Angiogenese spielen eine wichtige Rolle bei der Tumormetastasierung und Progression. In diesem Protokoll werden wir die duale Biolumineszenz-Bildgebungsmethode verwenden, um das dynamische Tumorverlauf und die Angiogenese in einem Mausmodell von Brustkrebs zu überwachen. In diesem Modell können wir das Tumorwachstum und die Angiogenese gleichzeitig in der einzelnen Maus durch Firefly luciferase bzw. Renilla luciferase Bildgebung verfolgen.
Dieses Modell kann weit verbreitet in Antitumor-Arzneimittel-Screening und Onkologie-Forschung angewendet werden. Dieses duale Biolumineszenzmodell kann verwendet werden, um Tumorprogression und Regression zu verfolgen und tumorbezogene molekulare Prozesse als Reaktion auf therapeutische Strategien zu erkennen. Angiogenese ist ein entscheidender Prozess der Tumorprogression.
Daher ist die visuelle und sensible Überwachung der Tumorprogression und Angiogenese für die Entwicklung wirksamer Tumorbehandlungen notwendig. Die Verfahren werden von Kaiyue Zhang, Chen Wang und Shang Chen, Studenten aus unserem Labor, demonstriert. Für Lentivirus-Verpackungen und Produktionssamen einmal 10 bis sechs sechs von 293T-Zellen in zwei Milliliter DMEM, ergänzt mit 10% fetalem Rinderserum pro Brunnen in eine Sechs-Brunnen-Platte für die Nachtkultur in einem befeuchteten Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid.
Am nächsten Morgen 7,5 Mikroliter Liposom mit 250 Mikroliter Neinem Essential Medium in zwei separaten 1,5-Milliliter-Röhren für eine fünfminütige Inkubation bei Raumtemperatur mischen. Zur Herstellung der DNA-Lösungen fügen Sie den Plasmid lentivirus RR Vektor und HelferPlasmide zu 250 Mikroliter n. Minimal Essential Medium in einzelnen 1,5-Milliliter-Röhren, wie in der Tabelle beschrieben. Am Ende der Inkubation fügen Sie die DNA RR-Lösungen den Liposomensuspensionen sanft tropfenweise hinzu und lassen Sie die DNA bei Raumtemperatur 20 Minuten lang an die Lipidmembranen kleben.
Während die Mischung inkubiert wird, ersetzen Sie den Überstand der 293T-Zellkultur durch einen Milliliter frisches Kulturmedium und fügen Sie jedem Brunnen vorsichtig 0,5 Milliliter der entsprechenden Liposomen-DNA-Mischung hinzu. Bringen Sie die Zellen für 12 bis 16 Stunden in den Zellkultur-Inkubator zurück, bevor Sie den Überstand in jedem Brunnen durch einen Milliliter frisches Kulturmedium ersetzen, das mit Antibiotika ergänzt wird. Nach weiteren 36 Stunden Inkubation die Überstande in einem konischen Röhrchen pro Lentivirus-Stamm bündeln, um die 293T-Zellen durch Zentrifugation zu sedimentieren.
Dann übertragen Sie das Lentivirus RR-haltige Überwasserstoffe in einzelne 1,5-Milliliter sterile Polypropylen-Lagerröhrchen zur Lagerung bei minus 80 Grad Celsius. Für die lentivirale Transduktion zur Genexpression in 4T1-Mamma-Tumorzellen ersetzen Sie den Überstand in jedem Brunnen einer sechs-Well-4T1-Zellkulturplatte durch ein Milliliter frisches RPMI-basiertes Zellkulturmedium, ergänzt durch fetales Rinderserum und einen Milliliter Lentiviralen Bestand. Dann fügen Sie acht Mikrogramm pro Milliliter Polybren zu jedem Brunnen, und sanft Pipette ein paar Mal zu mischen.
Zentrifugieren Sie die Platte, um die Transduktionseffizienz zu erhöhen, und geben Sie die Zellen für vier bis zwölf Stunden an den Zellkultur-Inkubator zurück. Am Ende der Inkubation, ersetzen Sie den Überstand in jedem Brunnen mit frischen Kulturmedium mit Serum und Antibiotika ergänzt, um alle lentiviralen Partikel und Polybrene zu entfernen. Um für die lentivirus-transduzierten Zellen auszuwählen, durchqueren Sie die transduzierten 4T1-Zellkulturen im Verhältnis von eins zu drei zu vier mit Selektionsmedium, wobei das Medium alle zwei bis drei Tage wechselt.
Sehen Sie sich nach sieben Tagen Selektionsmediumkultur die transduzierten Zellkulturen unter einem fluoreszenzinvertierten Phasenkontrastmikroskop an und zählen Sie die Anzahl der roten fluoreszierenden Protein-positiven oder RFP-4T1-Zellen und aller 4T1-Zellen in drei Sichtfeldern, um das RFP-positive Verhältnis zu schätzen. Um ein tumortragendes Mausmodell einzurichten, waschen Sie 80% konfluenttransduzierte Zellkulturen mit PBS, bevor Sie die Zellen mit zwei Millilitern Trypsin-EDTA pro 60-Millimeter-Kulturplatte lösen. Wenn die Zellen von den Plattenböden angehoben haben, stoppen Sie die Reaktion mit fünf bis 10 Milliliter Serum ergänzt Medium pro Platte.
Und übertragen Sie die Kulturen in einzelne 15-Milliliter-Zentrifugenrohre zum Zählen. Verdünnen Sie die Zellen auf ein mal 10 bis sechs liter Kulturmedium ohne Serumkonzentration. Und subkutan 100 Mikroliter der 4T1-RR-Zelllinie in die linke Schulter einer anästhesierten tumortragenden Modellmaus und 100 Mikroliter der 4T1-RRT-Zelllinie in die rechte Schulter derselben Maus injizieren.
Legen Sie nach den Injektionen jede Maus in einen geeigneten Erholungsbereich mit einer thermischen Unterstützung, bis sie vollständig wiederhergestellt ist. Palpate die Tumormassen jeden Tag für sieben Tage, um zu bestätigen, dass die Mäuse tumortragend sind. Am siebten Tag nach der Implantation injiziert intraperitoneal 50 Mikrogramm pro Kilogramm Ganciclovir in jede tumortragende Maus zweimal täglich bis zum Ende des Experiments.
Für Tumorwachstum, öffnen Sie das Living Imaging System. Initialisieren Sie die Living Imaging-Software und initialisieren Sie das System. Während der Initialisierung des Systems, verwenden Sie eine Insulinspritze, um jede Maus mit dem entsprechenden Volumen von Coelenterazin in die Retrobulbar abgebildet werden zu injizieren.
Legen Sie die injizierten Mäuse in die Kamerakammer und erhalten Sie sofort mehrere Bilder der Maus dorsal, um die Renilla-Luziferase-Signale von 4T1-Zellen zu erfassen, bis die biolumineszierenden Signale verblassen. 10 Minuten nach der Renilla-Luziferase-Bildgebung, verwenden Sie eine Insulinspritze, um das entsprechende Volumen von D-Luciferin in jedes Tier intraperitoneal zu injizieren. 10 Minuten nach der D-Luciferin-Injektion, legen Sie die Mäuse in die Kamerakammer und erhalten Sie mehrere Bilder der Maus dorsal, um die Firefly-Luziferase-Signale von der Angiogenese zu erhalten.
Nach der Lentivirus-Transduktion sind mehr als 99% der Zellen RFP-positiv, ohne Unterschiede in der Zellkulturmorphologie zwischen den beiden transduzierten Zelllinien. Anschließend zeigt die Biolumineszenz-Bildgebung der transduzierten Zellen, dass beide Zelllinien starke biolumineszierende Signale ähnlicher Stärke aussenden. Nach subkutaner Injektion der transducierten Zelllinien in ein transgenesenes tumortragendes Mausmodell kann das angiogenese-induzierte Tumorwachstum durch Firefly-Luziferase-Signale in Gegenwart von D-Luziferin bei demselben Tier bewertet werden.
Bei sieben Tagen nach der Implantation induziert die Ganciclovir-Verabreichung den Tod in den 4T1-RRT-Zellen, was zu einer dramatischen Reduktion des Renilla-Luziferase-Signals in den von diesen Zellen festgestellten Tumoren führt. Firefly Luziferase Signale erhöhen sich auch in Verbindung mit einer Erhöhung der Renilla luziferase Ausdruck und Abnahme nach Luziferase Rückgang. Zusammengenommen deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass es einen direkten Zusammenhang zwischen Tumorangiogenese und Tumorwachstum gibt.
Tatsächlich kann der Tod von Ganciclovir-induzierten Tumorzellen zu einer Hemmung der Tumorangiogenese führen. Darüber hinaus zeigt die Immunfärbung für antivaskuläre endotheliale Wachstumsfaktor-Rezeptor II, als Marker der Angiogenese, eine signifikanter etablierte mikrovaskuläre Struktur in 4T1-RR Tumorgewebeabschnitten als in Abschnitten von 4T1-RRT-Tumoren, im Einklang mit dem Rückgang des Firefly-Luziferase-Signals, das nach der Verabreichung von Ganciclovir beobachtet wurde. Der kritischste Schritt des Protokolls ist die Verwendung von zwei Arten von Luziferase, wie FLuc und RLuc für die gleichzeitige Verfolgung der Zellen und die Angiogenese.
Diese Technologie könnte verwendet werden, um Krebszellen an verschiedenen Orten zu behandeln, und es kann weit verbreitet in Viruskrebs-Modellen verwendet werden. Dieses Mausmodell ermöglicht es, das Tumorwachstum und die Anti-Tumor-Effekte des HSV-ttk/GCV-Tracking-Systems dynamisch bei einem lebenden Tier zu visualisieren. Eine Einrichtung der Biosicherheitsstufe II ist erforderlich, um eine Lentivirus-Transfektion zu verhindern, da die Medien Lentiviruspartikel enthalten, die für den Menschen schädlich sein könnten.
