Die Autoren möchten die Ligue Francaise contre l&#39;Epilepsie zu bestätigen (MA-L), Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Grants AVENIR R12087FS (FJ), gewähren von der Universität Montpellier (FJ) und Grant von Federation pour la Recherche sur le Cerveau (NM). Wir erkennen die technische Unterstützung von Chrystel Lafont bei der IPAM in-vivo-Bildgebung Kernplattform Einrichtung von Montpellier. Wir danken auch Mary Vernov (Weill Cornell Medical College) für das Manuskript Korrektur.

Mäuse sind erlaubt ad libitum Zugang zu Nahrung, Wasser und gewartet werden auf einer 12-Stunden - Licht-Dunkel - Zyklus. Alle Verfahren beteiligt Labortieren entsprachen nationalen und europäischen Gesetze und wurden von der Französisch Ministerium für Bildung und wissenschaftliche Forschung (CEEA-LR-00651-01) zugelassen. Insgesamt 6 transgenen 5xFAD und 4 littermate Wildtyp- (WT) Kontrollmäuse wurden für dieses Verfahren verwendet. 1. Die präoperative Vorbereitung <ol><li> Intraperitoneal (IP) Methoxy-X04 (10 mg / kg) 48 Stunden vor der Operation injizieren 11 Aß Ablagerungen zu etikettieren. </li><li> Bereiten sterile künstliche Cerebrospinal - Flüssigkeit (aCSF) (120 mM NaCl, 26,2 mM NaHCO 3, 2,5 mM KCl, 1 mM NaH 2 PO 4, 1,3 mM MgCl 2, 10 mM Glucose; Blase mit 95% O 2/5% CO 2 vor Zugabe von 2,5 mM CaCl 2). </li><li> Sterilisieren chirurgische Instrumente (Scheren, Pinzetten, Rasierklingen und Bohrer), einen Autoklaven oder eine heiße Perle Sterilisator mit vor aseptischenChirurgie. </li><li> Reinigen Sie die OP-Tisch und Mikroskop Platte mit 70% Ethanol und Abdeckung mit einem sauberen, saugfähigen Tuch. </li><li> Injizieren Ketamin / Xylazin (75 mg / kg und 10 mg / kg, jeweils) und die analgetische Ketoprofen (2,5 mg / kg) IP. </li><li> Überprüfen Sie die entsprechende Ebene der Anästhesie mit Pfote oder Schwanz kneift. </li><li> Bewerben sterile Augensalbe auf die Augen und rasieren das Fell (Nase zu Ohren), während die Barthaare zu vermeiden. A Enthaarungscreme kann so lange verwendet werden, wie es durch sorgfältiges Spülen mit Wasser folgt Hautreizungen zu verhindern. Rasieren Sie die verbleibende Fell mit einer Rasierklinge. Sterilisieren Sie die Haut mit PVP-Jod antiseptische Lösung. </li><li> Platzieren Sie die Maus unter dem Binokular und machen einen Hautschnitt von den Ohren zur Nase. Ziehen Sie die Haut seitlich auf den Schädel aus. Inzision des Periosts und wiederholt den Schädel mit sterilem aCSF spülen möglich Blutung zu stoppen. </li></ol> 2. Gefäßsystem Labeling und verdünnt SchädelFenstervorbereitung (40 min) <ol><li> Entfernen Sie die Augensalbe mit einem Wattestäbchen. Einen Tropfen topisches Augen Betäubungsmittel (Tetracain 1%) und den Druck sanft die Haut um die Augenhöhle Vorsprung zu erzielen. </li><li> Injizieren Fluorescein - Isothiocyanat (FITC) konjugiert mit Dextran (70 kD) (100 mg / kg oder 50 &amp; mgr; l einer 50 mg / ml Lösung; hypodermischen Nadel Insulin) in dem retroorbitalen Sinus nach dem Verfahren , beschrieben von Yardeni und Kollegen 12. Bewerben sterile Augensalbe auf die Augen. </li><li> Stellen Sie sicher, dass die Haut eingezogen ist und der Schädel ist sauber und trocken um den ausgewählten Imaging-Bereich. Eine kleine Menge von Cyanacryl- Klebstoff um das Fenster des Galgens Vorrichtung (bestehend aus gestapelten Rasierklingen, siehe Abbildung 1), und Kleber um den Zielbereich mit sanftem Druck für einige Sekunden 10. </li><li> Ziehen Sie die Enden der Haut an den Rand des Fensters der Kopfvorrichtung montieren, so dass Sie sicher, dass der Bereichtrocken. Sichern Sie die Haut und den Rand des Fensters mit einer kleinen Menge von Tier Klasse Cyanacryl- Leim und warten , bis sie trocken (Abbildung 1). </li><li> Sichern Sie das Tier auf der Bühne mit dem Kopf-Mount-Gerät. Spülen mit sterilem aCSF und sicherzustellen, dass die gut zwischen der Haut und Kopfmontage Gerät perfekt abgedichtet ist. Wickeln Sie die Maus in einer Rettungsdecke zu Normothermie aufrechtzuerhalten. </li><li> Führen Ausdünnung des Schädels in aCSF - Lösung , wie zuvor beschrieben 10. Man beachte, daß die Kopfhaut nicht vollständig entfernt wird. Regelmäßig den aCSF ändern Knochentrümmer zu löschen und Gewebe eine Überhitzung zu vermeiden. Ein verbleibender Knochentrümmer mit kurzen Luft Puffs entfernt werden. Die aCSF Lösung dämpft auch Schwingungen, die durch Bohren geschaffen. HINWEIS: Die Mausschädeldicke variiert zwischen 80 bis 150 &amp; mgr; m von dem Alter des Tieres und dem interessierenden Bereich abhängt. </li><li> Mit starten Sie eine Zahnbohrer (bei mittlerer Geschwindigkeit und einem 0,7 mm-Fräse) in einem Bereich 1 der Schädeloberfläche Verdünnung.0 mm Durchmesser eine regelmäßige vertikale Bewegung parallel zum Schädel und entfernen Sie den größten Teil des spongiösen Knochens (erste 40-70 &amp; mgr; m). erinnern aCSF alle 20-30 sec und begrenzen Kontinuierliches Bohren auf 3-4 sec zu ersetzen. dass der Knochen in der Nähe von Nähten Hinweis ist gefäß. Bewerben aCSF vorgetränkt Gelfoam eventuelle Blutung zu stoppen. </li><li> Mit einem scharfen Einweg ophthalmisches mikro Klinge mit der Ausdünnung des Schädels, um fortzufahren, aufpassen, nicht übermäßigen Druck auszuüben. Der Endbereich ist von etwa 0,5 mm im Durchmesser und mit einer Dicke von 20-35 &amp; mgr; m. HINWEIS: Aufgrund Knochen nachwachsen und Vernarbung, ist es notwendig, weitere dünne das Fenster an jeder Bildgebungssitzung. </li></ol> 3. Zwei-Photonen-Mikroskopie (45 min) <ol><li> Falls notwendig, injizieren mit 19 mg / kg Ketamin ausreichende Anästhesie aufrechtzuerhalten. </li><li> Übertragen Sie die Maus (fest auf die Bühne Headmount) unter der Zwei-Photonen-Laser-Mikroskop. Unter Verwendung eines 20X tauche objective mit einer numerischen Apertur von 1,0, suchen Sie den ausgedünnten Schädel-Fenster in der Mitte des optischen Feldes der Epi-Leuchtstofflampe verwendet wird. Stellen Sie sicher, dass das Ziel immer in aCSF eingetaucht ist. </li><li> Starten Laser-Scanning mit einem modengekoppelten gepulsten Laser (Ti-Saphir-680-1040nm). Eingestellt Anregungswellenlänge bei 750 nm die emittierte Fluoreszenz des methoxy-xO4 und FITC-Dextran in den blauen und grünen Kanäle jeweils zu erfassen. HINWEIS: Das Mikroskop weist zwei Strahlteiler bei 506 nm und 555 nm. Blaues Licht wird von einem Detektor mit einem NDD 470 ± 12 nm-Filter ausgestattet erfasst. Grünes Licht ist mit einem 525 ± 25 nm-Filter durch eine hohe Empfindlichkeit GaAsP Detektor erfasst. Die maximale Laserleistung vom Objektiv emittierte sollte nicht mehr als 10 mW Laser-induzierte Gewebeschädigung zu vermeiden. </li><li> Erwerben Sie ein geringer Vergrößerung Stapel (500 &amp; mgr; m × 500 &amp; mgr; m, 512 x 512 Pixel; 2 &amp; mgr; m Schritt) bei einer 0,7X numerischen Zoom einer 3D-Karte für die präzise Relokalisierung des ROI zu erstellenzu späteren Zeitpunkten. </li><li> Erwerben Sie ein Mosaik aus vier hohe digitale Vergrößerung von Bildern mit einem 2X numerischen Zoom (200 &amp; mgr; m × 200 &amp; mgr; m, 512 x 512 Pixel; 1 &amp; mgr; m-Schritt). Unter Verwendung der Imaging-Software das Fenster in 200 &amp; mgr; m Schritten bewegen alle Regionen zu erfassen. Tiefe der Stapel ist typischerweise 250 um, ausgehend von der Pia-Oberfläche in jedem Bild des Mosaiks. </li><li> Bevor Sie die Maus aus dem Mikroskop zu entfernen, nehmen Sie ein Bild oder machen eine handgezeichnete 2D-Karte des pialen Gefäße für zukünftige Relokalisation des Abbildungsfeldes. </li></ol> 4. Wiederherstellung und Re-Imaging <ol><li> Entfernen Sie die Kopfhalterung Gerät durch Traktion anwenden, während der Schädel unter halten. Wenn irgendein Klebstoff auf den Schädel oder der Haut haften bleibt, kratzen sie vorsichtig mit einer feinen Pinzette ab. Nähen Sie die Kopfhaut und legen Sie die Maus in einem beheizten Käfig aus der Narkose zu überwachen, bevor es an den Käfig zurück. Bewerben topische antibiotische Creme auf die Naht und injizieren Ketoprofen (2,5 mg / kg) IP die folgenden 2 Tagen. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 1,1 bis 2,5 für die wiederholte Imaging-Sitzungen. Falls erforderlich, rasieren die Knochen mit einer mikro Klinge optimale Qualität des Bildes zu gewährleisten. HINWEIS: Zusätzliche Verdünnung mit dem Zahnbohrer kann notwendig sein, wenn das Intervall zwischen Imaging-Sitzungen länger als einen Monat ist. </li><li> Bewegen Sie die Maus unter dem Mikroskop epifluoreszenten Licht verwendet, gemäß der 2D-Karte des pialen Gefäß entnommen aus der vorherigen Sitzung (Schritt 3.6). </li><li> Starten Zwei-Photonen-Laser-Scanning und stellen Mikroskoptisch Ausrichtung im Mikrometer-Bereich zu erreichen, um die 3D-Karte in Schritt unter Verwendung von 3,4. Fahren Sie detaillierte Bildgebung, wie in Schritt 3.5 beschrieben. </li></ol> 5. Nach der Akquisition dreidimensionale Rekonstruktion und Bildanalyse <ol><li> Erhalten Sie dreidimensionale Rekonstruktionen des Gefäßsystems und die Amyloid-Ablagerungen, die Bildanalyse-Software 3D mit wie Imaris (Version verwendet 8.0 und 7.7.2). </li&gt; <li> Verwenden Sie das Normalisieren Layer - Plugin auf der Bildverarbeitung Menü und Kontraständerung Untermenü idealen Kontrast der beiden Kanäle in der gesamten Tiefe des Bildstapels erhalten. </li><li> Öffnen Sie die Bilder aus der gleichen Region zu allen Zeitpunkten gleichzeitig und immer verarbeiten sie parallel , um die verschiedenen Zeitpunkten zu vergleichen. </li><li> Trace Gefäße mit dem Glühfaden Tracer-Modul. <ol><li> Klicken Sie auf das Filament Symbol, um einen neuen Faden zu schaffen, lassen Sie die automatische Tracer und wählen Sie die Auto-Pfad-Methode. </li><li> Seien Sie sicher, dass der gewählte Kanal auf das Gefäßbild entspricht und mit der Auswahlfunktion des Zeigers, klicken Sie an einer Gefäßverzweigung, die über die Imaging-Sitzungen erhalten wird, während das Halten der Shift + Steuertasten, um einen Ausgangspunkt zu bestimmen. Verwenden Sie die Auswahlfunktion des Zeigers und klicken Sie auf, während die Shift-Taste gedrückt halten, die die Endpunkte der Filamente zu wählen. HINWEIS: Vergleich der obtained Skelette werden strukturelle Veränderungen des Gefäßsystems zeigen. </li></ol></li><li> Führen Sie Ebene für Ebene Analyse neue Plaques zu verfolgen. Anwenden Oberfläche Modul auf den blauen Kanal für das Wachstum von Aß-Plaques zu verfolgen. Klicken Sie auf das Symbol Oberfläche eine neue Oberfläche zu erstellen und mit der automatisierten Oberflächenerstellung fortzufahren. Verwenden Sie das Schwellwertverfahren zu setzen und das Hintergrundsignal zu subtrahieren. Das Statistik-Menü bietet auf der Oberfläche einzelner Amyloid-Ablagerungen Daten relativ. </li></ol>

<ol>
	<li>Harb, R., Whiteus, C., Freitas, C., Grutzendler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+cerebral+microvascular+plasticity+from+birth+to+death.">In vivo imaging of cerebral microvascular plasticity from birth to death.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 33 (1), 146-156 (2013).</li><li>Whiteus, C., Freitas, C., Grutzendler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perturbed+neural+activity+disrupts+cerebral+angiogenesis+during+a+postnatal+critical+period.">Perturbed neural activity disrupts cerebral angiogenesis during a postnatal critical period.</a> Nature. 505 (7483), 407-411 (2014).</li><li>Masamoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microvascular+sprouting,+extension,+and+creation+of+new+capillary+connections+with+adaptation+of+the+neighboring+astrocytes+in+adult+mouse+cortex+under+chronic+hypoxia.">Microvascular sprouting, extension, and creation of new capillary connections with adaptation of the neighboring astrocytes in adult mouse cortex under chronic hypoxia.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 34 (2), 325-331 (2014).</li><li>Marchi, N., Lerner-Natoli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebrovascular+remodeling+and+epilepsy.">Cerebrovascular remodeling and epilepsy.</a> Neuroscientist. 19 (3), 304-312 (2013).</li><li>Giannoni, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebrovascular+pathology+during+the+progression+of+experimental+Alzheimer's+disease.">Cerebrovascular pathology during the progression of experimental Alzheimer's disease.</a> Neurobiol Dis. 88, 107-117 (2016).</li><li>Kimbrough, I. 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(43), (2010).</li><li>Joseph-Mathurin, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid+beta+immunization+worsens+iron+deposits+in+the+choroid+plexus+and+cerebral+microbleeds.">Amyloid beta immunization worsens iron deposits in the choroid plexus and cerebral microbleeds.</a> Neurobiol Aging. 34 (11), 2613-2622 (2013).</li><li>Sadowski, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+prion+amyloid+deposits+in+vivo.">Targeting prion amyloid deposits in vivo.</a> J Neuropathol Exp Neurol. 63 (7), 775-784 (2004).</li></ol>

Autoren haben keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Die Open-Schädel Technik zur in - vivo - Zwei-Photonen - Mikroskopie bietet den Vorteil der unbegrenzten Imaging - Sitzungen von großen Abbildungsfelder 13,14. Aber auch diese Technik eine Entzündung in der Region von Interesse 14, oft inkompatibel oder aufprallneurovaskuläre Auslesungen 15 erzeugt. Im Gegensatz dazu wird der ausgedünnte Schädel transkranielle Technik nicht dazu führen , neuro-Entzündung, die eine zuverlässige Abbildung der zerebrovaskulären S...

Das Gehirn ist ein Gefßsystem mehrzelligen Struktur, die anatomisch und funktionell mit Neuronen gekoppelt. Eine dynamische Umgestaltung von Gefäßen tritt in der gesamten Entwicklung des Gehirns und während des Fortschreitens von Erkrankungen des zentralen Nervensystems (CNS) 1,2. Es ist weithin anerkannt , dass zerebrovaskuläre Schaden ist ein Markenzeichen von mehreren Erkrankungen des ZNS, einschließlich Epilepsie, Alzheimer-Krankheit (AD), Schädel - Hirn - Verletzungen und Enzephalitis 3,4. Daher wird Tracking zerebrovaskulären Änderungen in vivo signifikant , wenn ZNS - Erkrankungen Modellierung von Beginn und in chronischen Phasen. Als zerebrovaskulären Änderungen ergeben sich häufig gleichzeitig mit neuronaler Schädigung oder Plastizität auftreten, Bildgebung des Neuro-Gefäß stellt einen zentralen Einstiegspunkt CNS Krankheit Pathophysiologie zu entziffern. Dieses Protokoll beschreibt einen Längs Zwei-Photonen-basierten Verfahren, um den Umbau des cerebrovasculature in einem Mausmodell zu verfolgen vonAD, eine progressive Pathologie gekennzeichnet durch zerebrovaskuläre Defekte auf großen und kleinen Kalibers Gefäße aufgrund amyloidogene Plaqueablagerung 5-7. Dieses Verfahren ermöglicht die Darstellung von Amyloidablagerungen und Verfolgung ihrer Position und das Wachstum in Bezug auf neurovaskuläre Remodellierung im Verlauf der Erkrankung. Vital Fluoreszenzfarbstoffe werden vor jeder Bildgebungssitzung für die Visualisierung der cerebrovasculature und Amyloidplaques in AD transgenen Mäuse injiziert 8. Wiederholte Imaging - Sitzungen eines ROI durch einen ausgedünnten Schädel transkranielle Fenster ist nicht-invasiv und die Methode der Wahl neurovaskuläre Remodeling im lebenden Gehirn der Maus 2,5,9,10 zu beurteilen. Das folgende Verfahren beschreibt die chirurgische Protokoll, Bildaufnahme und -verarbeitung. Die frühe Progression von zerebrale Amyloid-Angiopathie (CAA) meist bei großen leptomeningealen und eindringende Arteriolen charakterisiert.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="627">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">methoxy-X04</td>
			<td style="width:125px;">tocris</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4920</td>
			<td style="width:167px;">use 10 mg/Kg</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">FITC-Dextran 70Kda</td>
			<td style="width:125px;">sigma</td>
			<td align="right" style="width:119px;">46945</td>
			<td>use 100 mg/Kg</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">gelfoam/Bloxang</td>
			<td style="width:125px;">Bausch and Lomb</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">micorsurgical blade</td>
			<td style="width:125px;">surgistar</td>
			<td align="right" style="width:119px;">6900</td>
			<td>must be sharp and not dented</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">povidone-iodine</td>
			<td style="width:125px;">betadine</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>antisceptic solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">binocular stereomicroscope</td>
			<td style="width:125px;">olympus</td>
			<td style="width:119px;">SX10</td>
			<td>optimal image contrast is crucial for this procedure</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">2-photon microscope</td>
			<td style="width:125px;">zeiss</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Zeiss LSM 710mp</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">fine scissors-toughcut</td>
			<td style="width:125px;">Fine science tools</td>
			<td>14058-09</td>
			<td>this scissors are optimized for cutting skin and soft tissue</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

longitudinal in vivo imaging of the cerebrovasculature: relevance to cns diseases

Remodeling des Gehirns Gefäßen ist ein gemeinsames Merkmal von Hirnerkrankungen. In vivo sind Abbildungsverfahren grundlegende zerebrovaskulären Plastizität oder Beschädigung auftretende Verlängerung und in Bezug auf neuronale Aktivität oder den Blutfluss zu detektieren. In vivo Zweiphotonenmikroskopie ermöglicht die Untersuchung der strukturellen und funktionellen Plastizität von großen Zelleinheiten in lebenden Gehirn. Insbesondere die ausgedünnten Schädel Fenster Vorbereitung ermöglicht die Visualisierung der kortikalen Regionen von Interesse (ROI) ohne signifikante Entzündung des Gehirns zu induzieren. Repetitive Imaging-Sitzungen der kortikalen ROI sind möglich, während der Progression zahlreicher ZNS-Erkrankungen die Charakterisierung von Krankheits Kennzeichen im Laufe der Zeit bieten. Diese Technik der Pia-Strukturen innerhalb von 250 &amp; mgr; m des Gehirns Zugriff beruht auf der Detektion von Fluoreszenzsonden kodiert durch genetische Zellmarker und / oder Vitalfarbstoffen. Letztere (zB fluoreszierende Dextrane) werden verwendet , um die lumin zur Karteal Raum von zerebrovaskulären Strukturen. Germane dem Protokoll hierin beschrieben ist die Verwendung eines in vivo - Marker von Amyloidablagerungen, Methoxy-O4, Alzheimer-Krankheit (AD) Fortschreiten zu beurteilen. Wir beschreiben auch die nach dem Erwerb der Bildverarbeitung verwendet, um Gefäßveränderungen und amyloiden Ablagerungen verfolgen. Während gegenwärtig auf einem Modell der AD Fokussierung ist das beschriebene Protokoll zu anderen ZNS-Erkrankungen relevant, wo pathologische zerebrovaskulären Änderungen auftreten.

Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Visualisierung des cerebrovasculature und Amyloidablagerungen Überstunden. Fluoreszierende Farbstoffe wurden injiziert amyloiden Ablagerungen zu beschriften (methoxy-xO4) 11 und die zerebrovaskuläre Lumen (FITC-Dextran) 1 zu füllen. 3D-Bild-Analyse-Software-Module wurden verwendet, um 3D-Bilder eines konstanten Sichtfeld zu aufeinanderfolgenden Zeitpunkten erfasst erstellen. Repräsentative Bilder im somatosensorische...

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Longitudinal In Vivo Imaging of the Cerebrovasculature: Relevance to CNS Diseases

Mit Längs Zwei-Photonen - Mikroskopie Dieses Manuskript beschreibt ein Verfahren , um den Umbau des cerebrovasculature während Amyloid - Plaque - Akkumulation in vivo zu verfolgen. Ein ausgedünnten Schädel Vorbereitung ermöglicht die Visualisierung von Fluoreszenzfarbstoffen, das Fortschreiten von zerebrovaskulären Schädigung in einem Mausmodell der Alzheimer-Krankheit zu bewerten.

in Längsrichtung<em&gt; In Vivo</em&gt; Imaging des Cerebrovasculature: Bedeutung für ZNS-Erkrankungen

Remodeling of the brain vasculature is a common trait of brain pathologies. In vivo imaging techniques are fundamental to detect cerebrovascular ...

longitudinal-vivo-imaging-cerebrovasculature-relevance-to-cns

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Medicine

Longitudinal In Vivo Imaging of the Cerebrovasculature: Relevance to CNS Diseases

7.0K Aufrufe.  Institute of Functional Genomics.  Mit Längs Zwei-Photonen - Mikroskopie Dieses Manuskript beschreibt ein Verfahren , um den Umbau des cerebrovasculature während Amyloid - Plaque - Akkumulation in vivo zu verfolgen. Ein ausgedünnten Schädel Vorbereitung ermöglicht die Visualisierung von Fluoreszenzfarbstoffen, das Fortschreiten von zerebrovaskulären Schädigung in einem Mausmodell der Alzheimer-Krankheit zu bewerten. 

Serie: Longitudinal In Vivo Imaging of the Cerebrovasculature: Relevance to CNS Diseases

The Measurement and Treatment of Suppression in Amblyopia

Amblyopia, a developmental disorder of the visual cortex, is one of the leading causes of visual dysfunction in the working age population. Current estimates put the prevalence of amblyopia at approximately 1-3%1-3, the majority of cases being monocular2. Amblyopia is most frequently caused by ocular misalignment (strabismus), blur induced by unequal refractive error (anisometropia), and in some cases by form deprivation.
Although amblyopia is initially caused by abnormal visual input in infancy, once established, the visual deficit often remains when normal visual input has been restored using surgery and/or refractive correction. This is because amblyopia is the result of abnormal visual cortex development rather than a problem with the amblyopic eye itself4,5 . Amblyopia is characterized by both monocular and binocular deficits6,7 which include impaired visual acuity and poor or absent stereopsis respectively. The visual dysfunction in amblyopia is often associated with a strong suppression of the inputs from the amblyopic eye under binocular viewing conditions8. Recent work has indicated that suppression may play a central role in both the monocular and binocular deficits associated with amblyopia9,10 .
Current clinical tests for suppression tend to verify the presence or absence of suppression rather than giving a quantitative measurement of the degree of suppression. Here we describe a technique for measuring amblyopic suppression with a compact, portable device11,12 . The device consists of a laptop computer connected to a pair of virtual reality goggles. The novelty of the technique lies in the way we present visual stimuli to measure suppression. Stimuli are shown to the amblyopic eye at high contrast while the contrast of the stimuli shown to the non-amblyopic eye are varied. Patients perform a simple signal/noise task that allows for a precise measurement of the strength of excitatory binocular interactions. The contrast offset at which neither eye has a performance advantage is a measure of the "balance point" and is a direct measure of suppression. This technique has been validated psychophysically both in control13,14 and patient6,9,11 populations.
In addition to measuring suppression this technique also forms the basis of a novel form of treatment to decrease suppression over time and improve binocular and often monocular function in adult patients with amblyopia12,15,16 . This new treatment approach can be deployed either on the goggle system described above or on a specially modified iPod touch device15.

Amblyopia is a developmental disorder of the visual cortex that is often accompanied by strong suppression of one eye. We present a new technique for measuring and treating interocular suppression in patients with amblyopia that can be deployed using virtual reality goggles or a portable iPod Touch device.

Die Messung und Behandlung von Unterdrückung in Amblyopie

Amblyopia, a developmental disorder of the visual cortex, is one of the leading causes of visual dysfunction in the working age population. Current ...

Forschung

Medizin

The Use of Pharmacological-challenge fMRI in Pre-clinical Research: Application to the 5-HT System

Pharmacological MRI (phMRI) is a new and promising method to study the effects of substances on brain function that can ultimately be used to unravel underlying neurobiological mechanisms behind drug action and neurotransmitter-related disorders, such as depression and ADHD. Like most of the imaging methods (PET, SPECT, CT) it represents a progress in the investigation of brain disorders and the related function of neurotransmitter pathways in a non-invasive way with respect of the overall neuronal connectivity. Moreover it also provides the ideal tool for translation to clinical investigations. MRI, while still behind in molecular imaging strategies compared to PET and SPECT, has the great advantage to have a high spatial resolution and no need for the injection of a contrast-agent or radio-labeled molecules, thereby avoiding the repetitive exposure to ionizing radiations. Functional MRI (fMRI) is extensively used in research and clinical setting, where it is generally combined with a psycho-motor task. phMRI is an adaptation of fMRI enabling the investigation of a specific neurotransmitter system, such as serotonin (5-HT), under physiological or pathological conditions following activation via administration of a specific challenging drug.
The aim of the method described here is to assess brain 5-HT function in free-breathing animals. By challenging the 5-HT system while simultaneously acquiring functional MR images over time, the response of the brain to this challenge can be visualized. Several studies in animals have already demonstrated that drug-induced increases in extracellular levels of e.g. 5-HT (releasing agents, selective re-uptake blockers, etc) evoke region-specific changes in blood oxygenation level dependent (BOLD) MRI signals (signal due to a change of the oxygenated/deoxygenated hemoglobin levels occurring during brain activation through an increase of the blood supply to supply the oxygen and glucose to the demanding neurons) providing an index of neurotransmitter function. It has also been shown that these effects can be reversed by treatments that decrease 5-HT availability16,13,18,7. In adult rats, BOLD signal changes following acute SSRI administration have been described in several 5-HT related brain regions, i.e. cortical areas, hippocampus, hypothalamus and thalamus9,16,15. Stimulation of the 5-HT system and its response to this challenge can be thus used as a measure of its function in both animals and humans2,11.

The goal of this technique is to assess serotonin (5-HT) neurotransmitter function in the live and free-breathing animal with pharmacological magnetic resonance imaging (phMRI) and an intravenous challenge with a selective serotonin reuptake inhibitor (SSRI), fluoxetine.

Die Verwendung von pharmakologischen fMRT-Herausforderung in der präklinischen Forschung: Anwendung auf die 5-HT-System

Pharmacological MRI (phMRI) is a new and promising method to study the effects of substances on brain function that can ultimately be used to unravel ...

Intranasal Administration of CNS Therapeutics to Awake Mice

Intranasal administration is a method of delivering therapeutic agents to the central nervous system (CNS). It is non-invasive and allows large molecules that do not cross the blood-brain barrier access to the CNS. Drugs are directly targeted to the CNS with intranasal delivery, reducing systemic exposure and thus unwanted systemic side effects1. Delivery from the nose to the CNS occurs within minutes along both the olfactory and trigeminal neural pathways via an extracellular route and does not require drug to bind to any receptor or axonal transport2. Intranasal delivery is a widely publicized method and is currently being used in human clinical trials3.
Intranasal delivery of drugs in animal models allows for initial evaluation of pharmacokinetic distribution and efficacy. With mice, it is possible to administer drugs to awake (non-anesthetized) animals on a regular basis using a specialized intranasal grip. Awake delivery is beneficial because it allows for long-term chronic dosing without anesthesia, it takes less time than with anesthesia, and can be learned and done by many people so that teams of technicians can dose large numbers of mice in short periods. Efficacy of therapeutics administered intranasally in this way to mice has been demonstrated in a number of studies including insulin in diabetic mouse models 4-6 and deferoxamine in Alzheimer's mouse models. 7,8
The intranasal grip for mice can be learned, but is not easy and requires practice, skill, and a precise grip to effectively deliver drug to the brain and avoid drainage to the lung and stomach. Mice are restrained by hand using a modified scruff in the non-dominant hand with the neck held parallel to the floor, while drug is delivered with a pipettor using the dominant hand. It usually takes 3-4 weeks of acclimating to handling before mice can be held with this grip without a stress response. We have prepared this JoVE video to make this intranasal delivery technique more accessible.

A method to intranasally administer drugs to awake mice for the purpose of targeting the brain is described. This method allows for repeat dosing over long periods using intranasal administration of drug without anesthesia, and nose-to-brain delivery with minimal systemic exposure.

Intranasale Verabreichung von CNS Therapeutics Awake Mäuse

Intranasal administration is a method of delivering  therapeutic agents to the central nervous system (CNS). It is  non-invasive and allows large ...

In vivo Macrophage Imaging Using MR Targeted Contrast Agent for Longitudinal Evaluation of Septic Arthritis

Macrophages are key-cells in the initiation, the development and the regulation of the inflammatory response to bacterial infection. Macrophages are intensively and increasingly recruited in septic joints from the early phases of infection and the infiltration is supposed to regress once efficient removal of the pathogens is obtained. The ability to identify in vivo macrophage activity in an infected joint can therefore provide two main applications: early detection of acute synovitis and monitoring of therapy.
In vivo noninvasive detection of macrophages can be performed with magnetic resonance imaging using iron nanoparticles such as ultrasmall superparamagnetic iron oxide (USPIO). After intravascular or intraarticular administration, USPIO are specifically phagocytized by activated macrophages, and, due to their magnetic properties, induce signal changes in tissues presenting macrophage infiltration. A quantitative evaluation of the infiltrate is feasible, as the area with signal loss (number of dark pixels) observed on gradient echo MR images after particles injection is correlated with the amount of iron within the tissue and therefore reflects the number of USPIO-loaded cells.
We present here a protocol to perform macrophage imaging using USPIO-enhanced MR imaging in an animal model of septic arthritis, allowing an initial and longitudinal in vivo noninvasive evaluation of macrophages infiltration and an assessment of therapy action.

In vivo Macrophage Imaging Using MR Targeted Contrast Agent for Longitudinal Evaluation of Septic Arthritis

We demonstrate how to perform macrophage MR imaging using ultrasmall superparamagnetic contrast agent (USPIO) in septic arthritis, allowing an initial and longitudinal in vivo non-invasive evaluation of macrophages infiltration and an assessment of therapy efficacy.

In-vivo-Bildgebung mit MR Makrophagen gezielte Kontrastmittel für die Längs-Auswertung der septische Arthritis

Macrophages are key-cells in the initiation, the development and the regulation of the inflammatory response to bacterial infection. Macrophages are ...

Diffusion Tensor Magnetic Resonance Imaging in the Analysis of Neurodegenerative Diseases

Diffusion tensor imaging (DTI) techniques provide information on the microstructural processes of the cerebral white matter (WM) in vivo. The present applications are designed to investigate differences of WM involvement patterns in different brain diseases, especially neurodegenerative disorders, by use of different DTI analyses in comparison with matched controls. 	
DTI data analysis is performed in a variate fashion, i.e. voxelwise comparison of regional diffusion direction-based metrics such as fractional anisotropy (FA), together with fiber tracking (FT) accompanied by tractwise fractional anisotropy statistics (TFAS) at the group level in order to identify differences in FA along WM structures, aiming at the definition of regional patterns of WM alterations at the group level. Transformation into a stereotaxic standard space is a prerequisite for group studies and requires thorough data processing to preserve directional inter-dependencies. The present applications show optimized technical approaches for this preservation of quantitative and directional information during spatial normalization in data analyses at the group level. On this basis, FT techniques can be applied to group averaged data in order to quantify metrics information as defined by FT. Additionally, application of DTI methods, i.e. differences in FA-maps after stereotaxic alignment, in a longitudinal analysis at an individual subject basis reveal information about the progression of neurological disorders. Further quality improvement of DTI based results can be obtained during preprocessing by application of a controlled elimination of gradient directions with high noise levels.	
In summary, DTI is used to define a distinct WM pathoanatomy of different brain diseases by the combination of whole brain-based and tract-based DTI analysis.

Diffusion tensor imaging (DTI) basically serves as an MRI-based tool to identify in vivo the microstructure of the brain and pathological processes due to neurological disorders within the cerebral white matter. DTI-based analyses allow for application to brain diseases both at the group level and in single subject data.

Diffusion Tensor Magnetic Resonance Imaging in der Analyse von neurodegenerativen Erkrankungen

Diffusion tensor imaging (DTI) techniques provide information on the microstructural processes of the cerebral white matter (WM) in vivo. The present ...

Transplantation into the Anterior Chamber of the Eye for Longitudinal, Non-invasive In vivo Imaging with Single-cell Resolution in Real-time

Intravital imaging has emerged as an indispensable tool in biological research. In the process, many imaging techniques have been developed to study different biological processes in animals non-invasively. However, a major technical limitation in existing intravital imaging modalities is the inability to combine non-invasive, longitudinal imaging with single-cell resolution capabilities. We show here how transplantation into the anterior chamber of the eye circumvents such significant limitation offering a versatile experimental platform that enables non-invasive, longitudinal imaging with cellular resolution in vivo. We demonstrate the transplantation procedure in the mouse and provide representative results using a model with clinical relevance, namely pancreatic islet transplantation. In addition to enabling direct visualization in a variety of tissues transplanted into the anterior chamber of the eye, this approach provides a platform to screen drugs by performing long-term follow up and monitoring in target tissues. Because of its versatility, tissue/cell transplantation into the anterior chamber of the eye not only benefits transplantation therapies, it extends to other in vivo applications to study physiological and pathophysiological processes such as signal transduction and cancer or autoimmune disease development.

Transplantation into the Anterior Chamber of the Eye for Longitudinal, Non-invasive In vivo Imaging with Single-cell Resolution in Real-time

A new approach combining intraocular transplantation and confocal microscopy enables longitudinal, non-invasive real-time imaging with single-cell resolution within grafted tissues in vivo. We demonstrate how to transplant pancreatic islets into the anterior chamber of the mouse eye.

Transplantation in die Vorderkammer des Auges für Längs-, Non-invasive<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging mit Single-cell Auflösung in Echtzeit

Intravital imaging has emerged as an indispensable tool in biological research.  In the process, many imaging techniques have been developed to study ...

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

In vivo 19F MRI allows quantitative cell tracking without the use of ionizing radiation. It is a noninvasive technique that can be applied to humans. Here, we describe a general protocol for cell labeling, imaging, and image processing. The technique is applicable to various cell types and animal models, although here we focus on a typical mouse model for tracking murine immune cells. The most important issues for cell labeling are described, as these are relevant to all models. Similarly, key imaging parameters are listed, although the details will vary depending on the MRI system and the individual setup. Finally, we include an image processing protocol for quantification. Variations for this, and other parts of the protocol, are assessed in the Discussion section. Based on the detailed procedure described here, the user will need to adapt the protocol for each specific cell type, cell label, animal model, and imaging setup. Note that the protocol can also be adapted for human use, as long as clinical restrictions are met.

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

We describe a general protocol for in vivo cell tracking using MRI in a mouse model with ex vivo labeled cells. A typical protocol for cell labeling, image acquisition processing and quantification is included.

In-vivo-19 F-MRT für die Zellverfolgung

In vivo 19F MRI allows quantitative cell tracking without the use of ionizing radiation. It is a noninvasive technique that can be applied to humans. ...

Acute Brain Trauma in Mice Followed By Longitudinal Two-photon Imaging

Although acute brain trauma often results from head damage in different accidents and affects a substantial fraction of the population, there is no effective treatment for it yet. Limitations of currently used animal models impede understanding of the pathology mechanism. Multiphoton microscopy allows studying cells and tissues within intact animal brains longitudinally under physiological and pathological conditions. Here, we describe two models of acute brain injury studied by means of two-photon imaging of brain cell behavior under posttraumatic conditions. A selected brain region is injured with a sharp needle to produce a trauma of a controlled width and depth in the brain parenchyma. Our method uses stereotaxic prick with a syringe needle, which can be combined with simultaneous drug application. We propose that this method can be used as an advanced tool to study cellular mechanisms of pathophysiological consequences of acute trauma in mammalian brain in vivo. In this video, we combine acute brain injury with two preparations: cranial window and skull thinning. We also discuss advantages and limitations of both preparations for multisession imaging of brain regeneration after trauma.

Acute brain trauma is a severe injury that has no adequate treatment to date. Multiphoton microscopy allows studying longitudinally the process of acute brain trauma development and probing therapeutical strategies in rodents. Two models of acute brain trauma studied with in vivo two-photon imaging of brain are demonstrated in this protocol.

Akute Brain Trauma in Mäusen Gefolgt durch Längs Zwei-Photonen-Imaging

Although acute brain trauma often results from head damage in different accidents and affects a substantial fraction of the population, there is no ...

In Vivo Imaging and Tracking of Technetium-99m Labeled Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells in Equine Tendinopathy

Recent advances in the application of bone marrow mesenchymal stem cells (BMMSC) for the treatment of tendon and ligament injuries in the horse suggest improved outcome measures in both experimental and clinical studies. Although the BMMSC are implanted into the tendon lesion in large numbers (usually 10 - 20 million cells), only a relatively small number survive (&#60;10%) although these can persist for up to 5 months after implantation. This appears to be a common observation in other species where BMMSC have been implanted into other tissues and it is important to understand when this loss occurs, how many survive the initial implantation process and whether the cells are cleared into other organs. Tracking the fate of the cells can be achieved by radiolabeling the BMMSC prior to implantation which allows non-invasive in vivo imaging of cell location and quantification of cell numbers.
This protocol describes a cell labeling procedure that uses Technetium-99m (Tc-99m), and tracking of these cells following implantation into injured flexor tendons in horses. Tc-99m is a short-lived (t1/2 of 6.01 hr) isotope that emits gamma rays and can be internalized by cells in the presence of the lipophilic compound hexamethylpropyleneamine oxime (HMPAO). These properties make it ideal for use in nuclear medicine clinics for the diagnosis of many different diseases. The fate of the labeled cells can be followed in the short term (up to 36 hr) by gamma scintigraphy to quantify both the number of cells retained in the lesion and distribution of the cells into lungs, thyroid and other organs. This technique is adapted from the labeling of blood leukocytes and could be utilized to image implanted BMMSC in other organs.

In Vivo Imaging and Tracking of Technetium-99m Labeled Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells in Equine Tendinopathy

This protocol describes the radiolabeling of equine mesenchymal stem cells and their implantation into tendon injuries in the horse in order to determine cell survival and tissue distribution using gamma scintigraphy.

In-vivo-Imaging und Verfolgung von Technetium-99m markierten Knochenmark mesenchymale Stammzellen in Equine Tendinopathie

Recent advances in the application of bone marrow mesenchymal stem cells (BMMSC) for the treatment of tendon and ligament injuries in the horse suggest ...

Rose Bengal Photothrombosis by Confocal Optical Imaging In Vivo: A Model of Single Vessel Stroke

In vivo imaging techniques have increased in utilization due to recent advances in imaging dyes and optical technologies, allowing for the ability to image cellular events in an intact animal. Additionally, the ability to induce physiological disease states such as stroke in vivo increases its utility. The technique described herein allows for physiological assessment of cellular responses within the CNS following a stroke and can be adapted for other pathological conditions being studied. The technique presented uses laser excitation of the photosensitive dye Rose Bengal in vivo to induce a focal ischemic event in a single blood vessel. 
The video protocol demonstrates the preparation of a thin-skulled cranial window over the somatosensory cortex in a mouse for the induction of a Rose Bengal photothrombotic event keeping injury to the underlying dura matter and brain at a minimum. Surgical preparation is initially performed under a dissecting microscope with a custom-made surgical/imaging platform, which is then transferred to a confocal microscope equipped with an inverted objective adaptor. Representative images acquired utilizing this protocol are presented as well as time-lapse sequences of stroke induction. This technique is powerful in that the same area can be imaged repeatedly on subsequent days facilitating longitudinal in vivo studies of pathological processes following stroke.

Rose Bengal Photothrombosis by Confocal Optical Imaging In Vivo:  A Model of Single Vessel Stroke

Here, we describe a semi-invasive optical microscopy approach for the induction of a Rose Bengal photothrombotic clot in the somatosensory cortex of a mouse in vivo. The technical aspects of the imaging procedure are described from induction of a photothrombotic event to application and data collection.

Rose Bengal Photothrombosis von konfokalen optischen Imaging<em&gt; In Vivo</em&gt;: Ein Modell des Einzelfahrzeug Stroke

In vivo imaging techniques have increased in utilization due to recent advances in imaging dyes and optical technologies, allowing for the ability to ...