Name: longitudinal in vivo imaging of the cerebrovasculature: relevance to cns diseases
Uploaded: 2016-12-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 47 s
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著者らは、リーグ・フランセーズcontre L&#39;épilepsie（MA-Lに）、（FJ）に研究所ナショナル・デ・ラ・サンテら・デ・ラ・RECHERCHEMédicaleグラントAVENIR R12087FSは、モンペリエの大学からの助成金（FJ）と補助金を承認したいと思います連盟から（NM）にラRECHERCHEシュルルCerveauを注ぎます。私たちは、モンペリエのin vivoイメージングのコアプラットフォームの施設内IPAMでChrystelラフォンの技術支援を認めます。また、原稿を校正するためのメアリーVernov（ワイルコーネル医科大学を）感謝します。

マウスは、食物、水を自由に摂取へのアクセスを許可し、12時間の明暗サイクルで維持されています。実験動物に関わるすべての手順は、国家と欧州の法律に準拠し、教育や科学研究（CEEA-LR-00651から01）のためのフランスの省によって承認されました。 6トラ​​ンスジェニック5xFADと4同腹の野生型（WT）対照マウスの合計は、この手順のために使用されました。 1.術前の準備<ol><li>腹腔内（IP）メトキシX04（10mg / kgの）Aβ沈着物11を標識する手術前48時間を注入。 </li><li>無菌の人工脳脊髄液（aCSFの）（120 mMのNaClを、26.2 mMの炭酸水素ナトリウム、2.5 mMの塩化カリウムを、準備1 mMののNaH 2 PO 4、1.3のMgCl 2、10 mMグルコース、95％O 2/5％CO 2の前とバブル2.5 mMのCaCl 2を）加えます。 </li><li>無菌の前にオートクレーブまたはホットビーズ滅菌器を使用して、手術道具（はさみ、ピンセット、カミソリの刃とドリルビット）を滅菌します手術。 </li><li> 70％エタノールで手術用ベンチや顕微鏡プレートを清掃し、清潔な吸収性の布でカバーしています。 </li><li>ケタミン/キシラジン（75 mgの/ kgおよび10mg / kg、それぞれ）と鎮痛剤ケトプロフェン（2.5ミリグラム/キログラム）IPを注入します。 </li><li>足や尾のピンチで麻酔の適切なレベルを確認してください。 </li><li>目に無菌眼軟膏を適用し、ウィスカを避けながら毛皮（耳、鼻）を剃ります。脱毛クリームであれば、それは慎重に皮膚刺激を防止するために、水ですすぎが続いているとして使用することができます。かみそりの刃で、残りの毛を剃ります。ポビドンヨード消毒液で皮膚を滅菌します。 </li><li>双眼顕微鏡下でマウスを置き、鼻に耳から皮膚切開を行います。頭蓋骨を露出するように横向きに肌を引き出します。骨膜を切開し、繰り返し可能な出血を止めるために、滅菌aCSFので頭蓋骨をすすぎます。 </li></ol> 2.血管系標識および間伐スカルウィンドウの準備（40分） <ol><li>綿棒で眼軟膏を削除します。眼科用局所麻酔剤（テトラ1％）の低下を適用し、優しく突起を達成するために、眼窩の周りの皮膚に圧力をかけます。 </li><li>ヤーデニと同僚12によって記載された手順以下の眼窩に、デキストラン（70 kDaの）（皮下インスリン注射針を100mg / kgまたは50 mg / mlで溶液50μl）と結合したフルオレセインイソチオシアネート（FITC）を注入します。目に無菌眼軟膏を適用します。 </li><li>皮膚が後退し、頭蓋骨が選択された撮像領域の周り清潔で乾燥していることを確認してください。デバイスをマウントヘッドの窓周りのシアノアクリル接着剤の少量を適用し、数秒10のための穏やかな圧力を適用し、ターゲット領域の周囲、及び接着剤（積み重ねかみそり刃からなる、 図1を参照）。 </li><li>領域があることを確認すること、デバイスをマウントヘッドの窓の縁に皮膚の端を引いてドライ。皮膚および獣医グレードのシアノアクリル接着剤の少量のウィンドウの端を固定し、乾燥した（ 図1）になるまで待ちます。 </li><li>ヘッドマウント装置を使用しての段階で動物を固定します。滅菌aCSFのですすぎ、よく皮膚やヘッドマウントデバイスとの間が完全に密閉されていることを確認してください。正常体温を維持するために、生存毛布にマウスを包みます。 </li><li>以前に10を説明したようにaCSFの溶液中に頭蓋骨の間伐を行います。頭皮が完全に除去されないことに注意してください。定期的に骨の破片をクリアすると、組織の過熱を回避するために、aCSFのを変更します。残りの骨の破片が短い空気パフを用いて除去することができます。 aCSFの溶液は、穿孔によって作成された振動を減衰させます。 注：マウスの頭蓋骨の厚さは、動物の年齢と関心領域に応じて80〜150ミクロンの間で変化します。 </li><li> （中程度の速度でと0.7ミリメートルバリ）歯科用ドリルを使用すると、エリア1に頭蓋骨の表面を薄く開始します。頭蓋骨への定期的な上下動パラレルを使用して削除直径0ミリメートル海綿骨の大部分（最初の40から70ミクロン）。 aCSFのごとに20〜30秒を交換し、3-4秒に中断されない掘削を制限することを忘れないでください。縫合糸の近くに骨が高度に血管であることに注意してください。 aCSFのが最終的な出血を止めるためにゲルフォームを予め浸し適用します。 </li><li>過度の圧力がかからないように注意しながら、頭蓋骨の間伐を続行するには鋭利な使い捨ての眼科顕微ブレードを使用してください。 35ミクロン - 最後の領域は直径20の厚さと、約0.5mmです。 注：これにより、骨の再成長および瘢痕化のために、それは、各撮像セッションでウィンドウをさらに薄くする必要があります。 </li></ol> 3.二光子顕微鏡（45分） <ol><li>必要に応じて、適切な麻酔を維持するために19ミリグラム/ kgのケタミン注射します。 </li><li>二光子レーザー顕微鏡（headmountステージに固定された）マウスを転送します。 20X水浸OBJを使用して、、1.0の開口数ectiveエピ蛍光ランプを用いた光フィールドの中央に薄く頭蓋窓を探します。目的は常にaCSFの中に浸漬されていることを確認してください。 </li><li>モードロックパルスレーザーチタン（Ti-サファイア680-1040nm）でレーザスキャンを開始します。それぞれ青と緑のチャンネルにメトキシXO4およびFITCデキストランの放出された蛍光を検出するために、750 nmで励起波長を設定します。 注：顕微鏡は、506 nmおよび555 nmで2ビームスプリッタを持っています。青色光は、470±12 nmのフィルターを備えたNDD検出器によって捕捉されます。緑色光は、525±25 nmのフィルターを備えた高感度のGaAsP検出器によって捕捉されます。目的から放出された最大のレーザパワーは、レーザ誘起組織の損傷を避けるために、10ミリワットを超えてはなりません。 </li><li> ROIの正確な再局在化のための3Dマップを作成するために、0.7X数値ズームで、低倍率のスタック（2ミクロンステップ500ミクロン×500ミクロン、512×512ピクセル）を取得後の時点で。 </li><li> 2X数値ズーム（;1μmのステップは200μm×200μmで、512×512ピクセル）で4高いデジタル倍率画像のモザイクを取得します。イメージングソフトウェアを使用すると、すべての領域をキャプチャするために200μm以下の手順でウィンドウを移動します。スタックの深さは、モザイクの各画像に軟膜表面から出発し、一般的には250μmです。 </li><li>顕微鏡からマウスを削除する前に、写真を撮るか、イメージング分野の将来の再局在化のための軟膜血管系の手描きの2Dマップを作ります。 </li></ol> 4.リカバリと再イメージング<ol><li>下に頭蓋骨を保持しながらトラクションを適用することにより、ヘッドマウントデバイスを削除します。任意の接着剤は、頭蓋骨や皮膚に付着したままの場合、細かい鉗子で慎重にそれを削り取ります。頭皮を縫合し、ホームケージに戻す前に、麻酔からの回復を監視するために加熱されたケージにマウスを置きます。私は、縫合糸への局所抗生物質のクリームを適用し、ケトプロフェン（2.5ミリグラム/キログラム）を注入しますPは2日後。 </li><li>繰り返しは、繰り返しイメージングセッションのために1.1〜2.5を繰り返します。必要であれば、画像の最適な品質を確保するために顕微ブレードと骨を剃ります。 注：イメージングセッションの間の間隔は1ヶ月より長い場合、歯科用ドリルで追加の薄型化が必要になることがあります。 </li><li>前回のセッション（ステップ3.6）から取られた軟膜血管系の2Dマップに従って落射蛍光光を用いて顕微鏡下にマウスを置きます。 </li><li>二光子レーザー走査を開始し、ステップ3.4で得られた3次元地図を用いたマイクロメートルスケールでのアラインメントを達成するために顕微鏡のステージを調整します。ステップ3.5で説明したように、詳細な撮影に進みます。 </li></ol> 5.買収後三次元再構成と画像解析<ol><li>例えばIMARIS（バージョン8.0及び7.7.2を使用）などの3D画像解析ソフトウェアを用いて脈管構造およびアミロイド沈着の三次元再構成を得ます。 </li&gt; <li>画像スタックの深さ全体で2つのチャネルの理想的なコントラストを得るために、画像処理メニューやコントラスト変化サブメニューのノーマライズレイヤプラグインを使用します。 </li><li> 同時に全ての時点で同じ領域の画像を開き、常に異なる時点を比較するために並行して処理します 。 </li><li>フィラメントトレーサーモジュールを使用してトレース容器。 <ol><li> 、新しいフィラメントを作成するために、フィラメントのアイコンをクリックして自動トレーサーをスキップして、自動パス方法を選択します。 </li><li>選択されたチャンネルは、血管画像に対応していることを確認してくださいとポインタの選択機能を使用して、開始点を決定するために、シフト+コントロールキーを押しながらイメージングセッション間で保存されている血管分岐部でクリックします。ポインタの選択機能を使用して、フィラメントのエンドポイントを選択するには、Shiftキーを押しながらクリックします。 注：obtaiの比較NEDスケルトンは、血管系の構造変化が表示されます。 </li></ol></li><li>新しいプラークを追跡するために、平面分析による平面を行います。 Aβプラークの成長を追跡するための青チャンネルに表面モジュールを適用します。新しいサーフェスを作成し、自動化された表面の作成に進むには、表面のアイコンをクリックしてください。バックグラウンド信号を設定し、減算するしきい値メソッドを使用します。統計メニューは、個々のアミロイド沈着物の表面に関するデータを提供します。 </li></ol>

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著者には、競合する金融利害関係を持っていません。

in vivoでの 2光子顕微鏡のためのオープン頭蓋骨技術は大きな撮像視野13,14の無制限のイメージングセッションの利点を提供しています。しかし、この技術は、互換性のない、多くの場合、関心14の領域における炎症を生成または神経血管リードアウト15に影響を与えます。逆に、薄くなった頭蓋骨の頭蓋技術は、脳血管の構造およびプラーク蓄積10,14...

脳血管系は、解剖学的および機能的ニューロンに結合されている多細胞構造です。血管の動的なリモデリングは、脳の発達全体および中枢神経系（CNS）1,2の病状の進行中に発生します。広く脳損傷が、てんかん、アルツハイマー病（AD）、外傷性脳損傷および脳炎3,4を含むいくつかのCNS疾患の顕著な特徴であることが認められています。発症から慢性期に、CNS疾患をモデル化するときしたがって、in vivoでの脳血管の変化を追跡することは重要になります。脳血管の修飾は、しばしば、神経損傷または可塑性と同時に起こるように、神経血管系の​​画像化は、CNS疾患の病態生理学を解読するためのキーのエントリポイントを表します。 このプロトコルは、マウスモデルにおいて脳血管系の再構築を追跡するために、長手方向の二光子ベースの手順を説明しますAD、アミロイド形成性プラーク沈着5-7による大と小口径血管に脳血管の欠陥によってマークプログレッシブ病理。この手順では、病気の経過を通して神経血管リモデリングに対するアミロイド沈着の可視化とその位置と成長の追跡を可能にします。バイタル蛍光色素は、トランスジェニックADマウス8における脳血管およびアミロイド斑の可視化のための各撮像セッションの前に注入されます。薄くなった頭蓋骨の頭蓋窓を通してROIのイメージングセッションを非侵襲的であり、生きているマウスの脳2,5,9,10に神経血管リモデリングを評価するための選択の方法を繰り返します。 以下の手順は、外科プロトコル、画像取得および処理の概要を説明します。主に大軟膜と貫通細動脈における脳アミロイド血管症（CAA）の早期の進行を特徴としています。

<table><tbody><tr><td>methoxy-X04</td><td>tocris</td><td>4920</td><td>use 10 mg/kg</td></tr><tr><td>FITC-Dextran 70 Kda</td><td>sigma</td><td>46945</td><td>use 100 mg/kg</td></tr><tr><td>gelfoam/Bloxang</td><td>Bausch and Lomb</td><td></td><td></td></tr><tr><td>micorsurgical blade</td><td>surgistar</td><td>6900</td><td>must be sharp and not dented</td></tr><tr><td>povidone-iodine</td><td>betadine</td><td></td><td>antisceptic solution</td></tr><tr><td>binocular stereomicroscope</td><td>olympus</td><td>SX10</td><td>optimal image contrast is crucial for this procedure</td></tr><tr><td>2-photon microscope</td><td>zeiss</td><td></td><td>Zeiss LSM 710mp</td></tr><tr><td>fine scissors-toughcut</td><td>Fine science tools</td><td>14058-09</td><td>this scissors are optimized for cutting skin and soft tissue</td></tr></tbody></table>

longitudinal in vivo imaging of the cerebrovasculature: relevance to cns diseases

脳血管系のリモデリングは、脳の病理の共通の特徴です。 in vivoでのイメージング技術は、脳血管可塑性または損傷が残業を発生し、神経活動や血液の流れに関連して検出することが基本です。 生体内では 2光子顕微鏡は、生きている脳内の大規模な細胞単位の構造的および機能的可塑性の研究を可能にします。具体的には、間引き頭蓋骨ウィンドウの準備は重要な脳の炎症を誘発することなく、関心領域（ROI）の皮質領域の可視化を可能にします。皮質ROIの反復的なイメージングセッションは、多数のCNS疾患の進行中に、時間をかけて病気の特徴の特徴付けを提供する、実現可能です。脳の250μmの範囲内軟膜構造にアクセスするこの技術は、遺伝子細胞マーカーおよび/または生体染色色素によってコードされた蛍光プローブの検出に依存しています。後者（ 例えば、蛍光デキストラン）はLUMINをマッピングするために使用されています脳血管構造のアルコンパートメント。本明細書に記載のプロトコルに密接には、アルツハイマー病（AD）の進行を評価するためのアミロイド沈着のインビボマーカー、メトキシO4の使用です。我々はまた、血管の変化およびアミロイド沈着を追跡するために使用されるポスト取込み画像処理を説明します。 ADのモデルに現在着目して、記載されているプロトコルは、病理学的な脳血管変更が発生し、他のCNS障害に関連しています。

このプロトコルは、残業脳血管アミロイド沈着物を可視化するための方法を説明します。蛍光染料は、アミロイド沈着（メトキシXO4）11を標識することおよび脳血管内腔（FITC-デキストラン）1を埋めるために注入しました。 3D画像分析ソフトウェアモジュールは、連続した時点で撮像視野一定の視野の3D画像を作成するために使用されました。 5XFADマ?...

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Longitudinal In Vivo Imaging of the Cerebrovasculature: Relevance to CNS Diseases

この原稿が縦2光子顕微鏡を用いたin vivoでのアミロイド斑の蓄積の間に脳血管系のリモデリングを追跡するための手順を説明します。間引き頭蓋骨製剤は、アルツハイマー病のマウスモデルにおける脳損傷の進行を評価するために、蛍光色素の可視化を可能にします。

縦<em&gt;インビボ</em&gt;脳血管系のイメージング：中枢神経系疾患との関連

Remodeling of the brain vasculature is a common trait of brain pathologies. In vivo imaging techniques are fundamental to detect cerebrovascular ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

Longitudinal In Vivo Imaging of the Cerebrovasculature: Relevance to CNS Diseases

7.1K ビュー.  Institute of Functional Genomics. この原稿が縦2光子顕微鏡を用いたin vivoでのアミロイド斑の蓄積の間に脳血管系のリモデリングを追跡するための手順を説明します。間引き頭蓋骨製剤は、アルツハイマー病のマウスモデルにおける脳損傷の進行を評価するために、蛍光色素の可視化を可能にします。 

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A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

We have successfully integrated previously established Intracranial window (ICW) technology 1-4 with intravital 2-photon confocal microscopy to develop a novel platform that allows for direct long-term visualization of tissue structure changes intracranially. Imaging at a single cell resolution in a real-time fashion provides supplementary dynamic information beyond that provided by standard end-point histological analysis, which looks solely at 'snap-shot' cross sections of tissue.
Establishing this intravital imaging technique in fluorescent chimeric mice, we are able to image four fluorescent channels simultaneously. By incorporating fluorescently labeled cells, such as GFP+ bone marrow, it is possible to track the fate of these cells studying their long-term migration, integration and differentiation within tissue. Further integration of a secondary reporter cell, such as an mCherry glioma tumor line, allows for characterization of cell:cell interactions. Structural changes in the tissue microenvironment can be highlighted through the addition of intra-vital dyes and antibodies, for example CD31 tagged antibodies and Dextran molecules.
Moreover, we describe the combination of our ICW imaging model with a small animal micro-irradiator that provides stereotactic irradiation, creating a platform through which the dynamic tissue changes that occur following the administration of ionizing irradiation can be assessed.
Current limitations of our model include penetrance of the microscope, which is limited to a depth of up to 900 &mu;m from the sub cortical surface, limiting imaging to the dorsal axis of the brain. The presence of the skull bone makes the ICW a more challenging technical procedure, compared to the more established and utilized chamber models currently used to study mammary tissue and fat pads 5-7. In addition, the ICW provides many challenges when optimizing the imaging.

A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

We describe a novel in vivo imaging technique that couples fluorescent chimeric mice with intracranial windows and high-resolution 2-photon microscopy. This imaging platform aids studies of dynamic changes in brain tissue and microvasculature, at a single-cell level, following pathological insults and is adaptable to assess intracranial drug delivery and distribution.

新規高分解能<em生体内で&gt;</em腫瘍増殖と治療に頭蓋内構造物の動的応答を研究する&gt;イメージング技術

We have successfully integrated previously established Intracranial window (ICW) technology 1-4 with intravital 2-photon confocal microscopy to develop a ...

医学

Non-invasive Parenchymal, Vascular and Metabolic High-frequency Ultrasound and Photoacoustic Rat Deep Brain Imaging

Photoacoustics and high frequency ultrasound stands out as powerful tools for neurobiological applications enabling high-resolution imaging on the central nervous system of small animals. However, transdermal and transcranial neuroimaging is frequently affected by low sensitivity, image aberrations and loss of space resolution, requiring scalp or even skull removal before imaging. To overcome this challenge, a new protocol is presented to gain significant insights in brain hemodynamics by photoacoustic and high-frequency ultrasounds imaging with the animal skin and skull intact. The procedure relies on the passage of ultrasound (US) waves and laser directly through the fissures that are naturally present on the animal cranium. By juxtaposing the imaging transducer device exactly in correspondence to these selected areas where the skull has a reduced thickness or is totally absent, one can acquire high quality deep images and explore internal brain regions that are usually difficult to anatomically or functionally describe without an invasive approach. By applying this experimental procedure, significant data can be collected in both sonic and optoacoustic modalities, enabling to image the parenchymal and the vascular anatomy far below the head surface. Deep brain features such as parenchymal convolutions and fissures separating the lobes were clearly visible. Moreover, the configuration of large and small blood vessels was imaged at several millimeters of depth, and precise information were collected about blood fluxes, vascular stream velocities and the hemoglobin chemical state. This repertoire of data could be crucial in several research contests, ranging from brain vascular disease studies to experimental techniques involving the systemic administration of exogenous chemicals or other objects endowed with imaging contrast enhancement properties. In conclusion, thanks to the presented protocol, the US and PA techniques become an attractive noninvasive performance-competitive means for cortical and internal brain imaging, retaining a significant potential in many neurologic fields.

The present work describes a new protocol to perform non-invasive high-frequency ultrasound and photoacoustic based imaging on rat brain, to efficiently visualize deep subcortical regions and their vascular patterns by directing signals on skull foramina naturally present on animal cranium.

非侵襲的実質細胞、血管および代謝高周波超音波および光音響ラット脳深部イメージング

Photoacoustics and high frequency ultrasound stands out as powerful tools for neurobiological applications enabling high-resolution imaging on the central ...

神経科学

Quantification of Cerebral Vascular Architecture using Two-photon Microscopy in a Mouse Model of HIV-induced Neuroinflammation

Human Immunodeficiency Virus 1 (HIV-1) infection frequently results in HIV-1 Associated Neurocognitive Disorders (HAND), and is characterized by a chronic neuroinflammatory state within the central nervous system (CNS), thought to be driven principally by virally-mediated activation of microglia and brain resident macrophages. HIV-1 infection is also accompanied by changes in cerebrovascular blood flow (CBF), raising the possibility that HIV-associated chronic neuroinflammation may lead to changes in CBF and/or in cerebral vascular architecture. To address this question, we have used a mouse model for HIV-induced neuroinflammation, and we have tested whether long-term exposure to this inflammatory environment may damage brain vasculature and result in rarefaction of capillary networks. In this paper we describe a method to quantify changes in cortical capillary density in a mouse model of neuroinflammatory disease (HIV-1 Tat transgenic mice). This generalizable approach employs in vivo two-photon imaging of cortical capillaries through a thin-skull cortical window, as well as ex vivo two-photon imaging of cortical capillaries in mouse brain sections. These procedures produce images and z-stack files of capillary networks, respectively, which can be then subjected to quantitative analysis in order to assess changes in cerebral vascular architecture.

This paper describes a method by which the vascular architecture in the brain can be quantified using in vivo and ex vivo two-photon microscopy.

HIV誘導神経炎症のマウスモデルでは二光子顕微鏡を用いた脳血管のアーキテクチャの定量化

Human Immunodeficiency Virus 1 (HIV-1) infection frequently results in HIV-1 Associated Neurocognitive Disorders (HAND), and is characterized by a chronic ...

Lateral Chronic Cranial Window Preparation Enables In Vivo Observation Following Distal Middle Cerebral Artery Occlusion in Mice

Focal cerebral ischemia (i.e., ischemic stroke) may cause major brain injury, leading to a severe loss of neuronal function and consequently to a host of motor and cognitive disabilities. Its high prevalence poses a serious health burden, as stroke is among the principal causes of long-term disability and death worldwide1. Recovery of neuronal function is, in most cases, only partial. So far, treatment options are very limited, in particular due to the narrow time window for thrombolysis2,3. Determining methods to accelerate recovery from stroke remains a prime medical goal; however, this has been hampered by insufficient mechanistic insights into the recovery process. Experimental stroke researchers frequently employ rodent models of focal cerebral ischemia. Beyond the acute phase, stroke research is increasingly focused on the sub-acute and chronic phase following cerebral ischemia. Most stroke researchers apply permanent or transient occlusion of the MCA in mice or rats. In patients, occlusions of the MCA are among the most frequent causes of ischemic stroke4. Besides proximal occlusion of the MCA using the filament model, surgical occlusion of the distal MCA is probably the most frequently used model in experimental stroke research5. Occlusion of a distal (to the branching of the lenticulo-striate arteries) MCA branch typically spares the striatum and primarily affects the neocortex. Vessel occlusion can be permanent or transient. High reproducibility of lesion volume and very low mortality rates with respect to the long-term outcome are the main advantages of this model. Here, we demonstrate how to perform a chronic cranial window (CW) preparation lateral to the sagittal sinus, and afterwards how to surgically induce a distal stroke underneath the window using a craniotomy approach. This approach can be applied for sequential imaging of acute and chronic changes following ischemia via epi-illuminating, confocal laser scanning, and two-photon intravital microscopy.

Lateral Chronic Cranial Window Preparation Enables In Vivo Observation Following Distal Middle Cerebral Artery Occlusion in Mice

Surgical occlusion of a distal middle cerebral artery branch (MCAo) is a frequently used model in experimental stroke research. This manuscript describes the basic technique of permanent MCAo, combined with the insertion of a lateral cranial window, which offers the opportunity for longitudinal intravital microscopy in mice.

横慢性頭蓋窓の準備を有効<em&gt;インビボ</em&gt;マウスの遠位中大脳動脈閉塞後に観測

Focal cerebral ischemia (i.e., ischemic stroke) may cause major brain injury, leading to a severe loss of neuronal function and consequently to a host of ...

An In Vivo Duo-color Method for Imaging Vascular Dynamics Following Contusive Spinal Cord Injury

Spinal cord injury (SCI) causes significant vascular disruption at the site of injury. Vascular pathology occurs immediately after SCI and continues throughout the acute injury phase. In fact, endothelial cells appear to be the first to die after a contusive SCI. The early vascular events, including increased permeability of the blood-spinal cord barrier (BSCB), induce vasogenic edema and contribute to detrimental secondary injury events caused by complex injury mechanisms. Targeting the vascular disruption, therefore, could be a key strategy to reduce secondary injury cascades that contribute to histological and functional impairments after SCI. Previous studies were mostly performed on postmortem samples and were unable to capture the dynamic changes of the vascular network. In this study, we have developed an in vivo duo-color two-photon imaging method to monitor acute vascular dynamic changes following contusive SCI. This approach allows detecting blood flow, vessel diameter, and other vascular pathologies at various sites of the same rat pre- and post-injury. Overall, this method provides an excellent venue for investigating vascular dynamics.

An In Vivo Duo-color Method for Imaging Vascular Dynamics Following Contusive Spinal Cord Injury

We introduce an in vivo imaging method using two different fluorescent dyes to track dynamic spinal vascular changes following a contusive spinal cord injury in adult Sprague-Dawley rats.

In Vivoデュオ カラー霊長類脊髄損傷血管動態のイメージング手法

Spinal cord injury (SCI) causes significant vascular disruption at the site of injury. Vascular pathology occurs immediately after SCI and continues ...

Precise Brain Mapping to Perform Repetitive In Vivo Imaging of Neuro-Immune Dynamics in Mice

The central nervous system (CNS) is regulated by a complex interplay of neuronal, glial, stromal, and vascular cells that facilitate its proper function. Although studying these cells in isolation in vitro or together ex vivo provides useful physiological information; salient features of neural cell physiology will be missed in such contexts. Therefore, there is a need for studying neural cells in their native in vivo environment. The protocol detailed here describes repetitive in vivo two-photon imaging of neural cells in the rodent cortex as a tool to visualize and study specific cells over extended periods of time from hours to months. We describe in detail the use of the grossly stable brain vasculature as a coarse map or fluorescently labeled dendrites as a fine map of select brain regions of interest. Using these maps as a visual key, we show how neural cells can be precisely relocated for subsequent repetitive in vivo imaging. Using examples of in vivo imaging of fluorescently-labeled microglia, neurons, and NG2+ cells, this protocol demonstrates the ability of this technique to allow repetitive visualization of cellular dynamics in the same brain location over extended time periods, that can further aid in understanding the structural and functional responses of these cells in normal physiology or following pathological insults. Where necessary, this approach can be coupled to functional imaging of neural cells, e.g., with calcium imaging. This approach is especially a powerful technique to visualize the physical interaction between different cell types of the CNS in vivo when genetic mouse models or specific dyes with distinct fluorescent tags to label the cells of interest are available.

This protocol describes a chronic cranial window implantation technique that can be used for longitudinal imaging of neuro-glio-vascular structures, interactions, and function in both healthy and diseased conditions. It serves as a complementary alternative to the transcranial imaging approach that, while often preferred, possesses some critical limitations.

マウスにおける神経免疫ダイナミクスの反復インビボイメージングを行う正確な脳マッピング

The central nervous system (CNS) is regulated by a complex interplay of neuronal, glial, stromal, and vascular cells that facilitate its proper function. ...

免疫・感染学

In Vivo Imaging of Cerebrospinal Fluid Transport through the Intact Mouse Skull using Fluorescence Macroscopy

Cerebrospinal fluid (CSF) flow in rodents has largely been studied using ex vivo quantification of tracers. Techniques such as two-photon microscopy and magnetic resonance imaging (MRI) have enabled in vivo quantification of CSF flow but they are limited by reduced imaging volumes and low spatial resolution, respectively. Recent work has found that CSF enters the brain parenchyma through a network of perivascular spaces surrounding the pial and penetrating arteries of the rodent cortex. This perivascular entry of CSF is a primary driver of the glymphatic system, a pathway implicated in the clearance of toxic metabolic solutes (e.g., amyloid-&#946;). Here, we illustrate a new macroscopic imaging technique that allows real-time, mesoscopic imaging of fluorescent CSF tracers through the intact skull of live mice. This minimally-invasive method facilitates a multitude of experimental designs and enables single or repeated testing of CSF dynamics. Macroscopes have high spatial and temporal resolution and their large gantry and working distance allow for imaging while performing tasks on behavioral devices. This imaging approach has been validated using two-photon imaging and fluorescence measurements obtained from this technique strongly correlate with ex vivo fluorescence and quantification of radio-labeled tracers. In this protocol, we describe how transcranial macroscopic imaging can be used to evaluate glymphatic transport in live mice, offering an accessible alternative to more costly imaging modalities.

Transcranial optical imaging allows wide-field imaging of cerebrospinal fluid transport in the cortex of live mice through an intact skull.

蛍光マクロスコピーを用いた無傷マウス頭蓋骨を介した脳脊髄液輸送の生体内イメージング

Cerebrospinal fluid (CSF) flow in rodents has largely been studied using ex vivo quantification of tracers. Techniques such as two-photon microscopy and ...

Ex Vivo Pressurized Hippocampal Capillary-Parenchymal Arteriole Preparation for Functional Study

From subtle behavioral alterations to late-stage dementia, vascular cognitive impairment typically develops following cerebral ischemia. Stroke and cardiac arrest are remarkably sexually dimorphic diseases, and both induce cerebral ischemia. However, progress in understanding the vascular cognitive impairment, and then developing sex-specific treatments, has been partly limited by challenges in investigating the brain microcirculation from mouse models in functional studies. Here, we present an approach to examine the capillary-to-arteriole signaling in an ex vivo hippocampal capillary-parenchymal arteriole (HiCaPA) preparation from mouse brain. We describe how to isolate, cannulate, and pressurize the microcirculation to measure arteriolar diameter in response to capillary stimulation. We show which appropriate functional controls can be used to validate the HiCaPA preparation integrity and display typical results, including testing potassium as a neurovascular coupling agent and the effect of the recently characterized inhibitor of the Kir2 inward rectifying potassium channel family, ML133. Further, we compare the responses in preparations obtained from male and female mice. While these data reflect functional investigations, our approach can also be used in molecular biology, immunochemistry, and electrophysiology studies.

The present manuscript details how to isolate hippocampal arterioles and capillaries from the mouse brain and how to pressurize them for pressure myography, immunofluorescence, biochemistry, and molecular studies.

機能的研究のためのEx Vivo加圧海馬毛細血管-パンレンキマル動脈製剤

From subtle behavioral alterations to late-stage dementia, vascular cognitive impairment typically develops following cerebral ischemia. Stroke and ...

In Vivo Fiber-Coupled Pre-Clinical Confocal Laser-scanning Endomicroscopy (pCLE) of Hippocampal Capillaries in Awake Mice

The goal of this protocol is to describe fiber-optic-bundle-coupled pre-clinical confocal laser-scanning endomicroscopy (pCLE) in its specific application to elucidate capillary blood flow effects during seizures, driven by mural cells. In vitro and in vivo cortical imaging have shown that capillary constrictions driven by pericytes can result from functional local neural activity, as well as from drug application, in healthy animals. Here, a protocol is presented on how to use pCLE to determine the role of microvascular dynamics in neural degeneration in epilepsy, at any tissue depth (specifically in the hippocampus). We describe a head restraint technique that has been adapted to record pCLE in awake animals, to address potential side-effects of anesthetics on neural activity. Using these methods, electrophysiological and imaging recordings can be conducted over several hours in deep neural structures of the brain.

In Vivo Fiber-Coupled Pre-Clinical Confocal Laser-scanning Endomicroscopy pCLE of Hippocampal Capillaries in Awake Mice

Whereas multiphoton imaging is only effective at limited depths from the tissue&#8217;s surface, it is possible to achieve 3 &#181;m resolution imaging at any depth via pCLE. Here, we present a protocol to conduct pCLE imaging to measure microvascular dynamics in the hippocampus of ictal and wild-type mice.

覚醒マウスの海馬毛細血管の In Vivo ファイバー結合前臨床共焦点レーザー走査内顕微鏡 (pCLE)

The goal of this protocol is to describe fiber-optic-bundle-coupled pre-clinical confocal laser-scanning endomicroscopy (pCLE) in its specific application ...

A Needle Model for Vascular Cognitive Impairment Studies in Mice

A Mouse Model for Vascular Cognitive Impairment and Dementia Based on Needle-guided Asymmetric Bilateral Common Carotid Artery Stenosis

Vascular cognitive impairment and dementia (VCID) results from vascular brain injury. Given VCID&#39;s high incidence, which is expected to continue rising as the population ages, it is critical to establish a robust animal model for the disease. This paper presents a novel method of creating a mouse model of VCID that is based on asymmetric bilateral common carotid artery stenosis, which mimics human chronic cerebral hypoperfusion caused by carotid atherosclerosis.
Briefly, common carotid arteries (CCAs) are ligated to different gauge needles (32 G for the right CCA and 34 G for the left CCA) using 7-0 silk sutures followed by immediate needle removal. The remaining suture rings cause persistent blood flow reduction and long-term cognitive impairment associated with white matter injury, microinfarcts, and reactive gliosis, thus closely mimicking the pathogenesis of VCID. Importantly, in this needle model, the clinical representations do not revert with time, providing reliable long-term cognitive impairment. Moreover, the survival rate 24 weeks post surgery was 81.6%, which is higher compared to the other established models of VCID with a similar level of blood flow reduction.
Additional advantages include low material cost and compatibility with MRI to monitor brain injury in live animals since no metal is implanted. The main challenge in employing the needle model of VCID is the requirement for developing advanced surgical skills since mouse CCAs are less than 0.6 mm in diameter and are very fragile. High-quality visual representation of the surgery will thus help researchers to master this technique and advance our understanding of VCID, potentially leading to the development of novel therapeutic modalities to decrease the devastating cognitive decline associated with VCID.

The needle method of asymmetric bilateral common carotid artery stenosis is proposed to create a mouse model for vascular cognitive impairment and dementia. It results in longer-term outcomes compared to previously established models and is compatible with live MRI. Visual representation demonstrating the procedure provides guidance for mastering the surgery.

Vascular cognitive impairment and dementia (VCID) results from vascular brain injury. Given VCID&#39;s high incidence, which is expected to continue ...

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新規高分解能

非侵襲的実質細胞、血管および代謝高周波超音波および光音響ラット脳深部イメージング

HIV誘導神経炎症のマウスモデルでは二光子顕微鏡を用いた脳血管のアーキテクチャの定量化

横慢性頭蓋窓の準備を有効

In Vivoデュオカラー霊長類脊髄損傷血管動態のイメージング手法

マウスにおける神経免疫ダイナミクスの反復インビボイメージングを行う正確な脳マッピング

蛍光マクロスコピーを用いた無傷マウス頭蓋骨を介した脳脊髄液輸送の生体内イメージング

機能的研究のためのEx Vivo加圧海馬毛細血管-パンレンキマル動脈製剤

覚醒マウスの海馬毛細血管の In Vivo ファイバー結合前臨床共焦点レーザー走査内顕微鏡 (pCLE)

A Mouse Model for Vascular Cognitive Impairment and Dementia Based on Needle-guided Asymmetric Bilateral Common Carotid Artery Stenosis

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HIV誘導神経炎症のマウスモデルでは二光子顕微鏡を用いた脳血管のアーキテクチャの定量化

横慢性頭蓋窓の準備を有効

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マウスにおける神経免疫ダイナミクスの反復インビボイメージングを行う正確な脳マッピング

蛍光マクロスコピーを用いた無傷マウス頭蓋骨を介した脳脊髄液輸送の生体内イメージング

機能的研究のためのEx Vivo加圧海馬毛細血管-パンレンキマル動脈製剤

覚醒マウスの海馬毛細血管の In Vivo ファイバー結合前臨床共焦点レーザー走査内顕微鏡 (pCLE)

A Mouse Model for Vascular Cognitive Impairment and Dementia Based on Needle-guided Asymmetric Bilateral Common Carotid Artery Stenosis

In Vivoデュオカラー霊長類脊髄損傷血管動態のイメージング手法