저자는 리그 프랑세즈 CONTRE 난 épilepsie (MA-L에), (FJ에) 연구소 국립 드 라 상테 등 드 라 공들인 MEDICALE 부여 AVENIR R12087FS은 몽펠리에 대학에서 부여 (FJ에) 및 허가를 인정하고 싶습니다 연맹에서 (NM에) 라 공들인 쉬르 르 Cerveau을 붓는다. 우리는 몽펠리에의 생체 내 이미징 코어 플랫폼 기능의 IPAM에서 Chrystel Lafont의 기술 지원을 인정합니다. 우리는 또한 원고를 교정하기위한 메리 Vernov (웨일 코넬 의과 대학)을 주셔서 감사합니다.

마우스는 음식, 물에 광고 무제한 액세스를 허용하고, 12 시간의 명암주기에 유지됩니다. 실험 동물과 관련된 모든 절차는 국가 및 유럽 법을 따른다 교육 및 과학 연구 (CEEA-LR-00651-01)에 대한 프랑스의 교육부에 의해 승인되었다. (6) 형질 전환 5xFAD 4 한배 새끼를 야생형 (WT) 대조군의 총이 절차에 사용 하였다. 1. 수술 전 준비 <ol><li> 복강 (IP) 메 톡시 - X04 (10 ㎎ / ㎏) Aβ 예금 (11) 레이블을 수술 전 48 시간을 주입. </li><li> 멸균 된 인공 뇌척수액 (ACSF) (120 mM의 NaCl을, 26.2 밀리미터의 NaHCO3, 2.5 밀리미터의 KCl을 준비 1 ㎜의 NaH 2 PO 4, 1.3 밀리미터의 MgCl 2, 10 mM의 포도당, 95 % O 2 / 5 % CO 2 이전과 거품 2.5 mM의 CaCl2를) 첨가. </li><li> 오토 클레이브 또는 무균 전에 뜨거운 구슬 살균기를 사용하여, 수술 도구 (가위, 집게, 면도날과 드릴 비트) 소독외과. </li><li> 깨끗한 흡수 천으로 70 % 에탄올과 커버 수술 벤치와 현미경 플레이트를 청소합니다. </li><li> 케타민 / 자일 라진 (75 ㎎ / ㎏, 10 ㎎ / ㎏, 각각) 및 진통 케토 프로 펜 (2.5 ㎎ / ㎏) IP를 주입한다. </li><li> 발이나 꼬리 핀치와 마취의 적절한 수준을 확인합니다. </li><li> 눈에 멸균 안과 연고를 적용하고 수염을 피하면서 모피 (귀 코) 면도. 이 심하게 피부 자극을 방지하기 위해 세정을 행한 뒤에으로하는 제모 크림 길이로 사용될 수있다. 면도날에 남아있는 털을 면도. 포비돈 요오드 소독액로 피부를 소독. </li><li> 양안 현미경으로 마우스를 놓고 코 귀에서 피부 절개를합니다. 두개골을 노출 옆으로 피부를 당겨. 골막을 절개하고 반복 가능한 출혈을 멈추게하기 위해 멸균 ACSF으로 두개골을 씻어. </li></ol> 2. 혈관 라벨 및 박형화 두개골창 준비 (40 분) <ol><li> 코튼 팁 눈 연고를 제거합니다. 국소 안과 마취제 (tetracaine에 1 %) 한 방울을 적용하고 부드럽게 돌출부를 달성하기 위해 안와 주위 피부 압박. </li><li> Yardeni 동료 (12)에 의해 기술 된 절차에 따라 역 궤도 부비동에서 (피하 인슐린 바늘 100 ㎎ / ㎏ 또는 50 ㎎ / ㎖ 용액 50 μL) 덱스 트란 (70 kDa의)와 접합 형광 이소 티오 시아 네이트 (FITC)를 주입한다. 눈에 멸균 안과 연고를 적용합니다. </li><li> 피부가 후퇴하고 두개골 선택한 이미지 주변 깨끗하고 건조 된 상태인지 확인하십시오. 디바이스 장착 헤드의 창 주위 cyanoacrylic 접착제 소량 적용 수초 10 완만 한 압력을 적용 대상 영역 주위의 접착제 (적층 면도기 블레이드로 이루어진,도 1 참조). </li><li> 면적이 확실하게 디바이스를 탑재 헤드 윈도우의 가장자리에 피부의 끝을 당겨마른. 피부 의학적 등급 cyanoacrylic 접착제 소량의 윈도우 가장자리를 고정하고 건조 (도 1)까지 기다린다. </li><li> 헤드 마운트 장치를 사용하는 단계에서, 동물을 고정. 멸균 ACSF 헹군 후 잘 피부와 헤드 마운트 장치 사이에 완벽하게 밀봉되어 있는지 확인합니다. 정상 체온을 유지하기 위해 생존 담요에 마우스를 감싸. </li><li> 이전 10 바와 같이 ACSF 용액에 두개골의 박형화를 수행한다. 두피가 완전히 제거되지 않습니다. 정기적으로 뼈 파편을 취소하고 조직의 과열을 방지하기 위해 ACSF을 변경합니다. 남아있는 뼈 파편은 간단한 에어 퍼프로 제거 할 수 있습니다. ACSF 솔루션은 시추에 의해 생성 된 진동을 감쇠. 참고 : 동물의 연령과 관심 영역에 따라 μm의 150-80 사이에 마우스 두개골 두께가 달라집니다. </li><li> (중간 속도 및 0.7 mm 버) 치과 용 드릴을 사용하면 영역 1에서 두개골 표면을 얇게 시작합니다.두개골에 정기적으로 수직 운동 평행을 사용하여 제거 직경 0mm 해면골의 대부분 (제 1 40-70 μm의). ACSF마다 20 ~ 30 초를 교체하고 3 ~ 4 초에 중단 드릴링을 제한해야합니다. 그 뼈 근처 봉합 참고 높은 혈관이다. ACSF는 결국 출혈을 멈추게하기 위해 gelfoam을을 적시고 적용합니다. </li><li> 과도한 압력이 가해지지 않도록주의하면서 두개골의 숱이 계속 날카로운 일회용 안과 미세 수술 블레이드를 사용합니다. 35 μm의 - 최종 영역의 직경 및 20의 두께는 약 0.5 mm이다. 참고 : 뼈의 재성장과 흉터에, 그것은 각각의 영상 회의에서 더 얇은 창에 필요한 인해. </li></ol> 3. 이광자 현미경 (45 분) <ol><li> 필요한 경우, 충분한 마취를 유지하기 위해 19 밀리그램 / kg 케타민 주입. </li><li> 이광자 레이저 현미경 (headmount 스테이지에 고정 된) 마우스를 옮긴다. 20 배 침수 OBJ를 사용하여1.0 개구 수 ective 에피 형광 램프를 이용하여 광 필드의 중심에서 얇아진 두개골 창을 찾아. 목적이 항상 ACSF에 몰입되어 있는지 확인합니다. </li><li> 모드 잠금 펄스 레이저 (티 - 사파이어 680-1040nm)와 레이저 스캔을 시작합니다. 각각 파란색과 녹색 채널에서 방출 된 메 톡시 XO4의 형광 및 FITC-덱스 트란를 감지하는 750 nm의 여기 파장을 설정합니다. 참고 : 현미경은 506 nm 내지 555 nm에서 두 개의 빔 스플리터가 있습니다. 청색 광은 470 ± 12 nm의 필터를 구비 한 NDD 검출기에 의해 캡쳐된다. 녹색광은 525 ± 25 nm의 필터를 구비 한 고감도 하나로 이루어질 검출기에 의해 캡쳐된다. 대물로부터 방출 최대 레이저 출력은 레이저 - 유도 된 조직 손상을 피하기 위해 10 mW의을 초과하지 않아야한다. </li><li> 낮은 배율 스택을 획득 (500 μm의 X 500 μm의 512 X 512 픽셀, 2 μm의 단계) 투자 수익 (ROI)의 정확한 relocalization에 대한 3 차원지도를 제작하는 0.7 배 수치 줌에나중 시점에서. </li><li> 2 배 수치 줌 4 높은 디지털 확대 이미지의 모자이크를 취득 (200 μm의 X 200 μm의 512 X 512 픽셀, 1 μm의 단계). 이미징 소프트웨어는 200 μm의 단계로 창을 이동 사용하면 모든 지역을 촬영합니다. 스택의 깊이는 모자이크의 각 이미지에 pial 표면에서 시작하여, 일반적으로 250 μm의입니다. </li><li> 현미경에서 마우스를 제거하기 전에 사진을 촬영하거나 이미징 분야의 미래 relocalization에 대한 pial 혈관의 손으로 그린 ​​2D지도를합니다. </li></ol> 4. 복구 및 재 이미징 <ol><li> 아래 두개골을 누른 상태에서 견인을 적용하여 헤드 마운트 장치를 제거합니다. 어떤 접착제가 두개골이나 피부에 부착 된 상태를 유지하는 경우, 미세 집게로 조심스럽게 긁어. 두피를 봉합하고 홈 케이지에 반환하기 전에 마취에서 회복을 모니터링하는 가열 새장에 마우스를 놓습니다. 봉합사에 국소 항생제 크림을 적용하고 케토 프로 펜을 주입 (2.5 ㎎ / ㎏) IP는 이일 다음과 같습니다. </li><li> 반복 1.1 반복 이미징 세션에 대한 2.5 단계를 반복합니다. 필요한 경우, 화상의 최적의 품질을 보장하기 위해 미세 수술 블레이드 뼈 면도. 참고 : 이미징 세션 사이의 간격 한 달 이상 때 ​​치과 드릴 추가 숱이 필요할 수 있습니다. </li><li> 이전 세션 (단계 3.6)에서 촬영 pial 혈관의 2D 맵에 따라 epifluorescent 빛을 사용하여 현미경 아래에 마우스를 놓습니다. </li><li> 이광자 레이저 스캐닝을 시작하고, 단계 34에서 수득 한 3 차원지도를 이용하여 마이크로 미터 규모로 정렬하기 위해 현미경 스테이지를 조절. 단계 3.5에 설명 된대로 상세한 이미지로 넘어갑니다. </li></ol> 5. 후 인수 3 차원 재구성 및 이미지 분석 <ol><li> 입체 혈관의 복원 및 IMARIS 같은 3D 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 아밀로이드 침착을 (버전 8.0 및 7.7.2를 사용)을 얻었다. </li&gt; <li> 이미지 스택의 전체 깊이에 두 채널의 이상적인 대비를 얻기 위해 이미지 처리 메뉴 및 대비 변화 하위 메뉴의 표준화 계층 플러그인을 사용합니다. </li><li> 동시에 모든 시점에서 동일한 영역에서 이미지를 열고 항상 다른 시점을 비교하기 위해 병렬로 처리합니다. </li><li> 필라멘트 추적 모듈을 사용하여 추적 용기. <ol><li> 새로운 필라멘트를 만들 필라멘트 아이콘을 클릭 자동 추적을 건너 뛰고 자동 경로 방법을 선택합니다. </li><li> 선택된 채널은 혈관 화상과 상기 포인터의 선택 기능을 이용에 대응해야하는 시점을 결정하기 위해 시프트 + 컨트롤 키를 누른 상태에서 촬상 세션에서 보존하는 용기 분기점에서 클릭. 포인터의 선택 기능을 사용하여 필라멘트의 끝점을 선택하려면 Shift 키를 누른 상태에서 클릭합니다. 참고 : obtai의 비교네드 켈리는 혈관의 구조적 변화를 표시합니다. </li></ol></li><li> 새로운 플라크를 추적하는면 분석에 의해 평면을 수행합니다. Aβ 플라크의 성장을 추적 파랑 채널에 표면 모듈을 적용합니다. 새로운 표면을 생성하고 자동 표면 생성을 진행 표면의 아이콘을 클릭합니다. 설정하고 배경 신호를 감산하는 임계 방법을 사용합니다. 통계 메뉴 개별 아밀로이드 침착의 표면에 관한 데이터를 제공한다. </li></ol>

<ol>
	<li>Harb, R., Whiteus, C., Freitas, C., Grutzendler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+cerebral+microvascular+plasticity+from+birth+to+death.">In vivo imaging of cerebral microvascular plasticity from birth to death.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 33 (1), 146-156 (2013).</li><li>Whiteus, C., Freitas, C., Grutzendler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perturbed+neural+activity+disrupts+cerebral+angiogenesis+during+a+postnatal+critical+period.">Perturbed neural activity disrupts cerebral angiogenesis during a postnatal critical period.</a> Nature. 505 (7483), 407-411 (2014).</li><li>Masamoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microvascular+sprouting,+extension,+and+creation+of+new+capillary+connections+with+adaptation+of+the+neighboring+astrocytes+in+adult+mouse+cortex+under+chronic+hypoxia.">Microvascular sprouting, extension, and creation of new capillary connections with adaptation of the neighboring astrocytes in adult mouse cortex under chronic hypoxia.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 34 (2), 325-331 (2014).</li><li>Marchi, N., Lerner-Natoli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebrovascular+remodeling+and+epilepsy.">Cerebrovascular remodeling and epilepsy.</a> Neuroscientist. 19 (3), 304-312 (2013).</li><li>Giannoni, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebrovascular+pathology+during+the+progression+of+experimental+Alzheimer's+disease.">Cerebrovascular pathology during the progression of experimental Alzheimer's disease.</a> Neurobiol Dis. 88, 107-117 (2016).</li><li>Kimbrough, I. F., Robel, S., Roberson, E. D., Sontheimer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+amyloidosis+impairs+the+gliovascular+unit+in+a+mouse+model+of+Alzheimer's+disease.">Vascular amyloidosis impairs the gliovascular unit in a mouse model of Alzheimer's disease.</a> Brain. 138 (Pt 12), 3716-3733 (2015).</li><li>Herzig, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abeta+is+targeted+to+the+vasculature+in+a+mouse+model+of+hereditary+cerebral+hemorrhage+with+amyloidosis.">Abeta is targeted to the vasculature in a mouse model of hereditary cerebral hemorrhage with amyloidosis.</a> Nat Neurosci. 7 (9), 954-960 (2004).</li><li>Oakley, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraneuronal+beta-amyloid+aggregates,+neurodegeneration,+and+neuron+loss+in+transgenic+mice+with+five+familial+Alzheimer's+disease+mutations:+potential+factors+in+amyloid+plaque+formation.">Intraneuronal beta-amyloid aggregates, neurodegeneration, and neuron loss in transgenic mice with five familial Alzheimer's disease mutations: potential factors in amyloid plaque formation.</a> J Neurosci. 26 (40), 10129-10140 (2006).</li><li>Liston, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+glucocorticoid+oscillations+promote+learning-dependent+synapse+formation+and+maintenance.">Circadian glucocorticoid oscillations promote learning-dependent synapse formation and maintenance.</a> Nat Neurosci. 16 (6), 698-705 (2013).</li><li>Yang, G., Pan, F., Parkhurst, C. N., Grutzendler, J., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thinned-skull+cranial+window+technique+for+long-term+imaging+of+the+cortex+in+live+mice.">Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice.</a> Nat Protoc. 5 (2), 201-208 (2010).</li><li>Klunk, W. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Abeta+plaques+in+living+transgenic+mice+with+multiphoton+microscopy+and+methoxy-X04,+a+systemically+administered+Congo+red+derivative.">Imaging Abeta plaques in living transgenic mice with multiphoton microscopy and methoxy-X04, a systemically administered Congo red derivative.</a> J Neuropathol Exp Neurol. 61 (9), 797-805 (2002).</li><li>Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retro-orbital+injections+in+mice.">Retro-orbital injections in mice.</a> Lab Anim (NY). 40 (5), 155-160 (2011).</li><li>Cao, V. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+two-photon+imaging+of+experience-dependent+molecular+changes+in+cortical+neurons.">In vivo two-photon imaging of experience-dependent molecular changes in cortical neurons.</a> J Vis Exp. (71), (2013).</li><li>Holtmaat, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+term,+high-resolution+imaging+in+the+mouse+neocortex+through+a+chronic+cranial+window.">Long term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window.</a> Nat Protoc. 4 (8), 1128-1144 (2009).</li><li>Heppner, F. L., Ransohoff, R. M., Becher, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+attack:+the+role+of+inflammation+in+Alzheimer+disease.">Immune attack: the role of inflammation in Alzheimer disease.</a> Nat Rev Neurosci. 16 (6), 358-372 (2015).</li><li>Marker, D. F., Tremblay, M. E., Lu, S. M., Majewska, A. K., Gelbard, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+thin-skull+window+technique+for+chronic+two-photon+in+vivo+imaging+of+murine+microglia+in+models+of+neuroinflammation.">A thin-skull window technique for chronic two-photon in vivo imaging of murine microglia in models of neuroinflammation.</a> J Vis Exp. (43), (2010).</li><li>Joseph-Mathurin, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid+beta+immunization+worsens+iron+deposits+in+the+choroid+plexus+and+cerebral+microbleeds.">Amyloid beta immunization worsens iron deposits in the choroid plexus and cerebral microbleeds.</a> Neurobiol Aging. 34 (11), 2613-2622 (2013).</li><li>Sadowski, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+prion+amyloid+deposits+in+vivo.">Targeting prion amyloid deposits in vivo.</a> J Neuropathol Exp Neurol. 63 (7), 775-784 (2004).</li></ol>

저자는 더 경쟁 재정적 이해 관계가 없습니다.

생체 이광자 현미경 오픈 두개골 기술은 큰 이미지 필드 13,14 무제한 촬상 세션의 이점을 제공한다. 그러나이 기술은 또한 관심 (14)의 영역에 염증을 생산, 종종 호환되지 않거나 영향을 미치는 신경 혈관 읽기 아웃 15. 반대로, 얇아진 두개골 두개의 기술은 신뢰성 뇌 혈관 구조 촬상 플라크 축적 10,14있게 신경 염증을 초래하지 않는다. 이 기술에 의해 제공 ?...

뇌 혈관 해부학 기능적 신경 세포에 결합 된 멀티 - 셀 구조이다. 선박의 동적 리모델링 뇌 발달에 걸쳐 및 중추 신경계 (CNS)의 1,2- 병상의 진행 중에 발생한다. 널리 뇌 손상, 알츠하이머 병 (AD), 간질 등 여러 CNS 질환, 외상성 뇌 손상의 특징은 3,4- 뇌염 것을 허용한다. 발병에서 만성 단계로, CNS 질환을 모델링 할 때 따라서, 생체 내에서 뇌 혈관의 변화를 추적하는 것이 중요하게된다. 뇌 혈관 변형이 자주 신경 손상이나 소성 병용 발생으로, 신경 혈관의 영상은 중추 신경계 질환의 병태 생리를 해독하는 키 입력 포인트를 나타냅니다. 이 프로토콜의 마우스 모델에서 cerebrovasculature의 개조를 추적 길이 이광자 기반 절차를 설명AD 인해 아밀로이드 플라크 침착 5-7에 크고 작은 구경 혈관에서 뇌 혈관의 결함에 의해 표시 진보적 인 병리. 이 과정은 질환의 과정을 통해 신경 혈관 리모델링에 대한 아밀로이드 침착 및 위치 추적과 성장의 시각화를 허용한다. 중요한 형광 염료는 형질 전환 AD 마우스 (8)의 cerebrovasculature 및 아밀로이드 플라크의 시각화를위한 각 영상 세션 전에 주입된다. 얇아진 두개골 두개 창을 통해 반복적 ROI 영상 세션은 비 침습적 인 선택의 방법은 살아있는 쥐의 뇌에서 신경 혈관 리모델링 2,5,9,10을 평가. 아래의 절차는 수술 프로토콜, 이미지 수집 및 처리에 대해 간략하게 설명합니다. 대부분 큰 leptomeningeal 및 관통 동맥에서 대뇌 아밀로이드 혈관 병증 (CAA)의 초기 진행이 특징입니다.

<table><tbody><tr><td>methoxy-X04</td><td>tocris</td><td>4920</td><td>use 10 mg/kg</td></tr><tr><td>FITC-Dextran 70 Kda</td><td>sigma</td><td>46945</td><td>use 100 mg/kg</td></tr><tr><td>gelfoam/Bloxang</td><td>Bausch and Lomb</td><td></td><td></td></tr><tr><td>micorsurgical blade</td><td>surgistar</td><td>6900</td><td>must be sharp and not dented</td></tr><tr><td>povidone-iodine</td><td>betadine</td><td></td><td>antisceptic solution</td></tr><tr><td>binocular stereomicroscope</td><td>olympus</td><td>SX10</td><td>optimal image contrast is crucial for this procedure</td></tr><tr><td>2-photon microscope</td><td>zeiss</td><td></td><td>Zeiss LSM 710mp</td></tr><tr><td>fine scissors-toughcut</td><td>Fine science tools</td><td>14058-09</td><td>this scissors are optimized for cutting skin and soft tissue</td></tr></tbody></table>

longitudinal in vivo imaging of the cerebrovasculature: relevance to cns diseases

뇌 혈관의 리모델링은 뇌 병변의 일반적인 특성이다. 생체 내 이미징 기술은 뇌 가소성 손상이 초과 발생 및 신경 세포의 활동이나 혈액의 흐름과 관련하여 감지 할 기본입니다. 생체 이광자 현미경 살아있는 뇌 큰 휴대 장치의 구조 및 기능 가소성 연구를 허용한다. 특히, 박형화 두개골 윈도우 준비 중요한 뇌 염증을 유발하지 않고 관심 (ROI)의 피질 영역의 가시화를 허용한다. 피질 ROI 반복적 촬상 세션은 다수의 CNS 질환의 진행 시간 경과 질병 특징의 특성을 제공 가능하다. 두뇌의 250 μm의 내 pial 구조에 접근이 기술은 유전자 세포 마커 및 / 또는 중요한 염료로 인코딩 된 형광 프로브의 검출에 의존한다. 후자 (즉, 형광 덱스 트란)을 루민 매핑하는 데 사용되는뇌 혈관 구조의 알 함. 본원에 기술 된 프로토콜에 밀접한 알츠하이머 병 (AD)의 진행을 평가하기 아밀로이드 침착 생체 마커, 메 톡시 O4의 사용이다. 또한 혈관 변화 아밀로이드 침착을 추적하기 위해 사용 된 후 수집 화상 처리를 설명한다. AD의 모델에 초점을 맞추고 있지만, 현재의 기술 된 프로토콜은 뇌 병리 변화가 발생하는 기타 CNS 장애와 관련이있다.

이 프로토콜은 cerebrovasculature 아밀로이드 침착 초과를 시각화하기위한 방법을 설명한다. 형광 염료는 아밀로이드 증착 (메 톡시 XO4) (11) 레이블과 뇌 혈관 내강 (FITC-덱스 트란)를 1 채우기 위해 주입 하였다. 3D 이미지 분석 소프트웨어 모듈은 연속 시점에서 캡쳐 된 뷰의 일정한 필드의 3 차원 이미지를 생성하는데 사용되었다. 대표 이미지는 5XFAD 마우스 <su...

Watch this Scientific Journal Video about Longitudinal In Vivo Imaging of the Cerebrovasculature: Relevance to CNS Diseases at JoVE.com

Longitudinal In Vivo Imaging of the Cerebrovasculature: Relevance to CNS Diseases

이 원고는 세로 두 광자 현미경을 사용하여 생체 내에서 아밀로이드 플라크 축적 동안 cerebrovasculature의 리모델링을 추적하는 절차를 설명합니다. 얇아진 두개골 제제는 알츠하이머 질환의 마우스 모델에서 뇌 손상의 진행을 평가하기 위해, 형광 염료의 시각화를 가능하게한다.

종<em&gt; 생체</em&gt;은 Cerebrovasculature의 이미징 : CNS 질환에 관련성

Remodeling of the brain vasculature is a common trait of brain pathologies. In vivo imaging techniques are fundamental to detect cerebrovascular ...

longitudinal-vivo-imaging-cerebrovasculature-relevance-to-cns

Research

JoVE Journal

Medicine

Longitudinal In Vivo Imaging of the Cerebrovasculature: Relevance to CNS Diseases

7.1K 조회수.  Institute of Functional Genomics.  이 원고는 세로 두 광자 현미경을 사용하여 생체 내에서 아밀로이드 플라크 축적 동안 cerebrovasculature의 리모델링을 추적하는 절차를 설명합니다. 얇아진 두개골 제제는 알츠하이머 질환의 마우스 모델에서 뇌 손상의 진행을 평가하기 위해, 형광 염료의 시각화를 가능하게한다. 

비디오: Longitudinal In Vivo Imaging of the Cerebrovasculature: Relevance to CNS Diseases

Non-invasive Parenchymal, Vascular and Metabolic High-frequency Ultrasound and Photoacoustic Rat Deep Brain Imaging

Photoacoustics and high frequency ultrasound stands out as powerful tools for neurobiological applications enabling high-resolution imaging on the central nervous system of small animals. However, transdermal and transcranial neuroimaging is frequently affected by low sensitivity, image aberrations and loss of space resolution, requiring scalp or even skull removal before imaging. To overcome this challenge, a new protocol is presented to gain significant insights in brain hemodynamics by photoacoustic and high-frequency ultrasounds imaging with the animal skin and skull intact. The procedure relies on the passage of ultrasound (US) waves and laser directly through the fissures that are naturally present on the animal cranium. By juxtaposing the imaging transducer device exactly in correspondence to these selected areas where the skull has a reduced thickness or is totally absent, one can acquire high quality deep images and explore internal brain regions that are usually difficult to anatomically or functionally describe without an invasive approach. By applying this experimental procedure, significant data can be collected in both sonic and optoacoustic modalities, enabling to image the parenchymal and the vascular anatomy far below the head surface. Deep brain features such as parenchymal convolutions and fissures separating the lobes were clearly visible. Moreover, the configuration of large and small blood vessels was imaged at several millimeters of depth, and precise information were collected about blood fluxes, vascular stream velocities and the hemoglobin chemical state. This repertoire of data could be crucial in several research contests, ranging from brain vascular disease studies to experimental techniques involving the systemic administration of exogenous chemicals or other objects endowed with imaging contrast enhancement properties. In conclusion, thanks to the presented protocol, the US and PA techniques become an attractive noninvasive performance-competitive means for cortical and internal brain imaging, retaining a significant potential in many neurologic fields.

The present work describes a new protocol to perform non-invasive high-frequency ultrasound and photoacoustic based imaging on rat brain, to efficiently visualize deep subcortical regions and their vascular patterns by directing signals on skull foramina naturally present on animal cranium.

비 침습적 실질, 혈관 및 대사 고주파 초음파 및 광 음향 쥐 뇌 심부 이미징

Photoacoustics and high frequency ultrasound stands out as powerful tools for neurobiological applications enabling high-resolution imaging on the central ...

연구

신경과학

Quantification of Cerebral Vascular Architecture using Two-photon Microscopy in a Mouse Model of HIV-induced Neuroinflammation

Human Immunodeficiency Virus 1 (HIV-1) infection frequently results in HIV-1 Associated Neurocognitive Disorders (HAND), and is characterized by a chronic neuroinflammatory state within the central nervous system (CNS), thought to be driven principally by virally-mediated activation of microglia and brain resident macrophages. HIV-1 infection is also accompanied by changes in cerebrovascular blood flow (CBF), raising the possibility that HIV-associated chronic neuroinflammation may lead to changes in CBF and/or in cerebral vascular architecture. To address this question, we have used a mouse model for HIV-induced neuroinflammation, and we have tested whether long-term exposure to this inflammatory environment may damage brain vasculature and result in rarefaction of capillary networks. In this paper we describe a method to quantify changes in cortical capillary density in a mouse model of neuroinflammatory disease (HIV-1 Tat transgenic mice). This generalizable approach employs in vivo two-photon imaging of cortical capillaries through a thin-skull cortical window, as well as ex vivo two-photon imaging of cortical capillaries in mouse brain sections. These procedures produce images and z-stack files of capillary networks, respectively, which can be then subjected to quantitative analysis in order to assess changes in cerebral vascular architecture.

This paper describes a method by which the vascular architecture in the brain can be quantified using in vivo and ex vivo two-photon microscopy.

HIV 유도 된 신경 염증의 마우스 모델에서 이광자 현미경을 사용하여 뇌 혈관 구조의 정량

Human Immunodeficiency Virus 1 (HIV-1) infection frequently results in HIV-1 Associated Neurocognitive Disorders (HAND), and is characterized by a chronic ...

Lateral Chronic Cranial Window Preparation Enables In Vivo Observation Following Distal Middle Cerebral Artery Occlusion in Mice

Focal cerebral ischemia (i.e., ischemic stroke) may cause major brain injury, leading to a severe loss of neuronal function and consequently to a host of motor and cognitive disabilities. Its high prevalence poses a serious health burden, as stroke is among the principal causes of long-term disability and death worldwide1. Recovery of neuronal function is, in most cases, only partial. So far, treatment options are very limited, in particular due to the narrow time window for thrombolysis2,3. Determining methods to accelerate recovery from stroke remains a prime medical goal; however, this has been hampered by insufficient mechanistic insights into the recovery process. Experimental stroke researchers frequently employ rodent models of focal cerebral ischemia. Beyond the acute phase, stroke research is increasingly focused on the sub-acute and chronic phase following cerebral ischemia. Most stroke researchers apply permanent or transient occlusion of the MCA in mice or rats. In patients, occlusions of the MCA are among the most frequent causes of ischemic stroke4. Besides proximal occlusion of the MCA using the filament model, surgical occlusion of the distal MCA is probably the most frequently used model in experimental stroke research5. Occlusion of a distal (to the branching of the lenticulo-striate arteries) MCA branch typically spares the striatum and primarily affects the neocortex. Vessel occlusion can be permanent or transient. High reproducibility of lesion volume and very low mortality rates with respect to the long-term outcome are the main advantages of this model. Here, we demonstrate how to perform a chronic cranial window (CW) preparation lateral to the sagittal sinus, and afterwards how to surgically induce a distal stroke underneath the window using a craniotomy approach. This approach can be applied for sequential imaging of acute and chronic changes following ischemia via epi-illuminating, confocal laser scanning, and two-photon intravital microscopy.

Lateral Chronic Cranial Window Preparation Enables In Vivo Observation Following Distal Middle Cerebral Artery Occlusion in Mice

Surgical occlusion of a distal middle cerebral artery branch (MCAo) is a frequently used model in experimental stroke research. This manuscript describes the basic technique of permanent MCAo, combined with the insertion of a lateral cranial window, which offers the opportunity for longitudinal intravital microscopy in mice.

측면 만성 두개골 창 준비 활성화<em&gt; 생체</em&gt; 마우스의 말초 중간 대뇌 동맥 폐색에 따라 관측

Focal cerebral ischemia (i.e., ischemic stroke) may cause major brain injury, leading to a severe loss of neuronal function and consequently to a host of ...

Simultaneous Evaluation of Cerebral Hemodynamics and Light Scattering Properties of the In Vivo Rat Brain Using Multispectral Diffuse Reflectance Imaging

The simultaneous evaluation of cerebral hemodynamics and the light scattering properties of in vivo rat brain tissue is demonstrated using a conventional multispectral diffuse reflectance imaging system. This system is constructed from a broadband white light source, a motorized filter wheel with a set of narrowband interference filters, a light guide, a collecting lens, a video zoom lens, and a monochromatic charged-coupled device (CCD) camera. An ellipsoidal cranial window is made in the skull bone of a rat under isoflurane anesthesia to capture in vivo multispectral diffuse reflectance images of the cortical surface. Regulation of the fraction of inspired oxygen using a gas mixture device enables the induction of different respiratory states such as normoxia, hyperoxia, and anoxia. A Monte Carlo simulation-based multiple regression analysis for the measured multispectral diffuse reflectance images at nine wavelengths (500, 520, 540, 560, 570, 580, 600, 730, and 760 nm) is then performed to visualize the two-dimensional maps of hemodynamics and the light scattering properties of the in vivo rat brain.

Simultaneous Evaluation of Cerebral Hemodynamics and Light Scattering Properties of the In Vivo Rat Brain Using Multispectral Diffuse Reflectance Imaging

The simultaneous evaluation of cerebral hemodynamics and the light scattering properties of in vivo rat brain tissue is demonstrated using a conventional multispectral diffuse reflectance imaging system.

대뇌 혈류와의 광 산란 특성을 동시에 평가<em&gt; 생체</em&gt; 다중 스펙트럼 확산 반사 이미징을 이용한 쥐 뇌

The simultaneous evaluation of cerebral hemodynamics and the light scattering properties of in vivo rat brain tissue is demonstrated using a conventional ...

An In Vivo Duo-color Method for Imaging Vascular Dynamics Following Contusive Spinal Cord Injury

Spinal cord injury (SCI) causes significant vascular disruption at the site of injury. Vascular pathology occurs immediately after SCI and continues throughout the acute injury phase. In fact, endothelial cells appear to be the first to die after a contusive SCI. The early vascular events, including increased permeability of the blood-spinal cord barrier (BSCB), induce vasogenic edema and contribute to detrimental secondary injury events caused by complex injury mechanisms. Targeting the vascular disruption, therefore, could be a key strategy to reduce secondary injury cascades that contribute to histological and functional impairments after SCI. Previous studies were mostly performed on postmortem samples and were unable to capture the dynamic changes of the vascular network. In this study, we have developed an in vivo duo-color two-photon imaging method to monitor acute vascular dynamic changes following contusive SCI. This approach allows detecting blood flow, vessel diameter, and other vascular pathologies at various sites of the same rat pre- and post-injury. Overall, this method provides an excellent venue for investigating vascular dynamics.

An In Vivo Duo-color Method for Imaging Vascular Dynamics Following Contusive Spinal Cord Injury

We introduce an in vivo imaging method using two different fluorescent dyes to track dynamic spinal vascular changes following a contusive spinal cord injury in adult Sprague-Dawley rats.

에 비보 듀오 컬러 이미징 혈관 역학 Contusive 척수 상해를 따르는 방법

Spinal cord injury (SCI) causes significant vascular disruption at the site of injury. Vascular pathology occurs immediately after SCI and continues ...

Precise Brain Mapping to Perform Repetitive In Vivo Imaging of Neuro-Immune Dynamics in Mice

The central nervous system (CNS) is regulated by a complex interplay of neuronal, glial, stromal, and vascular cells that facilitate its proper function. Although studying these cells in isolation in vitro or together ex vivo provides useful physiological information; salient features of neural cell physiology will be missed in such contexts. Therefore, there is a need for studying neural cells in their native in vivo environment. The protocol detailed here describes repetitive in vivo two-photon imaging of neural cells in the rodent cortex as a tool to visualize and study specific cells over extended periods of time from hours to months. We describe in detail the use of the grossly stable brain vasculature as a coarse map or fluorescently labeled dendrites as a fine map of select brain regions of interest. Using these maps as a visual key, we show how neural cells can be precisely relocated for subsequent repetitive in vivo imaging. Using examples of in vivo imaging of fluorescently-labeled microglia, neurons, and NG2+ cells, this protocol demonstrates the ability of this technique to allow repetitive visualization of cellular dynamics in the same brain location over extended time periods, that can further aid in understanding the structural and functional responses of these cells in normal physiology or following pathological insults. Where necessary, this approach can be coupled to functional imaging of neural cells, e.g., with calcium imaging. This approach is especially a powerful technique to visualize the physical interaction between different cell types of the CNS in vivo when genetic mouse models or specific dyes with distinct fluorescent tags to label the cells of interest are available.

This protocol describes a chronic cranial window implantation technique that can be used for longitudinal imaging of neuro-glio-vascular structures, interactions, and function in both healthy and diseased conditions. It serves as a complementary alternative to the transcranial imaging approach that, while often preferred, possesses some critical limitations.

마우스에서 신경 면역 역학의 생체 내 이미징에서 반복적인 능력을 발휘하는 정밀한 두뇌 매핑

The central nervous system (CNS) is regulated by a complex interplay of neuronal, glial, stromal, and vascular cells that facilitate its proper function. ...

면역학 및 감염병학

In Vivo Imaging of Cerebrospinal Fluid Transport through the Intact Mouse Skull using Fluorescence Macroscopy

Cerebrospinal fluid (CSF) flow in rodents has largely been studied using ex vivo quantification of tracers. Techniques such as two-photon microscopy and magnetic resonance imaging (MRI) have enabled in vivo quantification of CSF flow but they are limited by reduced imaging volumes and low spatial resolution, respectively. Recent work has found that CSF enters the brain parenchyma through a network of perivascular spaces surrounding the pial and penetrating arteries of the rodent cortex. This perivascular entry of CSF is a primary driver of the glymphatic system, a pathway implicated in the clearance of toxic metabolic solutes (e.g., amyloid-&#946;). Here, we illustrate a new macroscopic imaging technique that allows real-time, mesoscopic imaging of fluorescent CSF tracers through the intact skull of live mice. This minimally-invasive method facilitates a multitude of experimental designs and enables single or repeated testing of CSF dynamics. Macroscopes have high spatial and temporal resolution and their large gantry and working distance allow for imaging while performing tasks on behavioral devices. This imaging approach has been validated using two-photon imaging and fluorescence measurements obtained from this technique strongly correlate with ex vivo fluorescence and quantification of radio-labeled tracers. In this protocol, we describe how transcranial macroscopic imaging can be used to evaluate glymphatic transport in live mice, offering an accessible alternative to more costly imaging modalities.

Transcranial optical imaging allows wide-field imaging of cerebrospinal fluid transport in the cortex of live mice through an intact skull.

형광 매크로법을 사용하여 그대로 마우스 두개골을 통해 뇌척수액 수송의 생체 내 이미징

Cerebrospinal fluid (CSF) flow in rodents has largely been studied using ex vivo quantification of tracers. Techniques such as two-photon microscopy and ...

Ex Vivo Pressurized Hippocampal Capillary-Parenchymal Arteriole Preparation for Functional Study

From subtle behavioral alterations to late-stage dementia, vascular cognitive impairment typically develops following cerebral ischemia. Stroke and cardiac arrest are remarkably sexually dimorphic diseases, and both induce cerebral ischemia. However, progress in understanding the vascular cognitive impairment, and then developing sex-specific treatments, has been partly limited by challenges in investigating the brain microcirculation from mouse models in functional studies. Here, we present an approach to examine the capillary-to-arteriole signaling in an ex vivo hippocampal capillary-parenchymal arteriole (HiCaPA) preparation from mouse brain. We describe how to isolate, cannulate, and pressurize the microcirculation to measure arteriolar diameter in response to capillary stimulation. We show which appropriate functional controls can be used to validate the HiCaPA preparation integrity and display typical results, including testing potassium as a neurovascular coupling agent and the effect of the recently characterized inhibitor of the Kir2 inward rectifying potassium channel family, ML133. Further, we compare the responses in preparations obtained from male and female mice. While these data reflect functional investigations, our approach can also be used in molecular biology, immunochemistry, and electrophysiology studies.

The present manuscript details how to isolate hippocampal arterioles and capillaries from the mouse brain and how to pressurize them for pressure myography, immunofluorescence, biochemistry, and molecular studies.

Ex Vivo 가압 해모골 모세관-Parenchymal Arteriole 기능 적 연구를 위한 준비

From subtle behavioral alterations to late-stage dementia, vascular cognitive impairment typically develops following cerebral ischemia. Stroke and ...

In Vivo Fiber-Coupled Pre-Clinical Confocal Laser-scanning Endomicroscopy (pCLE) of Hippocampal Capillaries in Awake Mice

The goal of this protocol is to describe fiber-optic-bundle-coupled pre-clinical confocal laser-scanning endomicroscopy (pCLE) in its specific application to elucidate capillary blood flow effects during seizures, driven by mural cells. In vitro and in vivo cortical imaging have shown that capillary constrictions driven by pericytes can result from functional local neural activity, as well as from drug application, in healthy animals. Here, a protocol is presented on how to use pCLE to determine the role of microvascular dynamics in neural degeneration in epilepsy, at any tissue depth (specifically in the hippocampus). We describe a head restraint technique that has been adapted to record pCLE in awake animals, to address potential side-effects of anesthetics on neural activity. Using these methods, electrophysiological and imaging recordings can be conducted over several hours in deep neural structures of the brain.

In Vivo Fiber-Coupled Pre-Clinical Confocal Laser-scanning Endomicroscopy pCLE of Hippocampal Capillaries in Awake Mice

Whereas multiphoton imaging is only effective at limited depths from the tissue&#8217;s surface, it is possible to achieve 3 &#181;m resolution imaging at any depth via pCLE. Here, we present a protocol to conduct pCLE imaging to measure microvascular dynamics in the hippocampus of ictal and wild-type mice.

깨어 있는 마우스의 해마 모세혈관의 In Vivo Fiber-Coupled Pre-Clinical Confocal Laser-scanning Endomicroscopy (pCLE)

The goal of this protocol is to describe fiber-optic-bundle-coupled pre-clinical confocal laser-scanning endomicroscopy (pCLE) in its specific application ...

<meta charset="utf8"></head><body>생쥐의 혈관 인지 장애 연구를 위한 바늘 모델

A Mouse Model for Vascular Cognitive Impairment and Dementia Based on Needle-guided Asymmetric Bilateral Common Carotid Artery Stenosis

Vascular cognitive impairment and dementia (VCID) results from vascular brain injury. Given VCID&#39;s high incidence, which is expected to continue rising as the population ages, it is critical to establish a robust animal model for the disease. This paper presents a novel method of creating a mouse model of VCID that is based on asymmetric bilateral common carotid artery stenosis, which mimics human chronic cerebral hypoperfusion caused by carotid atherosclerosis.
Briefly, common carotid arteries (CCAs) are ligated to different gauge needles (32 G for the right CCA and 34 G for the left CCA) using 7-0 silk sutures followed by immediate needle removal. The remaining suture rings cause persistent blood flow reduction and long-term cognitive impairment associated with white matter injury, microinfarcts, and reactive gliosis, thus closely mimicking the pathogenesis of VCID. Importantly, in this needle model, the clinical representations do not revert with time, providing reliable long-term cognitive impairment. Moreover, the survival rate 24 weeks post surgery was 81.6%, which is higher compared to the other established models of VCID with a similar level of blood flow reduction.
Additional advantages include low material cost and compatibility with MRI to monitor brain injury in live animals since no metal is implanted. The main challenge in employing the needle model of VCID is the requirement for developing advanced surgical skills since mouse CCAs are less than 0.6 mm in diameter and are very fragile. High-quality visual representation of the surgery will thus help researchers to master this technique and advance our understanding of VCID, potentially leading to the development of novel therapeutic modalities to decrease the devastating cognitive decline associated with VCID.

<meta charset="utf8"></head><body>A Mouse Model for Vascular Cognitive Impairment and Dementia Based on Needle-guided Asymmetric Bilateral Common Carotid Artery Stenosis(바늘 유도 비대칭 양측 공통 경동맥 협착증에 기반

The needle method of asymmetric bilateral common carotid artery stenosis is proposed to create a mouse model for vascular cognitive impairment and dementia. It results in longer-term outcomes compared to previously established models and is compatible with live MRI. Visual representation demonstrating the procedure provides guidance for mastering the surgery.

A Mouse Model for Vascular Cognitive Impairment and Dementia Based on Needle-guided Asymmetric Bilateral Common Carotid Artery Stenosis(바늘 유도 비대칭 양측 공통 경동맥 협착증에 기반한 혈관 인지 장애 및 치매에 대한 마우스 모델)

Vascular cognitive impairment and dementia (VCID) results from vascular brain injury. Given VCID&#39;s high incidence, which is expected to continue ...

종

요약

더 많은 비디오 탐색

이 비디오의 챕터