JCM é financiado por uma concessão do BBSRC-IPA com a Unilever Plc (BB / L023040 / 1). HAG é financiado por um Ministério da Arábia Saudita of Higher studentship PhD educação.

O método a seguir é adaptado 7,8 para testar estirpes concorrente com cepas produtoras de inibidores. NOTA: Este protocolo envolve a geração de aerossol com culturas bacterianas. Isso só pode ser realizado em um espaço contido com a implementação das considerações de segurança localmente aprovados. A pulverização da cultura em placas de agar dentro de uma câmara de segurança de nível 2 irá minimizar a contaminação das placas de agar e o ambiente circundante. Isso também irá proteger o pesquisador da inalação de aerossóis das bactérias pulverizados, esta é uma grande preocupação se o pesquisador está usando nível de confinamento 2 organismos. equipamento de protecção individual adequado deve ser usado. A área que circunda a placa de Petri é melhor coberto com papel absorvente descartável. descontaminação pós-pulverização utilizando luz UV é aconselhável. 1. Preparar as placas de ágar <ol><li> Prepare a infusão de coração e cérebro de agar (BHI) em conformidade com o manuinstruções do cante. </li><li> Autoclave a ágar de BHI a 121 ° C, 15 psi durante 20 min, ou de acordo com as recomendações do fabricante autoclave para esterilizar. </li><li> Despeje 15 ml alíquotas de agar BHI esterilizado em pratos de Petri e deixe-a definida. NOTA: Garantir a cada placa de agar para ser utilizado dentro do ensaio origina a partir do mesmo banco de ágar e que não é a mesma quantidade de agar em cada placa. Isso limita a variabilidade em nutrientes disponíveis e difusão inibidor entre as placas que permitem a comparabilidade. </li></ol> 2. Preparar estéril Caldo <ol><li> Prepare caldo BHI em conformidade com as instruções do fabricante. </li><li> Adicionar 10 ml de aliquotas de BHI a 28 frascos de vidro universais ml. </li><li> Autoclave o caldo de BHI a 121 ° C, 15 psi durante 20 min, ou de acordo com as recomendações do fabricante autoclave para esterilizar. NOTA: Assegurar que todo o caldo utilizado no ensaio origina a partir do mesmo lote de aut caldooclaved ao mesmo tempo limitar a variação de nutrientes que podem causar variação nos resultados. </li></ol> 3. Preparar frasco esterilizado vaporizador (s) <ol><li> Desmonte a garrafa vapourizer. </li><li> Spray de 5% de agente de limpeza de superfície activa através da vapourizer para eliminar contaminantes internos, mergulhe a garrafa vapourizer, tampa e vapourizer no agente de limpeza de superfície activa 5% durante a noite. NOTA: Luvas e equipamento de protecção individual adequado deve ser usado no manuseio agente de limpeza activo de superfície. </li><li> Seque o vaporizador, tampa e garrafas sob o capô fluxo de ar estéril. </li><li> Encher o frasco com etanol 70%, reconecte vapourizer e borrife um pouco do etanol através da vapourizer. </li><li> Colocar a tampa no vaporizador e armazenar com o etanol até à sua utilização no interior. </li><li> Imediatamente antes de usar, de forma asséptica enxaguar o frasco com caldo de BHI estéril e pulverizar o caldo através do vapourizer. NOTA: Isso impede que o aff etanolecting o inóculo adicionado à garrafa na secção 6.3. </li></ol> 4. Preparar a cultura durante a noite bacteriana (s) <ol><li> Streak o competidor e inibidor de estirpes numa placa de agar BHI estéril e incubar a 37 ° C em condições aeróbias durante aproximadamente 18 horas (durante a noite). NOTA: Este placa produz um stock de bactéria que podem ser usados ​​para várias repetições dentro da mesma semana, quando armazenados a 4 ° C. </li><li> Inocular 10 ml de caldo de BHI estéril com uma única colónia bacteriana da estirpe de competidor necessária dentro de um frasco de 28 ml universal. </li><li> Incubar a garrafa universal a 37 ° C durante a noite aerobicamente por agitação a 250 rpm num agitador orbital. </li></ol> 5. Ponto Cultura do isolado inibidor produtoras <ol><li> Preparar a cultura durante a noite (s), como descrito no ponto 4. </li><li> Certifique-se de placas de agar são completamente seco, sem condensação na tampa, antes da inoculação (por exemplo, através da incubação de PLAte durante 60 minutos a 37 ° C); isso impede que o inóculo se espalhe ao longo da placa do local de inoculação. </li><li> Pipetar 25 ml da cultura da noite para o centro das placas de agar. Evitar deprimindo completamente o êmbolo da pipeta para evitar bolhas de ar que pulverizam cultura através do ágar. </li><li> Permitir que a cultura a secar à temperatura ambiente para limitar a propagação da cultura. Incubar as placas de agar a 37 ° C durante a noite em condições aeróbias. </li></ol> 6. Preparar o pulverizador inóculo da estirpe de ensaio concorrente (s) <ol><li> Preparar a cultura durante a noite, como descrito na secção 4. Diluir a cultura durante a noite de 10 vezes em caldo BHI para se obter cerca de 4 x 10 6 UFC ml-1, e uma suspensão de OD 600 de 0,3 ± 0,05. NOTA: A diluição de 10 vezes não vai dar 4 x 10 6 CFU ml -1 para todas as espécies bacterianas, calcular o fator de diluição necessário pela propagação plaqueamento diluições em série entre 1 x 10 <sup&gt; -1 -1 x 10 -6. </li><li> Despeje a cultura diluído em um frasco de perfume vaporizador plástico estéril. NOTA: O volume total deve ser mais do que é necessário para o número de placas de agar a ser pulverizado. Aproximadamente 250 ul por placa é adequado para uma 9 cm de diâmetro numa caixa de Petri. </li></ol> 7. Ensaio de Inibição de Crescimento diferida <ol><li> Pulveriza-se a cultura por meio de cada um dos frascos de vaporizador para assegurar que a cultura é carregado no mecanismo de pulverização antes da pulverização sobre o ágar. </li><li> A partir de uma distância de aproximadamente 15 cm acima do ágar, pulverização com cerca de 250 ul de cultura diluída (3 pulverizadores de um típico 50 ml vaporizador) durante toda a superfície do agar. Incubar as placas de agar a 37 ° C durante a noite em condições aeróbias. Repetir para outras placas com o mesmo número de pulverizações. </li></ol> 8. Interpretação diferidos Resultados Inibição do Crescimento Ensaio <ol><li> Medir a zona de inibição do crescimento do competi pulverizadoTor estirpe (Figura 1A - C, &quot;X&quot; para &quot;X&quot;), em milímetros, subtraindo o diâmetro do ponto central do inibidor-produtor (Figura 1A - C, &quot;Y&quot; para &quot;Y&quot;). NOTA: Figura 1E mostra como esses dados poderiam ser apresentados </li><li> Grave a pontuação clareza para zonas de inibição. Nota: Isto indica o grau de inibição observada. Exemplos são mostrados na Figura 1A - D, as estirpes que podem ser utilizadas para a normalização são sugeridos na secção de resultados representativos. A escala seguinte pode ser usado para marcar clareza: uma pontuação de 0 a clareza descrever uma zona de inibição completa do crescimento da estirpe concorrente. Uma pontuação de 1 para descrever uma zona de inibição quase completa do crescimento, com a única colónias individuais presentes na zona de compensação. Uma pontuação de 2 para descrever uma zona visível de crescimento reduzida, crescimento dentro desta zona é confluente ou próximo confluentes mas reduziu na densidade de&gt; 50%. Uma pontuação de 3 para descrever apenas uma redução mínima de crescimento, o crescimento confluente e é reduzida em menos do que 50%, uma zona é ainda visível e mensurável. A pontuação de 4 para descrever nenhuma inibição visível de crescimento. Uma pontuação de 5 para descrever que o crescimento da estirpe de competidor foi aumentado na proximidade da estirpe produtora de inibidor de ensaio. Veja a Figura 1 para exemplos. Estas pontuações são subjetivos para o experimentador. </li></ol> 9. Réplicas <ol><li> Repetir os ensaios pelo menos em triplicado biológico para determinar a reprodutibilidade dos resultados obtidos. NOTA: Se repetições são realizadas em dias diferentes, fazer medições e marcar placas imediatamente após a remoção de incubação, então ou placas armazenar a 4 ° C ou tirar fotografias de alta qualidade placas antes de descartá-los. Armazenamento ou fotografias de placas permite uma fácil comparação dos resultados entre os diferentes dias, to seu é particularmente importante para a confirmação de pontuação reproduzíveis em dias / experimentos. Estar cientes de que o armazenamento das placas tem o potencial de alterar os resultados. NOTA: Para placas fotografias lugar claro na posição vertical sem a sua tampa sobre um fundo preto fosco em uma área de luz difusa, use uma câmera de alta resolução (≥8 MP) capaz de se concentrar em objetos perto da lente (modo macro). Alternativamente, alguns geradores de imagens de gel com trans-iluminador definidos para a luz branca pode produzir produtos de alta qualidade, imagens altamente reprodutíveis. </li></ol>

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Os autores não têm nada para revelar.

Uma etapa fundamental deste protocolo bacteriana competição espécies que o diferencia dos outros, é a incubação durante a noite do inibidor de isolar antes da adição do isolado concorrente. A cepa inibidor requer este período de crescimento para produzir compostos inibidores. À medida que a estirpe concorrente é sobreposta no topo da mesma forma, este método permite ao investigador observar todo o potencial da estirpe de inibidor para interferir com o crescimento da estirpe de concorrente. Como resultado, este ensaio reflecte o que acontece com a natureza; um isolado está totalmente estabelecida num nicho, e o outro deve ser capaz de neutralizar quaisquer variáveis ​​inibitórios para ser capaz de invadir com sucesso o nicho. Há duas partes para este protocolo que são mais susceptíveis de produzir resultados errados se for realizado incorretamente. Em primeiro lugar, a esterilização incompleta das garrafas vaporizador pode introduzir bactérias contaminantes para o ensaio. incubation do caldo utilizado para enxaguar o frasco vaporizador na etapa 3.6, em um recipiente estéril pode ser utilizado para confirmar garrafas foram completamente esterilizados. lavagens adicionais em soluções desinfectantes, como Virkon, pode ser utilizado antes da lavagem em agente de limpeza tensio-activo, descrito na etapa 3.2, se a esterilização adicional é necessária. A segunda etapa, que podem produzir resultados errados é a diluição da estirpe concorrente (passo 6.1). Se a diluição não é óptima, as medições claros de inibição não pode ser determinado facilmente. Este ensaio foi optimizado utilizando vários isolados nasal como inibidor da produção de estirpes através de uma ampla gama de espécies de bactérias Gram-positivas e Gram-negativas contra S. aureus SH1000 como o 7,8 estirpe concorrente. Ele foi subsequentemente testado utilizando vários estafilococos coagulase-negativa e coagulase- positiva como concorrente e estirpes produtoras de inibidor. Ao testar diferentes dos descritos acima como o concorrente gênerosestirpe, alguma optimização da diluição para o inoculo pode ser necessário. Se as notas clareza variam significativamente entre as repetições, pode ser necessário para padronizar o inóculo estirpe concorrente, definindo-a uma densidade óptica específica. No entanto, isto irá aumentar o tempo do ensaio preciso para configurar, e é susceptível de reduzir o número de estirpes é possível processar cada ensaio. Visualmente ajustar a cultura para um OD apropriado utilizando um padrão de McFarland pode fornecer uma alternativa rápida. Uma limitação desta técnica é que ela só pode ser aplicada a bactérias cultiváveis. É por isso que muitos estudos utilizam 16S rRNA sequenciamento de prever as interações de exclusão competitiva 3,4,13. No entanto, as técnicas genéticas e metagenomic só pode distinguir membros da comunidade ao nível de espécie, e / ou não levam em conta nomeadamente a variação intraespecífica característica. É possível rastrear a associação de uma particulAR gene que codifica um traço com a presença ou a ausência de uma espécie bacteriana 5, no entanto isto requer pré-conhecimento de um gene susceptível de ser associada com a exclusão de uma espécie. Uma consideração segurança dessa técnica é que, devido à geração de aerossol de bactérias, só pode ser utilizado em laboratórios com um gabinete de segurança de nível 2, ou com precauções de segurança semelhantes. Existem técnicas alternativas para testar a concorrência entre os isolados que representam a variação característica intra-específica e que não geram aerossóis de bactérias. Um tal método é o ensaio de antagonismo simultânea 2. Neste método, um inoculo de um isolado é espalhada sobre uma placa de ágar, e um segundo inoculo isolado é manchado ou picadas na parte superior uma vez que o primeiro ter secado. Isso produziria um ambiente onde as tensões estão em concorrência directa (antagonismo simultânea), ambos competindo para produzir compostos inibidores e varrer os nutrientes em primeiro lugar. o advantage do ensaio de inibição de crescimento diferido sobre o ensaio de antagonismo simultânea é que o isolado inibidor deve sempre ter a vantagem competitiva de ser totalmente estabelecida antes invasão do isolado concorrente. Este é mais reflexivo do que aconteceria no ambiente, como na maioria dos nichos, um isolado será estabelecida antes de uma outra estirpe é adicionado, em vez de dois isolados sendo adicionados ao mesmo tempo 8. Outra alternativa para evitar a geração de aerossol de bactérias seria adicionar o competidor isolar em ágar de topo, o que pode ser vertido em vez de pulverizado ao longo do isolado inibidor. No entanto, o volume de agar de topo adicionado teria de ser cerca de 3 ml a garantir uma cobertura uniforme da placa. Dentro deste volume, o isolado concorrente não seria crescendo nos mesmos meios de comunicação como o isolado inibidor, por isso não sofrem de nutrientes reduzidos. O competidor também não estaria em contacto directo com quaisquer compostos inibidores da UNTil eles difundido no topo Agar. Um tal ensaio não pode ser descrita como inibição ou antagonismo diferido simultânea. Um método semelhante foi anteriormente utilizada para avaliar os níveis de resistência à bacitracina entre S. clínica aureus 10. A principal diferença entre o protocolo descrito aqui e descrito por 10, é o último linhagens concorrentes unicamente classificadas como sensíveis (completo clareza inhibition- marcar 0) ou resistentes (parciais há clareza inhibition- marcar 1-5). O ensaio de inibição de crescimento diferido pode, portanto, ser também utilizadas para pesquisar os níveis de resistência aos produtores de agentes antimicrobianos em particular, ou mesmo para procurar novos agentes antimicrobianos activos contra os agentes patogénicos resistentes a múltiplas drogas. Tem sido sugerido que a microflora do hospedeiro podem ser manipuladas para eliminar os membros indesejáveis ​​da comunidade bacteriana 9. Aplicação de corinebactérias ou Staphylococcus epidermidis já foi mostrado para eliminar S. aureus colonização nas narinas em uma proporção significativa da população 11,12. Estudos em estirpes específicas que podem excluir competitivamente membros indesejáveis ​​da flora do hospedeiro, através de técnicas tais como a descrita aqui, pode, portanto, conduzir a terapias futuras.

Bacteria living in communities compete at the interspecific and intraspecific level for space and nutrients 6. Competition between microbes can often lead to exclusion of particular species or strains within a community. Exclusion can be due to competition for a particular receptor or nutrient, or the production of an antimicrobial compound by a member of the community 6.
Studies investigating competitive exclusion frequently examine the presence and absence of species using 16S rRNA sequencing 3,4,13. However, intraspecific trait variation, for example the presence or absence of antimicrobial peptide production, can hugely impact the ability of one species to inhibit another 1. Since 16S rRNA sequencing cannot distinguish between strains of the same species, intraspecific trait variation cannot be assessed. The technique described here can be used to assess the potential of individual strains to exclude other bacteria. This method has previously been used to show a positive correlation between the presence of Staphylococcus aureus inhibitory bacteria and the absence of S. aureus in a nasal community 7.
The deferred growth inhibition (competition) assay can identify production of antimicrobial compounds or nutrient competition by the inhibitor strain. It can also detect positive interactions, whereby the presence of the inhibitor strain actually improves the growth of the competitor strain. This assay can be used to create quantitative data (zone of clearing size) and qualitative data (degree of inhibition), both of which can be overlaid onto data of the presence or absence of a species within a community to find correlations between phenotype (trait) and competitive exclusion 7.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Brain heart infusion broth</td>
			<td style="width:71px;">Lab M</td>
			<td style="width:119px;">lab049</td>
			<td style="width:167px;">rich general purpose media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">agar-agar</td>
			<td style="width:71px;">Merck Milipore</td>
			<td align="right" style="width:119px;">101614</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">petri dishes</td>
			<td style="width:71px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:119px;">82.1473.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">plastic perfume vaporizer</td>
			<td style="width:71px;">not known</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td>10 cm high with 3.5 cm diameter clear plastic spray bottle with lid, purchased from the travel section of a supermarket</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Universal bottles</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;">no longer in production, alternative SLS BOT5006</td>
			<td>28 ml glass cylindrical bottle (approx 280 mm diameter, 850 mm height), flat bottomed with plastic screw cap</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Decon 90</td>
			<td style="width:71px;">Decon&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>surface active cleaning agent&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

deferred growth inhibition assay to quantify the effect of bacteria-derived antimicrobials on competition

Competitive exclusion can occur in microbial communities when, for example, an inhibitor-producing strain outcompetes its competitor for an essential nutrient or produces antimicrobial compounds that its competitor is not resistant to. Here we describe a deferred growth inhibition assay, a method for assessing the ability of one bacterium to inhibit the growth of another through the production of antimicrobial compounds or through competition for nutrients. This technique has been used to investigate the correlation of nasal isolates with the exclusion of particular species from a community. This technique can also be used to screen for lantibiotic producers or potentially novel antimicrobials. The assay is performed by first culturing the test inhibitor-producing strain overnight on an agar plate, then spraying over the test competitor strain and incubating again. After incubation, the extent of inhibition can be measured quantitatively, through the size of the zone of clearing around the inhibitor-producing strain, and qualitatively, by assessing the clarity of the inhibition zone. Here we present the protocol for the deferred inhibition assay, describe ways to minimize variation between experiments, and define a clarity scale that can be used to qualitatively assess the degree of inhibition.

Os resultados do ensaio deve ser observável como uma diferença na estirpe sobreposta concorrente centralmente perto da manchado inibidor produtoras de estirpe (Figura 1). Estas diferenças podem ser interpretado como a inibição completa (Figura 1A), a inibição parcial (Figura 1B e 1C), nenhuma inibição (figura 1D) ou a associação positiva. O laboratório amplamente disponíveis estirpes S. epidermidis e S. Tü3298 epidermidis Rp62A e S. epidermidis e S. Rp62A aureus Newman foram usadas nas Figuras 1B e 1D respectivamente. Sugere-se que estas estirpes podiam ser utilizados para testar este protocolo. Dependendo da espécie testada, a inibição completa e inibição parcial são provavelmente o resultado de péptidos antimicrobianos, antibióticos ou outros inhibito crescimento difusívelR produzidos pela estirpe produtora de inibidor. A inibição parcial também tem sido associada a reduzida disponibilidade de nutrientes para a estirpe concorrente devido à absorção ou sequestrante de nutrientes pela estirpe inibidor 6. Comparação do tamanho da zona de inibição entre diferentes isolados produtores de inibidores testados contra a mesma estirpe concorrente indica diferenças em qualquer um dos seguintes: a quantidade de agentes antimicrobianos produzidos pela estirpe produtora de inibidor; a capacidade do inibidor para se difundir através dos meios de comunicação; o tipo de inibidor produzido e o nível de resistência da estirpe aos inibidores concorrente a ser produzido. Comparação do tamanho da zona de inibição concorrente entre as diferentes estirpes testadas contra a mesma estirpe produtora de inibidor é indicativa dos níveis de resistência das estirpes concorrente para o inibidor a ser produzido. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; Os resultados irão variar, dependendo da estirpe utilizada e de inibição concorrente da estirpe utilizada. Repete com a mesma cepa inibitório e competidor deve, idealmente, ter a mesma pontuação clareza (descrito no capítulo 8.2), isso indica boa técnica tem sido usada por toda parte. Se tiver ocorrido aplicação inconsistente das bactérias das placas não deve ser usado. Por exemplo, se a cultura de ensaio concorrente é muito diluída a zona de inibição aparece maior e com um bordo inferior claramente definida do que o tipicamente observado (Figura 2A); isso iria afetar a confiabilidade de quaisquer medidas zona comparativos. Se o local estirpe produtora de inibidor não foi completamente seco antes da incubação durante a noite, a estirpe inibidor é susceptível de se espalhar e não formam um local bem definido (Figura 2B), que normalmente afecta as medições de zona, mas pode também afectar a clareza de pontuação. Se a tensão é concorrentenão pulverizados uniformemente isto pode levar a uma distribuição desigual de bactérias (Figura 2C). Se a estirpe concorrente é muito concentrado, é possível que a estirpe pode crescer concorrente no topo da estirpe inibidor (Figura 2C), em casos extremos, isso pode levar a alguma inversão das funções da estirpe concorrente / inibidor. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/54437/54437fig1.jpg" /> Figura 1:. O intervalo de resultados qualitativos e quantitativos que pode ser obtido a partir do ensaio de inibição de crescimento diferido Resultados para a inibição do crescimento pode variar a partir de (A) a inibição completa (pontuação de 0), (B) a inibição parcial (pontuação 1) , (C) inibição parcial (2 pontos) a (D) nenhuma inibição (escore 4). As etiquetas indicam as bordas de crescimento das estirpes de inibidor (Y) e a aresta mais exterior da inibiçãozonas (X). O tamanho da zona de inibição do intervalo de 0 mm a mais de 10 mm, como mostrado em (E), que mostra as medições para as placas fotografadas em A, B, C e D. Os resultados são apresentados para os isolados de estafilococos recentes (A , C) ou estafilocócica laboratório comum isola S. epidermidis Tü3298 (inibidor) e S. epidermidis Rp62A (competidor) (B), e S. epidermidis Rp62A (inibidor) e S. aureus Newman (concorrente) (D). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54437/54437fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54437/54437fig2.jpg" /> Figura 2: Exemplos de resultados inconsistentes devido à má técnica resultados podem aparecer de forma diferente do que o esperado, se (A. </strong&gt;) estirpe competidor foi muito diluída, (B) estirpe inibidor não estava completamente seco antes de incubação / placas não foram seco ou (C) se a cepa competidor não foi pulverizado de forma uniforme e estava muito concentrado. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54437/54437fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Deferred Growth Inhibition Assay to Quantify the Effect of Bacteria-derived Antimicrobials on Competition

The deferred growth inhibition assay can be used to assess the competition effect by one bacterial isolate on another. Inhibition is quantified by measuring the zone of clearing around the inhibitor-producing isolate, or qualitatively assessed by determining the visible extent of inhibition.

Crescimento diferido Ensaio de Inibição para quantificar o efeito de antimicrobianos bactérias derivadas de concorrência

Competitive exclusion can occur in microbial communities when, for example, an inhibitor-producing strain outcompetes its competitor for an essential ...

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Research

JoVE Journal

Biology

14.5K visualizações.  University of Liverpool. The deferred growth inhibition assay can be used to assess the competition effect by one bacterial isolate on another. Inhibition is quantified by measuring the zone of clearing around the inhibitor-producing isolate, or qualitatively assessed by determining the visible extent of inhibition.

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Growth Factor-Coated Bead Placement on Dorsal Forebrain Explants

This video demonstrates two methods for preparing and placing beads, which have been coated with growth factor, on explants of the developing cerebral cortex. These beads can be used to induce spatially restricted gene expression on developing neural tissue such as forebrain explants. Methods are given for using both Affi-Gel beads and heparin acryllic beads.

Fator-Revestido crescimento Placement Bead em explantes Encéfalo anterior Dorsal

Biologia

Identification of Growth Inhibition Phenotypes Induced by Expression of Bacterial Type III Effectors in Yeast

Many Gram-negative pathogenic bacteria use a type III secretion system to translocate a suite of effector proteins into the cytosol of host cells. Within the cell, type III effectors subvert host cellular processes to suppress immune responses and promote pathogen growth. Numerous type III effectors of plant and animal bacterial pathogens have been identified to date, yet only a few of them are well characterized. Understanding the functions of these effectors has been undermined by a combination of functional redundancy in the effector repertoire of a given bacterial strain, the subtle effects that they may exert to increase virulence, roles that are possibly specific to certain infection stages, and difficulties in genetically manipulating certain pathogens. Expression of type III effectors in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae may allow circumventing these limitations and aid to the functional characterization of effector proteins. Because type III effectors often target cellular processes that are conserved between yeast and other eukaryotes, their expression in yeast may result in growth inhibition phenotypes that can be exploited to elucidate effector functions and targets. Additional advantages to using yeast for functional studies of bacterial effectors include their genetic tractability, information on predicted functions of the vast majority of their ORFs, and availability of numerous tools and resources for both genome-wide and small-scale experiments. Here we discuss critical factors for designing a yeast system for the expression of bacterial type III effector proteins. These include an appropriate promoter for driving expression of the effector gene(s) of interest, the copy number of the effector gene, the epitope tag used to verify protein expression, and the yeast strain. We present procedures to induce expression of effectors in yeast and to verify their expression by immunoblotting. In addition, we describe a spotting assay on agar plates for the identification of effector-induced growth inhibition phenotypes. The use of this protocol may be extended to the study of pathogenicity factors delivered into the host cell by any pathogen and translocation mechanism.

In this video, we describe a procedure for the expression of bacterial type III effectors in yeast and the identification of effector-induced growth inhibition phenotypes. Such phenotypes can be subsequently exploited to elucidate effector functions and targets.

Identificação de fenótipos inibição do crescimento induzido pela expressão de Effectors Tipo III bacteriana em Yeast

Many Gram-negative pathogenic bacteria use a type III secretion system to translocate a suite of effector proteins into the cytosol of host cells. Within ...

Effect of Male Accessory Gland Products on Egg Laying in Gastropod Molluscs

In internally fertilizing animals, seminal fluid is usually added to the spermatozoa, together forming the semen or ejaculate. Besides nourishing and activating sperm, the components in the seminal fluid can also influence female physiology to augment fertilization success of the sperm donor. While many studies have reported such effects in species with separate sexes, few studies have addressed this in simultaneously hermaphroditic animals. This video protocol presents a method to study effects of seminal fluid in gastropods, using a simultaneously hermaphroditic freshwater snail, the great pond snail Lymnaea stagnalis, as model organism. While the procedure is shown using complete prostate gland extracts, individual components (i.e., proteins, peptides, and other compounds) of the seminal fluid can be tested in the same way. Effects of the receipt of ejaculate components on egg laying can be quantified in terms of frequency of egg laying and more subtle estimates of female reproductive performance such as egg numbers within each egg masses. Results show that seminal fluid proteins affect female reproductive output in this simultaneous hermaphrodite, highlighting their importance for sexual selection.

This video protocol demonstrates a method to study effects of seminal fluid in gastropods, using the hermaphroditic freshwater snail Lymnaea stagnalis.

Efeito do Masculino Acessório Gland produtos em postura de ovos em gastrópode

In internally fertilizing animals, seminal fluid is usually added to the spermatozoa, together forming the semen or ejaculate. Besides nourishing and ...

Reporter-based Growth Assay for Systematic Analysis of Protein Degradation

Protein degradation by the ubiquitin-proteasome system (UPS) is a major regulatory mechanism for protein homeostasis in all eukaryotes. The standard approach to determining intracellular protein degradation relies on biochemical assays for following the kinetics of protein decline. Such methods are often laborious and time consuming and therefore not amenable to experiments aimed at assessing multiple substrates and degradation conditions. As an alternative, cell growth-based assays have been developed, that are, in their conventional format, end-point assays that cannot quantitatively determine relative changes in protein levels.
Here we describe a method that faithfully determines changes in protein degradation rates by coupling them to yeast cell-growth kinetics. The method is based on an established selection system where uracil auxotrophy of URA3-deleted yeast cells is rescued by an exogenously expressed reporter protein, comprised of a fusion between the essential URA3 gene and a degradation determinant (degron). The reporter protein is designed so that its synthesis rate is constant whilst its degradation rate is determined by the degron. As cell growth in uracil-deficient medium is proportional to the relative levels of Ura3, growth kinetics are entirely dependent on the reporter protein degradation.
This method accurately measures changes in intracellular protein degradation kinetics. It was applied to: (a) Assessing the relative contribution of known ubiquitin-conjugating factors to proteolysis (b) E2 conjugating enzyme structure-function analyses (c) Identification and characterization of novel degrons. Application of the degron-URA3-based system transcends the protein degradation field, as it can also be adapted to monitoring changes of protein levels associated with functions of other cellular pathways.

Here we describe a robust biological assay for quantifying the relative rate of proteolysis by the ubiquitin-proteasome system. The assay readout is yeast growth rate in liquid culture, which is dependent on the cellular levels of a reporter protein comprising a degradation signal fused to an essential metabolic marker.

Baseada Reporter ensaio de crescimento para análise sistemática de degradação de proteínas

Protein degradation by the ubiquitin-proteasome system (UPS) is a major regulatory mechanism for protein homeostasis in all eukaryotes. The standard ...

Comparing the Affinity of GTPase-binding Proteins using Competition Assays

In this protocol we demonstrate a method for comparing the competition between GTPase-binding proteins. Such an approach is important for determining the binding capabilities of GTPases for two reasons: The fact that all interactions involve the same face of the GTPases means that binding events must be considered in the context of competitors, and the fact that the bound nucleotide must also be controlled means that conventional approaches such as immunoprecipitation are unsuitable for GTPase biochemistry. The assay relies on the use of purified proteins. Purified Rac1 immobilized on beads is used as the bait protein, and can be loaded with GDP, a non-hydrolyzable version of GTP or left nucleotide free, so that the signaling stage to be investigated can be controlled. The binding proteins to be investigated are purified from mammalian cells, to allow correct folding, by means of a GFP tag. Use of the same tag on both proteins is important because not only does it allow rapid purification and elution, but also allows detection of both competitors with the same antibody during elution. This means that the relative amounts of the two bound proteins can be determined accurately.

This protocol compares the relative affinities of binding partners for Rho-family GTPases, including Rac1. In vivo, Rac1-binding proteins compete for a single binding interface, the conformation of which is dictated by a bound nucleotide. The nucleotide is both important and difficult to control experimentally, due to the high hydrolysis rate.

Comparando-se a afinidade de proteínas de ligação utilizando ensaios de competição de GTPase

In this protocol we demonstrate a method for comparing the competition between GTPase-binding proteins. Such an approach is important for determining the ...

Techniques to Induce and Quantify Cellular Senescence

In response to cellular stress or damage, proliferating cells can induce a specific program that initiates a state of long-term cell-cycle arrest, termed cellular senescence. Accumulation of senescent cells occurs with organismal aging and through continual culturing in vitro. Senescent cells influence many biological processes, including embryonic development, tissue repair and regeneration, tumor suppression, and aging. Hallmarks of senescent cells include, but are not limited to, increased senescence-associated &#946;-galactosidase activity (SA-&#946;-gal); p16INK4A, p53, and p21 levels; higher levels of DNA damage, including &#947;-H2AX; the formation of Senescence-associated Heterochromatin Foci (SAHF); and the acquisition of a Senescence-associated Secretory Phenotype (SASP), a phenomenon characterized by the secretion of a number of pro-inflammatory cytokines and signaling molecules. Here, we describe protocols for both replicative and DNA damage-induced senescence in cultured cells. In addition, we highlight techniques to monitor the senescent phenotype using several senescence-associated markers, including SA-&#946;-gal, &#947;-H2AX and SAHF staining, and to quantify protein and mRNA levels of cell cycle regulators and SASP factors. These methods can be applied to the assessment of senescence in various models and tissues.

Cellular senescence, the irreversible state of cell-cycle arrest, can be induced by various cellular stresses. Here, we describe protocols to induce cellular senescence and methods to assess markers of senescence.

Técnicas para induzir e quantificar a senescência celular

In response to cellular stress or damage, proliferating cells can induce a specific program that initiates a state of long-term cell-cycle arrest, termed ...

An In Vitro Model to Study the Effect of 5-Aminolevulinic Acid-mediated Photodynamic Therapy on Staphylococcus aureus Biofilm

Staphylococcus aureus (S. aureus) is a common human pathogen, which causes pyogenic and systemic infections. S. aureus infections are difficult to eradicate not only due to the emergence of antibiotic-resistant strains but also its ability to form biofilms. Recently, photodynamic therapy (PDT) has been indicated as one of the potential treatments for controlling biofilm infections. However, further studies are required to improve our knowledge of its effect on bacterial biofilms, as well as the underlying mechanisms. This manuscript describes an in vitro model of PDT with 5-aminolevulinic acid (5-ALA), a precursor of the actual photosensitizer, protoporphyrin IX (PpIX). Briefly, mature S. aureus biofilms were incubated with ALA and then exposed to light. Subsequently, the antibacterial effect of ALA-PDT on S. aureus biofilm was quantified by calculating the colony forming units (CFUs) and visualized by viability fluorescent staining via confocal laser scanning microscopy (CLSM). Representative results demonstrated a strong antibacterial effect of ALA-PDT on S. aureus biofilms. This protocol is simple and can be used to develop an in vitro model to study the treatment of S. aureus biofilms with ALA-PDT. In the future, it could also be referenced in PDT studies utilizing other photosensitizers for different bacterial strains with minimal adjustments.

An In Vitro Model to Study the Effect of 5-Aminolevulinic Acid-mediated Photodynamic Therapy on Staphylococcus aureus Biofilm

This manuscript describes a protocol to study the antimicrobial effect of 5-aminolevulinic acid-mediated photodynamic therapy (ALA-PDT) on a Staphylococcus aureus biofilm. This protocol can be used to develop an in vitro model to study the treatment of bacterial biofilms with PDT in the future.

Um modelo In Vitro para estudar o efeito da terapia fotodinâmica 5 ácido aminolevulínico-mediada no biofilme de Staphylococcus aureus

Staphylococcus aureus (S. aureus) is a common human pathogen, which causes pyogenic and systemic infections. S. aureus infections are difficult to ...

SA-&#946;-Galactosidase-Based Screening Assay for the Identification of Senotherapeutic Drugs

Cell senescence is one of the hallmarks of aging known to negatively influence a healthy lifespan. Drugs able to kill senescent cells specifically in cell culture, termed senolytics, can reduce the senescent cell burden in vivo and extend healthspan. Multiple classes of senolytics have been identified to date including HSP90 inhibitors, Bcl-2 family inhibitors, piperlongumine, a FOXO4 inhibitory peptide and the combination of Dasatinib/Quercetin. Detection of SA-&#946;-Gal at an increased lysosomal pH is one of the best characterized markers for the detection of senescent cells. Live cell measurements of senescence-associated &#946;-galactosidase (SA-&#946;-Gal) activity using the fluorescent substrate C12FDG in combination with the determination of the total cell number using a DNA intercalating Hoechst dye opens the possibility to screen for senotherapeutic drugs that either reduce overall SA-&#946;-Gal activity by killing of senescent cells (senolytics) or by suppressing SA-&#946;-Gal and other phenotypes of senescent cells (senomorphics). Use of a high content fluorescent image acquisition and analysis platform allows for the rapid, high throughput screening of drug libraries for effects on SA-&#946;-Gal, cell morphology and cell number.

Cellular senescence is the key factor in the development of chronic age-related pathologies. Identification of therapeutics that target senescent cells show promise for extending healthy aging. Here, we present a novel assay to screen for the identification of senotherapeutics based on measurement of senescence associated &#946;-Galactosidase activity in single cells.

Ensaio de triagem à base de SA-β-galactosidase para a identificação de medicamentos Senoterapêuticos

Cell senescence is one of the hallmarks of aging known to negatively influence a healthy lifespan. Drugs able to kill senescent cells specifically in cell ...

A Plate Competition Assay As a Quick Preliminary Assessment of Disease Suppression

The goal was to develop and optimize a simple, affordable, and effective bioassay to detect disease suppressive ability of a specific compost against soilborne fungus Rhizoctonia solani. R. solani is a pathogen of a wide range of plant hosts worldwide. The fungus survives in soils as a saprophyte and grows rapidly on simple water agar media. The plate assay is a rapid method to compare composts for their ability to slow the growth of R. solani. The assay also correlates well with suppression of other soilborne fungal pathogens that survive as saprophytes in soils such as Alternaria early blights, Fusarium wilt, Phytophthora root rot, and Pythium root rot.

Presented is a protocol for a plate competition assay to identify whether a specific compost is likely to contain bacteria and fungi that suppress growth of Rhizoctonia solani.

Um ensaio de competição de placa como uma rápida avaliação preliminar de supressão da doença

The goal was to develop and optimize a simple, affordable, and effective bioassay to detect disease suppressive ability of a specific compost against ...

Medium-throughput Screening Assays for Assessment of Effects on Ca2+-Signaling and Acrosome Reaction in Human Sperm

Ca2+-signaling is essential to normal sperm cell function and male fertility. Similarly, the acrosome reaction is vital for the ability of a human sperm cell to penetrate the zona pellucida and fertilize the egg. It is therefore of great interest to test compounds (e.g., environmental chemicals or drug candidates) for their effect on Ca2+-signaling and acrosome reaction in human sperm either to examine the potential adverse effects on human sperm cell function or to investigate a possible role as a contraceptive. Here, two medium-throughput assays are described: 1) a fluorescence-based assay for assessment of effects on Ca2+-signaling in human sperm, and 2) an image cytometric assay for assessment of acrosome reaction in human sperm. These assays can be used to screen a large number of compounds for effects on Ca2+-signaling and acrosome reaction in human sperm. Furthermore, the assays can be used to generate highly specific dose-response curves of individual compounds, determine potential additivity/synergism for two or more compounds, and to study the pharmacological mode of action through competitive inhibition experiments with CatSper inhibitors.

Medium-throughput Screening Assays for Assessment of Effects on Ca2+-Signaling and Acrosome Reaction in Human Sperm

Here, two medium-throughput assays for assessment of effects on Ca2+-signaling and acrosome reaction in human sperm are described. These assays can be used to quickly and easily screen large amounts of compounds for effects on Ca2+-signaling and acrosome reaction in human sperm.

Ensaios de triagem para avaliação dos efeitos de Ca2 +médio-produção-sinalização e reacção acrossómica no esperma humano

Ca2+-signaling is essential to normal sperm cell function and male fertility. Similarly, the acrosome reaction is vital for the ability of a human sperm ...