The authors would like to thank Dr. Hannah Baker for her extensive work in optimizing this procedure.

Alle Tiere wurden mit Menschlichkeit behandelt und alle Protokolle wurden von der University of Virginia IACUC genehmigt. 1. Vorbereitung der Ausrüstung <ol><li> Stellen Sie sicher, dass alle Maschinen ordnungsgemäß angeschlossen sind. </li><li> Schalten Sie den Computer ein, gefolgt von der High-Power-Bi-Phasen-Stimulator und Dual-Mode-Hebelsystem. </li><li> Zu dieser Zeit, legen Sie das Tier in die Anästhesie Kammer mit 2% Isofluran geliefert, und schalten Sie das Heizelement, so dass die Plattform auf 37 ° C erhitzt wird. </li><li> Die Elektroden werden in 70% Ethanol, so dass die aus Polytetrafluorethylen (PTFE) beschichteten Spitzen untergetaucht sind und desinfiziert werden, während die Vorrichtung und Software-Einrichtung. </li><li> Suchen und öffnen Sie den Hebel Systemsteuersoftware auf dem Desktop. Hinweis: das wird die Software sein benötigten Funktionstests durchzuführen. </li></ol> 2. Software-Setup <ol><li> Sobald das Programm (Abbildung 1A) geöffnet wird, den Parameter zu änderns für Instant Stim unter dem Setup-Menü auf die gewünschten Werte. HINWEIS: In diesem Protokoll bleiben alle Parameter auf den voreingestellten Ebenen mit Ausnahme von &quot;Run Time (s)&quot;, die bis 180 sec (Abbildung 1B) geändert wird. </li><li> Erstellen Sie eine automatische Speicherung Ordner unter dem Setup-Menü. </li><li> Suchen Sie einen Typ-able Fenster mit der Bezeichnung &quot;Automatisches Speichern Base&quot;. Geben Sie den Namen der Probe, zum Beispiel &quot;Rat1-date-Zeitpunkt&quot;. Direkt links von der &quot;Automatisches Speichern Base&quot; Typ-able Fenster, klicken Sie auf das Feld &quot;Automatisches Speichern aktivieren&quot;. </li><li> An der Spitze des Steuerbildschirms, wählen Sie &quot;Sequencer&quot;. Ein neues Fenster öffnet sich. Auf der Unterseite des neuen Fensters, wählen Sie &quot;Öffnen Sequence&quot;. Ein neues Fenster öffnet sich. Wählen Sie die premade Sequenz und klicken Sie auf OK. Eine Protokollliste mit Sequenzparameter einschließlich der Häufigkeit und Dauer von Reizen und Ruhezeit wird im Fenster entwickeln genannt: Sequenzeditor (Abbildung 1C). Klicken Sie auf &quot;Load Sequence&quot; -&gt; &amp; #34; Fenster schließen &quot;. </li><li> Um Echtzeit aktuelle und Stimulation zu sehen, wählen Sie &quot;Datei&quot; -&gt; &quot;Live Data Monitor&quot;. Ein neues Fenster öffnet sich. </li><li> In der neuen Live - Datenfenster, Formatbildschirm für die Prüfung durch die automatische Skalierung - Funktion oder manuell den maximalen und minimalen y-Werte eingeben , auf dem Bildschirm angezeigt. </li></ol> 3. Tier-Set-up HINWEIS: Alle Kraftmessungen sind die von einem 11 Wochen alten Lewis-Ratte. Es besteht ein linearer Zusammenhang zwischen Muskelmasse und Kraft-Produktion (in Newton). Daher ist, wie das Alter der Ratte erhöht, die Kraftwerte durch das Bein erzeugte sollte auch erhöhen. <ol><li> Stellen Sie sicher, dass das Tier in der geeigneten Ebene der Anästhesie ist, bevor es aus der Narkose Kammer zu entfernen. komplett entfernen Haare auf der lateralen Seite zwischen dem Knöchel und dem Becken des Versuchs Bein einen elektrischen Haarschneider verwenden. HINWEIS: Die richtige Ebene der Anästhesie wird erreicht, wenn das Tier is nicht als Reaktion auf eine Zehe Prise. Es ist notwendig, die Richtlinien zu folgen, von den einzelnen Organen der Animal Care und Use Committee streckte. </li><li> Legen Sie das Tier in Rückenlage, die Nase des Tieres sicherzustellen, sicher in der Anästhesie Bugnase ist, so dass es an der ausreichenden Tiefe der Anästhesie bleibt. </li><li> Regeln die Position der Pedalvorrichtung durch drei unabhängige Knöpfe (Abbildung 2). Mit Hilfe der Knöpfe (A und B) das Fußpedal, legen Sie die Pedalvorrichtung an seinem äußersten linken und der niedrigsten Position einzustellen sind. Dadurch wird die korrekte Positionierung des Fußes des Tieres ermöglichen, während Raum Manipulationen für später verlassen. An dieser Position mit dem Drehknopf auf der linken Seite der Spur, um das Gerät von der Experimentator entweder in Richtung oder weiter weg zu bewegen, so dass das Tier Bein in einer geraden Ebene liegt. </li><li> Reinigen Sie das Bein mit drei Änderungen von Jod und Alkohol. Das Jod sollte für 30 Sekunden auf dem Bein verbleiben. </li><li> Stellen Sie die Tier oder Plattform(2A, D) , so daß der verlängerte Schenkel zwischen der Sohle des Fußes und dem Fußpedal vollständigen Kontakt gewährleistet. </li><li> Mit medizinischen Klebeband befestigen Sie den Fuß des Tieres gegen die Fußplatte (2D). Es ist entscheidend, dass die Ferse gegen die Unterseite des Pedals bündig ist und den gesamten Fuß ist flach und wird nicht von der Platte während des Testens entfernen. </li><li> Suchen Sie den Klemmmechanismus, das Bein zu stabilisieren. Schieben Sie den Stabilisierungsstift in so weit zu reduzieren Bewegung des Beines und einrasten, indem Sie den Inbusschlüssel drehen. </li><li> An dieser Position mit dem Drehknopf C , das Gerät zu bewegen , entweder zu oder weg von der Experimentator , so dass der Knöchel, der Tibia und Femur liegen in einer geraden Linie (2C). Stellen Sie sicher, dass das Bein mit dem Fußpedal parallel ist. Nehmen Sie die Einstellung auf den Verlauf und feinen Noppen auf der Rückseite des Gerätes gefunden, um langsam den Knöchel zu bewegen, so der Fuß und Unterschenkel bei einer 90 ° Position sind. </li><li> continue das Bein so Femur und Tibia zu bewegen , sind in einem 90-Grad - senkrechten Winkel (2B). An diesem Punkt ist das Tier für die Elektroden bereit. </li></ol> 4. Anordnung der Elektroden <ol><li> Aktivieren Sie &quot;Instant Stim&quot;, indem Sie auf den orangefarbenen Button mit der Aufschrift &quot;Instant Stim&quot; klicken. </li><li> Legen Sie beide Elektroden oberflächlich auf dem proximalen Ende des tibialis anterior und bewegen Sie die Elektrodenspitzen um bis Spikes auf dem Live-Monitor zu sehen sind. Idealerweise sollten die Spitzen etwa 0,4 N betragen HINWEIS: Die Elektroden benachbart und orthogonal zu der Ebene des Nervs peroneal platziert werden soll, die wiederum vom Knie verläuft seitlich und senkrecht zu der Tibia. </li><li> Legen Sie eine Nadel weit genug, um zu stechen Dermis, und kaum in die Muskelschicht. Bewegen Sie die andere Elektrode herum, bis Spikes auf dem Live-Monitor um 0,6 N. Insert gesehen werden Nadeln und klemmen sie an Ort und Stelle ein Hobby Klemme oder medizinische Klebeband. </li><li> EINdjust Grob- und Feineinstellungen Maximalkraft Ausgang zu finden. </li><li> Auf der High-Power-Bi-Phasen-Stimulator, wird es zwei Knöpfe in der Mitte sein. Man ist &quot;RANGE&quot; bezeichnet und die anderen &quot;ADJUST&quot;. Drehen Sie den &quot;RANGE&quot; Knopf, um die gewünschte maximale Stromstärke. HINWEIS: Die Peaks werden langsam in Größe zunehmen und die maximale Stromstärke ist als die Höhe bestimmt, bei der drei aufeinanderfolgenden Stimulationen in identischen kontraktilen Reaktionen führen. Wider die Stromstärke höher als notwendig drehen; die maximale Stromstärke wird die gesamte Muskel Vertrag, stimulieren aber jeder höheren Strom bei der Rekrutierung von benachbarten Muskeln und potenziell Antagonisten als auch führen. </li><li> Drehen Sie den &quot;ADJUST&quot; Regler, um den Prozentsatz der &quot;RANGE&quot; eingestellt werden, die verwendet wird, um die Muskeln zu stimulieren. An dieser Stelle sollte Kraft lesen um 1,0 N. Dies kann eine Erhöhung oder Verringerung des Stroms erfordern. </li><li> Überprüfen Sie die Elektroden, um sicherzustellen, dass sie sicher sind. HaltInstant-Stim. </li><li> Auf der &quot;Live Data&quot; Fenster klicken Sie auf &quot;Sequenz starten.&quot; </li><li> Weiter, um die Kurven zu überwachen, indem sie zurück zu dem Steuerbildschirm gehen, und dann auf die &quot;Analyse&quot; Knopf über dem Orange gelegen &quot;Instant Stim&quot; -Taste. Die tetanischer Kurve sollte beginnen Form um die 60 Hz-Stimulation zu nehmen. </li></ol> 5. Beenden Stimulation und Reinigung <ol><li> Nachdem die Sequenz beendet ist, Elektroden entfernen und mit 70% Alkohol sauber wischen. Die Elektroden werden in die Decke. </li><li> Lösen Sie die Knieklemme und ausschalten Anästhesie. Nehmen Sie das Tier aus dem Anästhesiegas und legen Sie das Tier in der Bauchlage, noch auf dem Heizkissen. Pflegen Sie die Ratte auf 100% O 2 für ein paar Minuten , nachdem das Isofluran Gas wurde mit Sauerstoff angereichert , die Ratte zu halten ausgeschaltet. Das Tier kann zunächst zu verschieben, aber nicht zurück, das Tier zurück in den Käfig, bis das Tier das Bewusstsein wiedererlangt. Wenn Muskelkater bemerktbei der Wiederherstellung sollte eine Dosis von NSAID gegeben werden, wie es von Ihrem Tierpflegeausschuss festgelegt. </li><li> Schalten Sie alle Geräte aufgelistet in Schritt 1.2, schließen Sie die Software, und weiter bis zur Datenanalyse. </li><li> Wischen Sie die Plattform und Fußpedal nach unten. </li></ol> 6. Datenanalyse HINWEIS: Die Datenanalyse erfolgt eine Sequenz von diesem Labor entwickelt, um fit und nach Laborprotokollen. Analysenwerte, Datenpunkte von Bedeutung, und andere Aspekte des Verfahrens wird auf die Absicht des Benutzers ändern sich abhängig. <ol><li> Öffnen Sie die Datenanalyse-Software. </li><li> Klicke auf das High Throughput Menü Analyse mehrerer Datendateien (Samples) zu einem Zeitpunkt zu ermöglichen. Wählen Sie &quot;Force-Frequency&quot; Analysis. </li><li> Klicken Sie auf die &quot;Pick-Dateien&quot; und öffnen so viele gespeicherte Datendateien wie gewünscht. </li><li> Wählen Sie &quot;Manuell&quot; im Cursor-Platzierung Feld Methode. HINWEIS: Dies ermöglicht es dem Benutzer alle dat zu analysierenein innerhalb eines gewünschten Zeitstempel, als an das Programm im Gegensatz automatisch die Analyse Standort wählen. </li><li> Ändern Sie den Cursor End - Zeitstempel - Wert auf 2. Klicken Sie auf die &quot;Analyze&quot; -Taste (Abbildung 1D). </li><li> Verwendung einer Tabelle, klicken Sie auf &quot;Speichern Tabelle, um die Tabelle zu speichern und die Daten analysieren Taste ACSII. Dadurch wird die Datei zu speichern, und es kann mit einer Tabelle zu einem späteren Zeitpunkt geöffnet werden. </li><li> Öffnen Sie die gespeicherte Datendatei in Tabelle. </li><li> Erstellen Sie eine zusätzliche Spalte mit der Bezeichnung &quot;Absolute Maximum&quot;, und bestimmen Sie die Differenz zwischen dem Ausgangswert und die Maximalwerte für jede Probe. Damit erhöht sich die maximale Kraft bei jeder Frequenz vorsehen. </li><li> Um Drehmoment bestimmen, multiplizieren Sie durch die Länge des Hebelarmes jeder Kraftwert. HINWEIS: In diesem Fall wird die von der Fußlänge des Tieres dargestellt werden würde. Dieses Protokoll verwendet die durchschnittliche experimentell bestimmten Wert von 30 mm. Der Benutzer hat nun die Werte für die ma bestimmtximale Drehmoment bei jeder Frequenz erzeugt wird. </li><li> Graph dieser Werte als Drehmomentfrequenzkurve oder das maximale Drehmoment durch das Tier in allen Stimulationsfrequenzen erzeugt. ANMERKUNG: Dies kann als ein einzelner Punkt des Vergleichs zwischen den Proben identifiziert und verwendet werden. </li></ol>

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N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Losartan+restores+skeletal+muscle+remodeling+and+protects+against+disuse+atrophy+in+sarcopenia.">Losartan restores skeletal muscle remodeling and protects against disuse atrophy in sarcopenia.</a> Sci transl med. 3, 82ra37 (2011).</li><li>Brooks, S. V., Zerba, E., Faulkner, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Injury+to+muscle+fibres+after+single+stretches+of+passive+and+maximally+stimulated+muscles+in+mice.">Injury to muscle fibres after single stretches of passive and maximally stimulated muscles in mice.</a> J Physiol. 488 (Pt 2), 459-469 (1995).</li><li>Machingal, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tissue-engineered+muscle+repair+construct+for+functional+restoration+of+an+irrecoverable+muscle+injury+in+a+murine+model.">A tissue-engineered muscle repair construct for functional restoration of an irrecoverable muscle injury in a murine model.</a> Tissue Eng Part A. 17, 2291-2303 (2011).</li><li>Pizza, F. X., Koh, T. J., McGregor, S. J., Brooks, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+inflammatory+cells+after+passive+stretches,+isometric+contractions,+and+lengthening+contractions.">Muscle inflammatory cells after passive stretches, isometric contractions, and lengthening contractions.</a> J Appl Physiol (1985). 92, 1873-1878 (2002).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Dieses Protokoll zeigt eine relativ einfache Methode zur in vivo Muskelfunktionstest an der vorderen crural Kompartiment der Ratte hindlimb durchführt. Andere Formen der Muskelfunktionstests, einschließlich ex vivo und in situ - Protokolle können auch wichtige Informationen über Muskelphysiologie bereitzustellen. Allerdings liegt die Bedeutung der in vivo Funktionsprüfung in seiner nicht - invasiven Natur und der Tatsache , dass es am genauesten endogene Mechanismen der Muskelstimulation rekapituliert. Sowohl für ex vivo- und in - situ - Tests, der Sehne und / oder Muskel ausgesetzt sind, und deshalb muss feucht oder unter Wasser 41,42 gehalten werden. In vivo - Tests entfernt Störvariablen des Traumas und Entzündung , die durch die chirurgische Eingriffe verursacht werden kann erforderlich für in situ Muskelfunktionsprüfung; Dies ist besonders wichtig, wenn das Ziel des Versuchs ist, inflammatorischen und zelluläre Prozesse zu untersuchen, <sbis&gt; 43. Außerdem ist in vivo - Tests erfordert wenig chirurgische Fähigkeiten als der Muskel nicht von seiner Umgebung isoliert ist und erfordert keine präzise Knoten Muskel / Sehnen - Schlupf zu reduzieren (wie es der Fall für die in situ oder ex - vivo - Tests) 41. Darüber hinaus mit ausreichender Praxis, die Geschwindigkeit der korrekten Platzierung der Elektroden und die Fähigkeit, schnell Anpassungen vornehmen maximale Kraftproduktion des Muskels zu erreichen , wird das Protokoll Abschluss ist schnell und sicher , sowohl innerhalb Tieren und in den verschiedenen Nutzern der gleichen Ausrüstung reproducible- 39 . Es ist vorteilhaft, mit einer Bewertung des gesamten vorderen crural Komponente zu beginnen, wie dargestellt, vor der Entfernung der weniger zugänglich synergistische Muskeln (EDL und HL) für eine direktere Untersuchung der TA Muskel. Mit diesem Ansatz kann man recht schnell die Beherrschung der Technik erreichen. Während die beschriebene Prozedur hier demonstriert und unterstreicht die Nützlichkeit einer Kraft frequency Protokoll Tetanus zu induzieren und die maximale Kraft bestimmen, durch einen Muskel erzeugt, sollten Anwender die Art (en) von Funktionstests ermitteln, die am besten zu ihren spezifischen Experiment informieren würde (n) und Forschungsziele. Es gibt mehrere wichtige Schritte, die sorgfältig in Reihenfolge durchgeführt werden sollten optimale und reproduzierbare experimentelle Ergebnisse zu gewährleisten, das heißt, konsistente maximale Kraft-Produktion durch den Muskel zu einer Vielzahl von Stimulationsparameter. Einige der wichtigsten Merkmale sind in Abbildung 2 dargestellt. Doch die richtige Platzierung und Stabilität der Stimulationselektrode ist eine unabdingbare Voraussetzung für eine reproduzierbare maximale Stimulation des Nervus peroneus. In dieser Hinsicht sollten die Elektroden oberflächlich angebracht werden. Das heißt, wenn die Elektrodenplatzierung zu tief ist, eine direkte elektrische Stimulation der antagonistischen Muskeln Risiken, wodurch die Größe der beobachteten kontraktile Antwort des vorderen crural Raum abnimmt. Ferner ist diezwei Elektroden sollten in so nahe beieinander wie möglich angeordnet werden, um den elektrischen Widerstand der umgebenden Haut und des Bindegewebes zu reduzieren. Im Allgemeinen Elektrodenpositionierung der Nähe des Knies und medial am Bein direkt den Rand des tibialis anterior Tracing, wo sie erfüllt die gastrocnemius ergibt oft eine ausreichende Kraftproduktion. Dies stellt auch sicher, dass die Elektroden benachbart und senkrecht zu der Ebene des Nervs peroneal angeordnet sind, die wiederum an der Tibia verläuft senkrecht und seitlich in den Beinen vom Knie. Allerdings erfordert die natürliche Variabilität in der Anatomie zwischen Tieren ständige Wachsamkeit, dass die Elektrodenplatzierung, um sicherzustellen, von Fall zu Fall optimiert ist. Als solches gibt es ein gewisses Maß an Versuch und Irrtum mit Elektrodenplatzierung zugeordnet ist, die wesentlich von der Erfahrung des Benutzers verringert wird. Die Anzahl der Male die Elektroden durchdringen die Haut sollte Schwellungen und Entzündungen zu reduzieren, minimiert werden, was mir abnimmtasured Kraftproduktion. Dies ist abhängig von wo die Nadeln zunächst gestellt werden, aber es wird empfohlen, um die Nadeln zwei Mal oder weniger vor allem im Bereich bewegen rund um die Kniescheibe. Schließlich, nachdem die Elektroden in dem Bein des Tieres angeordnet sind, kleinere Anpassungen können durch die Elektroden zu liefernde die Positionierung des Beins und dem Strom durchgeführt werden. Dies sollte gleichzeitig durchgeführt werden, während die aus einer einzigen Zucken erzeugte Kraft zu überwachen. Neben der Platzierung der Elektroden können Anpassungen auch an die an die Elektroden geliefert Spannung vorgenommen werden. Allerdings ist hier beschrieben im Setup ist es wichtig, vorsichtig zu sein, wenn die Spannung als eine Möglichkeit, steigende Kraftabgabe zu erhöhen, da die erhöhte Spannung die Nerven innervate Antagonist Muskeln, die anregen wird. Es gibt drei wichtige technische Bedenken, die gewährleisten, überwacht werden muss, dass die Platzierung der Elektroden optimal bleibt. Erstens muß der Fuß des narkotisierten Tier sein festverankert Vorrichtung mit dem Fußpedal, das die Muskelkraft Produktion (Abbildung 2) misst. Wenn der Fuß nicht fest verankert ist, kann nicht vollständig auf den Kraftaufnehmer übersetzt die wahre Kraft, die durch den Muskel produziert. Instabile Fußfixierung führt auch das Risiko für die optimale Platzierung der Elektroden als Bewegung über die normale Muskelkontraktion zu verlieren (dh der Fuß sich von der Bodenplatte entfernt) kann Verschiebung der Elektroden aus ihrer oberflächlichen Position verursachen oder sie vollständig entfernen. Entweder Szenario wird die gemessene Kraft zu verringern. Zweitens sollte dem Körper des Tieres vollständig Rücken sein und in einer geraden Ebene (Abbildung 2) ausgerichtet ist . Die richtige Positionierung des Tierkörpers verhindert leichte Bewegungen des Beins aufgrund der Atmung, und minimiert auch ein Verdrehen des Beines und des Beckens, eine bessere Platzierung und kontinuierlichen Kontakt der Stimulationselektroden ermöglicht. Drittens, die korrekte Positionierung und Verankerung des Knies ist kritical, um sicherzustellen, dass das Bein steady bleibt und somit hilft, die optimale Positionierung der Stimulationselektroden stabilisieren konsistente Aktivierung des peroneal Nerv zu ermöglichen. Es gibt ein paar zusätzliche Punkte, die hervorgehoben werden sollen. Zuerst wird der kommerzielle Muskelhebelsystem bei Prüfung auf dem linken Bein durchzuführen, aber der Aufbau modifiziert werden kann, als auch Tests auf dem rechten Bein durchzuführen. Zweitens Muskelhebelsysteme basierend auf der Größe des Tieres gewählt werden, so dass die Nutzer sollten sicherstellen, dass die Plattform angemessen ist die Kraft, die durch das Tiermodell der Wahl zu messen und zu unterstützen. Prüfbare Muskeln für die Ausrüstung Plattform sind auf diejenigen beschränkt, die plantar Verlängerung oder Dorsalflexion des Fußes induzieren. Drittens sollte es erneut zu betonen, dass die Elektrodenplatzierung kann eine Herausforderung sein und erfordert Geduld und Übung, die Technik zu beherrschen. Die Elektroden auch stumpf werden schnell bei regelmäßiger Anwendung, so ist es hilfreich, mehrere Ersatz s zu habenets für einmal wird es schwierig, die Haut oberflächlich zu stechen. Drittens nutzt das Protokoll in diesem Bericht beschriebenen spezifischen Stimulationssequenzen und Datenanalyseverfahren. Der Muskel Hebelsystem Steuerungssoftware und Datenanalyse-Software und die Daten, die sie bietet viele andere experimentelle Fragestellungen und damit zu beantworten, seinen Nutzen erstreckt sich über was hier skizziert ist. Als solche werden die Benutzer aufgefordert über die Grenzen des Softwareprotokolls (e) dargestellt in diesem Papier zu erkunden. Trotz dieser geringen Einschränkungen, in vivo Tests Muskelfunktion ist ein leistungsfähiger Ansatz , um die Gesundheit und die Kontraktionsfähigkeit des Skelettmuskels , um zu bestimmen , da sie minimal invasiv ist und kann mehrmals durchgeführt werden, über einen längeren Zeitrahmen, auf dem gleichen Tier. Kurz gesagt, diese Art der zu wartenden Nutzen macht das System besonders geschickt darin, die Auswirkungen von neuen Therapien für Skelettmuskelverletzungen oder Krankheit in der Ratte hindlimb testen.

Der Skelettmuskel hat eine bemerkenswerte Fähigkeit für eine Reparatur in Reaktion auf eine Verletzung oder Krankheit 1,2. Experimentell hat sich die Robustheit dieses regenerative Reaktion wurde in Tiermodellen durch das Studium, beispielsweise der zeitliche Verlauf der Skelettmuskelschäden, Reparatur und Regeneration nach dem Auftragen von myotoxins (zB Cardio) 3-7 gut dokumentiert. Genauer gesagt, wird die Regeneration von Satellitenzellen reifen die Bewohner Stammzellen vermittelt nach umfangreichen Cardio-induzierte Muskelschädigung (38-67% der Muskelfasern 8), die letztlich funktionelle Muskelfasern 4,9-13 geworden. Das Endergebnis ist eine erhöhte post Schaden funktionelle Regeneration gesunder, krafterzeugende Muskelgewebe 14-16. Obwohl die Einzelheiten weit über den Rahmen dieses Berichts sind, spiegelt die mechanistische Grundlage für die Regeneration der Muskeln, die sorgfältig orchestrierten Ereignisse zahlreicher Zelltypen aus mehreren Linien canoni Verwendungcal Signalwege kritisch sowohl auf die Gewebeentwicklung und Morphogenese 5,17-21. Wichtig ist, dass Myotoxin induzierte Regeneration durch die Tatsache ermöglicht , dass die extrazelluläre Matrix, Cardioinduzierte Muskelschäden 3,8,22 folgenden neuronalen Innervation und Blutgefäß Perfusion strukturell intakt bleiben. Im krassen Gegensatz dazu diese Schlüsselgewebestrukturen und Komponenten sind per Definition im Rahmen der VML Verletzung gänzlich fehlen; Wo Frank Gewebeverlust aufgrund einer Vielzahl von Ursachen, führt zu einer dauerhaften funktionellen und kosmetischen Defizite 23-25. Unabhängig von den zusätzlichen Herausforderungen im Zusammenhang mit Muskel-Reparatur und Regeneration nach VML Verletzungen im Vergleich zu Myotoxin-induzierte Muskelschäden, ein besseres Verständnis der mechanistischen Basis für Skelettmuskelregeneration und Reparatur, in einer Vielzahl von Kontexten, sind gut durch die Nutzung von biologisch serviert relevanten Tiermodellen in Kombination mit Längs einssessments einschlägiger funktionellen Maßnahmen. Wie hierin diskutiert, Studien der Ratte hindlimb zu diesem Zweck ein ausgezeichnetes Modellsystem bereitzustellen. Genauer gesagt, werden die Muskeln des vorderen crural Fach (tibialis anterior, Extensor digitorum longus (EDL) und hallucis longus (HL)), die für die Dorsalflexion des Fußes verantwortlich sind, leicht identifiziert und manipuliert werden können. Darüber hinaus sind sie von den großen Blutgefäßen (Becken und Zweige) serviert und werden von Nerven (Ischias und Niederlassungen, darunter peroneal) über die gesamte Länge des Beins 26-28 innervated. Als solche kann man die Ratte hindlimb Modell verwenden , um direkt Skelettmuskelfunktion / Pathologie in vivo zu bewerten, oder die mehr indirekte Auswirkungen der Pathologie bedingten Veränderungen in Blutgefäßen oder Nerven auf entsprechenden Skelettmuskelfunktion zu bewerten. In jedem Szenario kann die Schwere der Krankheit, sowie die Wirksamkeit der Behandlung als eine Funktion der Muskelkrafterzeugung (Drehmoment) und entsprechenden Fuß m bestimmt werden,29-34 ovement. Idealerweise werden Kraftmessungen durch histologische Untersuchungen begleitet und Genexpressionsanalysen rigoroser die strukturellen und molekularen Zustand der Skelettmuskulatur zu bewerten. Grund Histologie und Immunhistochemie, beispielsweise in der Lage, Fragen zu Muskelmasse, Muskelfaserausrichtung, extrazelluläre Matrixzusammensetzung, die Lage der Kerne, Zellzahl und Proteinlokalisierung zu beantworten. Genexpressionsanalyse, die wiederum notwendig ist, um die molekularen Mechanismen zu identifizieren, die die Reife der Muskelfasern, Krankheitszustände, und die metabolische Aktivität beeinflussen kann / modulieren. Während diese Verfahren entscheidende Informationen liefern, stellen sie im Allgemeinen Terminal-Endpunkte, und am wichtigsten, versagen sie direkt auf die Funktionsfähigkeit der Skelettmuskulatur zu behandeln, und sind somit eher als Korrelat ursächliche. Wenn jedoch histologische Untersuchungen und Genexpressionsanalysen werden in Verbindung mit funktionellen measur ausgewertetes dann Mechanismen der Kraftproduktion und funktionelle Regeneration können die meisten werden genau identifiziert. In dieser Hinsicht kann die Krafterzeugungsfähigkeiten eines Muskels in vitro gemessen werden, in situ oder in vivo. Alle drei Ansätze haben sowohl Vorteile als auch Grenzen. In einem in vitro Experiment, zum Beispiel, ist der Muskel vollständig isoliert und aus dem Körper des Tieres entfernt. Durch Entfernen der Einflüsse der Blutgefäße und Nerven, die den Muskel versorgen kann die Kontraktionsfähigkeit des Gewebes in einer streng kontrollierten äußeren Umgebung bestimmt werden 35. In situ Muskeltest ermöglicht es dem Muskel isoliert werden, wie mit in vitro Präparate jedoch die Innervation und Blutversorgung bleiben intakt. Der Vorteil der in situ experimentelles Modell ist , dass es ein einzelner Muskel ermöglicht sucht werden , während der Innervation und Blutversorgung minimal 36 gestört wird. Sowohlin vitro und in situ Experimenten pharmakologische Behandlungen angewendet mehr direkt für die Auswirkungen von umgebenden Gewebe oder die Auswirkungen des Kreislaufsystem auf den gemessenen kontraktilen Reaktionen ohne werden 37 zu berücksichtigen. Jedoch Tests in vivo - Funktion, wie hierin beschrieben, ist die am wenigsten invasive Technik zur Bewertung der Muskelfunktion in seiner nativen Umgebung 38, und kann wiederholt über die Zeit (dh in Längsrichtung) durchgeführt werden. Als solches wird es unter dem Mittelpunkt der Diskussion. In dieser Hinsicht perkutane Elektroden nahe dem Muskel von Interesse eingeführt wird, oder der motorischen Nerven dass sie dient, liefern ein elektrisches Signal an den Muskel. Ein Wandler misst dann die resultierende Länge oder Kraftänderungen in dem aktivierten Muskel, wie durch eine vorgegebene, individuelle Softwareprotokoll gerichtet. Aus diesen Daten können die physikalischen Eigenschaften des Muskels zu bestimmen. Dazu gehören fürce-Frequenz, maximale Tetanus, Kraft-Geschwindigkeit, Steifigkeit, Länge Spannung und Müdigkeit. Muskellänge oder Kraft kann auch konstant gehalten werden, so dass der Muskel isometrisch oder isotonisch. Wichtig ist, dass diese experimentellen Protokolle schnell durchgeführt werden, leicht wiederholt und Kundenspezifische- alle während das Tier anästhesiert und mit einer Erholungszeit von Stunden bis Tagen. Ein einzelnes Tier kann in vivo Krafttest mehrmals durchlaufen, so dass Langzeitstudien von Krankheitsmodellen oder die Bewertung der therapeutischen Plattformen / Technologien zu ermöglichen. Wie hier beschrieben, ist ein handelsübliches Muskelhebelsystem in Verbindung mit einer hohen Leistung, Bi-Phasen - Stimulator auszuführen in vivo Muskelfunktionstest verwendet , um den Beitrag des Tibialis anterior - Muskel der Ratte hindlimb zu Dorsalflexion des Fußes über die Anregung zu bewerten von die peroneus. Wir haben ein Protokoll entwickelt, das speziell entwickelt wurde, die regenerative Medizin / ti zu bewertenUSGABE Engineering-Technologien für Muskelreparatur nach einer traumatischen Verletzung VML der Ratte TA Muskel. Es sollte notiert werden; müssen die EDL und HL aus dem vorderen cruris Raum um seziert werden , um den TA Muskel (sie machen etwa 15-20% des gesamten tibialis anterior Drehmoment gemessen folgende peroneal Nervenstimulation (Corona et al., 2013) , um speziell zu bewerten ). Da dieser Ansatz umfassende Längsschnittanalyse der Muskelphysiologie / Funktion bietet, kann es 39 wichtige mechanistische Einblicke in zahlreiche andere Arten von physiologischen Untersuchungen sowie eine Vielzahl von Krankheiten oder therapeutischen Bereichen zu vergießen. Zum Beispiel bei der Prüfung vivo Muskelfunktion ist für Untersuchungen in der Sportphysiologie, Ischämie / Reperfusion Forschung, Myopathie, Nervenschäden / Neuropathie und Vaskulopathie, Sarkopenie und Muskeldystrophien 40.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="515">
	<tbody>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:199px;">Isothesia</td>
			<td style="width:128px;">Henry Schein Animal Health</td>
			<td style="width:103px;">05260-04-04</td>
			<td style="width:87px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:199px;">Isoflurane Vaporizer-Funnel Fill</td>
			<td style="width:128px;">Vet Equip</td>
			<td style="width:103px;">911103</td>
			<td style="width:87px;"></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:199px;">Inlet Adaptor for Vaporizer</td>
			<td style="width:128px;">Vet Equip</td>
			<td style="width:103px;">911124</td>
			<td style="width:87px;"></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:199px;">Outlet Adaptor for Vaporizer</td>
			<td style="width:128px;">Vet Equip</td>
			<td style="width:103px;">911125</td>
			<td style="width:87px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:199px;">Tabletop Anaesthesia Machine</td>
			<td style="width:128px;">Vet Equip</td>
			<td style="width:103px;">901801</td>
			<td style="width:87px;"></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:199px;">Compressed oxygen gas</td>
			<td style="width:128px;">Praxair</td>
			<td style="width:103px;">N/A</td>
			<td style="width:87px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:199px;">VaporGuard Activated Charcoal Filter</td>
			<td style="width:128px;">Vet Equip</td>
			<td style="width:103px;">931401</td>
			<td style="width:87px;"></td>
		</tr>
		<tr height="119">
			<td height="119" style="height:119px;width:199px;">T/Pump Professional water heater</td>
			<td style="width:128px;">Stryker</td>
			<td style="width:103px;">N/A</td>
			<td style="width:87px;">set on Continuous Therapy Time at 38/100 for temperature</td>
		</tr>
		<tr height="68">
			<td height="68" style="height:68px;width:199px;">Transpore Surgical Tape</td>
			<td style="width:128px;">3M</td>
			<td style="width:103px;">1527S-1</td>
			<td style="width:87px;">rip in half to make thinner strips</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:199px;">A5 Golden animal clippers</td>
			<td style="width:128px;">Oster</td>
			<td style="width:103px;">078005-050-002</td>
			<td style="width:87px;"></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:199px;">Povidone-Iodine Solution</td>
			<td style="width:128px;">Aplicare</td>
			<td style="width:103px;">82-227K</td>
			<td style="width:87px;"></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:199px;">Alcohol Swabs</td>
			<td style="width:128px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:87px;"></td>
		</tr>
		<tr height="68">
			<td height="68" style="height:68px;width:199px;">200 proof Ethanol</td>
			<td style="width:128px;">Decon labs</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:87px;">diluted to 70% with deionized water</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:199px;">cotton tipped applicators</td>
			<td style="width:128px;">Puritan</td>
			<td style="width:103px;">836-WC</td>
			<td style="width:87px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:199px;">Teflon coated electrodes-Monopolar needle electrode</td>
			<td style="width:128px;">Chalgren Enterprises</td>
			<td style="width:103px;">111-725-24TP</td>
			<td style="width:87px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:199px;">servomotor</td>
			<td style="width:128px;">Cambridge Technology</td>
			<td style="width:103px;">Model 6650LR</td>
			<td style="width:87px;"></td>
		</tr>
		<tr height="51">
			<td height="51" style="height:51px;width:199px;">Dual Mode Lever System</td>
			<td style="width:128px;">Aurora Scientific Inc</td>
			<td style="width:103px;">Model 305C-LR-FP</td>
			<td style="width:87px;">contact manufacturer to order</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:199px;">Signal Interface</td>
			<td style="width:128px;">Aurora Scientific Inc</td>
			<td style="width:103px;">Model 604A</td>
			<td style="width:87px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:199px;">High-Power, Bi-Phase Stimulator</td>
			<td style="width:128px;">Aurora Scientific Inc</td>
			<td style="width:103px;">Model 701C</td>
			<td style="width:87px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:199px;">Data analysis software</td>
			<td style="width:128px;">Aurora Scientific Inc</td>
			<td style="width:103px;">DMAv5.110 software</td>
			<td style="width:87px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:199px;">Muscle lever system control software</td>
			<td style="width:128px;">Aurora Scientific Inc</td>
			<td style="width:103px;">DMCv5.400 software</td>
			<td style="width:87px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

applications of in vivo functional testing of the rat tibialis anterior for evaluating tissue engineered skeletal muscle repair

Trotz der Regenerationsfähigkeit der Skelettmuskulatur, dauerhafte funktionelle und / oder kosmetische Defizite (zB Volumen Muskelschwund (VML) , die aus einer traumatischen Verletzung, Krankheit und verschiedene angeborene, genetische und erworbene Bedingungen sind durchaus üblich. Tissue Engineering und der regenerativen Medizin Technologien haben ein enormes Potential einer therapeutischen Lösung. jedoch Verwendung von biologisch relevanten Tiermodellen in Verbindung mit Längsabschätzungen von relevanten funktionalen Maßnahmen sind entscheidend für die Entwicklung verbesserter regenerative Therapeutika zur Behandlung von VML-ähnlichen Verletzungen. in dieser Hinsicht, ein Handelsmuskelhebelsystem zu messen Länge, Spannung, Kraft und Geschwindigkeit Parameter in der Skelettmuskulatur verwendet werden. Wir haben in Verbindung mit einer hohen Leistung, Bi-Phasen - Stimulator, dieses System, in vivo Kraftproduktion in Reaktion auf die Aktivierung des vorderen cruris Raum zu messen von die Ratte hindlimb. Wir haben PREVIlaufend dieses Gerät verwendet, um die funktionellen Auswirkungen von VML Verletzung an der tibialis anterior (TA) Muskel, sowie das Ausmaß der funktionellen Erholung nach der Behandlung des verletzten TA Muskel mit unseren Tissue Engineering Muskelreparatur (TEMR) Technologie zu beurteilen. Für solche Studien ist der linke Fuß einer anästhesierten Ratte sicher an einer Fußplatte mit einem Servomotor verbunden verankert ist, und der gemeinsame peroneal Nerv durch zwei perkutanen Nadelelektroden stimuliert Muskelkontraktion und Dorsalflexion des Fußes hervorzurufen. Die peroneal Nervenstimulation induzierte Muskelkontraktion wird über einen Bereich von Stimulationsfrequenzen (1-200 Hz) gemessen, eine eventuelle Plateau in Kraft Produktion zu gewährleisten, die für eine genaue Bestimmung der Spitzen tetanischer Kraft ermöglicht. Zusätzlich zur Bewertung des Ausmaßes der Schädigung VML sowie dem Grad der funktionellen Wiederherstellung nach der Behandlung kann diese Methodik leicht zu untersuchen diverse Aspekte der Muskelphysiologie und Pathophysiologie angewendet werden. Ein solcher Ansatz shomit der rationelleren Entwicklung verbesserter Therapeutika für Muskel-Reparatur und Regeneration ULD unterstützen.

Die tetanische Kurve kann verwendet werden, um optimale Ergebnisse aus suboptimalen Ergebnissen unterscheiden. Diese Kurve beginnt normalerweise bei einer Frequenz von 60 Hz zu bilden. Der Schlüsselfaktor, gute Ergebnisse zu erhalten, ist die Fähigkeit, die Muskeln zu stimulieren, so dass sie ihre maximale Kraft erzeugt und unterhält diese Kraft bei Tetanus. Die ideale Kurve sollte eine ununterbrochene, scharf, vertikale Aufschwung zum Zeitpunkt der Stimulation durch eine flache Plateauphase mit minimalen Schwingungen gefolgt, und eine ununterbrochene scharfe vertikale Verringerungsperiode bei Beendigung der Stimulation (Abbildung 4). Abweichungen von der Idealkurve sind Hinweise darauf , dass der Muskel (5D) oder dass der Muskel maximale Kraft (5B - C) zu erzeugen , wird nicht richtig stimuliert müde wird. Letzteres führt in der Regel durch falsche Platzierung der Elektroden bis zum Versagen der maximalen Rekrutierung von Muskelfasern während stimula führendention. Ein Unterscheidungsmerkmal, das die Forscher ermöglicht es zu bestimmen, ob eine nicht ideale Kurve das Ergebnis einer falschen Platzierung der Elektroden oder pathologische Veränderungen ist der Muskel ist, ob die tetanische Kurve abgeschlossen ist (fusioniert) oder unvollständig (nicht fusionierte). Einen nichtkondensierten, unvollständige tetanische Kurve zeigt, dass die Elektroden verlegt werden, wodurch der Muskel nicht eine maximale Kontraktion erfährt. Ein Beispiel für eine pathologische Veränderung kann in den Muskel beobachtet werden, als maximale Kontraktion im Vergleich zur Kontrolle verringert oder eine kontraktile Antwort, die schneller ermüdet. Die drei verschiedenen Arten von Spitzen im Laufe dieses Verfahrens erhalten repräsentieren unterschiedliche Elektrode und Beinpositionen und ist in Abbildung 3 zu sehen. Die ersten Gipfel rund um 0,4 N sein und auftreten , wenn die korrekte Platzierung der Elektroden oberflächlich auf der Haut (Abbildung bestimmt wird 3A). Der zweite Satz von Spitzen aufweist höhere Amplitude, normalerweise um 0.5-0.6N (3B) und treten auf, wenn die Elektroden durch die Dermis durchdringen. Nachdem diese erhalten werden, werden das Bein und Fuß eingestellt Kraft Produktion zu maximieren, die , wenn die Spitzenamplitude erhöht sich auf etwa 1 N oder höher (3C) erreicht. An diesem Punkt kann Instant-Stim ausgeschaltet werden und die Sequenz beginnen kann. Diese Richtlinien gewährleisten genaue und reproduzierbare Ergebnisse und sind Schlüsselkontrollen im gesamten Protokoll. Die endgültigen Ergebnisse können auf verschiedene Weise dargestellt werden, auf den Informationen abhängig, die der Benutzer von der Krafttest und dem experimentellen Design extrahiert. In diesem Protokoll wird die maximale Kraft über alle Frequenzen der Stimulation gemessen werden, können jedoch auch andere Datenpunkte für einen bestimmten Mitarbeiter oder der Anwendung wichtig sein. Ein Beispiel ist die Frequenz der Stimulation, bei der die tetanische Kurvenform zu nehmen beginnt. Ter Daten können zu anderen Ergebnissen verglichen werden, aus einer früheren oder späteren Versuch erhalten auf dem gleichen Tier oder für Vergleiche zwischen den verschiedenen Behandlungsgruppen. Force-Produktion kann durch Körpermasse normalisiert werden isometrischen Kraft zu berechnen und eine unvoreingenommene Beurteilung der Auswirkungen des Alters auf die maximale Kontraktion beobachtet liefern. Obwohl Tiere unterschiedlicher Körpergewicht und Alter werden verschiedene Maximalkräfte erzeugen, sollte die Form der tetanische Kurve zwischen allen Gruppen konsistent sein, wenn das Verfahren korrekt durchgeführt wird. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/54487/54487fig1.jpg" /> Abbildung 1: Übersicht über die Hebelsystemsteuerung und Datenanalyse - Software zur Analyse (A) Überblick über die Steuerungssoftware , wenn das Programm öffnen.. (B) Parameter für &quot;Instant Stim.&quot; (C) Beispielsequenz für die Kraftfrequenzstimulation. (D </strong&gt;) Repräsentative Daten von einer hohen Kraftfrequenzanalyse Durchsatz in der Analysesoftware. Es sollte angemerkt werden , dass die Beispielsequenz und Datenanalyseverfahren zu diesem Protokoll spezifisch ist , und nicht das gesamte Spektrum der Sequenzen und Ausgänge darstellt, die von dieser Software zur Verfügung gestellt werden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54487/54487fig1large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54487/54487fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/54487/54487fig2.jpg" /> Abbildung 2: Kritische Aspekte für die Positionierung der Ratte und Platzierung des Fußes in der Vorrichtung (A) Die Ratte ist in Rückenlage mit dem linken Fuß sicher an der Fußplatte befestigt.. Die rechten Winkel durch den Fuß, Bein und Oberschenkel gemacht sind eingekreist. (B) Die rechte Winkel , der durch den Knöchel angelegt wird markiert. (C) Das Bein sollte<html> in einer geraden Ebene vom Fuß bis zum Körper ausgerichtet werden. (D) Die Platzierung der Elektroden ist parallel und senkrecht zur Ebene des peroneus. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54487/54487fig2large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54487/54487fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/54487/54487fig3.jpg" /> Abbildung 3: Repräsentative Peaks Aufzeigen der Bedeutung der richtigen Elektrodenplatzierung auf maximale Kraftproduktion (A) Ausgangsspitzen tetanischer Reaktionen beobachtet , die mit Elektroden zu oberflächlich platziert.. (B) Größere Spitzen mit Elektroden an der richtigen Stelle eingesetzt wird . (C) Der Übergang von der größeren Spitzen signalisiert korrekte Platzierung der Elektroden , um eine optimale Präsequenz Spitzenamplitude als die Beine und Füße Positionen sind optimal eingestellt./ftp_upload/54487/54487fig3large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/54487/54487fig4.jpg" /> Abbildung 4:. Optimale Tetanische Kurve bei 100 Hz Diese Kurve steigt und sinkt stark und hat eine flache Plateauphase. Dieses Beispiel zeigt die korrekte Platzierung der Elektroden und die maximale Kraft Stimulation. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54487/54487fig4large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54487/54487fig4large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/54487/54487fig5.jpg" /> Abbildung 5:. Repräsentative Beispiele für Suboptimale Tetanische Kurven erhalten bei 100 Hz (A) Nach Entspannung, diese Kurve taucht unter der Grundlinie. Dies ist bezeichnend für Stimulationsvon Antagonisten. (B - D) Diese Diagramme sind das Ergebnis einer falschen Platzierung der Elektroden und ungleiche Rekrutierung von Muskelfasern. Die Plateauphasen zeigen große Schwingungen (B), eine Steigung (C) oder eine Neigung nach unten (D). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54487/54487fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54487/54487fig4large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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Applications of In Vivo Functional Testing of the Rat Tibialis Anterior for Evaluating Tissue Engineered Skeletal Muscle Repair

We describe an in vivo protocol to measure dorsiflexion of the foot following stimulation of the peroneal nerve and contraction of the anterior crural compartment of the rat hindlimb. Such measurements are an indispensable translational tool for evaluating skeletal muscle pathology and tissue engineering approaches to muscle repair and regeneration.

Anwendungen<em&gt; In Vivo</em&gt; Funktionstest der Ratte Vorderer Schienbeingewebe Skeletal Muscle Repair Engineered für die Bewertung

Despite the regenerative capacity of skeletal muscle, permanent functional and/or cosmetic deficits (e.g., volumetric muscle loss (VML) resulting from ...

applications-vivo-functional-testing-rat-tibialis-anterior-for

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Applications of In Vivo Functional Testing of the Rat Tibialis Anterior for Evaluating Tissue Engineered Skeletal Muscle Repair

13.7K Aufrufe.  University of Virginia. We describe an in vivo protocol to measure dorsiflexion of the foot following stimulation of the peroneal nerve and contraction of the anterior crural compartment of the rat hindlimb. Such measurements are an indispensable translational tool for evaluating skeletal muscle pathology and tissue engineering approaches to muscle repair and regeneration. 

Serie: Applications of In Vivo Functional Testing of the Rat Tibialis Anterior for Evaluating Tissue Engineered Skeletal Muscle Repair

Engineering Skeletal Muscle Tissues from Murine Myoblast Progenitor Cells and Application of Electrical Stimulation

Engineered muscle tissues can be used for several different purposes, which include the production of tissues for use as a disease model in vitro, e.g. to study pressure ulcers, for regenerative medicine and as a meat alternative 1. The first reported 3D muscle constructs have been made many years ago and pioneers in the field are Vandenburgh and colleagues 2,3. Advances made in muscle tissue engineering are not only the result from the vast gain in knowledge of biochemical factors, stem cells and progenitor cells, but are in particular based on insights gained by researchers that physical factors play essential roles in the control of cell behavior and tissue development. State-of-the-art engineered muscle constructs currently consist of cell-populated hydrogel constructs. In our lab these generally consist of murine myoblast progenitor cells, isolated from murine hind limb muscles or a murine myoblast cell line C2C12, mixed with a mixture of collagen/Matrigel and plated between two anchoring points, mimicking the muscle ligaments. Other cells may be considered as well, e.g. alternative cell lines such as L6 rat myoblasts 4, neonatal muscle derived progenitor cells 5, cells derived from adult muscle tissues from other species such as human 6 or even induced pluripotent stem cells (iPS cells) 7. Cell contractility causes alignment of the cells along the long axis of the construct 8,9 and differentiation of the muscle progenitor cells after approximately one week of culture. Moreover, the application of electrical stimulation can enhance the process of differentiation to some extent 8. Because of its limited size (8 x 2 x 0.5 mm) the complete tissue can be analyzed using confocal microscopy to monitor e.g. viability, differentiation and cell alignment. Depending on the specific application the requirements for the engineered muscle tissue will vary; e.g. use for regenerative medicine requires the up scaling of tissue size and vascularization, while to serve as a meat alternative translation to other species is necessary.

Engineered muscle tissue has great potential in regenerative medicine, as disease model and also as an alternative source for meat. Here we describe the engineering of a muscle construct, in this case from mouse myoblast progenitor cells, and the stimulation by electrical pulses.

Engineering Skeletal Muscle Gewebe von Murine Myoblast Progenitor Cells und Anwendung von Elektrostimulation

Engineered muscle tissues can be used for several different purposes, which include the production of tissues for use as a disease model in vitro, e.g. to ...

Forschung

Biotechnik

Determination of the Transport Rate of Xenobiotics and Nanomaterials Across the Placenta using the ex vivo Human Placental Perfusion Model

Decades ago the human placenta was thought to be an impenetrable barrier between mother and unborn child. However, the discovery of thalidomide-induced birth defects and many later studies afterwards proved the opposite. Today several harmful xenobiotics like nicotine, heroin, methadone or drugs as well as environmental pollutants were described to overcome this barrier. With the growing use of nanotechnology, the placenta is likely to come into contact with novel nanoparticles either accidentally through exposure or intentionally in the case of potential nanomedical applications. Data from animal experiments cannot be extrapolated to humans because the placenta is the most species-specific mammalian organ 1. Therefore, the ex vivo dual recirculating human placental perfusion, developed by Panigel et al. in 1967 2 and continuously modified by Schneider et al. in 1972 3, can serve as an excellent model to study the transfer of xenobiotics or particles.
Here, we focus on the ex vivo dual recirculating human placental perfusion protocol and its further development to acquire reproducible results.
The placentae were obtained after informed consent of the mothers from uncomplicated term pregnancies undergoing caesarean delivery. The fetal and maternal vessels of an intact cotyledon were cannulated and perfused at least for five hours. As a model particle fluorescently labelled polystyrene particles with sizes of 80 and 500 nm in diameter were added to the maternal circuit. The 80 nm particles were able to cross the placental barrier and provide a perfect example for a substance which is transferred across the placenta to the fetus while the 500 nm particles were retained in the placental tissue or maternal circuit. The ex vivo human placental perfusion model is one of few models providing reliable information about the transport behavior of xenobiotics at an important tissue barrier which delivers predictive and clinical relevant data.

Determination of the Transport Rate of Xenobiotics and Nanomaterials Across the Placenta using the ex vivo Human Placental Perfusion Model

The ex vivo dual recirculating human placental perfusion model can be used to investigate the transfer of xenobiotics and nanoparticles across the human placenta. In this video protocol we describe the equipment and techniques required for a successful execution of a placenta perfusion.

Bestimmung der Transport von Xenobiotika und Nanomaterialien über die Plazenta mit dem<em&gt; Ex vivo</em&gt; Menschliche Plazentaperfusion Modell

Decades ago the human placenta was thought to be an impenetrable barrier between mother and unborn child. However, the discovery of thalidomide-induced ...

Surgical Retrieval, Isolation and In vitro Expansion of Human Anterior Cruciate Ligament-derived Cells for Tissue Engineering Applications

Injury to the ACL is a commonly encountered problem in active individuals. Even partial tears of this intra-articular knee ligament lead to biomechanical deficiencies that impair function and stability. Current options for the treatment of partial ACL tears range from nonoperative, conservative management to multiple surgical options, such as: thermal modification, single-bundle repair, complete reconstruction, and reconstruction of the damaged portion of the native ligament. Few studies, if any, have demonstrated any single method for management to be consistently superior, and in many cases patients continue to demonstrate persistent instability and other comorbidities.
The goal of this study is to identify a potential cell source for utilization in the development of a tissue engineered patch that could be implemented in the repair of a partially torn ACL. A novel protocol was developed for the expansion of cells derived from patients undergoing ACL reconstruction. To isolate the cells, minced hACL tissue obtained during ACL reconstruction was digested in a Collagenase solution. Expansion was performed using DMEM/F12 medium supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS) and 1% penicillin/streptomycin (P/S). The cells were then stored at -80 &#186;C or in liquid nitrogen in a freezing medium consisting of DMSO, FBS and the expansion medium. After thawing, the hACL derived cells were then seeded onto a tissue engineered scaffold, PLAGA (Poly lactic-co-glycolic acid) and control Tissue culture polystyrene (TCPS). After 7 days, SEM was performed to compare cellular adhesion to the PLAGA versus the control TCPS. Cellular morphology was evaluated using immunofluorescence staining. SEM (Scanning Electron Microscope) micrographs demonstrated that cells grew and adhered on both PLAGA and TCPS surfaces and were confluent over the entire surfaces by day 7. Immunofluorescence staining showed normal, non-stressed morphological patterns on both surfaces. This technique is promising for applications in ACL regeneration and reconstruction.

Surgical Retrieval, Isolation and In vitro Expansion of Human Anterior Cruciate Ligament-derived Cells for Tissue Engineering Applications

For future applications as a patch to repair partial tears of the Anterior Cruciate Ligament (ACL), human ACL derived cells were isolated from tissue obtained during reconstructive procedures, expanded in vitro and grown on tissue engineered scaffolds. Cellular adhesion and morphology was then performed to confirm biocompatibility on scaffold surface.

Chirurgische Retrieval, Isolierung und<em&gt; In-vitro-</em&gt; Erweiterung des menschlichen vorderen Kreuzbandes abgeleiteten Zellen für Tissue Engineering Anwendungen

Injury to the ACL is a commonly encountered problem in active individuals. Even partial tears of this intra-articular knee ligament lead to biomechanical ...

Surgical Technique for the Implantation of Tissue Engineered Vascular Grafts and Subsequent In Vivo Monitoring

The development of Tissue Engineered Vessels (TEVs) is advanced by the ability to routinely and effectively implant TEVs (4-5 mm in diameter) into a large animal model. A step by-step protocol for inter-positional placement of the TEV and real-time digital assessment of the TEV and native carotid arteries is described here. In vivo monitoring is made possible by the implantation of flow probes, catheters and ultrasonic crystals (capable of recording dynamic diameter changes of implanted TEVs and native carotid arteries) at the time of surgery. Once implanted, researchers can calculate arterial blood flow patterns, invasive blood pressure and artery diameter yielding parameters such as pulse wave velocity, augmentation index, pulse pressures and compliance. Data acquisition is accomplished using a single computer program for analysis throughout the duration of the experiment. Such invaluable data provides insight into TEV matrix remodeling, its resemblance to native/sham controls and overall TEV performance in vivo.

Surgical Technique for the Implantation of Tissue Engineered Vascular Grafts and Subsequent In Vivo Monitoring

A step-by-step protocol for the inter-positional placement of Tissue Engineered Vessels (TEVs) into the carotid artery of a sheep using end-to-end anastomosis and real-time digital assessment in vivo until animal sacrifice.

Operationstechnik zur Implantation von Tissue Engineered Gefäßprothesen und Folge<em&gt; In-vivo-</em&gt; Überwachung

The development of Tissue Engineered Vessels (TEVs) is advanced by the ability to routinely and effectively implant TEVs (4-5 mm in diameter) into a large ...

Athymic Rat Model for Evaluation of Engineered Anterior Cruciate Ligament Grafts

Anterior cruciate ligament (ACL) rupture is a common ligamentous injury that often requires surgery because the ACL does not heal well without intervention. Current treatment strategies include ligament reconstruction with either autograft or allograft, which each have their associated limitations. Thus, there is interest in designing a tissue-engineered graft for use in ACL reconstruction. We describe the fabrication of an electrospun polymer graft for use in ACL tissue engineering. This polycaprolactone graft is biocompatible, biodegradable, porous, and is comprised of aligned fibers. Because an animal model is necessary to evaluate such a graft, this paper describes an intra-articular athymic rat model of ACL reconstruction that can be used to evaluate engineered grafts, including those seeded with xenogeneic cells. Representative histology and biomechanical testing results at 16 weeks postoperatively are presented, with grafts tested immediately post-implantation and contralateral native ACLs serving as controls. The present study provides a reproducible animal model with which to evaluate tissue engineered ACL grafts, and demonstrates the potential of a regenerative medicine approach to treatment of ACL rupture.

Animal models are important tools for the evaluation of tissue-engineered grafts. This paper presents the protocol for preparing an electrospun biodegradable polymer graft for use in anterior cruciate ligament tissue engineering, as well as a surgical protocol for implantation in a rat model.

Athymischen Rattenmodell für die Bewertung von Engineered vorderen Kreuzbandes Grafts

Anterior cruciate ligament (ACL) rupture is a common ligamentous injury that often requires surgery because the ACL does not heal well without ...

Engineered Vascularized Muscle Flap

One of the main factors limiting the thickness of a tissue construct and its consequential viability and applicability in vivo, is the control of oxygen supply to the cell microenvironment, as passive diffusion is limited to a very thin layer. Although various materials have been described to restore the integrity of full-thickness defects of the abdominal wall, no material has yet proved to be optimal, due to low graft vascularization, tissue rejection, infection, or inadequate mechanical properties. This protocol describes a means of engineering a fully vascularized flap, with a thickness relevant for muscle tissue reconstruction. Cell-embedded poly L-lactic acid/poly lactic-co-glycolic acid constructs are implanted around the mouse femoral artery and vein and maintained in vivo for a period of one or two weeks. The vascularized graft is then transferred as a flap towards a full thickness defect made in the abdomen. This technique replaces the need for autologous tissue sacrifications and may enable the use of in vitro engineered vascularized flaps in many surgical applications.

To date, thick tissue defects are typically reconstructed by applying autologous tissue flaps or engineered tissues. In this protocol, we present a new method for engineering vascularized tissue flap bearing an autologous pedicle, to serve as a substitute to autologous flaps.

Engineered Vaskularisierte Muskellappen

One of the main factors limiting the thickness of a tissue construct and its consequential viability and applicability in vivo, is the control of oxygen ...

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional Poly(&#949;-caprolactone) Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

This tutorial reflects on the fundamental principles and guidelines for electrospinning writing with polymer melts, an additive manufacturing technology with great potential for biomedical applications. The technique facilitates the direct deposition of biocompatible polymer fibers to fabricate well-ordered scaffolds in the sub-micron to micro scale range. The establishment of a stable, viscoelastic, polymer jet between a spinneret and a collector is achieved using an applied voltage and can be direct-written. A significant benefit of a typical porous scaffold is a high surface-to-volume ratio which provides increased effective adhesion sites for cell attachment and growth. Controlling the printing process by fine-tuning the system parameters enables high reproducibility in the quality of the printed scaffolds. It also provides a flexible manufacturing platform for users to tailor the morphological structures of the scaffolds to their specific requirements. For this purpose, we present a protocol to obtain different fiber diameters using melt electrospinning writing (MEW) with a guided amendment of the parameters, including flow rate, voltage and collection speed. Furthermore, we demonstrate how to optimize the jet, discuss often experienced technical challenges, explain troubleshooting techniques and showcase a wide range of printable scaffold architectures.

This protocol serves as a comprehensive guideline to fabricate scaffolds via electrospinning with polymer melts in a direct writing mode. We systematically outline the process and define the appropriate parameter settings for achieving targeted scaffold architectures.

Elektrospinnen Schreiben von dreidimensionalen Poly(ε-caprolactone) Gerüste mit steuerbaren Morphologien für Tissue Engineering Anwendungen zu schmelzen

This tutorial reflects on the fundamental principles and guidelines for electrospinning writing with polymer melts, an additive manufacturing technology ...

A Novel Tenorrhaphy Suture Technique with Tissue Engineered Collagen Graft to Repair Large Tendon Defects

Surgical management of large tendon defects with tendon grafts is challenging, as there are a finite number of sites where donors can be readily identified and used. Currently, this gap is filled with tendon auto-, allo-, xeno-, or artificial grafts, but clinical methods to secure them are not necessarily translatable to animals because of the scale. In order to evaluate new biomaterials or study a tendon graft made up of collagen type 1, we have developed a modified suture technique to help maintain the engineered tendon in alignment with the tendon ends. Mechanical properties of these grafts are inferior to the native tendon. To incorporate engineered tendon into clinically relevant models of loaded repair, a strategy was adopted to offload the tissue engineered tendon graft and allow for the maturation and integration of the engineered tendon in vivo until a mechanically sound neo-tendon was formed. We describe this technique using incorporation of the collagen type 1 tissue engineered tendon construct.

In this paper, we present an in vitro and in situ protocol to repair a tendon gap of up to 1.5 cm by filling it with engineered collagen graft. This was performed by developing a modified suture technique to take the mechanical load until the graft matures into the host tissue.

Eine neuartige Tenorrhaphy-Nahttechnik mit tissue engineered Collagen Graft zur Reparatur großer Sehnendefekte

Surgical management of large tendon defects with tendon grafts is challenging, as there are a finite number of sites where donors can be readily ...

Rodent Behavioral Testing to Assess Functional Deficits Caused by Microelectrode Implantation in the Rat Motor Cortex

Medical devices implanted in the brain hold tremendous potential. As part of a Brain Machine Interface (BMI) system, intracortical microelectrodes demonstrate the ability to record action potentials from individual or small groups of neurons. Such recorded signals have successfully been used to allow patients to interface with or control&#160;computers, robotic limbs, and their own limbs. However, previous animal studies have shown that a microelectrode implantation in the brain not only damages the surrounding tissue but can also result in functional deficits. Here, we discuss a series of behavioral tests to quantify potential motor impairments following the implantation of intracortical microelectrodes into the motor cortex of a rat. The methods for open field grid, ladder crossing, and grip strength testing provide valuable information regarding the potential complications resulting from a microelectrode implantation. The results of the behavioral testing are correlated with endpoint histology, providing additional information on the pathological outcomes and impacts of this procedure on the adjacent tissue.

We have shown that a microelectrode implantation in the motor cortex of rats causes immediate and lasting motor deficits. The methods proposed herein outline a microelectrode implantation surgery and three rodent behavioral tasks to elucidate potential changes in the fine or gross motor function due to implantation-caused damage to the motor cortex.

Nagetier Verhaltens Tests, um funktionelle Defizite verursacht durch Mikroelektrode Implantation im motorischen Kortex Ratte bewerten

Medical devices implanted in the brain hold tremendous potential. As part of a Brain Machine Interface (BMI) system, intracortical microelectrodes ...

Tissue-Engineered Graft for Circumferential Esophageal Reconstruction in Rats

The use of biocompatible materials for circumferential esophageal reconstruction is a technically challenging task in rats and requires an optimal implant technique with nutritional support. Recently, there have been many attempts at esophageal tissue engineering, but the success rate has been limited due to difficulty in early epithelization in the special environment of peristalsis. Here, we developed an artificial esophagus that can improve the regeneration of the esophageal mucosa and muscle layers through a two-layered tubular scaffold, a mesenchymal stem cell-based bioreactor system, and a bypass feeding technique with modified gastrostomy. The scaffold is made of polyurethane (PU) nanofibers in a cylindrical shape with a three-dimensional (3D) printed polycaprolactone strand wrapped around the outer wall. Prior to transplantation, human-derived mesenchymal stem cells were seeded into the lumen of the scaffold, and bioreactor cultivation was performed to enhance cellular reactivity. We improved the graft survival rate by applying surgical anastomosis and covering the implanted prosthesis with a thyroid gland flap, followed by temporary nonoral gastrostomy feeding. These grafts were able to recapitulate the findings of initial epithelialization and muscle regeneration around the implanted sites, as demonstrated by histological analysis. In addition, increased elastin fibers and neovascularization were observed in the periphery of the graft. Therefore, this model presents a potential new technique for circumferential esophageal reconstruction.

Esophageal reconstruction is a challenging procedure, and development of a tissue-engineered esophagus that enables regeneration of esophageal mucosa and muscle and that can be implanted as an artificial graft is necessary. Here, we present our protocol to generate an artificial esophagus, including scaffold manufacturing, bioreactor cultivation, and various surgical techniques.

The use of biocompatible materials for circumferential esophageal reconstruction is a technically challenging task in rats and requires an optimal implant ...