Das Protokoll präsentiert verschiedene Mikroskopietechniken, die angewendet werden, um die Pilzbesiedlung in mykoheterotrophen Pflanzen zu verstehen, von der Entnahme bis zur Vorbereitung von Proben im Detail und umfasst wesentliche Schritte. Solche Techniken können auf verschiedene mykoheterotrophe Pflanzen und sogar auf andere Pflanzenmaterialien als Mykoheterotrophe angewendet werden. Diese Methode bezieht sich hauptsächlich auf die strukturelle Botanik und könnte auch Einblicke in Mykorrhiza-Interaktionen, Physiologie, Reproduktionsbiologie, Evolution und Ökologie mykoheterotropher Pflanzen geben.
Sammeln Sie zunächst die mykoheterotrophen Pflanzen, indem Sie den Boden um die Pflanzenbasis herum erkunden und darauf achten, die unterirdischen Organe nicht zu beschädigen. Vermeiden Sie es auch, die Pflanzen vom Boden zu ziehen, um zu verhindern, dass die Luftorgane von den unterirdischen getrennt werden. Graben Sie vorsichtig mit einer Gartenkelle um Luftstrukturen herum, während Sie die unterirdischen Organe wie Wurzeln, Stängel, Rhizome und Speicherorgane erkunden, ohne diese Strukturen zu beschädigen.
Entfernen Sie Bodenpartikel, um zerbrechliche Strukturen zu erhalten, und waschen Sie diese Organe vorsichtig mit Leitungswasser, um die verbleibenden Bodenpartikel abzuspülen, bevor Sie die Proben fixieren. Mykoheterotrophe Pflanzen, die mit Laubstreu assoziiert sind, erfordern besondere Aufmerksamkeit. Sammeln Sie daher sorgfältig die empfindlichen Organe, die durch ihre Hyphen mit dem zersetzenden Material verbunden sind, ohne sie aus den verbundenen Strukturen zu ziehen.
Bewahren Sie Strukturen mit solchen Verbindungen und sammeln Sie den Abfall zur Analyse. Für die transmissionselektronenmikroskopische Analyse schneiden Sie die 3 bis 4 Millimeter dicken Proben in einem Tropfen Glutaraldehyd-Natriumcacodylatpuffer in kleinere Abschnitte von 1 bis 2 Millimeter Dicke. Verwerfen Sie die Schnittkanten außerhalb des Tropfens.
Stellen Sie sicher, dass der Fixierungsprozess an der Sammelstelle unmittelbar nach der Sammlung der Pflanzen durchgeführt wird. Die Abschnitte werden sofort in ein Sammelröhrchen mit einem Fixiermittelvolumen überführt, das mehr als 10-mal größer ist als das Volumen der Proben, da es sich um ein additives Fixiermittel handelt. Zur Oberflächenanalyse der oberflächlichen Hyphen in den Organen, insbesondere bei unterirdischen Organen und solchen, die mit Laubstreu in Kontakt kommen.
Beobachten Sie frisches oder festes Material unter dem Seziermikroskop bei einer 7,5-fachen oder höheren Vergrößerung. Suchen Sie nach den Interessengebieten, die von den oberflächlichen Hyphen und den Rhizomorphen geleitet werden. Wählen Sie die Proben aus, die Bereiche mit oberflächlichen Rhizomorphen enthalten, da diese geschnitten werden können, um Pelotone und Hyphenspulen innerhalb kortikaler Zellen in Wurzeln und Stängeln sichtbar zu machen.
0,2 Milligramm pro Milliliter Weizenkeimagglutininfluorochrom-Konjugat und 1%Calcofluor-Weißlösungen in 0,1-Mol-Phosphatpuffer wie im Textmanuskript beschrieben hergestellt. Inkubieren Sie nun die Abschnitte auf Glasobjektträgern, indem Sie sie 30 Minuten lang mit Weizenkeimagglutinininfluorochrom-Konjugatlösung abdecken. Nach der Inkubation waschen Sie die Abschnitte mit 0,1 molaren Phosphatpuffer und inkubieren sie in der Calcofluorlösung als Trägermedium.
Als nächstes legen Sie Deckblätter auf die Objektträger und beobachten Sie sie unter einem konfokalen oder fluoreszenzischen Lichtmikroskop mit den angegebenen Filtern. Nachdem Sie die Proben fixiert, dehydriert und in 70% Ethanol gelagert haben, belichten Sie jede gewünschte Oberfläche für die Rasterelektronenmikroskopie-Analyse, indem Sie eine scharfe und neue Rasierklinge verwenden, um Schnitte mit einer Einwegbewegung vorzunehmen. Verwenden Sie bei Bedarf ein Stereomikroskop, um die Proben auszuwählen, und berücksichtigen Sie den Bereich der Metallstummel bei der Bestimmung der Probengrößen.
Ferner dehydrieren Sie die Proben in einer ethanolischen Serie. Bewahren Sie kleine und empfindliche Proben für 30 Minuten in jeder Konzentration und größere und dichtere Proben für 1 Stunde auf. Als nächstes falten Sie kleine Umschläge mit Seidenpapier, um Proben für die nächsten Schritte zu organisieren.
Größere Proben können ohne Umschlag gehandhabt werden. Beschriften Sie die Umschläge mit einem Bleistift und führen Sie ein Protokoll der Proben. Legen Sie die Proben vorsichtig mit einem Pinsel in die Umschläge.
Bewahren Sie diese Proben nun in absolutem Ethanol auf. Fahren Sie sofort mit der Trocknung kritischer Punkte fort, indem Sie einen kritischen Punkttrockner gemäß den Standardarbeitsanweisungen betreiben. Legen Sie dazu die Proben in absolutes Ethanol in einen Probenhalter und legen Sie es in die Druckkammer des Trockners des kritischen Punktes.
Die Zwischenflüssigkeit löst sich am kritischen Kohlendioxidpunkt in die Übergangsflüssigkeit und trocknet so die Proben. Da die Rückabsorption der Luftfeuchtigkeit die Proben zerstören kann, lagern Sie sie unmittelbar nach der Trocknung des kritischen Punktes in einem Austrocknungsbehälter. Bevor Sie die Proben auf Metallstummel montieren, ziehen Sie die Handschuhe an, um die Stummel zu manipulieren.
Tauchen Sie sie für 5 Minuten in Aceton, um Fett zu entfernen und trocknen zu lassen. Fixieren Sie die Proben unter einem Stereomikroskop mit einem leitfähigen doppelseitigen Kohleklebeband auf dem Stummel, und positionieren Sie sie. Die Stelle von oben ist die einzig mögliche Perspektive in rasterelektronenmikroskopischen Bildern.
Um die Proben zu bearbeiten, verwenden Sie eine Feinspitzenpinzette. Das von der Pinzette berührte Probenteil ist in der Regel beschädigt. Seien Sie also vorsichtig und versuchen Sie, Teile zu berühren, die außerhalb der interessierenden Bereiche positioniert sind.
Pflegen Sie die Stubs mit Proben in einer verschlossenen Petrischale mit Silikagel. Als nächstes fahren Sie mit der Sputterbeschichtung fort, um eine Gold- oder Platinschicht auf der Oberfläche der Proben in einer Niederdruckatmosphäre aus Inertgas abzuscheiden, indem Sie die Standardarbeitsanweisungen befolgen. Die Schichtdicke hängt von der Topographie der Probe ab und liegt in der Regel zwischen 15 und 40 Nanometern.
Zum Schluss halten Sie die beschichteten Stummel in einer versiegelten Petrischale mit Silikagel, das Feuchtigkeit speichert. Die Proben können auf diese Weise wochenlang gelagert werden. Verwenden Sie ein Rasterelektronenmikroskop, um diese Proben zu analysieren.
Ein Elektronenstrahl trifft während der Rasterelektronenmikroskopie auf die Vakuumprobe und die Signalemission aus dieser Wechselwirkung wird als Bilder interpretiert. Stellen Sie sicher, dass die Lösungen und Materialien, die bei der symbiotischen Keimung von Samen verwendet werden, steril sind. um eine Kontamination zu vermeiden.
Beginnen Sie mit dem Autoklavieren für 20 Minuten bei 121 Grad Celsius. In einer laminaren Luftstromhaube die Früchte und Samen oberflächlich desinfizieren, indem Sie sie in eine Natriumhypochloritlösung mit 2% aktivem Chlor tauchen. Schlanke und zerbrechliche Samen können in eine 1:1 verdünnte Natriumhypochloritlösung getaucht werden.
Nach der Desinfektion erholen Sie sich die Samen, indem Sie sie mit xerografischem Gewebe filtern. Waschen Sie die Früchte und Samen dreimal in autoklaviertem destilliertem Wasser, um die Hypochloritlösung zu entfernen, bevor Sie mit den Keimtests fortfahren. Bewahren Sie sie gegebenenfalls in Filterpapierhüllen in Glaskolben mit Kieselgel bei 4 Grad Celsius auf und verschließen Sie die Kolben hermetisch und verschließen Sie sie mit Frischhaltefolie, dann bewerten Sie die Wirksamkeit des Waschvorgangs, indem Sie einige Tropfen Wasser aus der letzten Wäsche in Kartoffeldextrose-Agar überführen.
Für die symbiotische Keimung von Orchideensamen inkubieren Sie die Samen über 1 bis 2 Zentimeter autoklavierte Filterpapierscheiben, die in Petrischalen mit Haferflocken-Agar-Kulturmedium platziert sind. Beimpfen Sie nun die Mitte der Petrischale mit dem Fragment des Kulturmediums, das Myzel aus dem ausgewählten isolierten Pilz enthält. Verschließen Sie die Petrischalen mit Frischhaltefolie und brüten Sie sie je nach Pilzwachstum im Dunkeln bei etwa 25 Grad Celsius oder Raumtemperatur aus.
Bereiten Sie einige Gerichte mit Samen und ohne Pilzimpfung als Negativkontrolle für den Keimtest zu. Analysieren Sie die Keimergebnisse wöchentlich, indem Sie quantitative und qualitative Daten sammeln und Protocorme und Sämlinge fotografieren. Die Rhizomorphe sind in der Regel leicht als dunkle, shoestringartige Strukturen zu erkennen.
Freihand- oder andere Methoden zur Gewinnung von Abschnitten, die dicker als 10 Mikrometer sind, können Pelotone besser nachweisen und repräsentativere Bilder von Pilzmustern der Besiedlung liefern. Freihandschnitte können auch für die Hyphenanalyse in höherer Verstärkung geeignet sein. Details werden jedoch besser in dünneren Abschnitten erreicht.
Die sekundären Zellwände in Xylemelementen können leicht durch die Lichtfarbe identifiziert werden, die Toluidine erwirbt. Phloemelemente, die nur aus primären Zellwänden bestehen, werden durch ihre dünneren und dunkleren Zellwände identifiziert. Artefakte durch Autofluoreszenz können in Glykolmethacrylat-Harzabschnitten gesehen werden.
Diese Artefakte hängen normalerweise mit der Fluorchromkonzentration zusammen und können vermieden werden, indem die Proben häufiger mit dem Puffer gewaschen werden. Der freihändige Abschnitt der Wurzel zeigt innere und äußere Hyphen. Das gleiche Organ kann durch Rasterelektronenmikroskopie mit einer Fülle von Rhizomorphen und einzelnen Hyphen auf seiner Oberfläche gesehen werden.
Die meisten Orchideenarten keimen innerhalb weniger Wochen nach der Infektion mit dem geimpften Pilz oder bis fast mehr als einen Monat. Licht in der Rasterelektronenmikroskopie kann auf Blumen, Früchte und Samen angewendet werden, um die Reproduktionsbiologie oder mykoheterotrophe Pflanzen zu untersuchen. Die symbiotische Keimung von Samen kann auch in autotrophen Orchideen getestet werden.
