Dieses Protokoll vergleicht die Amyloid-Beta-Plaque-Belastung in ganzen Abschnitten von Interesse und Subregionen von Interesse in Gehirnabschnitten von transgenen APP/PS1-Mäusen. Die Methode und die Ergebnisse, die in diesem speziellen Protokoll vorgestellt werden, ermöglichen es den Lesern oder Forschern, entweder zwischen der vollständigen Interessenregion oder der Subregion of Interest-Analyse zu wählen, um eine Beta-Belastung in Maus-Gehirnabschnitten zu bestimmen. Laden Sie zunächst die Bildanalysesoftware herunter.
Starten Sie nach der Installation die Software und klicken Sie auf die Datei, öffnen Sie es und wählen Sie das zu analysierende Bild aus. Wählen Sie in der Symbolleiste der Software das gerade Werkzeug aus, und zeichnen Sie eine gerade Linie entlang der Länge der Maßstabsleiste. Klicken Sie auf die Analyse und dann auf die Registerkarten für die eingestellte Skalierung.
Klicken Sie erneut auf die Analyse- und dann auf die Messregisterkarten, um die Länge oder den Abstand der Skalierungsleiste in Pixeln zu notieren. Geben Sie im Popup-Fenster den Abstand in Pixel, den bekannten Abstand der Skalierungsleiste und die Längeneinheit als Mikrometer ein. Aktivieren Sie dann das globale Kontrollkästchen, um die neue Skalierungseinstellung auf alle folgenden Bilder anzuwenden, wenn mehrere Bilder verarbeitet werden.
Klicken Sie auf OK, um die Einstellungen zu übernehmen. Um die gewünschte Messung auf den Bereich des Abschnitts einzustellen, gehen Sie zu Analysieren, legen Sie dann die Maße fest und wählen Sie die Felder für den Bereich und die Anzeige aus. Stellen Sie sicher, dass das zu analysierende Bild auf der Registerkarte Umleiten an ausgewählt ist.
Um die Visualisierung des Hippocampus oder des Kortex zu erleichtern, gehen Sie zum Bild und passen Sie Helligkeit oder Kontrast an. Ziehen Sie den maximalen Schieberegler allmählich nach links, um die Gewebeklarheit zu erhöhen, bis die interessierenden Gehirnregionen oder der ROI identifizierbar sind. Verwenden Sie das Polygon- oder Freihandauswahlwerkzeug, um die Hippocampus-Region zu skizzieren.
Sobald der Bereich umrissen ist, klicken Sie auf die Option zum Zurücksetzen der Helligkeits- oder Kontrasteinstellungen, um die ursprüngliche Helligkeit wiederherzustellen. Um die gesamte Gewebefläche der ausgewählten Region zu messen, klicken Sie auf die bearbeiten und löschen Sie die Außenseite. Sobald der ausgewählte Bereich das einzige Bild auf dem Bildschirm ist, klicken Sie auf die Analyse- und dann auf die Messregisterkarten, um die gesamte Gewebefläche zu erhalten, die in einem Popup-Fenster analysiert wurde.
Speichern Sie dann die Daten in einer Excel-Datei. Um den gefärbten positiven Bereich 6-E10 zu messen, wechseln Sie zu den Registerkarten Bild, Anpassung und Farbschwellenwert in der angegebenen Reihenfolge. Ein vorgefertigter Filter unter der Schwellenwertmethode liefert die gewünschten Ergebnisse, indem er die stärksten Signale rot hervorhebt.
Nachdem Sie den entsprechenden Schwellenwert ausgewählt haben, überprüfen Sie den dunklen Hintergrund, um die Amyloid-Beta-Flecken auf schwarzem Hintergrund hervorzuheben. Klicken Sie auf die Auswahl, dann auf das Original und erneut auf die Auswahl, um die dunklen Signale der Amyloid-Beta-Ablagerungen auf weißem Hintergrund anzuzeigen. Wenn das Popup-Fenster generiert wird, klicken Sie auf die Registerkarte Partikel analysieren und analysieren und klicken Sie auf OK. Kopieren Sie die von der Software generierte Zusammenfassungsausgabe, indem Sie auf die Schaltflächen Bearbeiten und Kopieren klicken.
Fügen Sie dann die zuvor gestartete Excel-Datei mit den entsprechenden Beschriftungen ein. Berechnen Sie den Prozentsatz 6E-10 positive Fläche mit der Formel Nach dem Herunterladen der Bildanalysesoftware führen Sie die Schritte aus, bis der ROI des Gehirns identifizierbar ist, wie bereits gezeigt. Wählen Sie dann mit dem Rechteckwerkzeug den ROI im Kortex oder im Hippocampus aus.
Klicken Sie in der Symbolleiste auf Bearbeiten, wählen Sie dann aus und geben Sie die Registerkarte an, indem Sie die Höhe und Breite auf einen vordefinierten Wert ändern. Stellen Sie die Box so ein, dass sie vollständig vom Gewebe bedeckt ist. Setzen Sie die Helligkeit oder den Kontrast auf die ursprüngliche Helligkeit zurück.
Duplizieren Sie den ausgewählten ROI, indem Sie mit der rechten Maustaste auf das Kästchen klicken und auf das Duplikat klicken. Es öffnet sich ein neues Fenster mit der ausgewählten Region. Benennen Sie das duplizierte Bild um, um die Region anzuzeigen, in der es sich befindet.
Passen Sie den duplizierten Bildtyp an, indem Sie die Symbolleiste verwenden und auf das Bild klicken, und geben Sie dann 8-Bit-Tasten ein, um das duplizierte RGB-Bild in 8-Bit zu konvertieren und die Plaketten optimal zu analysieren. Kehren Sie das Bild um, indem Sie auf Bearbeiten klicken und dann umkehren. Um den positiven Bereich 6E-10 zu messen, gehen Sie zum Bild und passen Sie ihn an und schwellen Sie ihn an.
Ein vordefinierter Filter unter der Schwellenwertmethode liefert die gewünschten Ergebnisse und hebt die stärksten Signale rot hervor. Nachdem Sie den entsprechenden Schwellenwert ausgewählt haben, klicken Sie auf Übernehmen. Um den positiven Bereich 6E-10 zu analysieren, verwenden Sie die Symbolleiste und klicken Sie auf die Registerkarten Partikel analysieren und analysieren, um sicherzustellen, dass die Zusammenfassungsergebnisse überprüft werden.
Kopieren Sie die Zusammenfassungsausgabe mit dem Prozentbereich, indem Sie auf die Registerkarten Bearbeiten und Kopieren klicken. Fügen Sie dann die Zusammenfassungsausgabe in die zuvor gestartete Excel-Datei mit den entsprechenden Beschriftungen ein. Wiederholen Sie den Vorgang für die verschiedenen Bereiche im Gewebe und stellen Sie sicher, dass die Platzierung jeder Box, um den ROI zu skizzieren, zwischen den einzelnen Bildern konsistent ist.
In dieser repräsentativen Bewertung werden Voll- und Sub-ROI-Analysemethoden verglichen, um den positiven 6E-10-Bereich im Kortex und im Hippocampus-Hirngewebe zu quantifizieren. Die vollständige ROI-Analyse umfasst die Darstellung des gesamten ROI. Im Gegensatz dazu beinhaltet die Sub-ROI-Analyse die Auswahl einer vordefinierten Region innerhalb des ROI.
Das schrittweise Verfahren für die vollständige und sub-ROI 6E-10-positive Flächenquantifizierung mit ROI-Rotation für die Sub-ROI-Quantifizierung wird hier gezeigt. Hier wird der Zusammenhang zwischen der Voll- und der Sub-ROI-Analyse aufgezeigt. Eine signifikante positive Korrelation wurde zwischen dem positiven Bereich 6E-10 beobachtet, der von den beiden Lesern berichtet wurde, die die Sub-ROI-Analyse für den Kortex und den Hippocampus durchführten.
Darüber hinaus teilte die gemittelte positive Fläche unter ROI 6E-10 eine starke, signifikante positive Korrelation mit der Fläche, die unter Verwendung des vollen ROI erhalten wurde. Für den mittleren positiven Bereich von 6E-10 in den Sub-ROI-Analysen wurde kein signifikanter Unterschied im Kortex und im Hippocampus beobachtet. Eliza beobachtete eine signifikante Korrelation zwischen homogenen und löslichen Amyloid-beta-1-42-Messungen des gesamten Gehirns und einer vollständigen ROI-Analyse aus der Studie Die Auswahl des Schwellenwerts ist der Schlüssel zur genauen Datenquantifizierung.
Ein Benutzereingriff ist erforderlich, um sicherzustellen, dass die positiven Flecken mit dem ausgewählten Filter genau ausgewählt werden. Abgesehen von der Amyloid-Beta-Quantifizierung kann diese Methode für andere fluoreszierende Immunflecken verwendet werden. Zum Beispiel Iba-1, aus der Quantifizierung mikroglialer positiver Flächen.
