Wir danken Peter Staeheli zur Bereitstellung B6.A2G-Mx1 Mäusen und Semra Özcelik für technische Beratung. Diese Arbeit wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft über SFB829 und KN536 / 16 und der Köln Fortune-Programm / der Medizinischen Fakultät der Universität zu Köln unterstützt.

Ethik-Anweisung. Die Herstellung von epidermalen Schichten von geopferten Tiere erfolgt in strikter Übereinstimmung mit den Empfehlungen der Führer von Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz, Nordrhein-Westfalen (Deutschland) durchgeführt. Die Studie wurde von LANUV NRW (Anzahl 8.84-02.05.20.13.018) zugelassen. 1. Vorbereitung der Instrumente und Kultur Medien <ol><li> Kulti epidermalen Schichten in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) / Hoch Glucose enthaltenden Glutamindipeptid, 10% FCS, 100 IE / ml Penicillin und 100 ug / ml Streptomycin (nachstehend als &quot;DMEM&quot; bezeichnet). </li><li> Zur Herstellung von epidermalen Schichten sorgfältig aufzulösen Dispase II-Pulver (5 mg / ml) in PBS erhitzt (bis zu 37 ° C). Die Lösung wird durch ein 0,22 um Filter und ihn direkt für die Behandlung. </li><li> Für die Herstellung der gesamten epidermalen Halterungen 13, bereiten blockiert Buffer mit 0,5% Milchpulver, 0,25% Gelatine aus Kaltwasserfischen Haut und 0,5% Triton X-100 in TBS. Substanzen ermöglichen, durch Inkubieren des Gemisches für mindestens 2 h bei RT auf einem Rotationsmischer aufzulösen. Bereiten auch 0,2% Tween 20 in PBS als Waschpuffer. Zur Fixierung vorzubereiten 3,4% und 4% Formaldehyd in PBS. </li><li> Für die Immunfärbung von Gefrierschnitten, bereiten Blockierungspuffer mit 5% normalem Ziegenserum und 0,2% Tween 20 in PBS. Zur Fixierung, bereiten 0,5% Formaldehyd in PBS. </li></ol> 2. Herstellung der epidermalen Schichten von Mäusehaut <ol><li> Vorbereitung der Epidermis von Neugeborenen Rückenhaut für Infektionsstudien <ol><li> Legen Sie eine enthauptete Maus (1 bis 3 Tage nach der Geburt) in eine Dissektion Gericht und abgeschnitten Extremitäten und der Schwanz in der Nähe des Oberkörper, um eine effiziente Entfernung der Haut von der komplette Oberkörper zu ermöglichen. Während der Entfernung der Extremitäten, versuchen, die Einschnitte so klein wie möglich im Durchmesser zu halten. </li><li> Befestigen Sie den Oberkörper mit gekrümmten feinen Pinzette einnd sanft bewegen stumpfe Spitze Schere unter der Haut von kranial nach kaudal entlang der Rückseite, um die Haut vom Rumpf zu trennen. Slit die Haut entlang der Rückseite. </li><li> Für die FACS-Analyse, Isolierung von Keratinozyten oder die Zubereitung von RNA, ziehen Sie die komplette Haut vor den Oberkörper mit einer Pinzette, um das Gewebe und die stumpfe Spitze Schere zu beheben, um den Oberkörper abstoßen. Für die Herstellung von Gefrierschnitten oder ganzen Halterungen nehmen Sie nur Teile der Rückenhaut. </li><li> Hacken Sie die Rückenhaut mit einem Skalpell in 1-2 Stücke von ca. 10 x 10 mm. Setzen Sie die Stücke in eine Vertiefung einer 6-Well-Platte mit ~ 1 ml sterilem PBS. Stellen Sie sicher, dass die dermale Seite der Bodenflächen. </li><li> Ersetzen PBS mit 1,5 ml Dispase II (5 mg / ml PBS) und Inkubation für entweder 30 min bei 37 ° C (für Gesamtpräparate) oder O / N bei 4 ° C. Mit PBS waschen 3 Mal. Entfernen Sie vorsichtig die Epidermis als intaktes Blatt mit einer Pinzette, um die darunter liegenden Dermis und die anderen Pinzette zu beheben, um die Epidermis zu heben. Verwenden Sie ein Fernglas, um diesen Schritt zu machen easy. Übertragen Sie die epidermale Schicht in DMEM mit seinen basalen Seite nach unten. Verwenden Sie die Blätter sofort für Infektionsversuche. HINWEIS: Verwenden Sie die Vorbereitung der Epidermis von Neugeborenen Haut vor allem für die FACS-Analyse, Isolierung von Keratinozyten oder die Zubereitung von RNA. Wegen ihrer Zerbrechlichkeit, ist die Herstellung von infizierten Platten für Kryoschnitte oder Gesamtpräparate weniger geeignet. </li></ol></li><li> Vorbereitung der Epidermis von Erwachsenen Schwanzhaut für Infektionsstudien <ol><li> Euthanize die Mäuse im Alter von 1-3 Monaten durch zervikale Dislokation. Nehmen Schwanz statt Rückenhaut, da die lang eingebettet Haarfollikel auf der Rückseite beeinträchtigen Trennung von intakten epidermalen Schichten. Schneiden Sie den Schwanz von Mäusen geopfert und schlitzte es der Länge nach mit einem Skalpell. </li><li> Ziehen Sie weg der Haut vom Knochen und hacken sie mit einem Skalpell in Stücke von etwa 5 x 5 mm. Legen Sie bis zu 4 Stück in einem gut und fahren Sie mit der Inkubation in Dispase II wie unter 2.1.5 beschrieben, HINWEIS: Verwenden Sie für Erwachsene tail Haut zu Gefrierschnitten oder ganzen Lager vorzubereiten. Alternativ zur unmittelbaren Verwendung kann Schwänzen gelagert oder für etwa 24 h bei 4 ° C, ohne signifikante Infektionseffizienz transportiert werden. Wenn Schwänze sind bis zu 48 Stunden aufbewahrt, könnte epidermalen Schichten kaum mit HSV-1 infiziert. </li></ol></li><li> Dissoziation der Epidermis für die FACS-Analyse Hinweis: Der Nachweis von Oberflächenprotein-Expression durch FACS-Analyse erfordert geeignete Zelldissoziation Techniken, die nicht die Zelloberfläche und das Protein von Interesse schaden. <ol><li> Inkubieren neugeborenen epidermalen Schichten in einer 6-Well-Platte mit der basalen Seite auf 1,5 ml / well rekombinantem Trypsin basierten Zelldissoziationslösung für 15 min bei RT und 15 Minuten bei 37 ° C. </li><li> Stoppen Sie die Inkubation durch Zugabe von 3 ml DMEM. Distanzieren Keratinozyten unter Verwendung einer gekrümmten feinen Pinzette vorsichtig bewegen die Epidermis in der 6-Well-Platte, so dass die Keratinozyten erhalten gelöst. Sammeln Sie die Zellsuspension und wiederholen Sie diesen Schritt 3 malimmer mit frischem DMEM. Hinweis: Diese Dissoziation Verfahren ist angebracht, Nectin-1 auf der Oberfläche der Keratinozyten zu erkennen. </li><li> Alternativ inkubiere die epidermalen Blätter auf enzymfreien Zelldissoziationslösung (CDS) für 15 min bei RT und 15 Minuten bei 37 ° C. Inkubieren Sie weitere 15 min bei RT, um sanft spülen die Keratinozyten durch Pipettieren von CDS auf und ab. </li><li> Sammeln Sie die Zellsuspension und wiederholen Sie den Spülvorgang 3 mal mit frischem DMEM. Hinweis: Diese Dissoziation ist geeignet, um die Oberflächenexpression von HVEM zu erkennen. Der Nachteil der CDS-Lösung ist, dass weniger Zellen als bei rekombinante Trypsin-basierten Zelldissoziationslösung dissoziiert. Zusätzlich zur Oberflächen nach Dissoziation der infizierten epidermalen Schichten mit rekombinantem Trypsin basierten Zelldissoziationslösung Expression kann nukleare oder cytoplasmatische Expression wie ICP0-Expression durch FACS analysiert werden. </li></ol></li><li> Dissoziation von Epidermis-Keratinozyten oder ex isolierenRNA-Darm-Trakt <ol><li> Gesetzt neugeborenen epidermalen Schichten in einer 6-Well-Platte mit der basalen Seite in Richtung der Unterseite der Schale, die 1,5 ml / well rekombinantem Trypsin basierten Zelldissoziationslösung enthält. Inkubation für 30 min bei RT. In 3 ml DMEM und distanzieren Keratinozyten unter Verwendung einer gekrümmten feinen Pinzette vorsichtig bewegen die Epidermis in die Schüssel. </li><li> Sammeln Sie die Zellsuspension und wiederholen Sie diesen Schritt 3 mal mit frischem DMEM. Verwenden Sie diese Zellsuspension in RNA oder zur Kultur primären murinen Keratinozyten zu extrahieren. </li></ol></li></ol> 3. Die Infektion von epidermalen Schichten mit HSV-1 <ol><li> Es wird eine Lösung von HSV-1 Stamm 17 Gew 11 in nicht weniger als 500 &amp; mgr; l DMEM-Medium ersetzt und die durch die Viruslösung auf dem die epidermalen Schichten schwimmen. Dieser Zeitpunkt wird als Zeitpunkt 0 12 definiert. Führen Infektion eines epidermalen Schicht in eine Vertiefung einer Platte mit 24 Vertiefungen bei 37 ° C. Die Berechnung der Virustiter über die geschätzte Anzahl basierendvon Zellen in der Basalschicht pro epidermale Schicht (etwa 2 x 10 5 Zellen pro 5 x 5 mm Blech). </li><li> Infizieren mit HSV-1 mit ungefähr 100 Plaque-bildende Einheiten (PFU) / Zelle und ersetzen das virushaltige Medium durch DMEM bei 1 h pi HINWEIS: Bei epidermalen Schichten von Neugeborenen Haut, bedenken Sie, dass Blätter beginnen, während der Inkubation zu distanzieren. </li></ol> 4. Visualisierung der infizierten Zellen <ol><li> Epidermal Whole Halterungen 13 <ol><li> Fix epidermalen Schichten mit 3,4% Formaldehyd entweder für 2 h bei RT und O / N bei 4 ° C. Zwei Mal mit PBS waschen und blockieren mit 0,5% Milchpulver, 0,25% Gelatine aus Kaltwasserfischen Haut und 0,5% Triton X-100 in TBS 1 h bei RT 14. </li><li> Inkubieren Sie die Platten O / N mit Maus-Anti-ICP0 (monoklonaler Antikörper 11060) 15 verdünnt 1:60 in Blocking-Puffer bei RT. Um die Intermediärfilament Netzwerk visualisieren inkubieren gleichzeitig mit polyklonalen Kaninchen-Anti-Maus Keratin 14 (100 ng / ml). </li><li> Während 4 Stunden bei Raumtemperatur mit PBS-0,2% Tween 20 waschen 4-5 mal. Inkubieren O / N mit AF488-konjugiertes Anti-Maus-IgG (1 ug / ml), AF555-konjugierten Anti-Kaninchen-IgG (1 ug / ml) und DAPI (4 &#39;, 6-Diamidino-2-phenylindol) (100 ng / ml) in Blockierpuffer bei Raumtemperatur. </li><li> Waschen mit PBS-0,2% Tween 20 für 4 h bei RT. Berg epidermalen Schichten mit ihren basalen Seite auf einem Objektträger, einbetten in fluoreszierende Einschlussmittel geben und mit Deckgläschen. </li></ol></li><li> Epidermal Kryoschnitte <ol><li> Erwachsenen epidermalen Schichten wurden in 4% Formaldehyd in PBS für 20 min bei RT fixiert und 2 mal mit PBS gewaschen. Einbetten festen Blätter in Gewebegefriermedium und Einfrieren in flüssigem Stickstoff. Geschnitten 8-10 um-Schnitte mit einer Kryomikrotom. </li><li> Befestigen Sie die Profile wieder mit 0,5% Formaldehyd in PBS für 10 min bei RT, wäscht 2 mal mit PBS, Block mit 5% normalem Ziegenserum und 0,2% Tween 20 in PBS für 30 min bei RT und dann für 60 min mit m FleckOUSE Anti ICP0 (monoklonaler Antikörper 11060) 15 verdünnt 1:60 in Blocking-Puffer, gefolgt von 3 Mal Waschen mit dem Blockierungspuffer. </li><li> Dann Inkubieren mit AF488-konjugiertes Anti-Maus-IgG (1 ug / ml) und DAPI (100 ng / ml) in Blockierungspuffer für 45 Minuten bei RT und 3 x waschen. Betten Sie Abschnitte in fluoreszierende Einschlussmittel geben und mit Deckgläschen. </li></ol></li></ol>

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The authors declare that they have no competing financial interests.

Wenn epidermalen Schichten der Haut von Erwachsenen aus C57BL / 6 sind mit HSV-1 infiziert bei etwa 100 PFU / Zelle beobachten wir Infektion in fast allen Zellen der Basalschicht der interfollikuläre Epidermis während geringere Virusdosen korrelieren mit weniger infizierten Zellen und einer langsameren Fortschritt der Infektion. Im allgemeinen Haarfollikel zeigen eine variable Anzahl von infizierten Zellen; während die meisten der eher klein Keratinozyten säumen die Entwicklung Haarfollikel infiziert sind, wird nur ...

Herpes-simplex-Virus (HSV) können eine Reihe von Erkrankungen bei Menschen von leichten unkompliziert mukokutane Läsionen zu lebensbedrohlichen Infektionen. HSV Typ 1 (HSV-1) wird überwiegend mit orofazialen Infektionen und Enzephalitis assoziiert, während HSV Typ 2 (HSV-2) eher verursacht Genitalinfektionen 1. Zwar gibt es deutliche Fortschritte im Verständnis, wie HSV tritt in Zellen in Kultur initiiert und produziert Infektion Virusnachkommen, wissen wir wenig über das virale Invasion Weg (e) in das Gewebe auf zellulärer Ebene 2. Bei Studien von HSV Haut- oder Schleimhautinfektionen, Mäuse, haben Kaninchen und Meerschweinchen als Tiermodelle verwendet. Hautinfektion wurde durch intradermale Injektion oder durch Kratzen der Haut in Gegenwart von Virus etabliert und die Entwicklung der Krankheit wurde mit der Virusproduktion korreliert. Diese Verfahren beigetragen, verschiedene Aspekte der Pathogenese der Erkrankung zu verstehen, und werden verwendet, um antivirale Medikamente zu bewerten. Um HSV-Infektion am tissu studierene Ebene organotypischen Modelle der menschlichen Haut angewendet wurden. Als die Infektionsrate in diesen Floßkulturen beschränkt ist, nur eine begrenzte Anzahl von Studien, die Infektion, die Virusausbreitung und die Auswirkungen der antiviralen Komponenten veröffentlicht 3-6. Um zelluläre Determinanten, die während der HSV-1-Infektion in der intakten Epithels eine Rolle spielen, zu charakterisieren, haben wir ein Protokoll für die Ex-vivo-Infektionsstudien von murinen Epidermis 7. Haut von Neugeborenen oder von den Schwänzen von erwachsenen Mäusen hergestellt. Da HSV-1 kann er die vollständige Hautproben, die in virushaltige Medium eingetaucht wurden nicht infizieren, die Epidermis von der Dermis getrennt wir durch Behandlung Dispase II. Nach dem Schwimmen der epidermalen Schichten auf virushaltige Medium kann infizierte Zellen in der epidermalen Basalschicht zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Infektion (pi) 7 visualisiert werden. Um die Einleitung der Infektion in einzelnen Zellen vor der viralen Replikation eine Visualisierungnd Virusproduktion, gebeizt wir mit einem Antikörper gegen die infizierten Zellprotein 0 (ICP0), die eine der ersten Proteine ​​während der HSV-1-Infektion exprimiert wird. Die zelluläre Lokalisation von ICP0 durchläuft verschiedene Phasen während der frühen Infektion. Während ICP0 ist in Kern Foci vorliegenden während einer frühen Phase der viralen Genexpression, Relokalisierung ICP0 zum Zytoplasma zeigt eine spätere Phase der Infektion 8. Wir nutzten die Ex-vivo-Infektionsassay der epidermalen Schichten aus verschiedenen Mausmodellen, um die mögliche Rolle der verschiedenen zellulären Faktoren während der Infektion zu testen. Um die Auswirkungen von Rac1 als Schlüsselregulator der Aktindynamik adressieren, infizierten wir die Epidermis von Mäusen mit einem Keratinozyt-spezifische Deletion des Gens rac1 9. Dieses Modell erlaubt es, die Auswirkungen der mangel Rac1 auf den Wirkungsgrad der HSV-1-Infektion in epidermalen Keratinozyten Schichten zu studieren. Der Vergleich zu infizierten Epidermis der Steuerwurfwiedervealed keinen signifikanten Unterschied, was anzeigt, dass die Abwesenheit von Rac1 hatte keine Wirkung auf die Einleitung der Infektion in der Basalschicht der Epidermis 7. Die Verwendung weiterer Mausmodellen konnten wir Adresse, die zellulären Rezeptoren vermitteln den Eintritt in die Epidermis. Infizieren epidermalen Schichten entweder Nectin-1- oder HVEM-defizienten Mäusen mit HSV-1 zeigte, dass das anfängliche Eindringen des Virus in Gewebe hängt stark von der Gegenwart von Nectin-1 10. Darüber hinaus sind unsere Ergebnisse zeigen, dass HVEM auch als Rezeptor in murine Epidermis weniger effizient zu bedienen, auch wenn als Nectin-1 10. Um die räumliche Verteilung der infizierten Zellen in den Schichten der Epidermis zu adressieren visualisieren wir ICP0 Expression in Gewebeschnitten und epidermalen Gesamtpräparate (Abbildung 1). In Kryoschnitten von kompletten Haut, werden keine ICP0-exprimierenden Zellen detektiert (Abbildung 1). Im Gegensatz dazu Kryoschnitte der epidermalen Schichten zeigen zytoplasmatischenICP0 Ausdruck in der basalen Schicht bereits nach 3 Stunden pi (Abbildung 1). Zu späteren Zeitpunkten, virale Verbreitung in Schichten suprabasale visualisiert werden. Die räumliche Verteilung der infizierten Zellen in der Basalschicht leicht in epidermalen Gesamtpräparate (Figur 1) folgen. Bei der Infektion mit HSV-1 mit 100 PFU / Zelle wurden etwa 50% der basalen Keratinozyten in der Epidermis zeigen interfollikuläre ICP0 Expression bei 1,5 hr pi Zu diesem Zeitpunkt die meisten infizierten Zellen exprimieren Kern ICP0. Die Relokalisierung ICP0 in das Cytoplasma, das einen späteren Stadium der frühen Genexpression ist in nahezu allen Zellen in 3 h pi (Figur 1) vorhanden ist. Diese Modi auf ex vivo HSV-1-Infektion zu visualisieren infizierten Zellen über eine starke Assay zur Bestimmung der Wirkung von Inhibitoren oder gelöschter / mutierten zellulären Komponenten auf die virale Eintritt und die Ausbreitung im Gewebe zu untersuchen.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>DMEM/high glucose/GlutaMAX</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td align="right">31966047</td>
			<td>needed for cultivation of epidermal sheets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dispase II powder</td>
			<td>Roche</td>
			<td align="right">4942078001</td>
			<td>has to be solved in heated PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>enzyme-free cell dissociation solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5914</td>
			<td>needed for very gentle dissociation of epidermal sheets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE select cell dissociation solution</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12563-029</td>
			<td>needed for dissociation of epidermal sheets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chelex 100 resin</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>142-2832</td>
			<td>needed for chelation of polyvalent metal ions from the fetal calf serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gelatin from cold water fish skin&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7765</td>
			<td>needed for minimization of non-specific antibody binding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Keratin 14 Polyclonal Antibody (AF64) (conc.: 1 mg/ml)</td>
			<td>Covance</td>
			<td>PRB-155P</td>
			<td>used to visualize the intermediate filament keratin 14 which is a marker of the basal layer of the epidermis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor&#174; 488 conjugate (conc.: 2 mg/ml)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A-11029</td>
			<td>used as secondary antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor&#174; 555 conjugate (conc.: 2 mg/ml)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A-21429</td>
			<td>used as secondary antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#8242;,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI dihydrochloride)&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; (conc.: 0.1 mg/ml)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td align="right">36670</td>
			<td>used to counterstain the nucleus</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex vivo infection of murine epidermis with herpes simplex virus type 1

Um seine menschlichen Wirt eingeben, müssen Herpes-simplex-Virus Typ 1 (HSV-1) die Barriere von Schleimhäuten, Haut oder Hornhaut zu überwinden. HSV-1 Ziele Keratinozyten während der anfänglichen Eingabe und stellt eine Primärinfektion im Epithel, die durch latente Infektion von Neuronen folgt. Nach Reaktivierung können Viren deutlich an Schleimhaut Websites, die als Hautbläschen oder Schleimhautgeschwüre angezeigt zu werden. Wie HSV-1 dringt in Haut oder Schleimhaut und erreicht seine Rezeptoren ist wenig bekannt. Um die Invasion Route der HSV-1 in epidermale Gewebe auf zellulärer Ebene zu untersuchen, haben wir ein ex vivo-Infektionsmodell von murinen Epidermis, die den Ort der primären und rezidivierenden Infektion in der Haut darstellt. Der Test umfasst die Vorbereitung der Mäusehaut. Die Epidermis von der Dermis durch Dispase II Behandlung getrennt. Nach dem Aufschwimmen der epidermalen Schichten auf virushaltige Medium wird das Gewebe fixiert und Infektion kann zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Infektion durch visualisiertFärbung infizierter Zellen mit einem Antikörper gegen HSV-1-immediate early protein ICP0. ICP0-exprimierenden Zellen kann in der basalen Keratinozyten-Schicht bereits bei 1,5 Stunden nach der Infektion beobachtet werden. Mit längeren Zeiten der Infektion werden infizierte Zellen in Suprabasalschichten nachgewiesen, was anzeigt, dass die Infektion nicht auf die basalen Keratinozyten beschränkt, sondern das Virus verbreitet sich auf andere Schichten in dem Gewebe. Verwendung epidermalen Schichten von verschiedenen Mausmodellen erlaubt die Infizierungsprotokoll Bestimmung der Beteiligung von zellulären Komponenten, die zu HSV-1-Invasion im Gewebe beitragen. Darüber hinaus ist der Test geeignet, um Inhibitoren in Gewebe, das mit den ersten Eintrag Schritte stören, Zell-zu-Zell-Ausbreitung und die Virusproduktion zu testen. Hier beschreiben wir die ex vivo Infektion Protokoll im Detail und mit Nectin-1- oder HVEM-defizienten Mäusen präsentieren unsere Ergebnisse.

Die Aufgabe des Verfahrens ist es, epidermalen Blätter in dem HSV-1 kann von der basalen Schicht eindringen vorzubereiten. Der entscheidende Schritt ist die Trennung der Epidermis von der Dermis durch Dispase II-Behandlung, die in Abhängigkeit von der Mausstamm, angepasst werden muss. Die Konzentration von Dispase II kann 2,5 bis 5 mg / ml, und die Zeit der Inkubation von 20 bis 45 min liegen. Die Färbung der Intermediärfilamente Protein Keratin 14 ermöglicht leicht vorherzusagen, ob der basalen Epidermis infiziert...

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Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1

The skin is one target tissue of the human pathogen herpes simplex virus type 1 (HSV-1). To explore the invasion route of HSV-1 into tissue, we established an ex vivo infection model of murine epidermal sheets which represent the outermost layer of skin.

Ex vivo Infektion von murinen Epidermis mit Herpes Simplex Virus Typ 1

To enter its human host, herpes simplex virus type 1 (HSV-1) must overcome the barrier of mucosal surfaces, skin, or cornea. HSV-1 targets keratinocytes ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1

11.1K Aufrufe.  University of Cologne. The skin is one target tissue of the human pathogen herpes simplex virus type 1 (HSV-1). To explore the invasion route of HSV-1 into tissue, we established an ex vivo infection model of murine epidermal sheets which represent the outermost layer of skin.

Serie: Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1

Ex vivo Imaging of T Cells in Murine Lymph Node Slices with Widefield and Confocal Microscopes

Na&iuml;ve T cells continuously traffic to secondary lymphoid organs, including peripheral lymph nodes, to detect rare expressed antigens. The migration of T cells into lymph nodes is a complex process which involves both cellular and chemical factors including chemokines. Recently, the use of two-photon microscopy has permitted to track T cells in intact lymph nodes and to derive some quantitative information on their behavior and their interactions with other cells. While there are obvious advantages to an in vivo system, this approach requires a complex and expensive instrumentation and provides limited access to the tissue. To analyze the behavior of T cells within murine lymph nodes, we have developed a slice assay 
1, originally set up by neurobiologists and transposed recently to murine thymus 2. In this technique, fluorescently labeled T cells are plated on top of an acutely prepared lymph node slice. In this video-article, the localization and migration of T cells into the tissue are analyzed in real-time with a widefield and a confocal microscope. The technique which complements in vivo two-photon microscopy offers an effective approach to image T cells in their natural environment and to elucidate mechanisms underlying T cell migration.

Ex vivo Imaging of T Cells in Murine Lymph Node Slices with Widefield and Confocal Microscopes

This protocol describes a method to image fluorescent T cells introduced into lymph node slices. The technique permits real-time analyses of T cell migration with traditional widefield fluorescence or confocal microscopes.

Ex-vivo-Imaging von T-Zellen in Murine Lymph Node Slices mit Weitfeld und konfokale Mikroskope

Na&iuml;ve T cells continuously traffic to secondary lymphoid organs, including peripheral lymph nodes, to detect rare expressed antigens. The migration ...

Forschung

Immunologie und Infektion

A Primary Neuron Culture System for the Study of Herpes Simplex Virus Latency and Reactivation

Herpes simplex virus type-1 (HSV-1) establishes a life-long latent infection in peripheral neurons. This latent reservoir is the source of recurrent reactivation events that ensure transmission and contribute to clinical disease. Current antivirals do not impact the latent reservoir and there are no vaccines. While the molecular details of lytic replication are well-characterized, mechanisms controlling latency in neurons remain elusive. Our present understanding of latency is derived from in vivo studies using small animal models, which have been indispensable for defining viral gene requirements and the role of immune responses. However, it is impossible to distinguish specific effects on the virus-neuron relationship from more general consequences of infection mediated by immune or non-neuronal support cells in live animals. In addition, animal experimentation is costly, time-consuming, and limited in terms of available options for manipulating host processes. To overcome these limitations, a neuron-only system is desperately needed that reproduces the in vivo characteristics of latency and reactivation but offers the benefits of tissue culture in terms of homogeneity and accessibility.
Here we present an in vitro model utilizing cultured primary sympathetic neurons from rat superior cervical ganglia (SCG) (Figure 1) to study HSV-1 latency and reactivation that fits most if not all of the desired criteria. After eliminating non-neuronal cells, near-homogeneous TrkA+ neuron cultures are infected with HSV-1 in the presence of acyclovir (ACV) to suppress lytic replication. Following ACV removal, non-productive HSV-1 infections that faithfully exhibit accepted hallmarks of latency are efficiently established. Notably, lytic mRNAs, proteins, and infectious virus become undetectable, even in the absence of selection, but latency-associated transcript (LAT) expression persists in neuronal nuclei. Viral genomes are maintained at an average copy number of 25 per neuron and can be induced to productively replicate by interfering with PI3-Kinase / Akt signaling or the simple withdrawal of nerve growth factor1. A recombinant HSV-1 encoding EGFP fused to the viral lytic protein Us11 provides a functional, real-time marker for replication resulting from reactivation that is readily quantified. In addition to chemical treatments, genetic methodologies such as RNA-interference or gene delivery via lentiviral vectors can be successfully applied to the system permitting mechanistic studies that are very difficult, if not impossible, in animals. In summary, the SCG-based HSV-1 latency / reactivation system provides a powerful, necessary tool to unravel the molecular mechanisms controlling HSV1 latency and reactivation in neurons, a long standing puzzle in virology whose solution may offer fresh insights into developing new therapies that target the latent herpesvirus reservoir.

The protocol describes an efficient and reproducible model system to study herpes simplex virus type 1 (HSV-1) latency and reactivation. The assay employs homogenous sympathetic neuron cultures and allows for the molecular dissection of virus-neuron interactions using a variety of tools including RNA interference and expression of recombinant proteins.

Eine primäre Neuron Culture System zur Erforschung des Herpes Simplex Virus Latenz und Reaktivierung

Herpes simplex virus type-1 (HSV-1) establishes a life-long latent infection in peripheral neurons. This latent reservoir is the source of recurrent ...

Flow Cytometric Isolation of Primary Murine Type II Alveolar Epithelial Cells for Functional and Molecular Studies

Throughout the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII) to various aspects of immune regulation in the lung has been increasingly recognized. AECII have been shown to participate in cytokine production in inflamed airways and to even act as antigen-presenting cells in both infection and T-cell mediated autoimmunity 1-8. Therefore, they are especially interesting also in clinical contexts such as airway hyper-reactivity to foreign and self-antigens as well as infections that directly or indirectly target AECII. However, our understanding of the detailed immunologic functions served by alveolar type II epithelial cells in the healthy lung as well as in inflammation remains fragmentary. Many studies regarding AECII function are performed using mouse or human alveolar epithelial cell lines 9-12. Working with cell lines certainly offers a range of benefits, such as the availability of large numbers of cells for extensive analyses. However, we believe the use of primary murine AECII allows a better understanding of the role of this cell type in complex processes like infection or autoimmune inflammation. Primary murine AECII can be isolated directly from animals suffering from such respiratory conditions, meaning they have been subject to all additional extrinsic factors playing a role in the analyzed setting. As an example, viable AECII can be isolated from mice intranasally infected with influenza A virus, which primarily targets these cells for replication 13. Importantly, through ex vivo infection of AECII isolated from healthy mice, studies of the cellular responses mounted upon infection can be further extended.
Our protocol for the isolation of primary murine AECII is based on enzymatic digestion of the mouse lung followed by labeling of the resulting cell suspension with antibodies specific for CD11c, CD11b, F4/80, CD19, CD45 and CD16/CD32. Granular AECII are then identified as the unlabeled and sideward scatter high (SSChigh) cell population and are separated by fluorescence activated cell sorting 3.
In comparison to alternative methods of isolating primary epithelial cells from mouse lungs, our protocol for flow cytometric isolation of AECII by negative selection yields untouched, highly viable and pure AECII in relatively short time. Additionally, and in contrast to conventional methods of isolation by panning and depletion of lymphocytes via binding of antibody-coupled magnetic beads 14, 15, flow cytometric cell-sorting allows discrimination by means of cell size and granularity. Given that instrumentation for flow cytometric cell sorting is available, the described procedure can be applied at relatively low costs. Next to standard antibodies and enzymes for lung disintegration, no additional reagents such as magnetic beads are required. The isolated cells are suitable for a wide range of functional and molecular studies, which include in vitro culture and T-cell stimulation assays as well as transcriptome, proteome or secretome analyses 3, 4.

We describe the rapid isolation of primary murine type II alveolar epithelial cells (AECII) by flow cytometric negative selection. These AECII show high viability and purity and are suitable for a wide range of functional and molecular studies regarding their role in respiratory conditions such as autoimmune or infectious diseases.

Durchflusszytometrische Isolation of Primary Murine Type II Alveolarepithelzellen für Funktionelle und Molekulare Studien

Throughout  the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII)  to various aspects of immune regulation in the lung has been ...

Trans-vivo Delayed Type Hypersensitivity Assay for Antigen Specific Regulation

Delayed-type hypersensitivity response (DTH) is a rapid in vivo manifestation of T cell-dependent immune response to a foreign antigen (Ag) that the host immune system has experienced in the recent past. DTH reactions are often divided into a sensitization phase, referring to the initial antigen experience, and a challenge phase, which usually follows several days after sensitization. The lack of a delayed-type hypersensitivity response to a recall Ag demonstrated by skin testing is often regarded as an evidence of anergy. The traditional DTH assay has been effectively used in diagnosing many microbial infections.
Despite sharing similar immune features such as lymphocyte infiltration, edema, and tissue necrosis, the direct DTH is not a feasible diagnostic technique in transplant patients because of the possibility of direct injection resulting in sensitization to donor antigens and graft loss. To avoid this problem, the human-to-mouse "trans-vivo" DTH assay was developed 1,2. This test is essentially a transfer DTH assay, in which human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) and specific antigens were injected subcutaneously into the pinnae or footpad of a na&iuml;ve mouse and DTH-like swelling is measured after 18-24 hr 3. The antigen presentation by human antigen presenting cells such as macrophages or DCs to T cells in highly vascular mouse tissue triggers the inflammatory cascade and attracts mouse immune cells resulting in swelling responses. The response is antigen-specific and requires prior antigen sensitization. A positive donor-reactive DTH response in the Tv-DTH assay reflects that the transplant patient has developed a pro-inflammatory immune disposition toward graft alloantigens.
The most important feature of this assay is that it can also be used to detect regulatory T cells, which cause bystander suppression. Bystander suppression of a DTH recall response in the presence of donor antigen is characteristic of transplant recipients with accepted allografts 2,4-14. The monitoring of transplant recipients for alloreactivity and regulation by Tv-DTH may identify a subset of patients who could benefit from reduction of immunosuppression without elevated risk of rejection or deteriorating renal function.
A promising area is the application of the Tv-DTH assay in monitoring of autoimmunity15,16 and also in tumor immunology 17.

We describe a valuable diagnostic assay that could potentially be used to decide the withdrawal of immunosuppression after transplant without elevated risk of graft rejection. The assay uses the principles of Delayed Type Hypersensitivity and provides accurate assessment of both donor specific effector and regulatory immune responses mounted by recipients.

Trans-vivo Überempfindlichkeit vom verzögerten Typ Assay für Antigen-spezifische Verordnung

Delayed-type hypersensitivity response (DTH) is a rapid in vivo manifestation of T cell-dependent immune response to a foreign antigen (Ag) that the host ...

Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential to be used as drug therapies for HIV-1 infection. Post-integration inhibitors include ribozymes, short hairpin (sh) RNAs, small interfering (si) RNAs, U1 interference (U1i) RNAs and RNA aptamers. Many of these have been identified using transient co-transfection assays with an HIV-1 expression plasmid and some have advanced to clinical trials. In addition to measures of efficacy, small RNAs have been evaluated for their potential to affect the expression of human RNAs, alter cell growth and/or differentiation, and elicit innate immune responses. In the protocols described here, a set of transient transfection assays designed to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are described. We have used these assays to identify new ribozymes and optimize the format of shRNAs and siRNAs targeting HIV-1 RNA. The methods provide a quick set of assays that are useful for screening new anti-HIV-1 RNAs and could be adapted to screen other post-integration inhibitors of HIV-1 replication.

Methods to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps of the HIV-1 replication cycle are described. These methods are useful for screening new molecules and optimizing the format of existing ones.

Bewertung der Wirksamkeit und Toxizität von RNAs Targeting HIV-1-Produktion für den Einsatz in Gene oder Arzneimitteltherapie

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...

Ex Vivo Infection of Human Lymphoid Tissue and Female Genital Mucosa with Human Immunodeficiency Virus 1 and Histoculture

Histocultures allow studying intercellular interactions within human tissues, and they can be employed to model host-pathogen interactions under controlled laboratory conditions. Ex vivo infection of human tissues with human immunodeficiency virus (HIV), among other viruses, has been successfully used to investigate early disease pathogenesis, as well as a platform to test the efficacy and toxicity of antiviral drugs. In the present protocol, we explain how to process and infect with HIV-1 tissue explants from human tonsils and cervical mucosae, and maintain them in culture on top of gelatin sponges at the liquid-air interface for about two weeks. This non-polarized culture setting maximizes access to nutrients in culture medium and oxygen, although progressive loss of tissue integrity and functional architectures remains its main limitation. This method allows monitoring HIV-1 replication and pathogenesis using several techniques, including immunoassays, qPCR, and flow cytometry. Of importance, the physiologic variability between tissue donors, as well as between explants from different areas of the same specimen, may significantly affect experimental results. To ensure result reproducibility, it is critical to use an adequate number of explants, technical replicates, and donor-matched control conditions to normalize the results of the experimental treatments when compiling data from multiple experiments (i.e., conducted using tissue from different donors) for statistical analysis.

Ex Vivo Infection of Human Lymphoid Tissue and Female Genital Mucosa with Human Immunodeficiency Virus 1 and Histoculture

Infection of human tissues with human immunodeficiency virus (HIV) ex vivo provides a valuable 3D model of virus pathogenesis. Here, we describe a protocol to process and infect tissue specimens from human tonsils and female genital mucosae with HIV-1 and maintain them in culture at the liquid-air interface.

Ex-Vivo Infektion der lymphatischen Gewebe und weiblichen genitalen Schleimhaut mit Human Immunodeficiency Virus 1 und Histoculture

Histocultures allow studying intercellular interactions within human tissues, and they can be employed to model host-pathogen interactions under ...

An Ex Vivo Chicken Primary Bursal-cell Culture Model to Study Infectious Bursal Disease Virus Pathogenesis

Infectious bursal disease virus (IBDV) is a birnavirus of economic importance to the poultry industry. The virus infects B cells, causing morbidity, mortality, and immunosuppression in infected birds. In this study, we describe the isolation of chicken primary bursal cells from the bursa of Fabricius, the culture and infection of the cells with IBDV, and the quantification of viral replication. The addition of chicken CD40 ligand significantly increased cell proliferation fourfold over six days of culture and significantly enhanced cell viability. Two strains of IBDV, a cell-culture adapted strain, D78, and a very virulent strain, UK661, replicated well in the ex vivo cell cultures. This model will be of use in determining how cells respond to IBDV infection and will permit a reduction in the number of infected birds used in IBDV pathogenesis studies. The model can also be expanded to include other viruses and could be applied to different species of birds.

An Ex Vivo Chicken Primary Bursal-cell Culture Model to Study Infectious Bursal Disease Virus Pathogenesis

Here we describe the isolation of chicken primary bursal cells from the bursa of Fabricius, the culture and infection of the cells with infectious bursal disease virus, and the quantification of viral replication.

Ein Ex-Vivo Huhn Primärkultur Bursitis-Zelle Modell zur Bursitis Infektionskrankheit Virus Pathogenese

Infectious bursal disease virus (IBDV) is a birnavirus of economic importance to the poultry industry. The virus infects B cells, causing morbidity, ...

Temporal Analysis of the Nuclear-to-cytoplasmic Translocation of a Herpes Simplex Virus 1 Protein by Immunofluorescent Confocal Microscopy

Infected cell protein 0 (ICP0) of herpes simplex virus 1 (HSV-1) is an immediate early protein containing a RING-type E3 ubiquitin ligase. It is responsible for the proteasomal degradation of host restrictive factors and the subsequent viral gene activation. ICP0 contains a canonical nuclear localization sequence (NLS). It enters the nucleus immediately after de novo synthesis and executes its anti-host defense functions mainly in the nucleus. However, later in infection, ICP0 is found solely in the cytoplasm, suggesting the occurrence of a nuclear-to-cytoplasmic translocation during HSV-1 infection. Presumably ICP0 translocation enables ICP0 to modulate its functions according to its subcellular locations at different infection phases. In order to delineate the biological function and regulatory mechanism of ICP0 nuclear-to-cytoplasmic translocation, we modified an immunofluorescent microscopy method to monitor ICP0 trafficking during HSV-1 infection. This protocol involves immunofluorescent staining, confocal microscope imaging, and nuclear vs. cytoplasmic distribution analysis. The goal of this protocol is to adapt the steady state confocal images taken in a time course into a quantitative documentation of ICP0 movement throughout the lytic infection. We propose that this method can be generalized to quantitatively analyze nuclear vs. cytoplasmic localization of other viral or cellular proteins without involving live imaging technology.

ICP0 undergoes nuclear-to-cytoplasmic translocation during HSV-1 infection. The molecular mechanism of this event is not known. Here we describe the use of confocal microscope as a tool to quantify ICP0 movement in HSV-1 infection, which lays the groundwork for quantitatively analyzing ICP0 translocation in future mechanistic studies.

Zeitliche Analyse der nuklearen-cytoplasmatische Translokation eines Herpes-Simplex-Virus 1-Proteins Immunofluorescent konfokalen Mikroskopie

Infected cell protein 0 (ICP0) of herpes simplex virus 1 (HSV-1) is an immediate early protein containing a RING-type E3 ubiquitin ligase. It is ...

An Advanced Murine Model for Nonalcoholic Steatohepatitis in Association with Type 2 Diabetes

Obesity is associated with chronic low-grade inflammation and insulin resistance, contributing to an increasing prevalence of chronic metabolic diseases, such as type 2 diabetes and nonalcoholic steatohepatitis (NASH). Recent research has established that pro-inflammatory immune cells infiltrate obese hypertrophic adipose tissue and liver. Given the emerging importance of immune cells in the context of metabolic homeostasis, there is a critical need to quantify and characterize their modification during the development of type 2 diabetes and NASH. However, animal models that induce pathophysiological features typical of human NASH are sparse.
In this article, we provide a detailed protocol to identify immune cell subsets isolated from liver and adipose tissue in a reliable mouse model of NASH, established by housing high-fat diet (HFD) mice under non-specific pathogen-free (SPF) conditions without a barrier for at least seven weeks. We demonstrate the handling of mice in non-SPF conditions, digestion of the tissues and identification of macrophages, natural killer (NK) cells, dendritic cells, B and T cell subsets by flow cytometry. Representative flow cytometry plots from SPF HFD mice and non-SPF mice are provided. To obtain reliable and interpretable data, the use of antibodies, accurate and precise methods for tissue digestion and proper gating in flow cytometry experiments are critical elements.
The intervention to restore physiological antigen exposure in mice by housing them in non-SPF conditions and unspecific exposure to microbial antigens could provide a relevant tool for investigating the link between immunological alterations, diet-induced obesity and related long term complications.

A simple and reliable diet-induced rodent animal model for nonalcoholic steatohepatitis (NASH) is described, achieved through non-SPF housing of the animals and administration of a specific high-fat diet. We describe identification of hepatic and adipose immune cell subsets to recapitulate human immunological conditions by exposing mice to environmental germs.

Ein fortgeschrittenes Murine-Modell für alkoholfreie Steatohepatitis in Verbindung mit Typ-2-Diabetes

Obesity is associated with chronic low-grade inflammation and insulin resistance, contributing to an increasing prevalence of chronic metabolic diseases, ...

In Vitro ELISA Test to Evaluate Rabies Vaccine Potency

The growing global concern for the animal welfare is encouraging manufacturers and the National Control Laboratories (OMCLs) to follow the 3Rs strategy for the Replacement, Reduction, and Refinement of the laboratory animal testing. The development of in vitro approaches is recommended at the WHO and European levels as alternatives to the NIH test for evaluating the rabies vaccine potency. At the surface of the rabies virus (RABV) particle, trimers of glycoprotein constitute the major immunogen to induce Viral Neutralizing Antibodies (VNAbs). An ELISA test, where Neutralizing Monoclonal Antibodies (mAb-D1) recognize the trimeric form of the glycoprotein, has been developed to determine the contents of the native folded trimeric glycoprotein along with the production of the vaccine batches. This in vitro potency test demonstrated a good concordance with the NIH test and has been found suitable in collaborative trials by RABV vaccine manufacturers and OMCLs. Avoidance of animal use is an achievable objective in the near future.
The method presented is based on an indirect ELISA sandwich immunocapture using the mAb-D1 which recognizes the antigenic sites III (aa 330 to 338) of the trimeric RABV glycoprotein, i.e., the immunogenic RABV antigen. mAb-D1 is used for both coating and detection of glycoprotein trimers present in the vaccine batch. Since the epitope is recognized because of its conformational properties, the potentially denatured glycoprotein (less immunogenic) cannot be captured and detected by the mAb-D1. The vaccine to be tested is incubated in a plate sensitized with the mAb-D1. Bound trimeric RABV glycoproteins are identified by adding the mAb-D1 again, labeled with peroxidase and then revealed in the presence of substrate and chromogen. Comparison of the absorbance measured for the tested vaccine and the reference vaccine allows for the determination of the immunogenic glycoprotein content.

Here we describe an indirect ELISA sandwich immunocapture to determine the immunogenic glycoprotein contents in rabies vaccines. This test uses a neutralizing Monoclonal Antibody (mAb-D1) recognizing glycoprotein trimers. It is an alternative to the in vivo NIH test to follow the consistency of vaccine potency during production.

In Vitro ELISA-Test zur Bewertung der Wirksamkeit von Tollwut-Impfstoffen

The growing global concern for the animal welfare is encouraging manufacturers and the National Control Laboratories (OMCLs) to follow the 3Rs strategy ...