We are grateful to the technical support from Ms. Hong Xian Hsing, Mr. Min Jeng Li, and Mr. Eric C. P. Wu. We express our appreciation to Miranda Loney for English editing.

1. Fixation and Embedding <ol><li> Vorbereitung der Reagenzien <ol><li> 10x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) <ol><li> Hinzufügen , 80 g NaCl, 2 g KCl, 14,4 g Na 2 HPO 4 und 2,4 g KH 2 PO 4 in 800 ml doppelt destilliertem Wasser (ddH 2 O) und Einstellen des pH auf 7,4 mit HCl. In ddH 2 O auf ein Gesamtvolumen von 1 l, fügen Sie dann 1000 ul Diethylpyrocarbonat (DEPC) und kräftig schütteln. Store PBS über Nacht bei Raumtemperatur und Autoklaven bei 121 ° C für 20 min am folgenden Tag. </li></ol></li><li> 1x PBS <ol><li> Verdünne das Lager 10x PBS bei Verhältnis 1:10 in ddH 2 O zu einer Endkonzentration von 0,01 M Na 2 HPO 4, 0,002 M KH 2 PO 4, 0,003 M KCl und 0,13 M NaCl zu erhalten. </li></ol></li><li> Paraformaldehyd (PFA) Fixiermittel Achtung: Paraformaldehyd ist giftig. Bereiten Sie es unter einer Abzugshaube. Trag Handschuhe. <ol><li> Zur Herstellung von 250 ml PFA Fixativ, Wärme 100ml 1x PBS auf 70 bis 80 ° C und 1.750 &amp; mgr; l NaOH hinzu. Dann wurden 10 g Paraformaldehyd hinzufügen und gründlich mischen, bis es gelöst. Legen Sie die Lösung auf Eis und dann der pH - Wert auf 7,2 mit H 2 SO 4 (260-270 &amp; mgr; l für 100 ml) nach dem Abkühlen. </li><li> Stellen Sie das Volumen auf 250 ml mit 1 x PBS, fügen 625 ul Glutaraldehyd bis zu einer Endkonzentration von 0,25%. Nach Eintragen von 250 &amp; mgr; l Triton X-100 und 250 &amp; mgr; l Tween 20 die Infiltration der Fixierungsmittel zu erleichtern. HINWEIS: Die PFA Fixativ kann, ohne seine Fixierung Fähigkeit für einen Monat bei 4 ° C gelagert werden. </li></ol></li><li> Bereiten verschiedene Konzentrationen von Ethanol (30%, 50%, 70%, 85% und 95%) mit DEPC-behandeltem Wasser. </li></ol></li><li> Pflanzenprobensammlung <ol><li> Achselknospen <ol><li> Verwenden Sie reifen Phalaenopsis - Orchideen Pflanzen im Vier-Blatt - Stadium. Entfernen Sie vorsichtig Blätter durch die Blatt reißen nach dem midrib mit den Händen. </li><li> Mit einem scharfen Skalpell Töully Achselknospen aus der Basis des dritten und vierten Blattes auf der monopodial Schaft entfernen. </li></ol></li><li> Seed Probe <ol><li> Ernte reifen Orchidee Samenkapseln nach 4 Monaten nach der Bestäubung. Schneiden Sie Samenhülsen in Längsrichtung mit einem Skalpell. Schütteln Sie die Öffnung Samenschote vorsichtig und lassen Sie die trockenen Samen auf Filterpapier. </li></ol></li><li> Protocorm <ol><li> in einem Gewebekulturraum in einem 12 Stunden Lichtperiode und konstante Temperatur von 25 ° C Sow reifen Orchidee Samen auf einem 1 / 2x Murashige und Skoog-Agar-Platte, und zu wachsen. Beispiel grün Protocorm bei 7 Wochen nach der Aussaat. </li></ol></li><li> Protocorm artigen Körpern (PLB) <ol><li> Wachsen Orchidee PLBs auf T2 Regenerieren Agarplatten wie zuvor 10 und unter den gleichen Wachstumsbedingungen wie bei dem Schritt 1.2.3.1 beschrieben. Sammelt 10 PLBs in einer Höhe von 5 bis 8 mm. </li></ol></li><li> Blattprobe <ol><li> Sammeln Blattgewebe von einer reifen Orchidee Pflanze Phalaenopsis wie in Schritt1.2.1.1. </li><li> Mit einem scharfen Skalpell ein kleines Stück Blattgewebe zu schneiden (7 mm Länge x 5 mm Breite) von der zweiten neu entwickelten Blatt. </li></ol></li><li> Root-Probe <ol><li> Unter Verwendung der gleichen Anlage in der 1.2.1.1 Schritt beschrieben, sezieren 1 cm Länge von Gewebewurzelspitze ein scharfes Skalpell. </li></ol></li><li> Junge Spike <ol><li> Mit einem scharfen Skalpell junge Spike Gewebe aus dem Spitzenteil der Blütenstiel 10 cm in der Länge zu schneiden. </li></ol></li><li> Blütenknospe <ol><li> Excise eine kleine Blütenknospe von 5 mm im Durchmesser von Orchideenblütenstiel. Schneiden Sie ein Teil der Blütenknospe Gewebe in Längsrichtung (3 mm Dicke). </li></ol></li><li> Blattgewebe und Ährchen Gewebe von Getreide <ol><li> Cut 1 cm Länge Blattspreite Gewebe aus den ersten neu entwickelten Blätter von Reis, Weizen und Maispflanzen. </li><li> Sammle 10 Ährchen aus Pflanzen (Reis, Weizen und Mais) einen Tag vor der Blüte. </li></ol></li></ol></li><li> Fixierung<ol><li> Fix Pflanzenproben sofort, indem sie in einem Glasszintillationsröhrchen mit 15 ml eiskaltem PFA Fixativ zu übertragen. </li><li> Wenden Sie ein Vakuum (~ 720 mm Hg), um Pflanzenproben in einem 4 ° C kühlen Raum. Halten Sie das Vakuum für 15 bis 20 min (kleine Bläschen sollten aus den Proben freigesetzt werden). Wiederholen Sie diesen Schritt, bis die meisten der Gewebe nach der Freigabe des Vakuums zu versenken. Halten Sie das Vakuum über Nacht und lassen Sie die Vakuum langsam am nächsten Tag. </li></ol></li><li> Entwässerung HINWEIS: Verwenden Sie die gleiche Fläschchen aus der Fixierung durch die Infiltration Schritte. Gießen oder eine Pipette, um die Lösung in dem vorherigen Schritt abfließen und mit 15 ml neue Lösung in die Phiole zu ersetzen. Je nach Beschaffenheit des Gewebes, zu behandeln härtere Gewebe wie Orchidee Achselknospe, Samen, Protocorm und PLB und die Ährchen von Reis, Weizen und Mais für eine längere Zeit; Behandlung weicher Gewebe wie Orchideenblütenknospe, jung Spitze, Blatt und Wurzel, und das Blatt von Reis, Weizen und Mais für eine kürzere Zeit. <ol&gt; <li> Nach der Fixierung tauchen für 10 Minuten auf Eis, um die Probe in 15 ml 1x PBS. <ol><li> Dehydratisieren Proben in 15 ml Ethanolreihe bei Raumtemperatur wie folgt: 30% Ethanol für 30 min, 50% Ethanol für 30 min, 70% Ethanol für 1 h, 85% Ethanol für 54 min für härtere Gewebe und 30 min für weichere Gewebe, 95% Ethanol für 54 min für härtere Gewebe und 30 min für weichere Gewebe, und 100% Ethanol zweimal für 54 min für härtere Gewebe und 30 min für weichere Gewebe. HINWEIS: Pflanzenproben in 70% Ethanol bei 4 ° C mehrere Monate gelagert werden. </li></ol></li></ol></li><li> Paraffin Infiltration <ol><li> Infiltrieren Proben mit 15 ml Ethanol und Xylolersatz Gemisch 54 min jeweils für härtere Gewebe und 30 min für weichere Gewebe, bei Raumtemperatur wie folgt: Ethanol / Xylolersatz (2: 1, v / v), Ethanol / Xylolersatz (1 : 1, v / v), Ethanol / Xylol-Ersatz (1: 2, v / v) und reines zweimal Xylolersatz. Achtung: Xylol ist giftig. Führen Sie diesen Schritt in Abzug durchführen. </li&gt; <li> Infiltrieren Probe in dem Fläschchen mit 15 ml Xylolersatz und Paraffingemisch in einem Ofen bei 60 ° C, über Nacht für härtere Gewebe und für 60 min für weichere Gewebe, wie folgt: Xylolersatz / Paraffin (2: 1, v / v), Xylolersatz / Paraffin (1: 1, v / v), und Xylolersatz / Paraffin (1: 2, v / v). </li><li> Infiltrieren Probe mit 15 ml reinem Paraffin zweimal täglich und Inkubation in einem Ofen bei 60 ° C. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 1.5.3 am nächsten Tag. </li></ol></li><li> Gewebeeinbettung <ol><li> Schalten Sie die Kraft des Gewebeeinzentrum 1 Stunde im Voraus das Wachs in dem Paraffinbehälter zu schmelzen, bevor Gewebe in einem Paraffinblock eingebettet ist. </li><li> Warm up der Metallformen (Größe der Basis 3,3 cm Länge x 2 cm Breite) auf der Warmhalteplatte bei 62 ° C, und gießen Sie ca. 13 ml geschmolzenem Wachs in die Form Basis. </li><li> Übertragen einer Gewebeprobe aus dem Abschnitt 1.5.4 in die Form mit erwärmter Zange und richten Sie sie in die gewünschte Position. </li><li> Bewegen Sie die Formvorsichtig auf die Kühlplatte und lassen, bis das Wachs verfestigt wird. </li></ol></li></ol> 2. Die Gewebe Sectioning <ol><li> Paraffinschnittverfahren <ol><li> Machen Sie eine Wachsbasis durch eine Einbettungskassette auf der Oberseite einer Form (gleiche Größe im Abschnitt 1.6.2) das Aussetzen, füllen mit geschmolzenem Wachs und entfernen Sie die Form, nachdem das Wachs verfestigt wird. HINWEIS: Die Einbettungskassette wird eine Wachsbasis bilden die Probe Paraffinblock zu verankern. </li><li> Schneiden Sie den Paraffinblock in eine geeignete Form und Größe, und legen einige Wachsstücke auf einem flachen Spatel. Erhitzen Sie das Wachs Stücke einen Spiritusbrenner, bis das Wachs schmilzt und setzen es dann um das geschmolzene Wachs auf dem Wachsbasis in Abschnitt 2.1.1 um den Block zu halten. Klemmen Sie es in dem Mikrotom. </li><li> Legen Sie eine neue Klinge auf das Mikrotom, und stellen Sie den Winkel bis 5 Grad, um die Schnitte in das Mikrotom zu erleichtern. </li><li> Schneiden Sie die Probe Paraffinblock in dünne Scheiben (10 &amp; mgr; m), wie zuvor 11 beschrieben. </li> &lt;/ Ol&gt; </li><li> Hybrid-Cut-Methode sectioning <ol><li> Schneiden Sie die Probe Paraffinblock von Schritt 1.6.4 auf eine Säule mit einer Trapezfläche an der Spitze auf eine geeignete Größe mit einer Rasierklinge. </li><li> Fügen Sie etwas optimale Schnitt Temperatur Verbindung (OCT) zur Mitte des Kryostaten Bühne. Bringen Sie den Paraffinblock zu dem Kryostaten Bühne und dann orientieren schnell den Gewebeblock in die gewünschte Position. </li><li> Übertragen Sie die Paraffinblock / Stufe zu einer Kryostatkammer. Lassen Oktober für 10 min auf Schnellgefrier bar bei -42 ° C zu verfestigen. Sie nicht den Block während der Erstarrung von OCT (2C) zu bewegen. </li><li> Lassen Sie den Kryostaten Adapter und Kammertemperatur abkühlen bis zu -20 ° C und -16 ° C jeweils vor dem Paraffinblock / Stufe mit dem Kryostaten Adapter befestigen. Abschnitt Geweben bis 10 um in der Dicke. </li><li> Pick-Gewebeschnitte mit einer Pinzette. Schwimmer in den Abschnitten über 800 &amp; mgr; l DEPC-behandeltem Wasser in einem Poly - L - Lysin coated Rutsche und bei 42 ° C, um die Dias auf einer heißen Platte übertragen. </li><li> Lassen Sie die Abschnitte bei 42 ° C auf DEPC-behandeltem Wasser zu glätten. Verwenden Sie Filterpapier, um das Wasser vom Rand abfließen. </li><li> Berg Gewebe auf dem Schlitten durch den Schieber auf einem 42 ° C heißen Platte über Nacht platzieren. </li></ol></li></ol> 3. Gewebefärbung <ol><li> Entparaffinierung <ol><li> Sammeln Sie die Folien von der heißen Platte und legen Sie sie in einem Färbebank. In 150 ml Xylol in einem Färbeküvette in Dunstabzug und tauchen Sie das Rack in Xylol für 5 min. </li></ol></li><li> Rehydrierung <ol><li> Bereiten verschiedenen Konzentrationen von Ethanollösungen (100%, 95%, 70%, 50% und 30%) in DEPC-behandeltem Wasser und füllt 150 ml Lösung in verschiedene Färbeschalen, respectively. </li><li> Rehydrieren der Proben durch eine Reihe von Ethanolkonzentration abnimmt, wobei jeder Schritt für 3 min bei Raumtemperatur. Die Objektträger in der Färbebank ein Gefäß in ein anderes Gefäß mit different Ethanolkonzentrationen: 100% Ethanol, 95% Ethanol, 70% Ethanol, 50% Ethanol und 30% Ethanol. </li><li> Nach Rehydrierung, tauchen die Proben in ddH 2 O 3 min. </li></ol></li><li> Hämatoxylin-Färbung <ol><li> Stain Gewebeproben von Gewebeschnitten in Hämatoxylinlösung für 1,5 min eingetaucht wird. </li><li> Spülen kurz in ddH 2 O , enthaltend 1 bis 2 Tropfen 12 N Salzsäure (HCl) für ein paar Sekunden, und dann kurz waschen in ddH 2 O. </li></ol></li><li> Entwässerung <ol><li> Dehydratisieren der Proben durch eine Reihe von zunehmenden Ethanolkonzentrationen für 3 min bei Raumtemperatur: 30% Ethanol, 50% Ethanol, 70% Ethanol, 95% Ethanol und 100% Ethanol. Deaktivieren Sie die Proben mit Xylol in der Abzugshaube für 5 min. </li></ol></li><li> Montage <ol><li> Drop-in geeigneter Weise 600 ul Xylol-basierten Montagemedium auf Folie. Vorsichtig ein Deckglas über die Probe. Vermeiden Sie Luftblasen bilden Bilder von guter Qualität zu erhalten. </li><li> Lassen Sie die Folien über Nacht trocknen an der Luft. Beachten Sie die Probe unter einem Mikroskop am nächsten Tag. Hinweis: Die Bilder wurden bei 25X bis 400X Vergrßerung erfasst abhängig von der Größe der Proben. </li></ol></li></ol> 4. In Situ Hybridization <ol><li> Probe-Synthese <ol><li> Klon Phalaenopsis aphrodite Actin genspezifischen codierende Sequenz unter Verwendung der Primer 5&#39;-GGCAGAGTATGATGAATCTGGTCC-3 &#39;und 5&#39;- AGGACAGAAGTTCGGCTGGC -3&#39; (242 bp PCR - Amplikon zu erhalten) und CyclinB1; 1 - Gen - spezifischen Kodierungssequenz unter Verwendung der Primer 5&#39;-TCGTAGCAAGGTTGCTTGTG-3 &#39; und 5&#39;- ATGAGCATGGCGCTAATACC-3 &#39;(um 327 bp PCR - Amplicon) , wie 12 beschrieben. </li><li> Ligieren die spezifischen codierenden Sequenzen in Vektoren (zB pGEMT) nach dem Protokoll des Herstellers. </li><li> Erzeugen Digoxigenin (DIG) markierte Sense und Antisense-Sonden unter Verwendung von SP6 / T7 DIG RNA Labeling Kit nach Herstelleranweisungs. </li></ol></li><li> In situ Hybridisierung <ol><li> Schneiden Sie die 2. und 3. Achselknospe Gewebeschnitt (10 &amp; mgr; m Dicke) erzeugt , um die Hybrid-Cut - Verfahren, und montieren Scheiben auf beschichtete Folie. </li><li> Entparaffinieren Gewebeschnitte in Xylol (siehe 3.1.1), rehydrieren Konzentrationen von Ethanol (siehe 3.2.2) und Verdau mit 2 mg / ml Proteinase K bei 37 ° C für 30 min in abnimmt. </li><li> Führen in situ Hybridisierung gemäß dem Protokoll vorher beschriebenen 11,13 mit einigen Modifikationen, dh mit Hybridisierungstemperatur für Actin als 59 ° C und 60 ° C für CyclinB1;. 1 Hybridisieren Objektträger mit 40 ng DIG-markierter RNA - Sonde. </li><li> Verwenden Nitroblautetrazolium / 5-Brom-4-chlor-3-indolyl - phosphat (NBT / BCIP) -Lösung Hybridisierungssignale zu erfassen , wie 11 beschrieben. </li></ol></li></ol>

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No conflicts of interest declared.

Pflanzenzellen haben starren Zellwände, zähen Fasern, Kristalle und hohem Wassergehalt, die Gewebe Zerreißen Probleme bei Pflanzengewebe Schnitte verursachen. Obwohl Paraffinbasis Sektionieren häufig für Pflanzengeweben verwendet wird, zerreißen die endogene Kristalle oft das Pflanzengewebe während des Schneidens (Abbildung 1). Aufgrund der von Natur aus hohen Wassergehalt innerhalb der Pflanzenzellen, Kryostat-basierte Schnitte verursacht häufig gebrochene Zellen und rissig Gewebeschnitten. In der vorliegenden Studie wird eine kombinierte Paraffineinbettung und Kryoschnittes Protokoll Hybrid-Cut genannt wurde entwickelt und gute Qualität Gewebeschnitte wurden erhalten. Dieses Protokoll löst das Problem mit hohem Wassergehalt assoziiert durch Paraffineinbettung Einführen und verringert die Reißwirkung durch während des Schneidens (Abbildung 3) Paraffinwachs bei niedriger Temperatur aushärtet. Daher ist dieses modifizierte Protokoll vorteilhaft entweder über Paraffinbasis Sectioning oder Kryoschneiden Pflanzengewebe Integrität zu bewahren. Dieses Manuskript zeigt , dass die Hybrid-Cut - Verfahren bewahrt Gewebeintegrität in vielen Geweben von Phalaenopsis - Orchideen wie Achselknospe, Samen und PLB, etc., die ein hohes Maß an Kristallen (Abbildungen 3-4) enthalten. Darüber hinaus ist dieses Protokoll zugänglich Getreidekulturen wie Fortpflanzungsorgane und Blätter von Reis, Mais und Weizen , die mit hohem Siliciumdioxidgehalt (Abbildungen 5-6) enthalten. Vermutlich kann dieses Protokoll angewendet werden, um Pflanzen zu holzig hohe Faser enthält. In der Regel gründlich Festsetzung Gewebe ist sehr wichtig für Hybrid-Cut. Wir fanden , dass Formaldehyd-Alkohol-saure Säure (FAA) Fixiermittel besser ist als PFA die Gewebeintegrität von einigen widerspenstigen Geweben wie axial Knospen, Wurzeln, etc. Allerdings, PFA funktioniert besser als FAA bei der Erhaltung der RNA - Integrität zu erhalten. Daher wird empfohlen, PFA zu behebenProbe für die in - situ - Hybridisierung (ISH) Arbeit. Das hier beschriebene Protokoll wird für RNA ISH Experiment entworfen. Daher wurden alle Reagenzien hergestellt RNA-Abbau zu vermeiden, durch RNase Kontamination durch DEPC Behandlung beseitigt werden. Wenn Hybrid-Cut Abschnitt ist für anatomische Studien, regelmäßige Umkehrosmose (RO) Wasser und die davon abgeleiteten Puffer oder Reagenzien sind akzeptabel. Reduktionsprobengröße und der Dicke auf weniger als 3 mm ist für die Infiltration hilfreich. Außerdem sind zunehmende Tauchzeit zur Entwässerung und Infiltration für harte Textur Gewebe notwendig. Begrenzung dieses Protokoll könnte Probleme aufgrund von unzureichender Fixierung verursacht, Dehydrierung und Infiltration der Probe. Daher Einstellung der Verarbeitungszeit für jeden Schritt ist entscheidend für gute Qualität Paraffinblock zu erzeugen. Normalerweise braucht härtere Gewebe längere Bearbeitungszeit als weicher Gewebe. Darüber hinaus haben wir gezeigt, dass Hybrid-Cut erfolgreich in Kombination wi gearbeitetth ISH räumliche Verteilung der ausgewählten Transkripten (Figur 7) bereitzustellen. Zusammenfassend ist dieses Protokoll für die Untersuchung der Pflanzenanatomie und stellt eine gewebespezifische RNA Karte der ausgewählten Gene nützlich. Zusätzlich kann es andere molekulare Studien wie Desoxyribonukleotidyltransferase dUTP nick end labeling (TUNEL) Assay, Fluoreszenz - in situ - Hybridisierung (FISH) und Immunfärbungstechniken angewendet werden. Im Ergebnis ist dies eine verbesserte Gewebeschneide Protokoll sowohl nützlich und hilfreich für Forscher in Pflanzengemeinschaften.

Die Paraffinbasis Schnittverfahren ist eine weit verbreitete Technik für anatomische Studien. Erhaltung der intakten Gewebes Anatomie ist wichtig für die morphologische und biologische Untersuchungen. Das Paraffin eingebettete Schnitte Technik ist vorteilhaft, da Paraffineinbettung Zell- und Gewebemorphologie behält. Zusätzlich Paraffinblöcke können bequem für längere Zeit gelagert werden. Allerdings, in Paraffin eingebettete Schnitte ist für Pflanzengewebe enthält, intrazellulär Kristalle nicht geeignet. Kristalle innerhalb der Zellen häufig Paraffin Bänder und Gewebe schädigen Integrität reißen während des Schneidens. Im Gegensatz zu Paraffin Schneide ist Kryoschneiden relativ schnell und Abschnitte können ohne Fixierung, serielle Dehydratation oder Einbettmediums Infiltration 1 erhalten werden. Kryoschnitte sind kompatibel mit vielen Anwendungen , wie der Immunhistochemie, Hybridisierung in situ, und Enzymhistochemie. Der andere Vorteil von Kryoschneiden istdaß dieses Verfahren geht nicht durch ein Spannungs Denaturierung Prozesse wie hohe Temperatur und chemischen Behandlungen werden so zelluläre Moleküle gut innerhalb der Gewebeabschnitte 2 erhalten. Kryoschneiden ist im allgemeinen bevorzugt über Paraffinbasis für Studien in tierischen Geweben sectioning. Allerdings ist Kryoschneiden nicht die erste Wahl in Pflanzen, weil Gefriertemperatur manchmal Bildung von Eiskristallen verursacht, die die Qualität der Abschnitt Integrität beeinträchtigen. Obwohl osmoregulation wie Saccharoselösungen, Polyethylenglykol (PEG) oder Glycerin - 3 berichtet Kristall Eisbildung unter Gefrierbedingungen zu verringern, ist die Verbesserung geringer als optimal. Zur Anpassung an unterschiedliche Umgebungen, verschiedene Pflanzen haben oft unterschiedliche Gewebebeschaffenheit und Pflanzenzellen entwickelt haben starren Zellwände, zähen Fasern zu bilden, und Kristalle 4,5. Zum Beispiel sind unlösliche Kalziumoxalatkristallen und Kieselkörper relativ häufig inPflanzen 6. Silicate Körper / Kristalle wurden berichtet wird, um Anlagenarchitektur erhalten, Geradheit, und Verhütung von Krankheiten oder Schädlings in Getreidepflanzen 7-9. Die Topf Orchideen und Schnittblumen Orchidee Markt floriert und es ist eine wachsende Branche. Phalaenopsis aphrodite (Phalaenopsis) ist einer der wichtigsten Export Zierpflanzen in Taiwan. Erhebliche Anstrengungen wurden unternommen , um die morphologischen und physiologischen Veränderungen der Blüten Prozesse in Phalaenopsisorchideen zu verstehen gemacht. Floral Spitzen von Phalaenopsisorchideen aus Achselknospen an der Blattbasis eingeleitet. Nach einer Zeit der kühlen Umgebungstemperatur (etwa eineinhalb Monate), Achselknospen vergrößern, brechen dormancy und ragen aus dem Blattbasis in jungen Blumenspitzen zu entwickeln. Um die physiologischen verstehen, zellulären und molekularen Prozesse der Spitze Initiation ist es wichtig, eine stabile anatomische Technik zu entwickeln, um Visualize Gewebe oder Marker in einer angemessenen Weise. Doch das Vorhandensein von allgegenwärtigen Kristalle in Orchidee Geweben, insbesondere in Achselknospen, macht anatomische Arbeit schwierig. Hier haben wir versucht, Abschnitt Integrität von widerspenstigen Pflanzengewebe zu verbessern, die als technisch anspruchs bisher angesehen wurden. Hier zeigen wir ein verbessertes Protokoll namens Hybrid-Cut. Es ist ein Paraffinbasis Schnittverfahren, das einen Kryostaten durchgeführt wird. Paraffinausgießstation löst mit hohem Wassergehalt in Pflanzengewebe. Sectioning bei niedrigen Temperaturen härtet der Paraffinblock, reduziert Kristall Problem zu reißen, und die Integrität Gewebe erheblich verbessert. Dieses Protokoll deutlich verbessert die Gewebeintegrität für widerspenstige Pflanzenproben.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="734">
	<tbody>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:321px;">Embedding Center model EC780-1</td>
			<td style="width:127px;">CSA</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:321px;">Microtome model RM2255</td>
			<td style="width:127px;">Leica</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:321px;">Cryostat model CM 1950</td>
			<td style="width:127px;">Leica</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:321px;">Axio Scope A1 microscope&#160;</td>
			<td style="width:127px;">Zeiss</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:321px;">Murashige &#38; Skoog medium including vitamins</td>
			<td style="width:127px;">Duchefa Biochemia</td>
			<td style="width:119px;">M0222.0050</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:321px;">RNase free surface decontaminant</td>
			<td style="width:127px;">Apex</td>
			<td style="width:119px;">10-228</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:321px;">Diethyl pyrocarbonate (DEPC)</td>
			<td style="width:127px;">Bio Basic Inc.&#160;</td>
			<td style="width:119px;">D801154</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:321px;">Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td style="width:127px;">MDBio, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">101-7647-14-5</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:321px;">Potassium chloride, crystal (KCl)</td>
			<td style="width:127px;">J.T. Baker</td>
			<td style="width:119px;">7447-40-7</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:321px;">Sodium phosphate dibasic (NA2HPO4)</td>
			<td style="width:127px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">7558-79-4</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:321px;">Potassium phosphate monobasic (KH2PO4)</td>
			<td style="width:127px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">7778-77-0</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:321px;">Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td style="width:127px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">16005</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:321px;">Sodium hydroxide (NaOH)</td>
			<td style="width:127px;">Showa</td>
			<td style="width:119px;">19430160</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:321px;">Sulfuric acid (H2SO4)</td>
			<td style="width:127px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">7664-93-9</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:321px;">Glutaraldehyde solution</td>
			<td style="width:127px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">111-30-8</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:321px;">Polyoxyethylene 20 sorbitan monolaurate (Tween 20)</td>
			<td style="width:127px;">J.T. Baker</td>
			<td style="width:119px;">9005-64-5</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:321px;">Octyl Phenol Ethoxylate (Triton X100)</td>
			<td style="width:127px;">J.T. Baker</td>
			<td style="width:119px;">9002-93-1</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:321px;">Glass scintillation vials</td>
			<td style="width:127px;">Newastar</td>
			<td style="width:119px;">DG60805-00020</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">Desiccator vacuum</td>
			<td style="width:127px;">Violet Bioscience Inc.</td>
			<td style="width:119px;">TS-402030</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:321px;">Rotary vane pump RZ2.5</td>
			<td style="width:127px;">Vacuubrand</td>
			<td style="width:119px;">36149406</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:321px;">Ethanol</td>
			<td style="width:127px;">J.T. Baker</td>
			<td style="width:119px;">64-17-5</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:321px;">Sub-X&#160;</td>
			<td style="width:127px;">Leica Surgipath</td>
			<td style="width:119px;">3803670</td>
			<td style="width:167px;">Xylene substitute</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:321px;">Paraplast Plus&#160;</td>
			<td style="width:127px;">Leica Surgipath</td>
			<td style="width:119px;">39602004</td>
			<td style="width:167px;">Tissue embedding paraffin</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:321px;">SUPERFROST micro slide glass</td>
			<td style="width:127px;">Matsunami</td>
			<td style="width:119px;">S7441</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="51">
			<td height="51" style="height:51px;width:321px;">FSC 22 Clear&#160;</td>
			<td style="width:127px;">Leica Surgipath</td>
			<td style="width:119px;">3801480</td>
			<td style="width:167px;">Optimal Cutting Temperature compound (OCT)&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:321px;">Xylenes, Purified</td>
			<td style="width:127px;">Leica Surgipath</td>
			<td style="width:119px;">3803665</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:321px;">Hematoxylin</td>
			<td style="width:127px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;">HX305311</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:321px;">Hydrochloric acid (HCl)</td>
			<td style="width:127px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">7647-01-0</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:321px;">Micromount</td>
			<td style="width:127px;">Leica Surgipath</td>
			<td style="width:119px;">3801731</td>
			<td style="width:167px;">Mounting medium</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:321px;">pGEM T-easy vector</td>
			<td style="width:127px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">A1360</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Proteinase K</td>
			<td style="width:127px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">3115879001</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:321px;">SP6/T7 DIG RNA Labeling Kit</td>
			<td style="width:127px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">11175025910</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:321px;">NBT/BCIP stock solution</td>
			<td style="width:127px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">11681451001</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

hybrid-cut: an improved sectioning method for recalcitrant plant tissue samples

Anlagenteil Integrität Pflege ist wichtig für an der Zell-, Gewebe- detaillierten anatomischen Strukturen zu studieren oder sogar Organebene. Allerdings haben einige Pflanzenzellen starren Zellwände, zähen Fasern und Kristallen (Calciumoxalat, Siliciumdioxid, etc.) und mit hohem Wassergehalt , die stören oft Gewebeintegrität während des Schneidens Pflanzengewebe. Diese Studie stellt eine einfache Hybrid-Cut Gewebe Schnittverfahren. Dieses Protokoll modifiziert eine Paraffinbasis Sektionieren Technik und verbessert die Integrität von Gewebeschnitten aus verschiedenen Pflanzen. Pflanzengewebe wurden in Paraffin eingebettet, bevor bei -16 ° C in einem Kryostaten sectioning. deutlich Sectioning bei niedrigen Temperaturen gehärtet, um die Paraffinblöcke, reduziert Reißen und Kratzen und eine verbesserte Gewebeintegrität. Dieses Protokoll wurde erfolgreich sowie widerspenstigen Gewebe wie reproduktives orga zu Kalziumoxalat-reiche Phalaenopsisorchidee Gewebe aufgetragenns und Blätter von Reis, Mais und Weizen. Darüber hinaus könnte die hohe Qualität von Gewebeschnitten von Hybrid-Cut in Kombination verwendet werden , mit in - situ - Hybridisierung (ISH) räumliche Expressionsmuster von Genen von Interesse bereitzustellen. Abschließend ist dieses Protokoll besonders nützlich für die widerspenstigen Pflanzengewebe mit einem hohen Kristall oder Silica-Anteil. Gute Qualität Gewebeschnitte ermöglichen morphologische und andere biologische Studien.

Hybrid-Cut Verbessert die Integrität von Gewebeschnitten die Anatomie der reproduktiven Blüthenbau zu verstehen, ist wichtig, um die zugrunde liegende Mechanismus der Blütenbildung in Orchideen für die Untersuchung. Allerdings macht die Akkumulation von intrazellulären Calcium - Oxalat - Kristalle in Phalaenopsisorchideen solche Studien , die eine anspruchsvolle Aufgabe. Um die Probleme im Zusammenhang mit umgehen , indem Kristalle während des Schneidens verursacht Reißen (Abbildung 1), entwickelten wir ein System , das wir Hybrid-Cut genannt. Dieses Protokoll verbindet traditionelle Paraffineinbettung und Kryoschnittes Techniken. Wir testeten erste Hybrid-Cut in Achselknospen von Phalaenopsis - Orchideen , weil sie für die Gewebesteifigkeit und hoher Kristallgehalt berüchtigt sind. Axillary Knospe Gewebe in 4% wurde PFA (siehe Protokoll, Schritt 1.3). Nach Serien Ethanol-Dehydratisierung und Paraffinwachs infiltration, die Achselknospe in einem Paraffinblock eingebettet. Der Block wurde auf eine geeignete Größe zugeschnitten vor (2A) sectioning. Eine kleine Menge der OCT wurde dann in der Mitte des Kryostaten Stufe (2B) aufgebracht ist . Der Paraffinblock wurde dann auf die Stufe über Oktober haftete. Die Stufe wurde in einem Kryostat für 10 min inkubiert vollständigen Verfestigung der OCT zu ermöglichen , bevor sectioning (2C) , und dann Kryoschnitt wurde in einem -16 durchgeführt ° C Kammer (2D). Als Vergleich wurde ein Paraffinblock eine Achselknospe von Phalaenopsis - Orchideen enthält, Schnitte regelmäßigen Mikrotom ausgesetzt. Wie in 1A gezeigt, schwere Einreißen der Paraffin Bändern wurde nach Mikrotom Schnitte beobachtet. Die Gewebeintegrität und Zellstruktur wurde ebenfalls beeinträchtigt (1B). Hybrid-Cut, auf der anderen Seite,hergestellt intakte Gewebeschnitte (3A) mit konservierten strukturellen Integrität (3B). Die Anwendung der Hybrid-Cut zu verschiedenen Geweben von P. Aphrodite Um die Ansprechbarkeit von Hybrid-Cut zu testen, die wir getestet verschiedenen Geweben von Phalaenopsis Orchideen. Es ist oft schwierig Abschnitte von Samen mit Integrität gute Gewebe weil der gehärteten Samenschalen zu erhalten. Unter Verwendung dieses Protokolls, detaillierten Strukturen der Samen wurden nach sectioning (4A) aufbewahrt. Wie in 4A, Eiweißkörper gezeigt, 14 die gemeinsamen Speicherprodukte werden konnte eindeutig identifiziert werden . Hybrid-Cut arbeitete auch erfolgreich und zeigte die detaillierte Strukturen des Sprossapikalmeristem des einmonatigen alten Protocorm (die gekeimten Struktur aus einem Samen) (4B) undProtocorm-like-Körper (PLB, 4C). Die intrazellulären Kristalle wurden in Abschnitte von PLB. Phalaenopsisorchideen haben dicke und saftigen Blätter beobachtet und sie führen Crassulacean-Metabolismus (CAM) -Typ Photosynthese 15. Der Querschnitt der Blattspreite zeigte große Mesophyllzellen und Gefäßbündel enthält Xylem und Phloem (4D). Paar stomatal Öffnungen wurden auf der abaxial Blattoberfläche während der Tageszeit (4D) beobachtet. In der Tat entwickelte CAM - Pflanzen Kohlenstoff Gewinn zu maximieren , sondern gleichzeitig den Wasserverlust durch ihre Stomata öffnen in der Nacht unter trockenen Bedingungen 15,16 minimieren. Die Wurzel Apikalmeristems von P. aphrodite ist in 4E gezeigt. Die Wurzelspitze Zellen erschien eine beträchtliche Anzahl von Kristallen enthalten, die nach dem Schneiden (4E) erhaltene sehr gut waren. Längsschnitte der jungen Blumen Spikes versehen informatIonen über die Architektur der jungen Blumen primordials (4F). Außerdem Kelchblätter, Blütenblätter, labellum und pollinia deutlich von dem Längsschnitt der jungen Blütenknospen identifiziert werden konnten, die eine Differenzierung in dieser 5 mm Blütenknospe (4G) abgeschlossen haben. Beachten Sie, dass Kristalle in den Kelchblättern der jungen Blütenknospen angesammelt wurden. Kurz gesagt, funktioniert dieses Protokoll konsequent Gewebeintegrität zu erhalten und intakte Morphologie ermöglicht anatomische und mögliche zelluläre Studien produziert. Hybrid-Cut Behält Gewebeintegrität in Getreidekulturen Wir auch Hybrid-Cut auf Getreide wie Reis, Weizen und Mais getestet, hohem Silica - Anteil 17,18 enthalten. Wie in 5 gezeigt, wurden die Gewebeintegrität von Querschnitten von Reis, Weizen und Maisblätter wesentlich durch die Hy verbessertebrid-Cut-Verfahren. Xylem, Phloem, Mesophyllzellen, Stomata und bulliform Zellen, die der Blattspreite unkontrolliert ins Rollen Wasserverlust zu vermeiden, wurden aus Abschnitten von Reisblättern eindeutig identifiziert werden. Der Kranz Anatomie, Mesophyllzellen und Gefäßbündel des Maisblatt 19,20 wurden eindeutig identifiziert. Es war interessant eine hohe Dichte von Stomata auf zu finden sowohl die adaxial und abaxial Seiten Maisblättern (Abbildung 5). Das Verhältnis von adaxial und abaxial Stomata von 0,7 in Mais wurde bisher 21 berichtet. Darüber hinaus arbeitete dieses Protokoll auch erfolgreich die detaillierte Morphologie der Zellen von Ährchen aus Reis, Weizen und Mais (Abbildung 6) zu liefern. Ährchen sind dafür bekannt, reichlich Kieselsäure 9 enthalten. Normalerweise, das führt zu Schwierigkeiten bei der Durchführung von Gewebe Schnitte. In Situ Hybridization <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page= &quot;1&quot;&gt; Genomic und transkriptomischen Ansätze werden häufig die Funktionen von Genen zu annotieren verwendet. Die Bereitstellung der räumlichen Verteilung der Transkripte der Gene von Interesse in Entwicklungs- oder ökologischen Rahmenbedingungen ist wichtig , neue Einblicke in die möglichen Funktionen der Gene hinzuzufügen. In-situ - Hybridisierung (ISH) entwickelt wurde , Genexpressionsmuster auf der Ebene der Gewebe 11 zu lokalisieren 22-25. Zusätzlich kann ISH bieten zellulären und in einigen Fällen subzellulären, Auflösung von mRNA Verteilung in mehrzelligen Organismen 26. Während der ISH, ist RNA und Gewebeintegrität wesentlich zuverlässige räumliche Informationen über das ausgewählte Transkript zu erhalten. Wir testeten ISH das Hybrid-Cut - Protokoll Aktin - Gen (PATC157348) kloniert wurde unter Verwendung der Primer 5&#39;-GGCAGAGTATGATGAATCTGGTCC-3 &#39;und 5&#39; AGGACAGAAGTTCGGCTGGC -3 &#39;zu bekommen 242 bp PCR - Amplikon Cyclin B1:.. 1 (PATC146999) Genspezifischen codierende Sequenz unter Verwendung der Primer 5&#39;-TCGTAGCAAGGTTGCTTGTG-3 &#39;Und 5&#39; ATGAGCATGGCGCTAATACC-3 &#39;327 bp PCR-Amplikon zu erhalten. Nach ISH, Actin und Cyclin B1: 1 - Genexpression wurde in junge und reife Achselknospen überwacht (Abbildung 7). Beide Gene wurden in meristematischen Zellen von 2. und 3. Achselknospen ausgedrückt, mit stärkeren Signalen in 3 rd Achselknospen detektiert. Diese Ergebnisse zeigten, dass Hybrid-Cut gute Anatomie behalten und räumliche Genexpressionsmuster liefern. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/54754/54754fig1.jpg" /> Abbildung 1: Traditionelle Paraffin Abschnitt verursacht schwere Zerreißen von Gewebe Ein Paraffinblock eine Achselknospe von Phalaenopsis - Orchideen enthielt , wurde regelmäßig Mikrotom Schnitte unterzogen.. Arges Reissen der Paraffin Bänder wurde nach traditionellen Mikrotom Schnitte (A) beobachtet </strong&gt;. Die Gewebeintegrität und Zellstruktur wurde auch (B) beeinträchtigt werden . Die Pfeile zeigen die starke Abreißen des Gewebeschnitts. Pfeilspitze zeigt die Kristallkörper. Maßstabsbalken 100 &amp; mgr; m. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54754/54754fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54754/54754fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/54754/54754fig2.jpg" /> Abbildung 2:. Hybrid-Cut Schnittverfahren Ein Achselknospe Gewebe wurde in PFA fixiert und Gewebe wurden dehydriert, infiltriert mit Paraffinwachs und in einem Paraffinblock eingebettet. Der Paraffinblock wurde auf eine geeignete Größe (A) getrimmt. Optimale Schnitt Temperatur Verbindung (OCT) wurde in der Mitte des Kryostaten Stufe (B) aufgetragen. Der Paraffinblock wurde in den Oktober auf dem Kryostaten Stufe angebracht. Bei niedriger Temperatur, der Paraffinblock<html> wurde in den Kryostaten Stufe über OCT (C) eingehalten werden . Gewebeschnitte wurden in der Kryostatkammer bei -16 ° C (D) geschnitten. Maßstabsbalken repräsentieren 0,5 cm (A) und 1 cm (BD). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54754/54754fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54754/54754fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/54754/54754fig3.jpg" /> Abbildung 3: Hybrid-Cut Verbessert Abschnitt Integrität Ein Paraffinblock eine Achselknospe von Phalaenopsis - Orchideen enthielt , wurde auf Hybrid-Cut ausgesetzt sectioning (A) und das Hybrid-Cut - Verfahren hergestellt Abschnitte mit ausgezeichneten Gewebeintegrität (B).. Die Pfeilspitze zeigt die endogene Kristallkörper in der Achselknospe Gewebe eingebettet. Maßstabsbalken 100 um.rget = &quot;_ blank&quot;&gt; Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/54754/54754fig4.jpg" /> Abbildung 4: Anwendung von Hybrid-Schnitt auf verschiedene Gewebeschnitte von Phalaenopsis - Orchideen Verschiedene Orchidee. Gewebe wurden unter Verwendung der Hybrid-Cut - Verfahren, wie im Längsschnitt Orchideensamen , die im reifen Stadium (A), im Längsschnitt Protocorm (B), Längsschnitt von Protocorm artigen Körpern (PLB) (C), Querschnitt im Schnitt von Blattspreite (D), Längsschnitt Wurzel (E), Längsschnitt der jungen Blumenspitze (F) und Längsschnitt der jungen Blütenknospen (G). Gewebeschnitte wurden durch Hämatoxylin gefärbt. SC, Samenmantel; PB, Proteinkörper; M,meristem; MP, Mutter PLB; DP, Tochter PLB; Ad, adaxial Blattoberfläche; Ab, abaxial Blattoberfläche; St, Stomata; MC, Mesophyll-Zelle; VB, Gefäßbündel; RC, Wurzelkappe; fb, Blütenknospe; Se, Kelchblatt; Pe, Blütenblatt; La, labellum; Po, pollinia; Ro, rostellum; Ca, Kallus. Pfeilspitzen zeigen Kristalle. Maßstabsbalken stellen 20 &amp; mgr; m (AE) und 200 &amp; mgr; m (FG). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54754/54754fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54754/54754fig4large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/54754/54754fig5.jpg" /> Abbildung 5:. Hybrid-Cut Behält Blattgewebe Integrität in mehreren Getreidesaaten Vergleich von Blattgewebe der traditionellen Paraffin - Verfahren (linkes Feld) und die Hybrid-Cut - Technik in dieser Studie (rechte Tafel) entwickelt worden ist . Bilder zeigen Blattquerschnitte von Reis, Weizen und Mais. MC, Mesophyll-Zelle; Ph, Bast; St, Stomata; BC, bu<html> lliform Zelle. Die Pfeile zeigen das Abreißen von Gewebeschnitt. Pfeilspitzen zeigen Kieselkörper. Die blaue gestrichelte Kreise zeigen Kranz Anatomie in C4-Mais. Maßstabsbalken 20 um. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54754/54754fig5large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54754/54754fig5large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 6" src="/files/ftp_upload/54754/54754fig6.jpg" /> Abbildung 6:. Hybrid-Cut Behält Ährchen Gewebeintegrität in mehreren Getreidesaaten Vergleich der Gewebeintegrität von Ährchen Abschnitte zwischen traditionellen Paraffin und Hybrid-Cut Methoden. Die Pfeile zeigen das Abreißen von Gewebeschnitt. Pfeilspitzen zeigen Kieselkörper. Maßstabsbalken 20 &amp; mgr; m (Reis), und 200 &amp; mgr; m (Weizen und Mais). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54754/54754fig6large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54754/54754fig6large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> ent &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; 1 &quot;&gt; <img alt="7" src="/files/ftp_upload/54754/54754fig7.jpg" /> Abbildung 7: In - situ - Hybridisierung von Actin und CyclinB1; 1 Expressionsmuster in den Achsel Bud von Phalaenopsis - Orchideen Gewebeschnitten des 2. Achselknospen und 3. Achselknospe wurden die Hybrid-Cut - Verfahren hergestellt werden.. Insgesamt 40 ng Actin und CyclinB1; 1 DIG-markierten Sonde wurden für die Hybridisierung verwendet. Die Sense-Sonde wurde als negative Kontrolle verwendet. Die Pfeile zeigen die Fortpflanzungs meristem der Achselknospe. Maßstabsbalken 100 um. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54754/54754fig7large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54754/54754fig7large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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Hybrid-Cut: An Improved Sectioning Method for Recalcitrant Plant Tissue Samples

This protocol describes a simple Hybrid-Cut tissue sectioning method that is useful for recalcitrant plant tissues. Good quality tissue sections enable anatomical studies and other biological studies including in situ hybridization (ISH).

Hybrid-Cut: Ein verbesserter Schnittverfahren für widerspenstige Pflanzengewebeproben

Maintaining plant section integrity is essential for studying detailed anatomical structures at the cellular, tissue, or even organ level. However, some ...

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Research

JoVE Journal

Biology

18.8K Aufrufe.  Academia Sinica. This protocol describes a simple Hybrid-Cut tissue sectioning method that is useful for recalcitrant plant tissues. Good quality tissue sections enable anatomical studies and other biological studies including in situ hybridization (ISH).

Serie: Hybrid-Cut: An Improved Sectioning Method for Recalcitrant Plant Tissue Samples

Thin Sectioning of Slice Preparations for Immunohistochemistry

Many investigations in neuroscience, as well as other disciplines, involve studying small, yet macroscopic pieces or sections of tissue that have been preserved, freshly removed, or excised but kept viable, as in slice preparations of brain tissue.  Subsequent microscopic studies of this material can be challenging, as the tissue samples may be difficult to handle.  Demonstrated here is a method for obtaining thin cryostat sections of tissue with a thickness that may range from 0.2-5.0 mm.  We routinely cut 400 micron thick Vibratome brain slices serially into 5-10 micron coronal cryostat sections.  The slices are typically first used for electrophysiology experiments and then require microscopic analysis of the cytoarchitecture of the region from which the recordings were observed.  We have constructed a simple device that allows controlled and reproducible preparation and positioning of the tissue slice.  This device consists of a cylinder 5 cm in length with a diameter of 1.2 cm, which serves as a freezing stage for the slice.  A ring snugly slides over the cylinder providing walls around the slice allowing the tissue to be immersed in freezing compound (e.g., OCT).  This is then quickly frozen with crushed dry ice and the resulting  wafer  can be position easily for cryostat sectioning.  Thin sections can be thaw-mounted onto coated slides to allow further studies to be performed, such as various staining methods, in situ hybridization, or immunohistochemistry, as demonstrated here.

The present method allows reproducible cryostat sectioning of small, difficult-to-manage, tissue pieces, such as biopsies and brain slices. We utilize a simple aluminum freezing stage to facilitate handling of tissue and a standard cryostat to routinely produce 5-10 micron serial sections from 400 micron thick brain slices.

Dünnschnitt der Scheibe Vorbereitungen für die Immunhistochemie

Many investigations in neuroscience, as well as other disciplines, involve studying small, yet macroscopic pieces or sections of tissue that have been ...

Forschung

Biologie

Testing Nicotine Tolerance in Aphids Using an Artificial Diet Experiment

Plants may upregulate the production of many different seconday metabolites in response to insect feeding. One of these metabolites, nicotine, is well know to have insecticidal properties. One response of tobacco plants to herbivory, or being gnawed upon by insects, is to increase the production of this neurotoxic alkaloid. Here, we will demonstrate how to set up an experiment to address this question of whether a tobacco-adapted strain of the green peach aphid, Myzus persicae, can tolerate higher levels of nicotine than the a strain of this insect that does not infest tobacco in the field.

In this video and assay is demonstrated that tests the tolerance of nicotine to two types of aphids one that infests tobacco plants in the field and one that does not.

Testen Nikotin Toleranz in Blattläuse mit einer künstlichen Diät Experiment

Plants may upregulate the production of many different seconday metabolites in response to insect feeding. One of these metabolites, nicotine, is well ...

Agar-Block Microcosms for Controlled Plant Tissue Decomposition by Aerobic Fungi

The two principal methods for studying fungal biodegradation of lignocellulosic plant tissues were developed for wood preservative testing (soil-block; agar-block). It is well-accepted that soil-block microcosms yield higher decay rates, fewer moisture issues, lower variability among studies, and higher thresholds of preservative toxicity. Soil-block testing is thus the more utilized technique and has been standardized by American Society for Testing and Materials (ASTM) (method D 1413-07). The soil-block design has drawbacks, however, using locally-variable soil sources and in limiting the control of nutrients external (exogenous) to the decaying tissues. These drawbacks have emerged as a problem in applying this method to other, increasingly popular research aims. These modern aims include degrading lignocellulosics for bioenergy research, testing bioremediation of co-metabolized toxics, evaluating oxidative mechanisms, and tracking translocated elements along hyphal networks. Soil-blocks do not lend enough control in these applications. A refined agar-block approach is necessary.
Here, we use the brown rot wood-degrading fungus Serpula lacrymans to degrade wood in agar-block microcosms, using deep Petri dishes with low-calcium agar. We test the role of exogenous gypsum on decay in a time-series, to demonstrate the utility and expected variability. Blocks from a single board rip (longitudinal cut) are conditioned, weighed, autoclaved, and introduced aseptically atop plastic mesh. Fungal inoculations are at each block face, with exogenous gypsum added at interfaces. Harvests are aseptic until the final destructive harvest. These microcosms are designed to avoid block contact with agar or Petri dish walls. Condensation is minimized during plate pours and during incubation. Finally, inoculum/gypsum/wood spacing is minimized but without allowing contact. These less technical aspects of agar-block design are also the most common causes of failure and the key source of variability among studies. Video publication is therefore useful in this case, and we demonstrate low-variability, high-quality results.

This video demonstrates a controlled environment approach to study degradation of lignocellulosic plant tissues by aerobic fungi. The ability to control nutrient sources and moisture is a key advantage of agar-block microcosms, but the approach often yields mixed success. We address critical pitfalls to yield reproducible, low-variability results.

Agar-Block Mikrokosmen für Controlled Pflanzengewebekultur Zersetzung durch aerobe Pilze

The two principal methods for studying fungal biodegradation of lignocellulosic plant tissues were developed for wood preservative testing (soil-block; ...

Genotyping of Plant and Animal Samples without Prior DNA Purification

The Direct PCR approach facilitates PCR amplification directly from small amounts of unpurified samples, and is demonstrated here for several plant and animal tissues (Figure 1). Direct PCR is based on specially engineered Thermo Scientific Phusion and Phire DNA Polymerases, which include a double-stranded DNA binding domain that gives them unique properties such as high tolerance of inhibitors.
PCR-based target DNA detection has numerous applications in plant research, including plant genotype analysis and verification of transgenes. PCR from plant tissues traditionally involves an initial DNA isolation step, which may require expensive or toxic reagents. The process is time consuming and increases the risk of cross contamination1, 2. Conversely, by using Thermo Scientific Phire Plant Direct PCR Kit the target DNA can be easily detected, without prior DNA extraction. In the model demonstrated here, an example of derived cleaved amplified polymorphic sequence analysis (dCAPS)3,4 is performed directly from Arabidopsis plant leaves. dCAPS genotyping assays can be used to identify single nucleotide polymorphisms (SNPs) by SNP allele-specific restriction endonuclease digestion3. 
Some plant samples tend to be more challenging when using Direct PCR methods as they contain components that interfere with PCR, such as phenolic compounds. In these cases, an additional step to remove the compounds is traditionally required2,5. Here, this problem is overcome by using a quick and easy dilution protocol followed by Direct PCR amplification (Figure 1). Fifteen year-old oak leaves are used as a model for challenging plants as the specimen contains high amounts of phenolic compounds including tannins. 
Gene transfer into mice is broadly used to study the roles of genes in development, physiology and human disease. The use of these animals requires screening for the presence of the transgene, usually with PCR. Traditionally, this involves a time consuming DNA isolation step, during which DNA for PCR analysis is purified from ear, tail or toe tissues6,7. However, with the Thermo Scientific Phire Animal Tissue Direct PCR Kit transgenic mice can be genotyped without prior DNA purification. In this protocol transgenic mouse genotyping is achieved directly from mouse ear tissues, as demonstrated here for a challenging example where only one primer set is used for amplification of two fragments differing greatly in size.

The Direct PCR approach presented here facilitates PCR amplification directly from small amounts of unpurified plant and animal tissue.

Genotypisierung von Pflanzen und Tieren Proben ohne vorherige DNA-Aufreinigung

The Direct PCR approach facilitates PCR amplification directly from small amounts of unpurified samples, and is demonstrated here for several plant and ...

An Improved Method for Accurate and Rapid Measurement of Flight Performance in Drosophila

Drosophila has proven to be a useful model system for analysis of behavior, including flight. The initial flight tester involved dropping flies into an oil-coated graduated cylinder; landing height provided a measure of flight performance by assessing how far flies will fall before producing enough thrust to make contact with the wall of the cylinder. Here we describe an updated version of the flight tester with four major improvements. First, we added a &#34;drop tube&#34; to ensure that all flies enter the flight cylinder at a similar velocity between trials, eliminating variability between users. Second, we replaced the oil coating with removable plastic sheets coated in Tangle-Trap, an adhesive designed to capture live insects. Third, we use a longer cylinder to enable more accurate discrimination of flight ability. Fourth we use a digital camera and imaging software to automate the scoring of flight performance. These improvements allow for the rapid, quantitative assessment of flight behavior, useful for large datasets and large-scale genetic screens.

An Improved Method for Accurate and Rapid Measurement of Flight Performance in Drosophila

Here we describe a method for rapid and accurate measurement of flight performance in Drosophila, enabling high-throughput screening.

Ein verbessertes Verfahren für genaue und schnelle Messung der Flugleistung in<em&gt; Drosophila</em

Drosophila has proven to be a useful model system for analysis of behavior, including flight. The initial flight tester involved dropping flies into an ...

An Efficient Method for Quantitative, Single-cell Analysis of Chromatin Modification and Nuclear Architecture in Whole-mount Ovules in Arabidopsis

In flowering plants, the somatic-to-reproductive cell fate transition is marked by the specification of spore mother cells (SMCs) in floral organs of the adult plant. The female SMC (megaspore mother cell, MMC) differentiates in the ovule primordium and undergoes meiosis. The selected haploid megaspore then undergoes mitosis to form the multicellular female gametophyte, which will give rise to the gametes, the egg cell and central cell, together with accessory cells. The limited accessibility of the MMC, meiocyte and female gametophyte inside the ovule is technically challenging for cytological and cytogenetic analyses at single cell level. Particularly, direct or indirect immunodetection of cellular or nuclear epitopes is impaired by poor penetration of the reagents inside the plant cell and single-cell imaging is demised by the lack of optical clarity in whole-mount tissues.
Thus, we developed an efficient method to analyze the nuclear organization and chromatin modification at high resolution of single cell in whole-mount embedded Arabidopsis ovules. It is based on dissection and embedding of fixed ovules in a thin layer of acrylamide gel on a microscopic slide. The embedded ovules are subjected to chemical and enzymatic treatments aiming at improving tissue clarity and permeability to the immunostaining reagents. Those treatments preserve cellular and chromatin organization, DNA and protein epitopes. The samples can be used for different downstream cytological analyses, including chromatin immunostaining, fluorescence in situ hybridization (FISH), and DNA staining for heterochromatin analysis. Confocal laser scanning microscopy (CLSM) imaging, with high resolution, followed by 3D reconstruction allows for quantitative measurements at single-cell resolution.

An Efficient Method for Quantitative, Single-cell Analysis of Chromatin Modification and Nuclear Architecture in Whole-mount Ovules in Arabidopsis

We provide here an efficient and reliable protocol for immunostaining, Fluorescence in&#160;situ Hybridization, DNA staining followed by quantitative, high-resolution imaging in whole-mount Arabidopsis thaliana ovules. This method was successfully used to analyze chromatin modifications and nuclear architecture.

Eine effiziente Methode zur quantitativen, Einzel-Zell-Analyse von Chromatin Modifikation und Reaktor Architektur in Whole-Mount-Samenanlagen in<em&gt; Arabidopsis</em

In flowering plants, the somatic-to-reproductive cell fate transition is marked by the specification of spore mother cells (SMCs) in floral organs of the ...

Method for Measuring the Activity of Deubiquitinating Enzymes in Cell Lines and Tissue Samples

The ubiquitin-proteasome system has recently been implicated in various pathologies including neurodegenerative diseases and cancer. In light of this, techniques for studying the regulatory mechanism of this system are essential to elucidating the cellular and molecular processes of the aforementioned diseases. The use of hemagglutinin derived ubiquitin probes outlined in this paper serves as a valuable tool for the study of this system. This paper details a method that enables the user to perform assays that give a direct visualization of deubiquitinating enzyme activity. Deubiquitinating enzymes control proteasomal degradation and share functional homology at their active sites, which allows the user to investigate the activity of multiple enzymes in one assay. Lysates are obtained through gentle mechanical cell disruption and incubated with active site directed probes. Functional enzymes are tagged with the probes while inactive enzymes remain unbound. By running this assay, the user obtains information on both the activity and potential expression of multiple deubiquitinating enzymes in a fast and easy manner. The current method is significantly more efficient than using individual antibodies for the predicted one hundred deubiquitinating enzymes in the human cell.

The current protocol details a method for measuring the activity of functionally homologous deubiquitinating enzymes. Specialized probes covalently modify the enzyme and allow for detection. This method holds the potential to identify new therapeutic targets.

Verfahren zur Messung der Aktivität von Deubiquitinierungsenzyme in Zelllinien und Gewebeproben

The ubiquitin-proteasome system has recently been implicated in various pathologies including neurodegenerative diseases and cancer. In light of this, ...

A Fast Air-dry Dropping Chromosome Preparation Method Suitable for FISH in Plants

Preparation of chromosome spreads is a prerequisite for the successful performance of fluorescence in situ hybridization (FISH). Preparation of high quality plant chromosome spreads is challenging due to the rigid cell wall. One of the approved methods for the preparation of plant chromosomes is a so-called drop preparation, also known as drop-spreading or air-drying technique. Here, we present a protocol for the fast preparation of mitotic chromosome spreads suitable for the FISH detection of single and high copy DNA probes. This method is an improved variant of the air-dry drop method performed under a relative humidity of 50%-55%. This protocol comprises a reduced number of washing steps making its application easy, efficient and reproducible. Obvious benefits of this approach are well-spread, undamaged and numerous metaphase chromosomes serving as a perfect prerequisite for successful FISH analysis. Using this protocol we obtained high-quality chromosome spreads and reproducible FISH results for Hordeum vulgare, H. bulbosum, H. marinum, H. murinum, H. pubiflorum and Secale cereale.

A protocol is described for the preparation of high-quality mitotic plant chromosome spreads by a fast air-dry dropping method suitable for the FISH detection of single and high copy DNA probes.

Eine schnelle Klima trockenen Dropping Chromosom Herstellungsverfahren Geeignet für FISH in Pflanzen

Preparation of chromosome spreads is a prerequisite for the successful performance of fluorescence in situ hybridization (FISH). Preparation of high ...

Improved Swiss-rolling Technique for Intestinal Tissue Preparation for Immunohistochemical and Immunofluorescent Analyses

Understanding the role of factors that regulate intestinal epithelial homeostasis and response to injury and regeneration is important. The current literature describes several different methodological approaches to obtain images of intestinal tissues for data validation. In this paper, we delineate a common protocol relating to the derivation and processing of mouse intestinal tissues. Proper fixation of intestinal tissues and Swiss-roll techniques that enhance intestinal epithelial morphology are discussed. Postresection processing and reorientation of embedded intestinal tissues are critical in obtaining paraffin-embedded blocks that display intact intestinal structural features after sectioning. The Swiss-rolling technique helps in histological assessment of the complete intestinal or colonic sections examined. An ability to differentiate intestinal structural features can be vital in quantitative measurements of intestinal inflammation and tumorigenesis along the entire length. Finally, paraffin-embedded sections are ideal for robust processing using both immunohistochemical and immunofluorescent detection methods. Nonfluorescent immunohistochemical sections provide a vibrant image of the tissue detailing different cellular structural features but do not provide flexibility for intracellular co-localization experiments. Multiple fluorescent channels can be appropriately utilized with immunofluorescent detection for co-localization experiments, lending support to mechanistic studies.

Accurate identification and location of epithelial cells along the intestinal mucosal lining are essential to define different cell lineages. Proper imaging of intestinal tissues is crucial for identification of protein expression patterns with maximum resolution. This study aims to delineate the optimal methods and conditions for processing mouse intestinal tissues.

Verbesserte Schweizer Walztechnik für Darmgewebepräparation zur immunhistochemischen und Immunofluoreszenz-Analysen

Understanding the role of factors that regulate intestinal epithelial homeostasis and response to injury and regeneration is important. The current ...

An Easy Method for Plant Polysome Profiling

Translation of mRNA to protein is a fundamental and highly regulated biological process. Polysome profiling is considered as a gold standard for the analysis of translational regulation. The method described here is an easy and economical way for fractionating polysomes from various plant tissues. A sucrose gradient is made without the need for a gradient maker by sequentially freezing each layer. Cytosolic extracts are then prepared in a buffer containing cycloheximide and chloramphenicol to immobilize the cytosolic and chloroplastic ribosomes to mRNA and are loaded onto the sucrose gradient. After centrifugation, six fractions are directly collected from the bottom to the top of the gradient, without piercing the ultracentrifugation tube. During collection, the absorbance at 260 nm is read continuously to generate a polysome profile that gives a snapshot of global translational activity. Fractions are then pooled to prepare three different mRNA populations: the polysomes, mRNAs bound to several ribosomes; the monosomes, mRNAs bound to one ribosome; and mRNAs that are not bound to ribosomes. mRNAs are then extracted. This protocol has been validated for different plants and tissues including Arabidopsis thaliana seedlings and adult plants, Nicotiana benthamiana, Solanum lycopersicum, and Oryza sativa leaves.

This protocol describes an easy method to extract and fractionate transcripts from plant tissues on the basis of the number of bound ribosomes. It allows a global estimate of translation activity and the determination of the translational status of specific mRNAs.

Eine einfache Methode für Pflanzen Polysomen Profilieren

Translation of mRNA to protein is a fundamental and highly regulated biological process. Polysome profiling is considered as a gold standard for the ...