Name: quantitative 3d in silico modeling (q3dism) of cerebral amyloid-beta phagocytosis in rodent models of alzheimer's disease
Uploaded: 2016-12-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 33 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantitative 3D In Silico Modeling q3DISM of Cerebral Amyloid-beta Phagocytosis in Rodent Models of Alzheimer's Disease at JoVE.com

M-V.G-S. is supported by a BrightFocus Foundation Alzheimer's Disease Research Fellowship Award (A2015309F) and an Alzheimer's Association, California Southland Chapter Young Investigator Award. T.M.W. is supported by an ARCS Foundation and John Douglas French Alzheimer's Foundation Maggie McKnight Russell-JDFAF Memorial Postdoctoral Fellowship. This work was supported by the National Institute on Neurologic Disorders and Stroke (1R01NS076794-01, to T.T.), an Alzheimer's Association Zenith Fellows Award (ZEN-10-174633, to T.T.), and an American Federation of Aging Research/Ellison Medical Foundation Julie Martin Mid-Career Award in Aging Research (M11472, to T.T.). We are grateful for startup funds from the Zilkha Neurogenetic Institute, which helped to make this work possible. &#8195;

Erklärung der Forschungsethik: Alle Versuche mit hierin aufgeführten Tiere wurden von der University of Southern California Institutional Animal Care und Use Committee (IACUC) und durchgeführt in strikter Übereinstimmung mit den National Institutes of Health Leitlinien und Empfehlungen der Gesellschaft für Evaluierung und Akkreditierung von Labor genehmigt Animal Care international. 1. Gehirn von Nagetieren Isolierung und Vorbereitung für Immunostaining TAG 1: <ol><li> Legen Sie im Alter von TgF344-AD-Ratten (14 Monate alt) oder APP / PS1-Mäuse (12 Monate alte) unter Dauer tief Isoflurananästhesie (4%). Beurteilen Sie die Narkosetiefe durch Zehe Prise und das Fehlen von Rückzugsreflex. </li><li> Schneiden Sie durch beide Seiten des Brustkorbs und heben Sie das Herz aussetzen. Legen Sie eine 23 G-Nadel in den linken Ventrikel des Herzens und machen einen kleinen Einschnitt in den rechten Vorhof. Fahren Sie mit dem Ausbluten von transkardialer Perfusion mit eiskalter phosphatgepufferter Salzlösung(PBS) eine peristaltische Pumpe (30 ml für Mäuse; 150-200 ml für Ratten) verwendet. </li><li> Machen Sie einen Schwanzmittelschnitt in die Haut und die Haut und Muskeln zur Seite schieben. Geschnitten durch die Oberseite des Schädels entlang der Mittellinie und zwischen den Augen. Entfernen Sie die Knochenplatten und isolieren das gesamte Gehirn aus dem Schädel. </li><li> Legen Sie das Gehirn in einen koronalen Gehirn von Nagetieren Matrix und in Scheiben schneiden sie in Viertel. posterior Viertel inkubieren O / N (16 h) in Paraformaldehyd Fixierlösung (4% PFA in PBS) bei 4 ° C. Waschen 3x in PBS, und dann übertragen zu 70% Ethanol. Achtung: PFA ist giftig und sollte unter einer chemischen Abzugshaube mit geeigneter persönlicher Schutzausrüstung gehandhabt werden. </li></ol> TAG 2: <ol start="5"><li> Platzieren Gehirn Viertel in Einbettungskassetten und progressiv Gewebe entwässern in sukzessiv konzentrierter 1 h Ethanolbäder (70%, 80%, 95% und 100% x3). </li><li> Klar Ethanol aus dem Gewebe mit drei aufeinanderfolgenden 100% Xylol Bäder (jeweils 1 h). Achtung: Xylol ist giftig und shOuld mit entsprechenden persönlichen Schutzausrüstung unter einer chemischen Abzugshaube gehandhabt werden. </li><li> Einbetten von Gewebe in Paraffinblöcken nach zwei geschmolzene Paraffinwachs Bäder (56-58 ° C, 90 min jeweils). </li></ol> TAG 3: <ol start="8"><li> Schneiden Sie 10 um dicke Abschnitte von in Paraffin eingebetteten Gehirne mit einem Mikrotom. Dip Abschnitte in ein Wasserbad (50 ° C für 1 min) und wenden auf Objektträger. Lassen Sie die Folien O / N, um sicherzustellen, Gewebe Haftung auf der Folie zu trocknen. </li></ol> 2. Immunostaining Hinweis: Verschiedene Kombinationen von Antikörpern können für das Färbeverfahren eingesetzt werden unten beschrieben. Antikörper - Cocktails kompatibel mit Hirngewebe von Ratten und Mäusen sind in Tabelle 1 aufgeführt. TAG 4: <ol><li> Deparaffinisieren Gehirnschnitte mit 2x 100% Xylol Bäder (12 min jeweils). </li><li> Rehydrieren Hirnschnitten in aufeinanderfolgenden Bädern ethanol - 100% für 10 min, 95% für 5 min, 80% für 10 min, und schließlich 70% für 15 min - followed durch 3x PBS Waschungen [5 min bei RT, mit Licht Agitation]. Inzwischen Lösungswärme Antigen-Retrieval auf 95-97 ° C auf einer Heizplatte mit Magnetstab gerührt wurde. </li><li> Inkubieren Hirnschnitten in Antigen-Retrieval-Lösung bei 95-97 ° C für 30 min. Dann waschen 3x in PBS (5 min bei RT, mit Licht Agitation). </li><li> Schnell trocken Dias heikle Aufgabe Wischer mit Gewebe ein Austrocknen zu verhindern, und mit einer hydrophoben Barriere Stift eine hydrophobe Barriere rund um den Gewebebereich zu ziehen. Füllen eingekreisten Gewebebereich mit Blockierungspuffer [PBS, enthaltend 0,3% Triton X-100 und 10% normalem Eselserum (NDS)] und für 1 h in einer befeuchteten Kammer bei RT inkubieren. </li><li> Ersetzen Blockierungspuffer mit Iba1 primären Antikörper (in Blockierungspuffer verdünnt) mononukleären Phagozyten zu etikettieren, und Inkubieren O / N bei 4 ° C in einer befeuchteten Kammer. Siehe Antikörper - Hosts und Arbeitsverdünnungen, Tabelle 1 und die Tabelle der Materialien. </li></ol> TAG 5: <ol start="6"><li> Spülenprimärer Antikörper mit 3x PBS Bäder (5 min bei RT mit Licht Agitation). Inkubieren mit fluoreszierenden Sekundärantikörper (konjugiert mit einem 594 nm-Emission Fluorophor) für 1 h (in Blockierungspuffer bei RT im Dunkeln), gefolgt von PBS 3x Bäder (5 min bei RT mit leichtem Schütteln). Zu diesem Zeitpunkt halten Abschnitte im Dunkeln Fluoreszenzsignal Bleichen zu vermeiden. </li></ol> Tag 6 - 7: <ol start="7"><li> Wiederholen Sie die Schritte 2.5 und 2.6 mit CD68 (Rattenhirnen) oder LAMP1 (Mausgewebe) Antikörper und geeignete Sekundärantikörper (in Verbindung mit einem 488-nm-Emissions Fluorophore) Phagolysosome zu beschriften. </li></ol> TAG 7 - 8: <ol start="8"><li> Wiederholen Sie die Schritte 2.5 und 2.6 mit OC (Rattengewebe) oder 4G8 (Gehirn der Maus) Antikörper und einem geeigneten sekundären Antikörper (gekoppelt mit einem 647 nm Fluorophore) Aß Ablagerungen zu beschriften. HINWEIS: Alternativ können 6E10 Antikörper erfolgreich sowohl auf Maus und Ratte Gewebe verwendet werden. Für eine entsprechende Antikörper - Kombinationen finden Sie in der Tabelle der Materialien </strOng&gt;. </li><li> Lassen Abschnitte vollständig trocknen O / N bei RT im Dunkeln. Dann Abdeckung Proben mit einem Deckglas versiegelt durch Fluoreszenz Montage Medien mit DAPI. </li></ol> 3. Erwerb von großen Z-Stack konfokale Datensätze Hinweis: Dieses Protokoll ein Laser-Scanning-konfokalen Mikroskop, ausgestattet mit einem 60X Objektiv und 405 nm, 488 nm, 594 nm und 647 nm Laser vollständig automatisiert erfordert. Alle Geräte sind Computer von Imaging- und Lasersteuerungssoftware gesteuert. Vor dem Bildgebungsprotokoll, Leistung auf dem Computer, epifluoreszenten Lampe, Mikroskop, Laser und Kamera zu beginnen. TAG 9: <ol><li> Wählen Sie das 60X Mikroskopobjektiv. In Sionsöl auf die Linse, und legen Sie die Probe auf den Mikroskoptisch Diahalter. Heben Sie das Ziel, bis der Öl Kontakt mit der Folie macht. Stellen Sie die Fokusebene zu Amyloid-Plaques im Hippocampus oder Hirnrinde mit epifluoreszenten Beleuchtung durch die Okulare lokalisieren. </li><li> Erwerben Sie konfokalen imAlter aktivierte mononukleäre Phagozyten Amyloid-Ablagerungen im Hippocampus oder Cortex von Nagetieren umgebenden durch konfokale Mikroskopie (60X Vergrößerung, z-Stapel Schritte: 0,25 &amp; mgr; m &lt;z &lt;0,40 um, die Anzahl der Schritte 25 &lt;n &lt;35). </li></ol> 4. q3DISM Hinweis: Um aussagekräftige Ergebnisse zu erhalten, empfehlen wir Ihnen ein Minimum von 3 Bildern pro Tier / Region von Interesse zu analysieren. Für jedes Bild variiert die Fülle von Zellen zu analysieren, auf experimentellen Paradigmen abhängig. In den repräsentativen Ergebnisse in diesem Bericht gezeigt, analysierten wir 3 Zellen / Zustand (zB einkernigen Phagozyten entfernt von oder mit Plaques, siehe 1C - D und 2C - D). TAG 10: <ol><li> Analysieren Sie konfokalen Datensätze mit wissenschaftlichen 3D-Bildverarbeitung und Analyse-Software Kolokalisation (coloc) Modul für die räumliche Nähe von Iba1 / CD68 (Rattengewebe) oder Iba1 / LAMP1 (Mausgewebe) Färbung in allen z-Ebenen gleichzeitig.Erstellen Sie Iba + / CD68 + oder Iba + / LAMP1 + Kolokalisierung Kanäle , die zu Phagolysosome innerhalb aktivierten mononukleären Phagozyten entsprechen. <ol><li> Wählen TRITC für Kanal A (entsprechend Iba1 Anfärbung gekoppelt mit 594 nm Fluorophor) und FITC für Kanal B (entsprechend CD68 oder LAMP1 Anfärbung gekoppelt mit 488 nm-Fluorophor). Auf der rechten Seite des Software-Fensters für &#39;Modus zu überprüfen, &quot;die Option&quot; Schwelle &quot;, und für&quot; coloc Intensitäten &quot;die Option&quot; Quellkanäle &quot;. </li><li> Klicken Sie auf &#39;Bearbeiten&#39; &#39;coloc Farbe &quot;auszuwählen, auf der rechten Seite des Software-Fensters. </li><li> Für jeden Kanal unabhängig einstellen Schwellen spezifische Färbung zu schließen und Hintergrund / nicht-spezifische Signale auszuschließen. Einmal eingestellt, ändern sich nicht, Schwellen zwischen den Bildern eine unvoreingenommene Analyse zu gewährleisten. Die colocalized Voxel (Pixel von allen Z-Stapel) wird in der Farbe in Schritt ausgewählt erscheinen 4.1.2 in allen z-Stacks simultaneously. </li><li> Klicken Sie auf &quot;coloc Kanal bauen &#39;. Die Kolokalisation Kanal erstellt wird im Display Einstellungsfenster angezeigt. </li><li> Klicken Sie auf den coloc Kanal Kanalstatistik zu öffnen. Die &#39;% Volumen / Material A über dem Schwellenwert colocalized&#39; stellt die% der Iba1 Signal (Voxel zu dem 594 nm Fluorophore entspricht) kolokalisiert mit LAMP1 oder CD68-Signal (Voxel zu dem 488 nm Fluorophore entspricht). Einfacher ausgedrückt, ist dies die durch Phagolysosomen besetzten monocyte Volumen (Figuren 1C und 2C zu sehen). HINWEIS: &#39;% Volumen / Material B oberhalb der Schwelle colocalized&#39; entspricht% der LAMP1 oder CD68-Signal mit Iba1 colocalized. Dies sollte zu 100% betragen, wie Phagolysosome intrazelluläre Strukturen sind. Die Werte basieren auf einem Verhältnis von Signal von allen Z-Stapel über dem Schwellenwert colocalized. </li></ol></li><li> das coloc Modul verwenden, analysieren die coloc Kanal in Schritt 4.1 für räumliche Nähe mit OC (Ratte ti erstelltUSGABE) oder 4G8 (Mausgewebe) Aß-Signale. Dies ermöglicht die quantitative Bestimmung von A &amp; bgr; in Phagolysosomen eingekapselt. <ol><li> Wählen Sie den Kanal A coloc-Datensatz (entsprechend dem Iba1 / CD68 oder Iba1 / LAMP1 coloc Kanal in Schritt 4.1 erstellt) und Cy5 für Kanal B (entsprechend OC oder 4G8-Färbung gekoppelt mit 647 nm Fluorophore). </li><li> Bauen Sie ein coloc Kanal wie in den Schritten 4.1.2 bis 4.1.5 beschrieben. </li><li> Klicken Sie auf den coloc Kanal Kanalstatistik zu öffnen. Die &#39;% Volumen / Material A über dem Schwellenwert colocalized&#39; stellt die% der Iba1 / LAMP1 oder Iba1 / CD68 colocalized mit OC oder 4G8-Signal (Voxel entsprechend dem 647 (Voxel zum coloc Kanal in Schritt 4.1.5. Gebaut entspricht) nm Fluorophore). Dies ist das phagolysosomalen Volumen von Aß besetzt (siehe 1D und 2D). HINWEIS: &#39;% Volumen / Material B oberhalb der Schwelle colocalized&#39; entspricht% der Gesamtmenge von Aß-Signal mit Phagolysosome colocalized.Dies kann dazu verwendet werden, um den Anteil des gesamten Aß Ablagerungen innerhalb Phagolysosome eingekapselt zu bewerten (nicht in den vorliegenden repräsentativen Ergebnisse gezeigt). </li></ol></li><li> Verwenden Sie das Modul übertreffen die konfokale Bildstapel und erzeugen 3D-Modelle von Aß in Monozyten Phagolysosome eingekapselt zu rekonstruieren. <ol><li> Im Fenster &quot;Anzeige Einstellung&quot;, wählen Sie TRITC (nur Iba1 Färbung zeigen). Im Fenster &quot;Volume-Eigenschaften&quot;, klicken Sie auf &quot;Hinzufügen neuer Oberfläche &#39;. </li><li> In Schritt &#39;1/5 Algorithmus&#39; in &#39;Einstellungen&#39; wählen &#39;Oberfläche.&#39; Auch in &quot;Farbe&quot; Farbtyp in der Palette oder RGB auszuwählen und anzupassen Transparenz (rot bei 60% Transparenz in den 1B und 2B eingestellt ist). Kontrollkästchen &quot;wählen Region von Interesse&quot;. Klicken Sie auf Weiter. </li><li> In Schritt &#39;2/5 Region von Interesse &quot; , ein Fenster um die Zelle von Interesse ziehen durch x Einstellung, y und z - Koordinaten (siehe weiße Kästchen in den 1A </strong&gt; und 2A). Klicken Sie auf Weiter. </li><li> In Step &#39;3/5 Quellkanal &quot;, wählen Sie den TRITC Quellkanal. Markieren Sie das Kästchen &quot;glatt&quot; und setzen Oberfläche Detailebene bis 0,4 um. Für &quot;Thresholding&quot; absolute Intensität auswählen. Klicken Sie auf Weiter. </li><li> In Step &#39;4/5 Schwelle &quot;einstellen Schwelle, so dass das erzeugte Volumen perfekt mit dem Signal TRITC Kanal überlappt. Klicken Sie auf Weiter. </li><li> In Step &#39;5/5 Oberflächen klassifizieren, &quot;in Abschnitt&quot; Filtertyp &quot;die Option Objekte in Abhängigkeit von ihrer Größe von den Volumina eingeschlossen oder ausgeschlossen werden, geschaffen werden. Klicken Sie auf Fertig, führen alle erforderlichen Schritten und den Assistenten zu beenden. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 4.3.1 bis 4.3.6 eine 3D - Oberfläche für die FITC - Kanal (LAMP1 + oder CD68 + Phagolysosome) zu erstellen. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 4.3.1 bis 4.3.6 eine 3D - Oberfläche für die Cy5 Kanal (OC + oder 4G8 + Aß Ablagerungen) zu erstellen. </li></ol></li></ol>

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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+distance+mapping+identifies+functional+T+follicular+helper+cells+in+inflamed+human+renal+tissue.">Cell distance mapping identifies functional T follicular helper cells in inflamed human renal tissue.</a> Sci Transl Med. 6 (230), 46 (2014).</li><li>Nichols, L., Pike, V. W., Cai, L., Innis, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+and+in+vivo+quantitation+of+beta-amyloid:+an+exemplary+biomarker+for+Alzheimer's+disease.">Imaging and in vivo quantitation of beta-amyloid: an exemplary biomarker for Alzheimer's disease.</a> Biol Psychiatry. 59 (10), 940-947 (2006).</li><li>Skovronsky, D. M., Zhang, B., Kung, M. P., Kung, H. F., Trojanowski, J. Q., Lee, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+detection+of+amyloid+plaques+in+a+mouse+model+of+Alzheimer's+disease.">In vivo detection of amyloid plaques in a mouse model of Alzheimer's disease.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (13), 7609-7614 (2000).</li><li>Lian, H., Litvinchuk, A., Chiang, A. C. -. A., Aithmitti, N., Jankowsky, J. L., Zheng, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte-Microglia+Cross+Talk+through+Complement+Activation+Modulates+Amyloid+Pathology+in+Mouse+Models+of+Alzheimer's+Disease.">Astrocyte-Microglia Cross Talk through Complement Activation Modulates Amyloid Pathology in Mouse Models of Alzheimer's Disease.</a> J Neurosci. 36 (2), 577-589 (2016).</li><li>Novotny, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conversion+of+Synthetic+A&#946;+to+In+Vivo+Active+Seeds+and+Amyloid+Plaque+Formation+in+a+Hippocampal+Slice+Culture+Model.">Conversion of Synthetic A&#946; to In Vivo Active Seeds and Amyloid Plaque Formation in a Hippocampal Slice Culture Model.</a> J Neurosci. 36 (18), 5084-5093 (2016).</li><li>Tartaro, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+fluorescence-based+in+vivo+phagocytosis+assay+to+measure+mononuclear+phagocyte+system+function+in+the+rat.">Development of a fluorescence-based in vivo phagocytosis assay to measure mononuclear phagocyte system function in the rat.</a> J Immunotoxicol. 12 (3), 239-246 (2015).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Das Protokoll , das wir in diesem Bericht für echte 3D - Quantifizierung von Aß Phagozytose in vivo durch mononukleäre Phagozyten beschreiben beruht auf einer spezifischen Kennzeichnung von zellulärer und subzellulärer Kompartimente sowie Aß Ablagerungen. Insbesondere verwenden wir Iba1 (ionisiertes-Calcium - Bindungs Adaptor - Molekül 1), ein Protein , das in 18 - Membran Kräuseln und Phagozytose bei Zellaktivierung beteiligt ist, 19, zerebrale mononukleären Phagozyten...

Alzheimer-Krankheit (AD) ist die häufigste Altersdemenz 1 wird durch die zerebrale Amyloid-β (Aß) ist eine Anreicherung als &quot;senile&quot; β-Amyloid - Plaques, chronische Low-Level - neuroinflammation, Tauopathie, Verlust von Neuronen charakterisiert und kognitive Störung 2 . In AD Patienten Gehirn wird bestimmt neuroinflammation durch reaktive Astrozyten und mononukleäre Phagozyten (bezeichnet als Mikroglia, obwohl ihre zentrale vs. peripheren Herkunft unklar bleibt) umgebende Aß Ablagerungen 3. Da die angeborene Immun Wächtern des ZNS, sind Mikroglia zentral Aß zu löschen Gehirn positioniert. Mikroglia Rekrutierung Aß - Plaques jedoch durch sehr wenig begleitet, wenn überhaupt, Aß Phagozytose 4,5. Eine Hypothese ist, dass Mikroglia zunächst neuroprotektive sind durch phagocytozing kleine Versammlungen von Aß. Doch schließlich werden diese Zellen neurotoxisch als überwältigend Aß Belastung und / oder altersbedingten Funktions decline, provoziert Mikroglia in einer dysfunktionalen proinflammatorischen Phänotyp, einen Beitrag zur Neurotoxizität und kognitive Abnahme 6. Aktuelle genomweite Assoziationsstudien (GWAS) haben einen Cluster von AD Risiko - Allele Gehören Kern angeborenen Immunwege 7 , die 8-11 Phagozytose identifiziert modulieren. Folglich hat die Immunantwort auf die zerebrale Amyloid - Ablagerung ein bedeutendes Interessengebiet geworden, sowohl in Bezug auf AD Ätiologie zu verstehen und für neue therapeutische Ansätze zu entwickeln 14.12. Dennoch gibt es ein wesentliches Bedürfnis nach Methodik Aß Phagozytose in vivo zu bewerten. Um diesen ungedeckten Bedarf adressieren, haben wir quantitative 3D in silico - Modellierung (q3DISM) zu ermöglichen , echte 3D - Quantifizierung von zerebralen Aß Phagozytose durch mononukleäre Phagozyten in Nagetiermodellen der Alzheimer-ähnliche Krankheit entwickelt. nur durch das Ausmaß beschränkt, auf die sie Krankheit rekapitulieren, Tiermodelle habenbewiesen von unschätzbarem Wert für das Verständnis der AD pathoetiology und für experimentelle Therapeutika zu bewerten. Aufgrund der Tatsache, dass Mutationen in den Presenilin (PS) und Amyloid Precursor Protein (APP) Gene unabhängig autosomal dominant AD verursachen, sind diese mutierten Transgene wurden verwendet, umfassend transgene Nagetiermodellen zu erzeugen. Transgene APP / PS1 - Mäuse Koexpression gleichzeitig &quot;Schwedisch&quot; mutiertes menschliches APP (APP swe) und Δ Exon 9 mutierten humanen Presenilin 1 (PS1ΔE9) vorhanden mit beschleunigten zerebraler Amyloidose und neuroinflammation 15,16. Ferner haben wir bi-transgenen Ratten co - injiziert mit APP swe und PS1ΔE9 Konstrukte (Linie TgF344-AD, auf einem Fischer - 344 - Hintergrund) erzeugt. Im Gegensatz zu transgenen Mausmodellen von zerebraler Amyloidose entwickeln TgF344-AD - Ratten , die zerebrale Amyloid - 17 Tauopathie, apoptotischen Verlust von Neuronen und Verhaltens Beeinträchtigung vorausgeht. In diesem Bericht beschreiben wir ein Protokoll für die immunostaining Mikroglia, Phagolysosome und Aß-Ablagerungen in Hirnschnitten von APP / PS1-Mäusen und TgF344-AD Ratten und Erwerb von großen z-dimensionalen konfokalen Bildern. Wir Detail in silico Erzeugung und Analyse von echten 3D - Rekonstruktionen aus konfokalen Datensätze ermöglicht die Quantifizierung von Aß - Aufnahme in Mikroglia Phagolysosome. Allgemeiner gesagt, dass die Methodik ausführlich hier können wir nahezu jede Form der Phagozytose in vivo zu quantifizieren.

<table><tbody><tr><td>Isoflurane</td><td>Abbott</td><td>NDC 0044-5260-05</td><td></td></tr><tr><td>Dissecting scissors</td><td>VWR</td><td>82027-582</td><td></td></tr><tr><td>Dissecting scissors Blunt tip</td><td>VWR</td><td>82027-588</td><td></td></tr><tr><td>Tweezers</td><td>VWR</td><td>94024-408</td><td></td></tr><tr><td>23 G needle</td><td>VWR</td><td>BD305145</td><td></td></tr><tr><td>peristaltic pump FH10</td><td>Thermo Scientific</td><td>72-310-010</td><td></td></tr><tr><td>PBS 10x</td><td>Bioland Scientific</td><td>PBS01-02</td><td>Phosphate-buffered Saline; Working concentration 1x</td></tr><tr><td>Adult Mouse Brain Matrix, Coronal slices, Stainless Steel 1 mm&amp;nbsp;</td><td>Kent Scientific</td><td>RBMS-200C</td><td></td></tr><tr><td>Adult Rat Brain Matrix, Coronal slices, Stainless Steel 1 mm&amp;nbsp;</td><td>Kent Scientific</td><td>RBMS-305C&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>32% Paraformaldehyde aqueous solution (PFA)</td><td>EMS</td><td>15714-S</td><td>Caution: Toxic. Working concentration: 4% in PBS</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>VWR</td><td>89125-188</td><td>Various concentrations, see protocol</td></tr><tr><td>Tissue-Tek Uni-cassettes Sakura</td><td>VWR</td><td>25608-774</td><td></td></tr><tr><td>Embedding and Infiltration Paraffin</td><td>VWR</td><td>15147-839</td><td></td></tr><tr><td>Microtome Leica RM2125</td><td>Leica Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Disposable Microtome Blades&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>25608-964</td><td></td></tr><tr><td>Water bath Leica HI 1210</td><td>Leica Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micro slide Superfrost plus</td><td>VWR</td><td>48311-703</td><td></td></tr><tr><td>Xylene</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>534056-4X4L</td><td>Caution: Toxic&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Target Retrieval Solution 10x</td><td>DAKO</td><td>S1699</td><td>Working concentration 1x</td></tr><tr><td>KimWipes</td><td>VWR</td><td>21905-026</td><td></td></tr><tr><td>Hydrophobic PAP pen</td><td>VWR</td><td>95025-252</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>VWR</td><td>97062-208</td><td></td></tr><tr><td>Normal Donkey Serum (NDS)</td><td>Jackson Immuno</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td>Coverslips</td><td>VWR</td><td>48393081</td><td></td></tr><tr><td>Prolong Gold antifade reagent with DAPI</td><td>Life Technologies</td><td>P36935</td><td></td></tr><tr><td>Glass Slide Rack</td><td>VWR</td><td>100492-942</td><td></td></tr><tr><td>Iba1 antibody (polyclonal, rabbit)</td><td>Wako</td><td>019-19741&amp;nbsp;</td><td>Working concentration 1:200</td></tr><tr><td>Iba1 antibody (polyclonal, goat)</td><td>LifeSpan Bioscience</td><td>LS-B2645</td><td>Working concentration 1:200</td></tr><tr><td>rat CD68 [KP1] antibody (monoclonal, mouse)</td><td>Abcam</td><td>ab955</td><td>Working concentration 1:200</td></tr><tr><td>mouse CD68 [FA-11] antibody (monoclonal, rat)</td><td>Abcam</td><td>ab53444</td><td>Working concentration 1:200</td></tr><tr><td>mouse CD107a (LAMP1) antibody (monoclonal, rat)</td><td>Affymetrix</td><td>14-1071</td><td>Working concentration 1:100</td></tr><tr><td>Beta-Amyloid, 17 - 24 (4G8) antibody (monoclonal, mouse)</td><td>Covance</td><td>SIG-39220</td><td>Working concentration 1:200</td></tr><tr><td>Beta-Amyloid, 1 - 16 (6E10) antibody (monoclonal, mouse)</td><td>Covance</td><td>SIG-39320</td><td>Working concentration 1:200</td></tr><tr><td>OC antibody (polyclonal, rabbit)</td><td>Gifted by D. H. Cribbs and C. G. Glabe (UC Irvine)</td><td>Working concentration 1:200</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 mouse secondary antibody</td><td>Invitrogen</td><td>A-11001</td><td>Working concentration 1:1,000</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 rat secondary antibody</td><td>Invitrogen</td><td>A-11006</td><td>Working concentration 1:1,000</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 rabbit secondary antibody</td><td>Invitrogen</td><td>A-11037</td><td>Working concentration 1:1,000</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 goat secondary antibody</td><td>Invitrogen</td><td>A-11080</td><td>Working concentration 1:1,000</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 mouse secondary antibody</td><td>Invitrogen</td><td>A-21235</td><td>Working concentration 1:1,000</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 rabbit secondary antibody</td><td>Invitrogen</td><td>A-21443</td><td>Working concentration 1:1,000</td></tr><tr><td>Immersion oil</td><td>Nikon&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>A1 Confocal microscope</td><td>Nikon&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NIS Elements Advanced Research software</td><td>Nikon&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Imaris:Bitplane software version 7.6</td><td>Bitplane</td><td></td><td>&quot;coloc&quot; and &quot;supass&quot; modules are used.&amp;nbsp;Alternatively, the open-source freeware&amp;nbsp;ImageJ can be used for colocalization&amp;nbsp;analysis of confocal z-stacks datasets.</td></tr></tbody></table>

quantitative 3d in silico modeling (q3dism) of cerebral amyloid-beta phagocytosis in rodent models of alzheimer's disease

Neuroinflammation wird nun als wichtiger ätiologischer Faktor bei der neurodegenerativen Erkrankung anerkannt. Mononukleäre Phagozyten sind angeborene Immunzellen verantwortlich für die Phagozytose und die Räumung von Schutt und Geröll. Diese Zellen sind ZNS-Makrophagen als Mikroglia bekannt und mononukleäre Phagozyten von der Peripherie zu infiltrieren. Die Lichtmikroskopie wurde allgemein verwendet worden, die Phagozytose in Nagetieren oder menschliche Gehirn Proben zu visualisieren. Allerdings haben qualitative Methoden nicht definitive Beweise für in vivo Phagozytose zur Verfügung gestellt. Hier beschreiben wir quantitative 3D in silico - Modellierung (q3DISM), ein robustes Verfahren ermöglicht für echte 3D - Quantifizierung von Amyloid-β (Aß) Phagozytose durch mononukleäre Phagozyten in Nagetier Alzheimer-Krankheit (AD) Modelle. Das Verfahren beinhaltet das fluoreszenz VISUALISIEREN Aß innerhalb Phagolysosome in Nagetier Hirnschnitten verkapselt. Große z-dimensionale konfokalen Datensätze werden dann 3D für die Quantifizierung von A rekonstruiert &amp;# 946; räumlich innerhalb des Phagolysosom colocalized. Wir demonstrieren die erfolgreiche Anwendung von q3DISM zu Maus- und Rattengehirnen, aber diese Methode kann in jedem Gewebe zu praktisch jeder phagozytischen Ereignis verlängert werden.

Mit dem mehrstufigen Methodik für q3DISM oben beschrieben, sind wir in der Lage Aß - Aufnahme in Monozyten Phagolysosome im Gehirn von APP / PS1 - Mäuse (Abbildung 1) und TgF344-AD - Ratten (Abbildung 2) zu quantifizieren. Daher hat die q3DISM Methodik Analyse von mononukleären Phagozyten in Maus- und Rattenmodellen von AD aktiviert. Interessanterweise wird das Volumen besetzt durch CD68 + Phagolysosomen signifikant erhöht in Iba1 +<...

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Quantitative 3D In Silico Modeling q3DISM of Cerebral Amyloid-beta Phagocytosis in Rodent Models of Alzheimer's Disease

Wir entwickelten eine Methode für die quantitative 3D in silico - Modellierung (q3DISM) zerebraler Amyloid-β (Aß) Phagozytose durch mononukleäre Phagozyten in Nagetiermodellen der Alzheimer-Krankheit. Dieses Verfahren kann für die Quantifizierung von praktisch jedem phagozytischen Ereignis in vivo verallgemeinert werden.

Quantitative 3D<em&gt; In Silico</em&gt; Modellierung (q3DISM) zerebraler Amyloid-beta Phagozytose in Nagetiermodellen der Alzheimer-Krankheit

Neuroinflammation is now recognized as a major etiological factor in neurodegenerative disease. Mononuclear phagocytes are innate immune cells responsible ...

quantitative-3d-silico-modeling-q3dism-cerebral-amyloid-beta

Research

JoVE Journal

Medicine

Quantitative 3D In Silico Modeling (q3DISM) of Cerebral Amyloid-beta Phagocytosis in Rodent Models of Alzheimer's Disease

7.9K Aufrufe.  University of Southern California (USC).  Wir entwickelten eine Methode für die quantitative 3D in silico - Modellierung (q3DISM) zerebraler Amyloid-β (Aß) Phagozytose durch mononukleäre Phagozyten in Nagetiermodellen der Alzheimer-Krankheit. Dieses Verfahren kann für die Quantifizierung von praktisch jedem phagozytischen Ereignis in vivo verallgemeinert werden. 

Serie: Quantitative 3D In Silico Modeling q3DISM of Cerebral Amyloid-beta Phagocytosis in Rodent Models of Alzheimer's Disease

Detection of Neuritic Plaques in Alzheimer's Disease Mouse Model

Alzheimer's disease (AD) is the most common neurodegenerative disorder leading to dementia. Neuritic plaque formation is one of the pathological hallmarks of Alzheimer's disease. The central component of neuritic plaques is a small filamentous protein called amyloid &beta; protein (A&beta;)1, which is derived from sequential proteolytic cleavage of the beta-amyloid precursor protein (APP) by &beta;-secretase and &gamma;-secretase. The amyloid hypothesis entails that A&gamma;-containing plaques as the underlying toxic mechanism in AD pathology2. The postmortem analysis of the presence of neuritic plaque confirms the diagnosis of AD. To further our understanding of A&gamma; neurobiology in AD pathogenesis, various mouse strains expressing AD-related mutations in the human APP genes were generated. Depending on the severity of the disease, these mice will develop neuritic plaques at different ages. These mice serve as invaluable tools for studying the pathogenesis and drug development that could affect the APP processing pathway and neuritic plaque formation. In this protocol, we employ an immunohistochemical method for specific detection of neuritic plaques in AD model mice. We will specifically discuss the preparation from extracting the half brain, paraformaldehyde fixation, cryosectioning, and two methods to detect neurotic plaques in AD transgenic mice: immunohistochemical detection using the ABC and DAB method and fluorescent detection using thiofalvin S staining method.

One of the pathological characteristics of AD is the formation of Amyloid &#x03B2; protein positive neuritic plaques. In this protocol we describe two methods to detect neuritic plaques in transgenic AD model mice: immunohistochemical detection using the ABC and DAB method and fluorescent detection using thioflavin S staining method.

Nachweis von neuritischen Plaques bei Alzheimer-Maus-Modell

Alzheimer's disease (AD) is the most common neurodegenerative disorder leading to dementia. Neuritic plaque formation is one of the pathological hallmarks ...

Forschung

Neurowissenschaften

Establishment of a Valuable Mimic of Alzheimer's Disease in Rat Animal Model by Intracerebroventricular Injection of Composited Amyloid Beta Protein

Alzheimer&#39;s disease (AD) is an irreversible, progressive brain disease that slowly destroys memory and is accompanied by neuron loss and structure change. With the increase of AD patients worldwide, the pathology and treatment of the disease has become a focus in the International Pharmaceutical Industry. Thus, the establishment of the animal model to mimic AD in the laboratory is of great importance.
Here, we describe a detailed protocol for establishing a mimic of AD in a rat animal model though intracerebroventricular injection of amyloid beta protein 25-35 (A&#946;25-35) combined with aluminum trichloride (AlCl3) and anterodorsal thalamic nucleus injection of recombinant human transforming growth factor-&#946;1 (RHTGF-&#946;1) to rats. The related markers of AD were measured, including: spatial memory, neuronal structure and substructure, neuronal A&#946;, and neurofibrillary tangles (NFT) production. This rat model demonstrates spatial memory impairment, neuronal structure and substructure pathological changes, neuron intracellular A&#946; burden, and NFT aggregation, and provides a close mimic of the neuronal structure and function disorder to that of clinical AD patients. Thus, the presented AD rat modelprovides a valuable in vivo tool for exploring neuronal function, neuronal pathology, and drug screening of AD.

This is a protocol to mimic Alzheimer&#39;s Disease in rats by evaluation of spatial memory impairment, neuronal pathological changes, neuronal amyloid beta protein (A&#946;) burden, and neurofibrillary tangles aggregation, induced by the injection of A&#946;25-35 combined with aluminum trichloride and recombinant human transforming growth factor-&#946;1.

Alzheimer&#39;s disease (AD) is an irreversible, progressive brain disease that slowly destroys memory and is accompanied by neuron loss and structure ...

Verhalten

Stereotaxic Infusion of Oligomeric Amyloid-beta into the Mouse Hippocampus

Alzheimer&#8217;s disease is a neurodegenerative disease affecting the aging population. A key neuropathological feature of the disease is the over-production of amyloid-beta and the deposition of amyloid-beta plaques in brain regions of the afflicted individuals. Throughout the years scientists have generated numerous Alzheimer&#8217;s disease mouse models that attempt to replicate the amyloid-beta pathology. Unfortunately, the mouse models only selectively mimic the disease features. Neuronal death, a prominent effect in the brains of Alzheimer&#8217;s disease patients, is noticeably lacking in these mice. Hence, we and others have employed a method of directly infusing soluble oligomeric species of amyloid-beta - forms of amyloid-beta that have been proven to be most toxic to neurons - stereotaxically into the brain. In this report we utilize male C57BL/6J mice to document this surgical technique of increasing amyloid-beta levels in a select brain region. The infusion target is the dentate gyrus of the hippocampus because this brain structure, along with the basal forebrain that is connected by the cholinergic circuit, represents one of the areas of degeneration in the disease. The results of elevating amyloid-beta in the dentate gyrus via stereotaxic infusion reveal increases in neuron loss in the dentate gyrus within 1 week, while there is a concomitant increase in cell death and cholinergic neuron loss in the vertical limb of the diagonal band of Broca of the basal forebrain. These effects are observed up to 2 weeks. Our data suggests that the current amyloid-beta infusion model provides an alternative mouse model to address region specific neuron death in a short-term basis. The advantage of this model is that amyloid-beta can be elevated in a spatial and temporal manner.

Here, we present a protocol for direct stereotaxic brain infusion of amyloid-beta. This methodology provides an alternative in vivo mouse model to address the short-term effects of amyloid-beta on brain neurons.

Stereotaktische Infusion von oligomeren Amyloid-beta in die Maus-Hippocampus

Alzheimer&#8217;s disease is a neurodegenerative disease affecting the aging population. A key neuropathological feature of the disease is the ...

Intracerebroventricular Injection of Amyloid-&#946; Peptides in Normal Mice to Acutely Induce Alzheimer-like Cognitive Deficits

Amyloid-&#946; (A&#946;) is a major pathological mediator of both familial and sporadic Alzheimer's disease (AD). In the brains of AD patients, progressive accumulation of A&#946; oligomers and plaques is observed. Such A&#946; abnormalities are believed to block long-term potentiation, impair synaptic function, and induce cognitive deficits. Clinical and experimental evidences have revealed that the acute increase of A&#946; levels in the brain allows development of Alzheimer-like phenotypes. Hence, a detailed protocol describing how to acutely generate an AD mouse model via the intracerebroventricular (ICV) injection of A&#946; is necessary in many cases. In this protocol, the steps of the experiment with an A&#946;-injected mouse are included, from the preparation of peptides to the testing of behavioral abnormalities. The process of preparing the tools and animal subjects before the injection, of injecting the A&#946; into the mouse brain via ICV injection, and of assessing the degree of cognitive impairment are easily explained throughout the protocol, with an emphasis on tips for effective ICV injection of A&#946;. By mimicking certain aspects of AD with a designated injection of A&#946;, researchers can bypass the aging process and focus on the downstream pathology of A&#946; abnormalities.

The amyloid-&#946; (A&#946;)-injected animal model enables the administration of a defined quantity and species of A&#946; fragments and reduces individual differences within each study group. This protocol describes the intracerebroventricular (ICV) injection of A&#946; without stereotactic instruments, enabling the production of Alzheimer-like behavioral abnormalities in normal mice.

Intracerebroventricular Injektion von Amyloid-β-Peptide in normalen Mäusen zu Akut Induce Alzheimer-ähnliche kognitive Defizite

Amyloid-&#946; (A&#946;) is a major pathological mediator of both familial and sporadic Alzheimer's disease (AD). In the brains of AD patients, ...

Assessment of Spontaneous Alternation, Novel Object Recognition and Limb Clasping in Transgenic Mouse Models of Amyloid-&#946; and Tau Neuropathology

Here we describe a staged, behavioral testing approach that can be used to screen for compounds that exhibit in vivo efficacy on cognitive and functional motor behaviors in transgenic mouse models of &#946;-amyloidosis and tauopathy. The paradigm includes tests for spontaneous alternation in a Y-maze, novel object recognition, and limb clasping. These tests were selected because they: 1) interrogate function of cognitive or motor domains and the correlate neural circuitry relevant to the human disease state, 2) have clearly defined endpoints, 3) have easily implementable quality control checks, 4) can be run in a moderate throughput format, and 5) require little intervention by the investigator. These methods are designed for investigators looking to screen compounds for activity in short-term and working memory tasks, or functional motor behaviors associated with Alzheimer's disease mouse models. The methods described here use behavioral tests that engage a number of different brain regions including hippocampus and various cortical areas. Investigators that desire cognitive tests that specifically assess cognition mediated by a single brain region could use these techniques to supplement other behavioral tests.

Described here is a staged, behavioral screening approach that can be used to screen for compounds that exhibit in vivo efficacy on cognitive and functional motor behaviors in transgenic mouse models of &#946;-amyloidosis and tauopathy. These methods are optimized to screen compounds for activity in short-term and working memory tasks.

Assessment of Spontane Alternation, neuartige Objekterkennung und Gliedmaßenverkürzung in transgenen Mausmodellen der Amyloid-β- und Tau-Neuropathologie

Here we describe a staged, behavioral testing approach that can be used to screen for compounds that exhibit in vivo efficacy on cognitive and functional ...

Medizin

Detecting Amyloid-&#946; Accumulation via Immunofluorescent Staining in a Mouse Model of Alzheimer's Disease

Alzheimer's disease (AD) is a neurodegenerative disease that contributes to 60-70% dementia around the world. One of the hallmarks of AD undoubtedly lies on accumulation of amyloid-&#946; (A&#946;) in the brain. A&#946; is produced from the proteolytic cleavage of the beta-amyloid precursor protein (APP) by &#946;-secretase and &#947;-secretase. In pathological circumstances, the increased &#946;-cleavage of APP leads to overproduction of A&#946;, which aggregates into A&#946; plaques. Since A&#946; plaques are a characteristic of AD pathology, detecting the amount of A&#946; is very important in AD research. In this protocol, we introduce the immunofluorescent staining method to visualize A&#946; deposition. The mouse model used in our experiments is 5&#215;FAD, which carries five mutations found in human familial AD. The neuropathological and behavioral deficits of 5xFAD mice are well-documented, which makes it a good animal model to study A&#946; pathology. We will introduce the procedure including transcardial perfusion, cryosectioning, immunofluorescent staining and quantification to detect A&#946; accumulation in 5&#215;FAD mice. With this protocol, researchers can investigate A&#946; pathology in an AD mouse model.

In the neuropathology of Alzheimer's disease, one of the most crucial characteristics is the deposition of amyloid-&#946;. In this protocol, we describe the method of immunofluorescent staining in 5&#215;FAD transgenic mouse to detect amyloid-&#946; accumulation in plaques. The process of perfusion, cryosectioning, staining and quantification will be described in detail.

Alzheimer's disease (AD) is a neurodegenerative disease that contributes to 60-70% dementia around the world. One of the hallmarks of AD undoubtedly lies ...

Full- versus Sub-Regional Quantification of Amyloid-Beta Load on Mouse Brain Sections

Extracellular accumulation of amyloid-beta (A&#946;) plaques is one of the major pathological hallmarks of Alzheimer's disease (AD), and is the target of the only FDA-approved disease-modifying treatment for AD. Accordingly, the use of transgenic mouse models that overexpress the amyloid precursor protein and thereby accumulate cerebral A&#946; plaques are widely used to model human AD in mice. Therefore, immunoassays, including enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and immunostaining, commonly measure the A&#946; load in brain tissues derived from AD transgenic mice. Though the methods for A&#946; detection and quantification have been well established and documented, the impact of the size of the region of interest selected in the brain tissue on A&#946; load measurements following immunostaining has not been reported. Therefore, the current protocol aimed to compare the A&#946; load measurements across the full- and sub-regions of interest using an image analysis software. The steps involved in brain tissue preparation, free-floating brain section immunostaining, imaging, and quantification of A&#946; load in full- versus sub-regions of interest are described using brain sections derived from 13-month-old APP/PS1 double transgenic male mice. The current protocol and the results provide valuable information about the impact of the size of the region of interest on A&#946;-positive area quantification, and show a strong correlation between the A&#946;-positive area obtained using the full- and sub-regions of interest analyses for brain sections derived from 13-month-old male APP/PS1 mice that show widespread A&#946; deposition.

The present protocol describes and compares the procedure to perform a full-region or sub-region of interest analysis of sagittal mouse brain sections to quantify amyloid-beta load in the APP/PS1 transgenic mouse model of Alzheimer's disease.

Voll- versus subregionale Quantifizierung der Amyloid-Beta-Belastung von Hirnschnitten der Maus

Extracellular accumulation of amyloid-beta (A&#946;) plaques is one of the major pathological hallmarks of Alzheimer's disease (AD), and is the target of ...

Fabrication of Amyloid-&#946;-Secreting Alginate Microbeads for Use in Modelling Alzheimer's Disease

According to the amyloid cascade hypothesis, the earliest trigger in the development of Alzheimer&#8217;s disease (AD) is the accumulation of toxic amyloid-&#946; (A&#946;) fragments, eventually leading to the classical features of the disease: amyloid plaques, neurofibrillary tangles and synaptic and neuronal loss. The lack of relevant non-transgenic preclinical models reflective of disease progression is one of the main factors hindering the discovery of effective drug treatments. To this end, we have developed a protocol for the fabrication of alginate microbeads containing amyloid-secreting cells useful for the study of the effects of chronic A&#946; production.
Chinese hamster ovary cells previously transfected with a human APP gene, secreting A&#946; (i.e., 7PA2 cells), were used in this study. A three-dimensional (3D) in vitro model for the sustained release of A&#946; was fabricated by encapsulation of 7PA2 cells in alginate. The process was optimized to target a bead diameter of 500-600 &#956;m for further in vivo studies. Optimization of 7PA2 cell encapsulation in alginate was performed altering fabrication parameters, e.g., alginate concentration, gel flow rate, electrostatic potential, head vibration frequency, gelling solution. Levels of secreted A&#946; were analyzed over time and compared between alginate beads and standard cell culture methods (up to 96 h).
A concentration of 1.5 x 106 7PA2 cells/mL and an alginate concentration of 2% (w/v) buffered with HEPES and subsequent gelation in 0.5 M calcium chloride for 5 min were found to fabricate the most stable microbeads. Fabricated microbeads were 1) of uniform size, 2) with an average diameter of 550 &#956;m, 3) containing about 100-150 cells per microbead and 4) able to secrete A&#946;.
In conclusion, our optimized method for the production of stable alginate microbeads containing amyloid-producing 7PA2 cells might enable the modeling of important aspects of AD both in vitro and in vivo.

This protocol illustrates a cell encapsulation method by rapid physical gelation of alginate to immobilize cells. Obtained microbeads allow controlled and sustained secretion of amyloid-&#946; over time and can be used to study the effects of secreted amyloid-&#946; in in vitro and in vivo models.

Herstellung von Amyloid---Sekret alginat Mikroperlen für den Einsatz bei der Modellierung der Alzheimer-Krankheit

According to the amyloid cascade hypothesis, the earliest trigger in the development of Alzheimer&#8217;s disease (AD) is the accumulation of toxic ...

Biologie

Establishing an Alzheimer's Disease Rat Model Through an Amyloid-Beta Peptide Injection

Source: Xiaoguang, W., et al. <a href="https://app.jove.com/v/56157">Establishment of a Valuable Mimic of Alzheimer&#39;s Disease in Rat Animal Model by Intracerebroventricular Injection of Composited Amyloid Beta Protein.</a> J. Vis. Exp. (2018).
This video demonstrates the procedure for injecting amyloid-beta peptides, aluminum chloride, and a neuroinflammatory growth factor, which collectively aids in toxic amyloid plaque formation in the hippocampus region. This causes memory impairment in the rat, characteristic of Alzheimer&#39;s disease.

Etablierung eines Alzheimer-Rattenmodells durch eine Amyloid-Beta-Peptid-Injektion

All procedures involving animal models have been reviewed by the local institutional animal care committee and the JoVE veterinary review board.
1. ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Neuroscience

Neuropathology

Neurodegenerative Diseases

Direct Stereotaxic Brain Infusion of Amyloid-Beta Proteins for an Alzheimer's Disease Model

Source: Jean, Y. Y. et al., <a href="https://app.jove.com/v/52805">Stereotaxic Infusion of Oligomeric Amyloid-beta into the Mouse Hippocampus.</a> J. Vis. Exp. (2015)
This video demonstrates the precise stereotaxic infusion of amyloid beta into the dentate gyrus to establish a mouse model of Alzheimer&#39;s disease. Accurate coordinate determination and controlled delivery of amyloid beta proteins result in neuronal degradation, disrupting memory processing and contributing to Alzheimer&#39;s disease development.

Quantitative 3D

Zusammenfassung

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