktivierung: <ol><li> Mischen die Perlensuspension durch sanftes Invertieren und Übertragen der erforderlichen Menge an Perlensuspension (beispielsweise 12 ml) in ein steriles 1,5-ml-Röhrchen mit 1 ml sterilem PBS, pH 7,0. </li><li> Gently Pipette auf und ab, um die Perlen und Pellet durch Zentrifugation in einer Mikrozentrifuge (2 min bei 16.000 × g) waschen. </li><li> Den Überstand mit einer Pipette und entsorgen Sie vorsichtig entfernen. Resuspendieren der Wulst Pellet in 1 ml frischem sterilem PBS und wiederholen Sie den Waschschritt. Resuspendieren Wulst Pellet in 0,8 ml PBS. </li><li> Fügen Sie 200 ml frisch hergestellte 10 mM Sulfo-SMPB, um eine endgültige concent gebenration von 2 mm. </li><li> Inkubieren der Perlen-Suspension für 1 h bei 25 ° C auf einem rotierenden Rad. </li></ol></li><li> Protein-Reduktion: <ol><li> Während der Inkubationszeit der Aktivierungsschritt vorzubereiten, die das Protein die folgenden Kupplungsschritt so kann sie sofort an die aktivierten Beads zugesetzt werden. Anmerkung: Obwohl diese Reduktionsschritt nicht immer für GST (Glutathion-S-Transferase) Fusionsproteine ​​erforderlich ist, wird empfohlen, eine hohe Kopplungseffizienz zu gewährleisten. <ol><li> Überprüfen der Proteinkonzentration und stellen sie auf die Endkonzentration für die Kupplungsreaktion erforderlich. Anmerkung: 6 mM Protein in PBS, und ein Volumen von 1 ml werden in der Regel verwendet. </li><li> In TCEP Lager, um eine Endkonzentration von 5 mM zu ergeben. Inkubieren der Lösung für 30 min bei RT. Anmerkung: Das Reaktionsgemisch kann direkt für die folgende Kupplungsreaktion verwendet werden. </li><li> Behalten eine kleine Menge (einige ml) der Proteinlösung für die Bestimmung der pro<html> Proteinkonzentration und Berechnung des Kopplungseffizienz (siehe Abschnitt 2). </li></ol></li></ol></li><li> Protein-Kupplungsschritt: <ol><li> Pellet die aktivierten Beads durch Zentrifugation (2 min, 16.000 xg in einer Mikrozentrifuge) und wasche das Pellet einmal in 1 ml frischer steriler PBS. </li><li> Das Pellet in die vorbereitete Proteinlösung (zum Beispiel 1 ml), um das gewünschte Proteinkonzentration zu ergeben. Achtung: Die Proteinkonzentration während der Kupplungsschritt wird auf die durchschnittliche Kupplungseffizienz (siehe Abschnitt 2 zur Bestimmung der Kopplungseffizienz) und der gewünschten Kupplungsdichte (wie in 1.1.4.3 berechnet) abhängen. Der Wirkungsgrad etwa 85%, und die gewünschte Endkonzentration 5 mM im 10x Perlensuspension, so Proteinkonzentration während der Kupplungsstufe sollte ungefähr 6 mm betragen. </li><li> Berechnung der Kupplungsdichte unter Verwendung der folgenden Formel: jpg &quot;/&gt; wobei ρ c Kupplungsdichte [Anzahl der Protein-Moleküle / nm 2], Protein konzentrierter Proteinkonzentration [mg / ml] Protein M w Proteinmolekulargewicht [da], Wulst konz Perlenkonzentration [Anzahl der Perlen / L], d Perlendurchmesser [nm 2] Avogadro-Zahl </li><li> Verwenden Sie die Kupplungsdichte, um die durchschnittliche Ligand Abstand berechnen: <img alt="Gleichung 2" src="/files/ftp_upload/53400/53400eq2.jpg" /></li><li> Inkubieren der protein Bead-Suspension 2 h bei 25 ° C auf einem rotierenden Rad. Hinweis: EinigeProteine ​​können nicht stabil sein bei RT. In diesen Fällen kann die Reaktion bei 4 ° CO / N ausgeführt werden. </li><li> Deaktivieren verbleibenden aktivierten Gruppen auf den Perlen durch Zugabe von Cystein-Lager bis zu einer Endkonzentration von 50 mM und Inkubation der Suspension für 30 min bei 25 ° C auf einem rotierenden Rad. Pellet die Beads durch Zentrifugation (2 min, 16.000 xg in einer Mikrozentrifuge). </li><li> Halten Sie den Überstand zur Bestimmung der Proteinkonzentration und Berechnung des Kopplungseffizienz (siehe Abschnitt 2). </li><li> Zweimaliges Waschen der Bead-Pellet mit 1 ml PBS und resuspendieren in 1 ml frischem PBS, um das Endprodukt zu ergeben. Hinweis: Das obige Protokoll wird in der Regel geben, 1 ml gekoppelten Protein, in einer Endkonzentration von 5 mM Protein, das als 10x Lager für nachfolgende Experimente (siehe Abschnitt 3) verwendet werden kann. </li><li> Um in Abschnitt 3 des Protokolls gehen, arbeiten mit 100 ml / ml Bead Lager, oder in einer Endkonzentration von 500 nM Protein. Hinweis: Ein guter Ausgangspunkt für diese procedure ist 2 × 10 12 Perlen / ml sein, was zu einer durchschnittlichen Kupplungsdichte von 3 × 10 -4 Proteine ​​/ nm 2 oder einem mittleren Abstand von 57 nm auf einem Kügelchen von 2 mm Durchmesser. </li></ol></li></ol></li><li> Thiol-Carboxy Richtungskopplungs Hinweis: Dieses Protokoll ist für die Kopplung Cystein enthaltenden Proteinen an carboxylfunktionalisierten Polystyrolperlen. Die Carboxylgruppe zunächst mit 1-Ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimid (EDC) / N-Hydroxysuccinimid (NHS), modifizierte Amin und anschließend vernetzt mit Sulfo-SMPB (Figur 2) aktiviert wird. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/53400/53400fig2.jpg" /> Abbildung 2. Vernetzungsstrategie für gerichtete Thiol-carboxyl Kopplung von Proteinen an Polymerkügelchen verwendet. Carboxylierte Polystyrolkügelchen werden zunächst mit EDC aktiviert und mit NHS modifiziert, um eine semistabile NHS-Ester zu bilden. Nachfolgende Amin-Kopplung ethylenediAmin führt zu einer freien Amingruppe, die sich mit Sulfo-SMPB reagiert. Maleimid aktivierte Kügelchen können dann mit freien Cysteinen reagieren paar Proteine, um Perlen gerichtet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53400/53400fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <ol><li> Herstellung der Reagenzien: <ol><li> Vorbereitung PBS (100 mM Natriumphosphat, 150 mM NaCl, pH 7,0) und Autoklaven. </li><li> Bereiten Sie eine 100x Lager (0,5 M oder 287 mg / ml in PBS,) von TCEP unmittelbar vor der Verwendung. </li><li> Bereiten Sie eine 10-faches (20 mM oder 4 mg / ml in PBS) EDC (1-Ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimid) unmittelbar vor der Verwendung. </li><li> Bereiten Sie eine 10-faches (50 mM, oder 6 mg / ml in PBS) des NHS (N-Hydroxysuccinimid) unmittelbar vor der Verwendung. </li><li> Bereiten Sie eine 5x Lager (10 mM bzw. 4,58 mg / ml in dH 2 O) von Sulfo-SMPB unmittelbar vor der Verwendung. </li><li> Bereiten Sie eine 10-faches (500 mM oder 88 mg / ml in PBS, pH 7,0) von Cystein sofort bevor Gebrauch. </li></ol></li><li> Bead-Aktivierung: <ol><li> Mischungsperlensuspension durch sanftes Invertieren und Übertragen der erforderlichen Menge an Perlensuspension (beispielsweise 12 ml) in ein steriles 1,5-ml-Röhrchen mit 1 ml sterilem PBS, pH 7,0. </li><li> Gently Pipette auf und ab, um die Perlen und Pellet durch Zentrifugation in einer Mikrozentrifuge (2 min bei 16.000 × g) waschen. </li><li> Den Überstand mit einer Pipette und entsorgen Sie vorsichtig entfernen. </li><li> Resuspendieren der Wulst Pellet in 1 ml frischem sterilem PBS und wiederholen Sie den Waschschritt. </li><li> Resuspendieren Wulst Pellet in 0,8 ml PBS. </li><li> 100 ml 10-fach EDC Lager (2 mM Endkonzentration) und sofort 100 ml 10x NHS-Stammlösung (5 mM Endkonzentration) auf die Partikelsuspension. </li><li> Inkubieren der Perlen-Suspension für 30 min bei 25 ° C auf einem rotierenden Rad. </li><li> Einmal zu waschen Kügelchen in 1 ml PBS und resuspendieren in 0,8 ml frischem sterilem PBS. </li><li> In 200 ml Ethylendiamin und incUbate die Perlensuspension 1 Stunde bei 25 ° C auf einem rotierenden Rad. </li><li> Einmal zu waschen Perlen mit 1 ml PBS und Resuspendieren der Kügelchen in 0,8 ml frischem PBS. </li><li> Gehen Sie aus dem Abschnitt 1.1.2.4 (Wulst Aktivierung mit Sulfo-SMPB) wie in Abschnitt 1.1.2 beschrieben und folgen Sie den Rest des in Abschnitt 1.1 (Thiol-Amin-Richtungskopplungs) beschriebenen Protokoll. Führen Proteinpräparat und Protein-Kopplungsschritte in einer Weise identisch zu denen in Abschnitt 1.1 beschrieben. Hinweis: Die typische Kopplungseffizienz unter Verwendung dieses Protokolls ist etwas niedriger im Vergleich zum Abschnitt 1.1, also die anfängliche Proteinkonzentration entsprechend anpassen, um die gleiche Kopplungsdichte zu erreichen (ca. 75%.). </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Bestimmung der Kopplungseffizienz Hinweis: Um festzustellen, Proteinkonzentration, verwenden Sie Bradford-Reagenz 10 und kolorimetrische Assays wie folgt: <ol><li> Vorsichtig umdrehen Bradford-Reagenz bis e<html> Nsure Homogenität des Reagens. </li><li> Unter Verwendung einer 10 mg / ml BSA-Stammlösung, prepare protein Normen für Konzentrationen von 0,1 bis 1,5 mg / ml BSA in Puffer. </li><li> Man 250 ml Bradford Reagenz in die Vertiefungen einer Platte mit 96 Vertiefungen. Vorbereitung genug Vertiefungen für alle Proben, Proteinstandards und negative Kontrollen (nur Puffer). </li><li> 5 ml der Proteinprobe (Proteinstandards oder Puffer für die Negativkontrolle), um das Reagenz in der 96-Well-Platte. </li><li> Inkubieren der Platte auf einem Orbitalschüttler bei Raumtemperatur für 10 min. </li><li> Messung der Extinktion bei 595 nm mit einem Plattenlesegerät. </li><li> Generieren Sie eine Standardkurve der BSA-Konzentration gegen die A595 nm und nutzen diese, um Proteinkonzentrationen in der Aus- und Überstandsproben zu bestimmen. </li><li> Wird die Konzentration des gekoppelten Proteins wie folgt: <img alt="Gleichung 3" src="/files/ftp_upload/53400/53400eq3.jpg" /></li><li> Berechnung der Kopplungseffizienz als: 00eq4.jpg &quot;/&gt; </li></ol> 3. Verwendung von Bead-gekoppelter Adhäsine in Konkurrenztests <ol><li> Vorbereitung: <ol><li> Samen 1 ml pro Vertiefung von HeLa-Zellen bei einer Konzentration von 150.000 Zellen / ml in eine Platte mit 24 Vertiefungen einen Tag vor der Kompetitionsassay, sodass die Zellen etwa 80% Konfluenz vor dem Beginn des Experiments zu erreichen. </li><li> Richten Sie jeden experimentellen Zustand in dreifacher Ausfertigung. Fügen Brunnen für die negativen Kontrollen (keine Bakterien während der Konkurrenz-Assays hinzugefügt), positive Kontrollen (Kontrollkügelchen, um die Fusion-Tag nur während Kompetitionsassays hinzugefügt gekoppelt) und Lyse Kontrollen (Zytotoxizität Experimente). </li><li> Impfen eine 5 ml marine LB (MLB) Kultur mit einer frischen Kolonie V. parahaemolyticus und wachsen O / N bei 30 ° C, zu zittern. </li><li> Bereiten Sie ausreichend Kügelchen gekoppelt MAM, wie in Kapitel 1 (Kupplung) beschrieben. Lassen Sie für 100 ml 10x Korn Stock pro Vertiefung. </li></ol></li><li> Competition Assay: <ol><li> Am Tag der competitIonen-Experiment messen die OD 600 der Bakterienkultur. </li><li> Bereiten Infektion Medien durch Bakterienkulturen in farblose DMEM ohne Zusätze verdünnt, auf 37 ° C vorgewärmt, mit 10% v / v Perlensuspension (entweder Adhäsin-gekoppelten Kügelchen oder Kontrollkügelchen), zu einer MOI von 10. Bereiten Sie 1 ml geben / gut, und 10-20% Überschussvolumen pro Probe. Anmerkung: Bei den oben genannten Bedingungen (24-Well-Platte, V. parahaemolyticus, MOI 10), das notwendige Volumen des O / N-Kultur zu je Vertiefung (ml / ml) ist als 3 / OD 600 der Kultur Höhe berechnet. Zum Beispiel wird 1 ml Infektionsmedium enthält typischerweise 100 ml Partikelsuspension, ein paar ml Bakterienkultur und bis zu 1 ml mit farblosen, nicht ergänzten DMEM hergestellt werden. </li><li> Entfernen alte Medium aus den Vertiefungen und waschen kultivierten HeLa-Zellen durch Zugabe von 1 ml sterilem PBS vorgewärmt auf 37 ° C zu jeder Vertiefung. </li><li> Entfernen PBS und 1 ml Infektionsmedium pro Vertiefung. Auch die Kontrollen eingestellt, durch Zugabe von Lösungen containing Steuer Perlen und Bakterien (positive Kontrolle) oder Adhäsin Perlen und keine Bakterien (negative Kontrollen) oder DMEM, das 0,1% Triton X-100 (Lyse-Steuerung, nur für Zytotoxizität Messungen erforderlich). </li><li> Inkubieren der Platte in einem Gewebekultur-Inkubator bei 37 ° C für die gewünschte Zeitdauer (zB 4 Stunden auf Cytotoxizität Messungen oder 1 Stunde auf Haftung Messungen). Anmerkung: sind bakterielle Adhäsion und Zytotoxizität auf Wirtszellen können als Auslesungen für die Wirksamkeit der Hemmung verwendet werden. Wenn die Zeitpunkte der Zytotoxizität und Haftungsmessungen übereinstimmen, können beide Tests durchgeführt unter Verwendung von Proben aus der gleichen gut, da Zytotoxizität wird mit dem Kulturüberstand und Befestigungs Assays verwenden Proben aus der restlichen Zellschicht abgeleitet wird, bestimmt. </li></ol></li><li> Zytotoxizität Messungen: <ol><li> Zu angegebenen Zeitpunkten (zB 4 Stunden nach der Infektion), entfernen Sie dreimal 200 ml von jedem 24-Loch und Transfer zumeine 96-Well-Platte. </li><li> Spin 96-Well-Platten bei 1500 × g, 5 min und Transfer 100 ml aus jeder Vertiefung in ein frisches 96-Well-Platte. 100 ml der bei der Infektionsexperimente Frisch Vertiefungen der Platte mit 96 Vertiefungen in dreifacher Ausführung verwendeten Medien (diese werden als Rohlinge verwendet werden). </li><li> Durchführung der Laktat-Dehydrogenase (LDH) Freisetzungstest unter Verwendung eines LDH Zytotoxizität Nachweiskits und nach den Anweisungen des Herstellers. <ol><li> Kurz gesagt, die Berechnung der Menge an Reagenz in Schritten von 25 benötigt (zB wenn 62 Proben gemessen werden sollen, machen genug Reagenz-Mix für 75 etc.). </li><li> Zum Beispiel für 100 Proben, mischen 11,25 ml Reagenz A mit 250 ul Reagenz B. umkehren, nicht vortexen Schaumbildung zu vermeiden. </li><li> Setzen Sie die Mischung in einem Behälter in der Lage sein, mit einer Mehrkanal-Pipette pipettiert werden. 100 l Reagenzienmix zu jeder Probe. </li><li> Inkubieren Platte bei RT und die Extinktion bei 490 nm auf einem Plattenleser bei 10, 20, 30 min. </li&gt; <li> Analysieren des Datensatzes, für die die Absorption der Lyse Kontrollprobe hoch ist, aber immer noch innerhalb des linearen Bereichs des Plattenlesers (typischerweise 2-3 Extinktionseinheiten). </li><li> Express-Ergebnisse als% Zytotoxizität, nach der folgenden Formel für die Umrechnung: <img alt="Gleichung 5" src="/files/ftp_upload/53400/53400eq5.jpg" /></li></ol></li></ol></li><li> Die Messung der bakteriellen Adhäsion: <ol><li> Bei den angegebenen Zeitpunkten (beispielsweise 1 Stunde nach der Infektion), das Medium entfernt, der Zellschicht. </li><li> Die Zellschicht gründlich mit steriler, vorgewärmten PBS (mindestens 3-4 Wäschen von jeweils 1 ml PBS), um alle nicht-anhaftenden Zellen zu entfernen. </li><li> Lyse von Wirtszellen durch Zugabe von 1 ml einer sterilen 1% v / v Triton X-100-Lösung in PBS pro Vertiefung. Inkubieren der Platte bei 37 ° C für 5 min. </li><li> Pipettieren Sie jede Probe nach oben und unten mehrere Male, bevor die Übertragung der Inhalt der Vertiefungen bis 1,5-ml-Röhrchen zu trennen. Bereiten Sie das 10-fache serielle Verdünnungen von Probenin sterile PBS (zB verwenden 100 ml Probe und 900 ml PBS). </li><li> Platte 100 ml von jeder Probe auf MLB Agar und verteilt unter Verwendung einer Zelle Treuer. Optimieren Sie die je nach Bakterienstämme und Zeitpunkt bis zum Teller Verdünnung. Hinweis: Für die beschriebenen Versuchsaufbau, geben 10 5 oder 10 6 fachen Verdünnungen eine geeignete Anzahl von KBE. </li><li> Platten bei 37 ° CO / N und aufzuzählen Bakterien durch Koloniezählung. </li></ol></li></ol>

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	<li>Lim, J., Stones, D. H., Hawley, C. A., Watson, C. A., Krachler, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multivalent+Adhesion+Molecule+7+clusters+act+as+signaling+platform+for+host+cellular+GTPase+activation+and+facilitate+epithelial+barrier+dysfunction.">Multivalent Adhesion Molecule 7 clusters act as signaling platform for host cellular GTPase activation and facilitate epithelial barrier dysfunction.</a> PLoS Pathog. 10 (9), e1004421 (2014).</li><li>Krachler, A. M., Ham, H., Orth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outer+membrane+adhesion+factor+multivalent+adhesion+molecule+7+initiates+host+cell+binding+during+infection+by+gram-negative+pathogens.">Outer membrane adhesion factor multivalent adhesion molecule 7 initiates host cell binding during infection by gram-negative pathogens.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 108 (28), 11614-11619 (2011).</li><li>Krachler, A. M., Orth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+characterization+of+the+interaction+between+bacterial+adhesin+multivalent+adhesion+molecule+7+(MAM7)+protein+and+its+host+cell+ligands.">Functional characterization of the interaction between bacterial adhesin multivalent adhesion molecule 7 (MAM7) protein and its host cell ligands.</a> J Biol Chem. 286 (45), 38939-38947 (2011).</li><li>Joh, D., Speziale, P., Gurusiddappa, S., Manor, J., Hook, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+specificities+of+the+staphylococcal+and+streptococcal+fibronectin-binding+microbial+surface+components+recognizing+adhesive+matrix+molecules.">Multiple specificities of the staphylococcal and streptococcal fibronectin-binding microbial surface components recognizing adhesive matrix molecules.</a> Eur J Biochem. 258 (2), 897-905 (1998).</li><li>Bingham, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structures+of+fibronectin-binding+sites+from+Staphylococcus+aureus+FnBPA+in+complex+with+fibronectin+domains.">Crystal structures of fibronectin-binding sites from Staphylococcus aureus FnBPA in complex with fibronectin domains.</a> Proc Natl Acad Sci U.S.A. 105 (34), 12254-12258 (2008).</li><li>Ensenberger, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+interactions+between+F1+adhesin+of+Streptococcus+pyogenes+and+N-terminal+modules+of+fibronectin.">Specific interactions between F1 adhesin of Streptococcus pyogenes and N-terminal modules of fibronectin.</a> J Biol Chem. 276 (38), 35606-35613 (2001).</li><li>Hawley, C. A., Watson, C. A., Orth, K., Krachler, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+MAM7+peptide-based+inhibitor+of+Staphylococcus+aureus+adhesion+does+not+interfere+with+in+vitro+host+cell+function.">A MAM7 peptide-based inhibitor of Staphylococcus aureus adhesion does not interfere with in vitro host cell function.</a> PLoS One. 8 (11), e81216 (2013).</li><li>Krachler, A. M., Ham, H., Orth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Turnabout+is+fair+play:+use+of+the+bacterial+Multivalent+Adhesion+Molecule+7+as+an+antimicrobial+agent.">Turnabout is fair play: use of the bacterial Multivalent Adhesion Molecule 7 as an antimicrobial agent.</a> Virulence. 3 (1), 68-71 (2012).</li><li>Krachler, A. M., Mende, K., Murray, C., Orth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+characterization+of+multivalent+adhesion+molecule+7-based+inhibition+of+multidrug-resistant+bacteria+isolated+from+wounded+military+personnel.">In vitro characterization of multivalent adhesion molecule 7-based inhibition of multidrug-resistant bacteria isolated from wounded military personnel.</a> Virulence. 3 (4), 389-399 (2012).</li><li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding.">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Hier beschreiben wir zwei Protokolle, die zum Koppeln thiolhaltigen Proteine ​​verwendet werden können, um Amin- oder Carboxylat-modifizierten Polystyrolperlen sind. Wegen der Leichtigkeit der Verfahrensweise, Thiol-Amin-Kopplung bevorzugt, aber abhängig von dem gewünschten Wulst Spezifikation (Durchmesser, Fluoreszenzeigenschaften) kann die Verwendung von Amin-funktionalisierten Kügelchen nicht möglich sein, und wir haben deshalb enthalten ein Protokoll, das den Carbonsäureester umwandeln - in eine Amin-Einheit für den Forscher die größtmögliche Flexibilität bei der Wahl des Gerüsts zu geben. Obwohl beide Thiol-Amin und Thiol-carboxyl Kupplungs Arbeit für jeden Cystein Protein Richtkoppler enthält (dh die Immobilisierung des Proteins pro seinem N-Terminus, imitiert surface display) erfordert eine Protein ohne Cysteinreste, wird diese als eine GST-Fusion hergestellt Protein oder dass enthält ein Nebenstelle eingeführt einzigen terminalen Cysteinrest Mutagenese. Wenn mehrere reaktive Cysteine ​​enthalten sindinnerhalb des Proteins, wird dieser zufällige Immobilisierung der Proteinfunktion beeinträchtigen könnten führen. Viele bakterielle Adhäsine weiß Cysteine ​​enthalten, nicht natürlich. Für andere kann diese durch ortsgerichtete Mutagenese entfernt werden, obwohl dies umfangreiche Untersuchungen erfordert, um sicherzustellen, nativen Struktur und Funktion in der Mutante erhalten. GST-Fusionsproteine ​​können gereinigte GST-Tag an Kügelchen gekoppelt sind, wie eine geeignete Negativkontrolle verwendet werden. Verwendung entkoppelt Kügelchen als Kontrolle sollte vermieden werden, da diese oft eine höhere Neigung zu verklumpen oder sich an Zellen nicht-spezifisch. Eine vereinfachte Version der Protokoll 1.2., Nur mit EDC kann zu koppeln Proteinen an Carboxylgruppen funktionalisierten Polymerkügelchen verwendet werden, jedoch ist in diesem Fall Kopplung erfolgt über primäre Amine in dem Protein und garantiert deshalb nicht Richtungskopplung. TCEP als Reduktionsmittel darf nicht mit anderen kommerziell erhältlichen und üblichen Reduktionsmitteln, wie zum Beispiel dithiothr ersetzt werdeneitol (DTT) oder 2-Mercaptoethanol (BME), da die in ihnen enthaltenen Thiole mit Protein-Kopplung in der Thiol-Maleimid Kopplungsschritt konkurrieren. PBS kann mit anderen Puffer ersetzt werden, aber mit den folgenden Überlegungen: Puffer möglicherweise nicht primäre Amine enthalten (so Tris-Puffer enthält, sind nicht geeignet). Verwendung von Puffern, die sehr gering (&lt;10 mm) Salzkonzentrationen führt zu Verklumpung Auffädeln und sollten ebenfalls vermieden werden. Proteinreinheit ist auch ein wichtiger Faktor, der bei diesem Verfahren entstehen, sowie die Daten von hoher Qualität zu erreichen, sollte reine Proteine ​​verwendet werden. Wir routinemßig zu reinigen Proteine ​​in mehreren Schritten, darunter mindestens eine Affinitätsreinigung und Gelfiltrationsschritt, aber in einigen Fällen Ionenaustauschchromatographie in einem dritten Schritt erfolgt. Als Folge ist die Reinheit von Proteinen für die Kopplung verwendet wird, ist üblicherweise 90% oder höher, wie durch SDS-PAGE beurteilt. Es wird empfohlen, Protein-Konzentrationen sowohl in der anfänglichen Reaktionsmischung sowie th bestimmene Stand nach Beendigung der Reaktion. Dies wird helfen, die scheinbare Konzentration der Kügelchen gekoppelten Proteins und damit Kopplungsdichte zu bestimmen. Bestimmung der beiden Werte ermöglicht auch die Berechnung der Kopplungseffizienz. Dies kann berücksichtigt werden, wenn die Vorbereitung der Ausgangsproteinlösung in nachfolgenden Reaktionen, um die gewünschte Endkonzentration zu erzielen, und Kupplungsdichte berücksichtigt werden. Bradford-Reagenz ist insbesondere zur Bestimmung der Proteinkonzentration geeignet vor und nach der Kupplungsreaktion, da keine der Substanzen in der Reaktions stört die Farbstoffkomplexbildung bei den verwendeten Konzentrationen. Niedrigeren Proteinkonzentrationen, die verwendet werden sollen, kann dieses Verfahren müssen durch eine empfindlichere Nachweismethode ersetzt jedoch Aufmerksamkeit ist auf die Tatsache hat es mit den in der Kopplungsreaktion enthaltenen Substanzen kompatibel sind gezahlt. Es wird auch empfohlen, um frisch zubereiteten Reagenzien zu verwenden und zu handhaben pulverförmigen Reagenzien mit Sorgfalt (zB Shopin einem verschlossenen Behälter und mit Siliciumdioxidperlen, um die Reagenzien Feuchtigkeit zeichnen), da die Qualität der Reagenzien wird die Kopplungseffizienz beeinflussen zu vermeiden. Wenn die Kopplungseffizienz geringer als erwartet ist, umfassen mögliche Abhilfen Erhöhung der anfänglichen Wulst und Proteinkonzentrationen. Falls höhere Konzentrationen verwendet werden, muss die Konzentration von Kopplungsreagenzien proportional erhöht, um eine ausreichende molaren Überschuss sicherzustellen. Ändern von Korn / Protein-Konzentrationen in der Regel eine bessere Schritt hin zu Optimierung, anstatt die Reaktionszeiten. Da die Protokolle für die Wulst Kopplung sind langwierig, wir gemeinhin bereiten eine große Charge des Materials. Aliquots der Suspension in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei -20 ° C mehrere Monate gelagert werden. Aufgetauten Aliquots sollten nicht eingefroren werden und bei 4 ° C gelagert und innerhalb von 1-2 Tagen verwendet werden. Dies wird jedoch mit der Art und Stabilität der so sollte auf eine kleine Charge zunächst getestet werden verwendeten Proteins variieren. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Bead-gekoppelter Adhäsine kann für viele Anwendungen verwendet werden, wie unten diskutiert. Dieses Protokoll beschrieben einen Test, der üblicherweise verwendet wird, um die Hemmung der bakteriellen Bindung und Pathogen-vermittelten Zytotoxizität auf Wirtszellen zu messen. Der Test wird üblicherweise durchgeführt, um die Kapazität der Kügelchen gekoppelt MAMs kompetitiv inhibiert Infektion von HeLa-Epithelzellen mit dem Meeresfoodborne pathogen Vibrio parahaemolyticus zu messen, entweder mit einer Abnahme der bakteriellen Bindung an die Wirtszellen oder reduzierte Zytotoxizität als Auslese . In beiden Fällen, die Vorbereitung und kompetitive Assays nach dem gleichen Protokoll. Je nach dem Auslesen verschiedener Stämme von V. parahaemolyticus verwendet werden: die zytotoxische Stamm POR1 zur Zytotoxizität Messungen verwendet, während die nicht-zytotoxischen Stamm POR2 zum Messen der bakteriellen Adhäsion verwendet, da Zelltod und Zellablösung beeinträchtigt das Verfahren zur Quantifizierung hefteten Bakterien. Zunächst compebewerb Experimente wurden als schrittweise Protokoll, bei dem Wirtszellen wurden zunächst mit Perlen vor der Zugabe von Bakterien präinkubiert eingestellt. Für V. parahaemolyticus und dem Wulst bestimmungsgemäßer Verwendung (2 &amp; mgr; m-Perlen zu MAM7 gekoppelt) können beide Perlen und Bakterien zur gleichen Zeit, ohne die Änderungen in der resultierenden Zytotoxizität hinzugefügt werden. Das heißt, in diesem Versuchsaufbau, Perlen outcompete Bakterien Wirtszelle verbindlich. In Abhängigkeit von der Bakterienart und Wulstgeometrie verwendet wird, kann es gute Gründe für die Aufrechterhaltung der Wulst Adhäsion und bakterielle Infektion als zwei getrennte Stufen. Beispielsweise um Zellen mit nicht-beweglichen Bakterien zu infizieren, werden die Platten üblicherweise nach der Zugabe der Infektion Medium zentrifugiert. Jedoch sollte Zentrifugation von Platten enthaltenden Suspensionen Wulst vermieden werden, da dies zu einer sehr ungleichmäßigen Verteilung der Perlen auf die Zellschicht. Wenn kleinere Partikelgrößen verwendet werden, werden Kügelchen länger dauern, bis auf der Zelloberfläche zu regeln, in welchem ​​Fall suffizient Zeit sollte für Korn Anbringung vor der Infektion zugelassen. Wenn bakterielle Adhäsion wird als ein Auslesen verwendet wird, sollten die Proben zu den Zeitpunkten genommen werden, wo Wirtszellen nicht wesentlich von der infizierenden Stamm beschädigt, wie Zellablösung und Lyse kann die Quantifizierung der angehefteten Bakterien beeinträchtigen. Statt Aufzählen bakterielle Adhäsion durch Verdünnungsausstrichtest können Proben alternativ zur Abbildung (Abbildung 5) verarbeitet werden. In diesem Fall sollte der Gewebekultur von Zellen auf Glasdeckgläschen ausgesät werden, anstatt direkt in die Vertiefungen. Zusätzlich können fluoreszierende Kügelchen und Bakterien ein Fluoreszenzprotein exprimieren, verwendet werden, zusammen mit einer Infektion spezifischen Wirtszellmarker. Zum Beispiel werden Kompetitionsexperimente üblicherweise unter Verwendung von fluoreszierenden roten Rhodamin-Phalloidin, die Wirtszellen &quot;Aktin-Zytoskelett zu färben und zu bewerten morphologische Veränderungen, die sich aus der Infektion zusammen mit fluoreszierenden blauen Perlen und fluoreszierende abgebildetgrün (GFP-exprimierenden oder SYTO18 gefärbt) Bakterien. Eine Reihe von Kügelchen gekoppelt Adhäsine, einschließlich Staphylococcus aureus FnBPA, Streptococcus pyogenes F1 FUD und Vibrio parahaemolyticus MAM wurden als biomimetische Materialien verwendet worden, um die Haftung, Adhäsionsinhibierung und den Beitrag der Adhäsion zu untersuchen Pathogen-vermittelten Zytotoxizität 1, 7, 8. Einer der Vorteile der Verwendung dieses Ansatzes ist die einfache Visualisierung der Befestigungs Ereignisse, da die Polymerperlen als Gerüste verwendet werden, sind in einer breiten Palette von Farben (beispielsweise blau, fluoreszierend rot, blau, grün, orange). Somit direkte Markierung von Proteinen, die mit der Funktion beeinträchtigen können, vermieden werden. Weiterhin werden die Oberflächenkupplungs ahmt das mehrwertige Anzeige Adhäsine auf der bakteriellen Oberfläche reflektiert damit eine physiologisch relevante Konformation im Vergleich zu löslichen Proteinen. Im Vergleich zu Studien mit intakten Bakterien oder bacterial-Mutanten, umgeht der Wulst Ansatz Probleme mit Bakterienwachstum verbunden. B. Langzeit (zB O / N) Studien über die bakterielle Adhäsion an Zellen mit intakten Bakterien beherbergen werden oft durch bakterielle Begleitwachstumserscheinungen gefährdet - Ansäuern des Wachstumsmediums und Nährstoffraubbau negativ auf Wirtszellen und bakteriellen Replikations letztendlich Kompromisse Abbildungsqualität. In jüngerer Zeit ist die Verwendung von Kügelchen gekoppelt Adhäsine wurde erweitert, um ihre Verwendung als Mittel zur Affinitätsreinigungen von Wirtszellfaktoren in Signalprozesse nachgeschalteten bakteriellen Befestigung beteiligt sind. V. parahaemolyticus MAM7, über die Bindung an Phosphatidsäuren in der Membran der Wirtszelle, löst RhoA Aktivierung und Aktin Umlagerungen 1, 3. MAM-gekoppelten Kügelchen verwendet werden, um zu reinigen und zu identifizieren Proteine ​​in den Signalisierungs Plattformen als Folge MAM-Wirtszelle zusammengebaut beteiligten Bindung. Seit Perlendurch einen kurzen Zentrifugationsschritt vom Überstand abgetrennt werden und das Protein von Interesse kovalent gekoppelt ist, ist dies ein gutes Verfahren, um eine Trennung von verunreinigenden Proteinen zu erreichen und zu bereichern relevanten Protein-Komplexe, die für Downstream-Anwendungen wie Proteomik oder Western verwendet werden können, Blotting.

Dissecting the interactions between bacterial adhesins and host surface receptors at the host-pathogen interface is an essential step towards our understanding of the underlying mechanisms driving bacterial adhesion. Ultimately, this will help us to identify strategies to interfere with these processes during infections. In conducting such studies, we often face a dilemma: Biochemical and biophysical analysis of the molecular mechanisms of adhesin binding requires their separation from other cell wall components, which may interfere with adhesion events. On the other hand, the use of recombinant soluble proteins over-simplifies the adhesion event, by disregarding protein anchoring in the bacterial cell wall and multivalency of binding achieved through bacterial surface display. Equally, from the host cell&#8217;s perspective, encountering and binding to single adhesin molecules does not always have the same impact in terms of plasma membrane organization, membrane fluidity and receptor clustering1 and this, ultimately, makes it difficult to evaluate the impact of adhesion on host cellular signaling and the outcome of bacteria-host interactions. 
Recently a method was devised, whereby recombinant purified adhesins or adhesin fragments are directionally and covalently coupled to polymer particles similar in size to bacteria, thus mimicking bacterial surface display. This approach has been used on a range of different adhesins, from Gram-negative Multivalent Adhesion Molecules (MAMs)2, 3, to Gram-positive adhesins including Staphylococcus aureus fibronectin binding protein (FnBPA)4, 5 and Streptococcus pyogenes F1 6, 7. This method has allowed the dissection of adhesin fragments important for host cell binding, identification of host surface receptors and determination of their behavior on the host cell surface, while taking both binding affinity and avidity into consideration 1, 8. Additionally, this approach has been used to investigate the efficacy of immobilized adhesins and derivatives as inhibitors of host-pathogen interactions 8, 9. It has been demonstrated that surface coupled derivatives of the Vibrio parahaemolyticus Multivalent Adhesion Molecule (MAM) 7 can be used to attenuate a range of bacterial infections in vitro, including those caused by multidrug-resistant pathogens such as Acinetobacter baumannii and methicillin-resistant S. aureus (MRSA) 7, 9. 
Herein, we describe different chemistries which can be used to immobilize adhesins to commercially available functionalized polystyrene particles. Due to the wide array of available surface functionalities, labels and particle sizes, these are a useful scaffold for the production of bacteriomimetic materials to investigate adhesin-host interactions. We further describe methods for the initial characterization of the coupling reaction, and for the calculation of important properties of the resulting materials. Finally, the use of bead-coupled adhesins as competitive inhibitors of in vitro bacterial infections is discussed as an example of their application, as well as the future scope and limitations of this approach.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>646547</td>
			<td>Danger; corrosive 
			can be bought as solution or freshly prepared</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfosuccinimidyl 4-(p-maleimidophenyl)butyrate (Sulfo-SMPB)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>PN22317</td>
			<td>Danger; toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-cysteine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>30089</td>
			<td>Danger; toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Latex beads, amine-modified polystyrene, fluorescent blue - aqueous suspension, 2.0&#160;&#956;m mean particle size</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L0280</td>
			<td>harmful; 
			a range of alternative particle sizes and colors is available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide (EDC)</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>22980</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-hydroxysuccinimide (NHS)</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>24500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carboxylate-modified polystyrene beads</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>CLB9</td>
			<td>harmful; 
			a range of alternative particle sizes and colors is available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E26266</td>
			<td>Danger; flammable, corrosive, toxic, sensitizing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>W3841</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bradford reagent</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B6916</td>
			<td>Danger; corrosive and toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium - high glucose - With 4500 mg/L glucose and sodium bicarbonate, without&#160;L-glutamine, sodium pyruvate, and phenol red, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D1145</td>
			<td>for infection experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6429</td>
			<td>for maintenance of cultured host cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, heat inactivated</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F9665</td>
			<td>supplement for tissue culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin - 
			Solution stabilized, with 10,000 units penicillin and 10&#160;mg streptomycin/mL, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F9665</td>
			<td>supplement for tissue culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LDH Cytotoxicity detection kit</td>
			<td>Takara</td>
			<td>MK401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasticware</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reagent reservoirs (25ml)</td>
			<td>SLS</td>
			<td>F267660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plates</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>662160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>655182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>haemocytometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microcentrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plate reader</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tissue culture facilities</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>multichannel pipette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

biomimetic materials to characterize bacteria-host interactions

Bacterial attachment to host cells is one of the earliest events during bacterial colonization of host tissues and thus a key step during infection. The biochemical and functional characterization of adhesins mediating these initial bacteria-host interactions is often compromised by the presence of other bacterial factors, such as cell wall components or secreted molecules, which interfere with the analysis. This protocol describes the production and use of biomimetic materials, consisting of pure recombinant adhesins chemically coupled to commercially available, functionalized polystyrene beads, which have been used successfully to dissect the biochemical and functional interactions between individual bacterial adhesins and host cell receptors. Protocols for different coupling chemistries, allowing directional immobilization of recombinant adhesins on polymer scaffolds, and for assessment of the coupling efficiency of the resulting &#8220;bacteriomimetic&#8221; materials are also discussed. We further describe how these materials can be used as a tool to inhibit pathogen mediated cytotoxicity and discuss scope, limitations and further applications of this approach in studying bacterial - host interactions.

Die V. parahaemolyticus Adhäsin MAM7 enthält sieben Tandemsäugetierzell Eintrag (MCE) Domänen in Anerkennung der Host-Oberflächenrezeptoren beteiligt. Wir verwendeten Polystyrolkügelchen, um rekombinantes gekoppelt, gereinigten Fragmente umfasst entweder alle sieben Tandem MCE-Domains (MAM7) oder nur die erste MCE Domain (MAM1), um die Fähigkeit dieser Materialien, mit V. Wettbewerb testen parahaemolyticus für Wirtszellenbindung und die resultierende Wirksamkeit dieser Materialien als Haftinhibitoren. HeLa-Zellen wurden mit V. infiziert parahaemolyticus Stamm POR1 und Zytotoxizität von in vitro-Infektion wurde nach 4 h (Figur 3) untersucht. Behandlung von HeLa-Zellen mit 0,1% Triton X-100 (positive Lyse Kontrolle) führte zu einer vollständigen Zellyse angezeigt infizierte Zellen sehr geringe Zytotoxizität. In vitro-Infektion von unbehandelten Zellen mit POR1 führte zu sehr hohen Niveaus der Zelllyse, und das wurde von MAM7-co gehemmtupled Perlen aber nicht MAM1 gekoppelte oder GST-gekoppelten Kontrollkügelchen (Abbildung 3). <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/53400/53400fig3.jpg" /> Abbildung 3. Charakterisierung von Vibrio parahaemolyticus induzierte Zytotoxizität in Epithelzellen während der Konkurrenz-Assays. Die Zellen wurden mit V. behandelt parahaemolyticus (Vp), angedeutet mit (+) oder keine Bakterien (-) in Gegenwart von verschiedenen konkurrierenden Einheiten (Komp.), wie angegeben. Dazu gehörten entweder keine comp. (-), MAM7 Perlen (MAM7), MAM1 Perlen (MAM1) oder GST Kontrollkügelchen (GST). Als Kontrollen wurden Zellen, die entweder mit Triton X-100 (Triton-Lyse-Kontrolle) behandelt bzw. links nicht infizierten (uninf). LDH-Freisetzung nach 4 h wurde wie in Kapitel 3 beschrieben, gemessen und die Ergebnisse zu Triton Kontrollen (100%) und Rohlinge (0%), wie oben beschrieben normalisiert. Die Ergebnisse sind Mittelwerte ± SEM von Dreifachversuche. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53400/53400fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> Aufzählung V. parahaemolyticus entweder unbehandelten HeLa-Zellen oder Zellen mit MAM7-, MAM1- oder GST Steuer Perlen, inkubiert befestigt gezeigt, dass MAM7-Perlen, aber nicht MAM1- oder GST-Kontrollkügelchen outcompete V. parahaemolyticus zur Befestigung Zelloberflächenrezeptoren (Figur 4) zu hosten. <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/53400/53400fig4.jpg" /> Abbildung 4. Charakterisierung von bakteriellen Befestigung während der Konkurrenzexperimente. HeLa-Zellen wurden mit V. infiziert parahaemolyticus POR2 (Vp +), in Abwesenheit (-) oder in Gegenwart von konkurrierenden Einheiten wie folgt: MAM7 Kügelchen (MAM7) MAM1 Kügelchen (MAM1) oder GST Kontrollkügelchen (GST) (vgl.). Bakterielle Adhäsion wurde nach 1 Stunde gemessen,<html> im Abschnitt 3. Ergebnisse sind Mittelwerte ± SEM von Dreifachversuche. Mittel (vlnr in CFU / ml) sind 2,3010 6, 1,5310 5, 6 2,0510, 2,1210 6. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53400/53400fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> Adhäsine Fluorophor markierten Kügelchen gekoppelt resultieren in der Erzeugung von Materialien, die bakterielle Adhäsion imitieren an Wirtszellen und sind leistungsstarke Werkzeuge für die zelluläre Bildgebung (Abbildung 5). Verwendung MAM7 gekoppelten fluoreszierenden blauen Perlen, dadurch wir den Prozess der MAM7-vermittelte Bindung an Epithelzellen. Befestigung MAM7 an Wirtszellen in Folge Aktin Umlagerungen und die Bildung von Stressfasern, die Co-visualisiert mit Rhodamin-Phalloidin auf F-Actin (5B) Fleck waren. _upload / 53400 / 53400fig5.jpg &quot;/&gt; Abbildung 5. Herstellung und die Verwendung von Fluorophor zur Bildgebung markiert biomimetische Perlen. (A) Die Aussetzung der fluoreszierenden blauen biomimetische Perlen (rechts Rohr, 10x Lager) und Puffersteuerung (links Rohr). (B) Befestigung MAM7-gekoppelten Kügelchen, um Hela Zellen führt zu Aktin Umlagerungen und Stressfaserbildung. Befestigung von fluoreszierenden blauen Perlen und daraus resultierende Aktin-Stressfasern (rot, mit Rhodamin-Phalloidin gefärbt) wurden durch Mikroskopie abgebildet. Bar, 10 &amp; mgr; m. Bilder im Feld B wurden von Lim et al. 1 angepasst und unter der Creative Commons Attribution Lizenz reproduziert werden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53400/53400fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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Biomimetic Materials to Characterize Bacteria-host Interactions

Bacterial attachment to host cells is a key step during host colonization and infection. This protocol describes the generation of polymer-coupled recombinant adhesins as biomimetic materials which allow analysis of the contribution of individual adhesins to these processes, independent of other bacterial factors.

Biomimetische Materialien zu den Bakterien-Wirt-Interaktionen Charakterisieren

Bacterial attachment to host cells is one of the earliest events during bacterial colonization of host tissues and thus a key step during infection. The ...

biomimetic-materials-to-characterize-bacteria-host-interactions

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

9.2K Aufrufe.  University of Birmingham. Bacterial attachment to host cells is a key step during host colonization and infection. This protocol describes the generation of polymer-coupled recombinant adhesins as biomimetic materials which allow analysis of the contribution of individual adhesins to these processes, independent of other bacterial factors. 

Serie: Biomimetic Materials to Characterize Bacteria-host Interactions

Use of Interferon-&gamma; Enzyme-linked Immunospot Assay to Characterize Novel T-cell Epitopes of Human Papillomavirus

A protocol has been developed to overcome the difficulties of isolating and characterizing rare T cells specific for pathogens, such as human papillomavirus (HPV), that cause localized infections. The steps involved are identifying region(s) of HPV proteins that contain T-cell epitope(s) from a subject, selecting for the peptide-specific T cells based on interferon-&gamma; (IFN-&gamma;) secretion, and growing and characterizing the T-cell clones (Fig. 1). Subject 1 was a patient who was recently diagnosed with a high-grade squamous intraepithelial lesion by biopsy and underwent loop electrical excision procedure for treatment on the day the T cells were collected1. A region within the human papillomavirus type 16 (HPV 16) E6 and E7 proteins which contained a T-cell epitope was identified using an IFN- g enzyme-linked immunospot (ELISPOT) assay performed with overlapping synthetic peptides (Fig. 2). The data from this assay were used not only to identify a region containing a T-cell epitope, but also to estimate the number of epitope specific T cells and to isolate them on the basis of IFN- &gamma; secretion using commercially available magnetic beads (CD8 T-cell isolation kit, Miltenyi Biotec, Auburn CA). The selected IFN-&gamma; secreting T cells were diluted and grown singly in the presence of an irradiated feeder cell mixture in order to support the growth of a single T-cell per well. These T-cell clones were screened using an IFN- &gamma; ELISPOT assay in the presence of peptides covering the identified region and autologous Epstein-Barr virus transformed B-lymphoblastoid cells (LCLs, obtained how described by Walls and Crawford)2 in order to minimize the number of T-cell clone cells needed. Instead of using 1 x 105 cells per well typically used in ELISPOT assays1,3, 1,000 T-cell clone cells in the presence of 1 x 105 autologous LCLs were used, dramatically reducing the number of T-cell clone cells needed. The autologous LCLs served not only to present peptide antigens to the T-cell clone cells, but also to keep a high cell density in the wells allowing the epitope-specific T-cell clone cells to secrete IFN-&gamma;. This assures successful performance of IFN-&gamma; ELISPOT assay. Similarly, IFN- &gamma; ELISPOT assays were utilized to characterize the minimal and optimal amino acid sequence of the CD8 T-cell epitope (HPV 16 E6 52-61 FAFRDLCIVY) and its HLA class I restriction element (B58). The IFN- &gamma; ELISPOT assay was also performed using autologous LCLs infected with vaccinia virus expressing HPV 16 E6 or E7 protein. The result demonstrated that the E6 T-cell epitope was endogenously processed. The cross-recognition of homologous T-cell epitope of other high-risk HPV types was shown. This method can also be used to describe CD4 T-cell epitopes4.

Use of Interferon-&#947; Enzyme-linked Immunospot Assay to Characterize Novel T-cell Epitopes of Human Papillomavirus

Characterizing T-cell epitopes of pathogens that cause localized infections such as human papillomavirus is a challenge because of limited number of T cells in circulation. A method is described in which rare T cells were isolated and were characterized starting with a very small number of cells.

Verwendung von Interferon-γ enzyme-linked immunospot Assay zur Novel T-Zell-Epitope des humanen Papillomvirus Charakterisieren

A protocol has been developed to overcome the difficulties of isolating and characterizing rare T cells specific for pathogens, such as human ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Single Cell Measurements of Vacuolar Rupture Caused by Intracellular Pathogens

Shigella flexneri are pathogenic bacteria that invade host cells entering into an endocytic vacuole. Subsequently, the rupture of this membrane-enclosed compartment allows bacteria to move within the cytosol, proliferate and further invade neighboring cells. Mycobacterium tuberculosis is phagocytosed by immune cells, and has recently been shown to rupture phagosomal membrane in macrophages. We developed a robust assay for tracking phagosomal membrane disruption after host cell entry of Shigella flexneri or Mycobacterium tuberculosis. The approach makes use of CCF4, a FRET reporter sensitive to &beta;-lactamase that equilibrates in the cytosol of host cells. Upon invasion of host cells by bacterial pathogens, the probe remains intact as long as the bacteria reside in membrane-enclosed compartments. After disruption of the vacuole, &beta;-lactamase activity on the surface of the intracellular pathogen cleaves CCF4 instantly leading to a loss of FRET signal and switching its emission spectrum. This robust ratiometric assay yields accurate information about the timing of vacuolar rupture induced by the invading bacteria, and it can be coupled to automated microscopy and image processing by specialized algorithms for the detection of the emission signals of the FRET donor and acceptor. Further, it allows investigating the dynamics of vacuolar disruption elicited by intracellular bacteria in real time in single cells. Finally, it is perfectly suited for high-throughput analysis with a spatio-temporal resolution exceeding previous methods. Here, we provide the experimental details of exemplary protocols for the CCF4 vacuolar rupture assay on HeLa cells and THP-1 macrophages for time-lapse experiments or end points experiments using Shigella flexneri as well as multiple mycobacterial strains such as Mycobacterium marinum, Mycobacterium bovis, and Mycobacterium tuberculosis.

We describe a method for tracking the endomembrane rupture elicited by the intracellular bacteria Shigella flexneri and Mycobacterium tuberculosis upon host cell invasion. Our assay makes use of CCF4, a host cytoplasmic FRET probe in live or fixed cells. This reporter is degraded by an enzyme activity present on the bacterial surface.

Single Cell Messungen Vacuolar Rupture durch intrazelluläre Erreger verursacht

Shigella flexneri are pathogenic bacteria that invade host cells entering into an endocytic vacuole. Subsequently, the rupture of this membrane-enclosed ...

A Comparative Approach to Characterize the Landscape of Host-Pathogen Protein-Protein Interactions

Significant efforts were gathered to generate large-scale comprehensive protein-protein interaction network maps. This is instrumental to understand the pathogen-host relationships and was essentially performed by genetic screenings in yeast two-hybrid systems. The recent improvement of protein-protein interaction detection by a Gaussia luciferase-based fragment complementation assay now offers the opportunity to develop integrative comparative interactomic approaches necessary to rigorously compare interaction profiles of proteins from different pathogen strain variants against a common set of cellular factors.
This paper specifically focuses on the utility of combining two orthogonal methods to generate protein-protein interaction datasets: yeast two-hybrid (Y2H) and a new assay, high-throughput Gaussia princeps protein complementation assay (HT-GPCA) performed in mammalian cells.
A large-scale identification of cellular partners of a pathogen protein is performed by mating-based yeast two-hybrid screenings of cDNA libraries using multiple pathogen strain variants. A subset of interacting partners selected on a high-confidence statistical scoring is further validated in mammalian cells for pair-wise interactions with the whole set of pathogen variants proteins using HT-GPCA. This combination of two complementary methods improves the robustness of the interaction dataset, and allows the performance of a stringent comparative interaction analysis. Such comparative interactomics constitute a reliable and powerful strategy to decipher any pathogen-host interplays.

This article focuses on the identification of high-confident interaction datasets between host and pathogen proteins using a combination of two orthogonal methods: yeast two-hybrid followed by a high-throughput interaction assay in mammalian cells called HT-GPCA.

Komparativen Ansatz, um die Landschaft von Wirt-Pathogen-Protein-Protein-Wechselwirkungen charakterisieren

Significant efforts were gathered to generate  large-scale comprehensive protein-protein interaction network maps. This is  instrumental to understand the ...

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

Bacterial intracellular pathogens can be conceived as molecular tools to dissect cellular signaling cascades due to their capacity to exquisitely manipulate and subvert cell functions which are required for the infection of host target tissues. Among these bacterial pathogens, Listeria monocytogenes is a Gram positive microorganism that has been used as a paradigm for intracellular parasitism in the characterization of cellular immune responses, and which has played instrumental roles in the discovery of molecular pathways controlling cytoskeletal and membrane trafficking dynamics. In this article, we describe a robust microscopical assay for the detection of late cellular infection stages of L. monocytogenes based on the fluorescent labeling of InlC, a secreted bacterial protein which accumulates in the cytoplasm of infected cells; this assay can be coupled to automated high-throughput small interfering RNA screens in order to characterize cellular signaling pathways involved in the up- or down-regulation of infection.

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a Gram positive bacterial pathogen frequently used as a major model for the study of intracellular parasitism. Imaging late L. monocytogenes infection stages within the context of small-interfering RNA screens allows for the global study of cellular pathways required for bacterial infection of target host cells.

Imaging InlC Sekretion to Cellular-Infektion durch den bakteriellen Erreger untersuchen<em&gt; Listeria monocytogenes</em

Bacterial intracellular  pathogens can be conceived as molecular tools to dissect cellular signaling  cascades due to their capacity to exquisitely ...

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote its motility and dissemination. New work has shown that proteins involved in actin-based motility are also linked to autophagy, an intracellular degradation process crucial for cell autonomous immunity. Strikingly, host cells may prevent actin-based motility of S. flexneri by compartmentalizing bacteria inside &#8216;septin cages&#8217; and targeting them to autophagy. These observations indicate that a more complete understanding of septins, a family of filamentous GTP-binding proteins, will provide new insights into the process of autophagy. This report describes protocols to monitor autophagy-cytoskeleton interactions caused by S. flexneri in vitro using tissue culture cells and in vivo using zebrafish larvae. These protocols enable investigation of intracellular mechanisms that control bacterial dissemination at the molecular, cellular, and whole organism level.

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

To counteract pathogen dissemination, host cells reorganize their cytoskeleton to compartmentalize bacteria and induce autophagy. Using Shigella infection of tissue culture cells, host and pathogen determinants underlying this process are identified and characterized. Using zebrafish models of Shigella infection, the role of discovered molecules and mechanisms are investigated in vivo.

Verwendung von<em&gt; Shigella flexneri</em&gt; Zum Autophagie-Zytoskelett Interaktionen zu untersuchen

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote ...

Phage Phenomics: Physiological Approaches to Characterize Novel Viral Proteins

Current investigations into phage-host interactions are dependent on extrapolating knowledge from (meta)genomes. Interestingly, 60 - 95% of all phage sequences share no homology to current annotated proteins. As a result, a large proportion of phage genes are annotated as hypothetical. This reality heavily affects the annotation of both structural and auxiliary metabolic genes. Here we present phenomic methods designed to capture the physiological response(s) of a selected host during expression of one of these unknown phage genes. Multi-phenotype Assay Plates (MAPs) are used to monitor the diversity of host substrate utilization and subsequent biomass formation, while metabolomics provides bi-product analysis by monitoring metabolite abundance and diversity. Both tools are used simultaneously to provide a phenotypic profile associated with expression of a single putative phage open reading frame (ORF). Representative results for both methods are compared, highlighting the phenotypic profile differences of a host carrying either putative structural or metabolic phage genes. In addition, the visualization techniques and high throughput computational pipelines that facilitated experimental analysis are presented.

Here, we present phenomic approaches for the functional characterization of putative phage genes. Techniques include a developed assay capable of monitoring host anabolic metabolism, the Multi-phenotype Assay Plates (MAPs), in addition to the established method of metabolomics, capable of measuring effects to catabolic metabolism.

Phage Phenomics: Physiologische Ansätze zur Charakterisierung Novel virale Proteine

Current investigations into phage-host interactions are dependent on extrapolating knowledge from (meta)genomes. Interestingly, 60 - 95% of all phage ...

Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential to be used as drug therapies for HIV-1 infection. Post-integration inhibitors include ribozymes, short hairpin (sh) RNAs, small interfering (si) RNAs, U1 interference (U1i) RNAs and RNA aptamers. Many of these have been identified using transient co-transfection assays with an HIV-1 expression plasmid and some have advanced to clinical trials. In addition to measures of efficacy, small RNAs have been evaluated for their potential to affect the expression of human RNAs, alter cell growth and/or differentiation, and elicit innate immune responses. In the protocols described here, a set of transient transfection assays designed to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are described. We have used these assays to identify new ribozymes and optimize the format of shRNAs and siRNAs targeting HIV-1 RNA. The methods provide a quick set of assays that are useful for screening new anti-HIV-1 RNAs and could be adapted to screen other post-integration inhibitors of HIV-1 replication.

Methods to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps of the HIV-1 replication cycle are described. These methods are useful for screening new molecules and optimizing the format of existing ones.

Bewertung der Wirksamkeit und Toxizität von RNAs Targeting HIV-1-Produktion für den Einsatz in Gene oder Arzneimitteltherapie

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...

A New Method for Qualitative Multi-scale Analysis of Bacterial Biofilms on Filamentous Fungal Colonies Using Confocal and Electron Microscopy

Bacterial biofilms frequently form on fungal surfaces and can be involved in numerous bacterial-fungal interaction processes, such as metabolic cooperation, competition, or predation. The study of biofilms is important in many biological fields, including environmental science, food production, and medicine. However, few studies have focused on such bacterial biofilms, partially due to the difficulty of investigating them. Most of the methods for qualitative and quantitative biofilm analyses described in the literature are only suitable for biofilms forming on abiotic surfaces or on homogeneous and thin biotic surfaces, such as a monolayer of epithelial cells.
While laser scanning confocal microscopy (LSCM) is often used to analyze in situ and in vivo biofilms, this technology becomes very challenging when applied to bacterial biofilms on fungal hyphae, due to the thickness and the three dimensions of the hyphal networks. To overcome this shortcoming, we developed a protocol combining microscopy with a method to limit the accumulation of hyphal layers in fungal colonies. Using this method, we were able to investigate the development of bacterial biofilms on fungal hyphae at multiple scales using both LSCM and scanning electron microscopy (SEM). This report describes the protocol, including microorganism cultures, bacterial biofilm formation conditions, biofilm staining, and LSCM and SEM visualizations.

This protocol describes a new method to grow and qualitatively analyze bacterial biofilms on fungal hyphae by confocal and electron microscopy.

Eine neue Methode zur qualitativen Mehrskalige Analyse von bakteriellen Biofilmen auf filamentösen Pilzkolonien mittels konfokaler und Elektronenmikroskopie

Bacterial biofilms frequently form on fungal surfaces and can be involved in numerous bacterial-fungal interaction processes, such as metabolic ...

Flow Virometry to Analyze Antigenic Spectra of Virions and Extracellular Vesicles

Cells release small extracellular vesicles (EVs) into the surrounding media. Upon virus infection cells also release virions that have the same size of some of the EVs. Both virions and EVs carry proteins of the cells that generated them and are antigenically heterogeneous. In spite of their diversity, both viruses and EVs were characterized predominantly by bulk analysis. Here, we describe an original nanotechnology-based high throughput method that allows the characterization of antigens on individual small particles using regular flow cytometers. Viruses or extracellular vesicles were immunocaptured with 15 nm magnetic nanoparticles (MNPs) coupled to antibodies recognizing one of the surface antigens. The captured virions or vesicles were incubated with fluorescent antibodies against other surface antigens. The resultant complexes were separated on magnetic columns from unbound antibodies and analyzed with conventional flow cytometers triggered on fluorescence. This method has wide applications and can be used to characterize the antigenic composition of any viral- and non-viral small particles generated by cells in vivo and in vitro. Here, we provide examples of the usage of this method to evaluate the distribution of host cell markers on individual HIV-1 particles, to study the maturation of individual Dengue virions (DENV), and to investigate extracellular vesicles released into the bloodstream.

Viruses or extracellular vesicles were immunocaptured with 15 nm magnetic nanoparticles coupled to antibodies recognizing surface antigens. The captured virions or vesicles were labeled with fluorescent antibodies against other surface antigens. The resultant complexes were separated in high magnetic field and analyzed with conventional flow cytometers triggered on fluorescence.

Fluss Virometry zur Analyse Antigenic Spektren von Virionen und extracellular Vesikeln

Cells release small extracellular vesicles (EVs) into the surrounding media. Upon virus infection cells also release virions that have the same size of ...

A Protocol to Characterize the Morphological Changes of Clostridium difficile in Response to Antibiotic Treatment

Assessment of antibiotic action with new drug development directed towards anaerobic bacteria is difficult and technically demanding. To gain insight into possible MOA, morphologic changes associated with antibiotic exposure can be visualized using scanning electron microscopy (SEM). Integrating SEM imaging with traditional kill curves may improve our insight into drug action and advance the drug development process. To test this premise, kill curves and SEM studies were conducted using drugs with known but different MOA (vancomycin and metronidazole). C. difficile cells (R20291) were grown with or without the presence of antibiotic for up to 48 h. Throughout the 48 h interval, cells were collected at multiple time points to determine antibiotic efficacy and for imaging on the SEM. Consistent with previous reports, vancomycin and metronidazole had significant bactericidal activity following 24 h of treatment as measured by colony-forming unit (CFU) counting. Using SEM imaging we determined that metronidazole had significant effects on cell length (&#62; 50% reduction in cell length for each antibiotic; P&#60; 0.05) compared to controls and vancomycin. While the phenotypic response to drug treatment has not been documented previously in this manner, they are consistent with the drug&#39;s MOA demonstrating the versatility and reliability of the imaging and measurements and the application of this technique for other experimental compounds.

A Protocol to Characterize the Morphological Changes of Clostridium difficile in Response to Antibiotic Treatment

Antibiotic efficacy is most commonly determined by conducting killing kinetic studies and measuring colony forming units (CFUs). By integrating scanning electron microscopy (SEM) with these standard methods, we can distinguish the pharmacological effects of treatment between different antibiotics.

Ein Protokoll zur Charakterisierung der morphologischen Veränderungen von<em&gt; Clostridium difficile</em&gt; In Antwort auf Antibiotika-Behandlung

Assessment of antibiotic action with new drug development directed towards anaerobic bacteria is difficult and technically demanding. To gain insight into ...

Biomimetische Materialien zu den Bakterien-Wirt-Interaktionen Charakterisieren

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