Dieses Protokoll erklärt die Herstellung von Mikroperlen, die verwendet werden, um die Freisetzungsrate und die Menge an Amyloid zu kontrollieren, die ein Protein von Interesse ist. Die Mikroperlen werden Zellen in einem geeigneten Biomaterial immobilisieren und sie vor ihrer Umgebung schützen und ihnen ermöglichen, Nebenprodukte und Nährstoffe mit ihrer Umgebung auszutauschen. Das Verkapseln von Zellen mit dieser Technik gewährleistet eine enge Kontrolle der Mikroperlengröße sowie der Zellzahl, und wir tun dies, indem wir verschiedene Fertigungsparameter anpassen.
Die Verkapselung der in diesem Protokoll beschriebenen Zellen wird uns also mehr eine chronische Freisetzung von Amyloid geben, die sowohl in vitro als auch in vivo-Systemen verwendet werden kann, und die Idee wäre, dass dies uns ein besseres Verständnis der Mechanismen von Krankheiten geben und uns auch erlauben würde, neue Behandlungen zu testen. Diese Methode kann verwendet werden, um kontrolliertes System zu formulieren und die Freisetzung von Biomolekülen für viele Zelltypen zu untersuchen, ob allein oder in Kombination. Entfernen Sie zunächst einen nahezu konfluenten Kolben aus dem Inkubator.
Behandeln Sie die Zellen mit 0,25%Trypsin-EDTA-Lösung und inkubieren Sie bei 37 C fünf bis zehn Minuten, um die Zellen zu lösen. Nach dem Hinzufügen von DMEM/F12 Medium, sammeln Sie die Zellen in einem 50 Milliliter Rohr. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 1000 U/min für fünf Minuten.
Entfernen Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet in HEPES gepufferter Saline wieder auf, um die endgültige gewünschte Zellkonzentration zu verdoppeln. Mischen Sie diese Zellsuspension in einem 50-Milliliter-Zentrifugenrohr in einem Verhältnis von 1 zu Eins mit 4%Gewichts- und Volumenalginatlösung, um eine endliche Suspension zu erhalten, die die gewünschte Zellkonzentration in einer 2%-Gewichts- und Volumenalginatlösung enthält. Um die Kapselungsparameter festzulegen, legen Sie die Geschwindigkeit der Verkapselungsmaschine auf die maximale Extrusionsgeschwindigkeit fest, und legen Sie dann die Spannung und die Frequenz fest.
Um die Mikroperlen herzustellen, in einer 20-Milliliter-Spritze fünf Milliliter der Zellalginatsuspension zu laden und eine Spritze am Verkapseler zu befestigen. Um den Verkapselungskörper zu starten, aktivieren Sie den Fluss, der die Zellalginatsuspension durch den Feeder drückt, und ein Strom von Tröpfchen wird durch die Düse extrudiert. Sammeln Sie den ersten Milliliter im Abfallbecher, um den anfänglichen ungleichmäßigen Strom zu vermeiden.
Dann fahren Sie weiter die restlichen vier Milliliter, so dass die Tröpfchen in das Calciumchlorid-Gelationsbad fallen. Bei Kontakt mit dem Gelationsbad kreuzt das Alginat in den Tröpfchen sofort mit den Kalziumionen im Gelationsbad und bildet sphärische Mikroperlen. Nach einer Minute entfernen Sie das Gelationsbecherglas von der magnetischen Plattform und lassen Sie die Mikroperlen für weitere vier Minuten ohne Rührung ruhen, um ihre Gelation bei Raumtemperatur abzuschließen.
Um die Mikroperlen abzurufen, verwenden Sie zuerst eine sterile Pinzette, um große Alginat-Trümmer oder Artefakte zu entfernen. Nachdem Sie das Ende einer Kunststoffpipette geschnitten haben, verwenden Sie sie, um die Mikroperlen aus dem Gelationsbad auf einen 74-Mikrometer-Netzfilter zu übertragen, der über einem Abfallbecher gehalten wird. Um den Erfolg zu gewährleisten, schneiden wir immer das Ende einer Kunststoffpipette, um die Mikroperlen nicht zu beschädigen, und wir tun dies jedes Mal, wenn wir Perlen nach der Verkapselung von einem Gefäß auf ein anderes übertragen.
Invertieren Sie den Netzfilter über ein Zentrifugenrohr. Pipette das entsprechende Kulturmedium darüber, um die Perlen in die Röhre zu waschen und sie in diesem Medium für fünf Minuten aushalten lassen. Dann übertragen Sie sie in einen Kolben, der zuvor mit dem entsprechenden Medium für die Inkubation und weitere Experimente gefüllt war.
Um die Zelllebensfähigkeit nach Verkapselung und Kultur zu bewerten, fügen Sie Auflösungsmischung hinzu, um die Mikroperlen sanft zu stören und die gekapselten Zellen freizusetzen. Inkubieren Sie die Zellen in einem Zellkultur-Inkubator, ergänzt mit 5% Kohlendioxid bei 37 C für 10 Minuten mit sanfter Rührung. Schätzen Sie die Zelllebensfähigkeit dieser Zellen, indem Sie sie mit Trypanblau beflecken und eine Hämozytometerkammer verwenden.
Um die Stabilität von Mikroperlen zu bewerten, messen Sie den durchschnittlichen Durchmesser für eine Probe aus jeder Mikroperlenpopulation über einen Zeitverlauf mit einem Mikroskop und einer Bildgebungssoftware. Nach der Vorbereitung wurden mit diesem Protokoll erfolgreich einheitliche und sphärische Alginat-Mikroperlen erzeugt. Nach einem Tag in Standard-Zellkulturbedingungen wurden gekapselte 7PA2-Zellen gleichmäßig in Mikroperlen verteilt.
Als die 7PA2-Zellproliferation mit einem MTS-Assay getestet wurde, gab es keinen signifikanten Unterschied zwischen dem Verhalten von 7PA2-Zellen, die mit oder ohne Alginat über einen Zeitraum von sieben Tagen angebaut wurden. Konditionierte Medien, die aus 2D- und 3D-Kulturen von 7PA2-Zellen analysiert wurden, zeigten einen konstanten Anstieg der Amyloid-Beta-Spiegel 1-42 in beiden Kulturen. Die Freisetzungsrate von Amyloid-Beta 1-42 aus Mikroperlen oder 3D-Kultur ist im Profil ähnlich wie die, die aus der 2D-Kultur freigesetzt wird.
7PA2-Zellen, die in Alginat-Mikroperlen eingekapselt sind, können effektiv für die nachhaltige Freisetzung von Amyloid-Beta verwendet werden. Mikroperlen für die Transplantation in das Rattenhirn müssen klein genug sein, um eingebettet zu werden, ohne eine große Läsion zu erzeugen. Eine millimetergroße Perle im Gehirn für In-vivo-Zwecke würde nicht funktionieren, während eine Mit diesem Protokoll hergestellte Mikroperle eine geeignete Größe für die Einfügung in den Hippocampus der Ratte aufweist.
Um sicherzustellen, dass wir eine gleichmäßige Verteilung der Zellen im Endprodukt haben, ist es wichtig, die Zellen in der Zellalginatsuspension gründlich zu mischen, und dies garantiert eine gleichmäßige Freisetzung von Amyloid aus jeder Mikroperle.
