We would like to thank Chris Wreden and Michelle Bland for comments on the manuscript and for technical help.

1. Herstellung von Larvae <ol><li> Eine Woche vor Verhalten aufnehmen, setzen Sie ein Kreuz (Minimum von 25 Jungfrauen und fünf Männer) auf. Pflegen Sie alle Kreuze und Nachkommen bei 25 ° C. HINWEIS: Die Temperatur der Kulturbedingungen verändert werden können, aber die unten beschriebenen Zeitlinie müssten für Änderungen in der Entwicklungsgeschwindigkeit Rechnung angepasst werden. </li><li> 5 Tage vor der Aufnahme, als erstes am Morgen, legen Sie das Kreuz in einen Sammelkorb mit einem Agar / Saft Kappe und einem Klecks (0,5-1 ml) von Hefe-Paste in der Mitte des Agar / Saft Kappe. <ol><li> Um eine Sammlung Käfig machen, stoßen Löcher in eine 6 Unzen Platz Polyethylen Drosophila Flasche. </li><li> Agar / Saft Kappen, mischen 18 g Agar mit 600 ml Wasser in einem Erlenmeyerkolben zu machen. In einem separaten Kolben Mischung 20 g Saccharose mit 200 ml Apfelsaft. Mikrowellen bis die Feststoffe gelöst sind. Kombinieren und rühren, wodurch Mischung auf 60 ° C abkühlen. 20 ml 10% Methyl-p-hydroxybenzoat in 95% Ethanol, und rühren. In ~ 7ml auf die untere Hälfte eines 35 x 10 mm Runde Petrischale. Erlauben Agar / Saft für 1 h bei RT zu verfestigen. Lagerung bei 4 ° C. </li><li> Um Hefe-Paste, fügen gleichen Volumenteilen Trockenhefe und Wasser. Lagerung bei 4 ° C. </li></ol></li><li> Überprüfen Sie die Gesundheit der Larven Sammlungen. <ol><li> Am Morgen, 4 und 3 Tage vor der Aufnahme entfernen Sie die Kappe und legen Sie eine neue Kappe auf den Käfig. Ändern Sie die Kappen zur gleichen Zeit jeden Tag eine 24-Stunden-Sammlung von Eiern zu bekommen und frisch geschlüpfte Larve. </li><li> Nach jeder Kappe entfernt wird, untersuchen, um zu sehen, wie viele Eier das Kreuz zu legen. Erwarten Sie, zwischen 500-2000 Eier. Stellen Sie die Anzahl der Erwachsenen, wenn nötig. HINWEIS: Einige Eier in die Larven geschlüpft sollten, und die frisch geschlüpften Larven von der Hefe-Paste zu finden. </li><li> Alter jeder Kappe für 24 Stunden. Erneut zu prüfen, um die Kappe zu bestimmen, ob Larven gesund sind. HINWEIS: Die meisten Eier sollten in Larven geschlüpft sind, und die Larven sollten in die ihr gekrochenast Paste. Anzeichen für eine schlechte Gesundheit umfassen eine große Anzahl von nicht geschlüpften Eier, tote Larven Körper weg von der Hefe-Paste, und Larven mit signifikanten dunklen Flecken im Bauch, eine Immunreaktion anzeigt. Wenn Larven ungesund sind, um den Käfig zu ändern, machen frische Kappen / Hefe-Paste, und den Genotyp überprüfen. </li><li> Entsorgen Sie die alten Kappen. </li></ol></li><li> Sammeln Larven für Verhaltensaufnahmen. <ol><li> An beiden 2 und 1 Tag vor der Aufnahme, entfernen Sie die Kappe und ersetzen mit einem frischen Kappe. </li><li> Beschriften Sie jede entfernt Kappe und halten bei 25 ° C. Dies wird eine gestaffelte Reihe von Larven für Verhaltens Aufnahmen produzieren. Die Larven von neu geschlüpften (0-4 hr posthatch) durch die zweite instar (24-48 h posthatch) können in den Kanälen verwendet werden. Speichern Kappen für Aufnahmen an aufeinanderfolgenden Tagen. </li><li> Entsorgen Sie alle Kappen nach 48 Stunden. </li><li> Falls erforderlich, wiederholen Sie die Schritte 1.4.1-1.4.3 für bis zu 5 weitere d. Nach dieser weniger werden befruchtete Eier produziert. </li></ol></li></ol><ol><li> Bereiten Sie die linearen Kanal PDMS (Polydimethylsiloxan, ein Siliconelastomer) Gießform (1A). PDMS Gussformen sind aus dem Heckscher-Labor auf Anfrage erhältlich. <ol><li> Reinigen Sie die Gießform mit Isopropylalkohol. Luft trocknen, trocken tupfen mit Labortücher, oder mit Druckluft verwenden. </li><li> Legen Sie die Gießform in eine 10 cm Petrischale Deckel oder einem anderen Behälter. </li></ol></li><li> Vorbereiten und Agarose - Lösung gießen. <ol><li> Machen Sie eine 3% igen Lösung in Wasser (3 g in 100 ml) durch Erhitzen in der Mikrowelle bis zur vollständigen Auflösung. </li><li> Man kühlt auf 55 ° C, so dass Blasen Oberfläche steigen. </li><li> Gießen der Agarose-Gemisch in die Petrischale, die Gießform enthält, so daß die Form gerade bedeckt. Lassen Sie Agarose-Set bis verfestigt. </li></ol></li><li> Entfernen Sie die Agarose-Kanäle aus der Gießform. Trimmen der Ränder der Agarose-Platte mit einer Rasierklinge. <ol><li> Setzen Sie den Kanals in einer 10 cm Petrischale in Wasser eingetaucht. Sie können bei 4 ° C für 7 Tage aufbewahrt. </li></ol></li></ol> 3. eine Larve in einen Kanal aufzuzeichnen Verhalten Laden HINWEIS: Wenn Kanäle bei 4 ° C lagern lassen Kanäle auf RT kommen, bevor sie für Verhaltensaufzeichnung verwenden. <ol><li> Verwenden Sie einen sauberen Rasierklinge einen einzigen Kanal von den in Schritt 2 (2A) bereit zu schneiden. </li><li> Verwenden Sie eine Zange um den Kanal gerillten Seite nach oben auf einem Deckglas (2B) zu platzieren. Die Größe und die Dicke des Deckglases hängt von dem spezifischen Anwendungsbereich für die Bildgebung verwendet. </li><li> Verwenden feinen Pinzette eine Larve aus dem Agar / Saft Kappe in Schritt vorbereitet , um 1 ziehen und in den Schnittkanal (2C). <ol><li> Sie nicht die Larve quetschen. Wählen Sie ihn sanft mit der Spitze der Zange Zinke nach oben. Es ist auch möglich, Larve mit einem Pinsel mit einer feinen Spitze zu manipulieren. Hinweis: Dies ist wichtig, da Larven sind sehr sensitive zu berühren. Wenn sie nicht mit Sorgfalt behandelt werden, kann nozizeptiven Reaktionen ihr Verhalten während der ersten paar Sekunden des Versuchs dominieren. </li><li> Waschen Sie die Larven durch kurzes sie in Wasser eingetaucht. </li><li> Nach der Platzierung der Larve auf Schnittkanal mit der Spitze der Zange Zinke vorsichtig auf die Larve in den Kanal Hain necken. HINWEIS: Für die meisten Anwendungen ist die Breite der Larve und die Breite des Kanals entsprechen sollte. Die durchschnittliche Breite der Larven in verschiedenen Stadien der Entwicklung folgt: 0 hr posthatch - 140 um, 24 hr posthatch - 180 um, 48 hr posthatch - 320 um, 72 hr posthatch - 500 um 96 Stunden posthatch - 750 um 8. Kanäle kommen in den folgenden Breiten: 100, 150, 200, 250, und 300 &amp; mgr; m, und alle Kanäle sind 150 &amp; mgr; m tief. </li><li> Verwenden Sie die Spitze einer Pinzette Zinke oder Pinsel die Position der Larve innerhalb des Kanals einzustellen. Es kann in jeder Richtung orientiert sein: ventralup, ventralen nach unten, ventralen auf der einen Seite, auf welche Struktur in Abhängigkeit abgebildet werden soll. </li></ol></li><li> Mit einer Pinzette, drehen sanft den Kanal über, so dass die Larve nun auf dem Deckglas ist. Ein oder zwei Tropfen Wasser an den Enden des Kanals , so dass es mit Wasser (2D) füllt. <ol><li> Heben Sie vorsichtig die Seiten des Kanals alle Luftblasen zu entfernen. </li><li> Passen Sie die Ausrichtung der Larve. Dazu vorsichtig den Kanal schubsen, aber nicht das Deckglas die Larve zu rollen. Wenn dies nicht die Ausrichtung zu ändern, entfernen Sie das Deckglas und Larven Position einstellen. Die Larve ist bereit, das abgebildet werden soll. </li><li> Bild der Kanal / Deckglas auf einem inversen Mikroskop. Wenn Bildgebung auf einem aufrechten Mikroskop, kehren Sie einfach den Kanal / Deckglas. </li></ol></li></ol> 4. Messen Merkmal von Interesse in Behavioral Recording <ol><li> Für eine Struktur von Interesse (zB Schwanz, ZNS), messen ein Merkmal von Interesse (zB, Fluoreszenzintensität, Ort) über die Zeit. HINWEIS: Strukturen wie der Kopf und Schwanz kann manuell mit Anmerkungen versehen werden. Zum Beispiel kann der Kopf als enthält dunkle H-förmigen Mundhaken identifiziert werden, und der Schwanz kann als enthaltenden hinteren Tracheal spiricles identifiziert werden. Dieser Beitrag konzentriert sich auf den Nervenstrang. Verwenden Sie die neuronale GAL4 Linie elav-GAL4 ein UAS-myr-GFP - Transgen zu fahren (elav&gt; GFP) 9,10 bis fluoreszenz das zentrale Nervensystem (ZNS) beschriften. Das CNS enthält zwei vorderen Gehirnlappen an den Nervenstrang befestigt, der an der hinteren erstreckt (Figur 3). </li><li> Messen der Pixelintensität des Nervenstrang (f (NC)) zu jedem Zeitpunkt (t). Im Folgenden beschreibt eine manuelle Annotation Ansatz, aber dieser Schritt automatisiert werden konnten. <ol><li> In Fidschi (oder eine ähnliche Software) im Menü &quot;Analysieren&quot;, die &quot;Set Messungen ...&quot; verwenden Dialogfeld den mittleren Grauwert und slic berichtene Position. </li><li> Ziehen Sie manuell eine Box in der Mitte des Nervenstrang im ersten Frame des Films (Abbildung 3). Dieser Schritt könnte auch mit Bildsegmentierung und Registrierungsalgorithmen automatisiert werden. </li><li> Verwenden Sie das &quot;Measure&quot; -Befehl im &quot;Analysieren&quot; Menü, um die durchschnittliche Pixelintensität in der boxed Region von Interesse zu melden. Dies erzeugt ein Fenster &quot;Ergebnisse&quot;. </li><li> Im nächsten Bild neu zu positionieren manuell die Box ohne Ändern der Größe, indem Sie die Pfeiltasten. Verwenden Sie das &quot;Measure&quot; Befehl erneut aus. Die aktualisierten Ergebnisse werden im Fenster &quot;Ergebnisse&quot; angezeigt. Wiederholen Sie diesen Schritt für jeden Frame von Interesse. </li><li> Speichern Sie die &quot;Ergebnisse&quot; mit dem &quot;Speichern unter ...&quot; Befehl aus dem Menü Datei. Die Ergebnisse werden als .xls-Datei exportiert werden. </li></ol></li></ol> 5. Analysieren Sie die Messungen <ol><li> Normalisieren jedes f (NC) Wert auf einen Wert zwischen 0 und 1 (z (t) &lt;/ Em&gt;). <ol><li> In Tabelle (oder ein anderes Programm), öffnen Sie die Datei Results.xls. Diese Datei wird über zwei Spalten repräsentieren Rahmennummer und die mittlere Fluoreszenzintensität. </li><li> Machen Sie eine neue Spalte und verwenden Sie die Formel z (t) = f (NC [t]) -min (f [NC]) / max (f [NC]) -min (f [NC]) eine normalisierte Fluoreszenzwert zu erzeugen , entsprechend jedem Zeitpunkt. </li></ol></li><li> Bestimmen Sie die Schrittperiode für jeden Schritt in der Aufnahme. HINWEIS: Ein Schrittzyklus ist die Einheit der sich wiederholenden Ganzkörperbewegung für vorwärts (und umgekehrt) kriecht. Vereinbarungs ein Vortritt beginnt (und endet) mit der Vorwärtsbewegung des Schwanzes, den Kopf und andere innere Organe wie Darm oder CNS 1. <ol><li> Die Verhaltens Aufzeichnung manuell zu prüfen und die Initiationszeiten (i) von jedem Schritt (i (Stride Zyklus [n])) aufzeichnen. HINWEIS: Im Beispiel unten, Vorwärtsbewegungdes ZNS wie die Einleitung eines Schrittzyklus verwendet (Abbildung 3). </li><li> Für jeden Schritt berechnen die Zeit: Δ t (Stride - Zyklus) = i (Stride Zyklus [n + 1]) -I (Stride Zyklus [n]). </li></ol></li><li> Berechnen Prozentsatz der Schrittzyklus für jeden Zeitpunkt der Aufzeichnung verstrichen ist . <ol><li> Machen Sie eine zusätzliche Spalte in der Tabellendatei Zeit seit dem Start eines Schrittzyklus abgelaufen darstellt (c). Stellen Sie die Zeit seit Schritt Initiation auf Null zu Beginn eines jeden Schritt (c (Stride Zyklus [n]) = 0). Passen Sie mal nach Beginn entsprechend. </li><li> Machen Sie eine zusätzliche Spalte in der Tabellendatei darstellt Prozent Schrittzyklus (% Schrittzyklus) vergangen eingestellten Zeiten Teilen durch Schrittperiode und mit 100 multipliziert , um Prozentsatz der Schrittzyklus zu konvertieren abgelaufene.% Schrittzyklus = (c (Stride Zyklus [n] )) / (Δ t (Stride - Zyklus) * 100). </li></ol></li></ol> 6. Generieren Polardiagramme Koordinaten Dynamik der Tragstrukturen von Interesse über die Crawl-Zyklus darstellen <ol><li> In MATLAB, verwenden Sie den Dialog &quot;Importieren von Daten&quot; in der Registerkarte Start der aktualisierten Results.xls zu importieren. </li><li> Machen Sie ein neues Array &quot;Theta&quot; enthält Prozent Schrittzyklus Werte (% Schrittzyklus). ( &quot;Theta = Var1&quot; , wo Var1% Schrittzyklus darstellt). </li><li> Machen Sie ein neues Array &quot;Rho&quot; enthalten normalisierte Fluoreszenzwerte (z (t)). ( &quot;Rho = Var2&quot; , wo Var2 z (t darstellt)). </li><li> Verwenden Sie die &#39;PolarPlot&#39; Befehl Polarkoordinaten Plots mit dem Prozentschrittzyklus als der Winkel zu machen, und die Fluoreszenz als der Radius ( &quot;PolarPlot (Theta, Rho)&quot;). </li></ol>

<ol><li>Heckscher, E. S., Lockery, S. R., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Drosophila+larval+crawling+at+the+level+of+organism%2C+segment%2C+and+somatic+body+wall+musculature%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Characterization of Drosophila larval crawling at the level of organism, segment, and somatic body wall musculature.</a> J Neurosci. 32 (36), 12460-12471 (2012).</li>
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</ol>

The authors have nothing to disclose.

Es wurde eine Mikrofluidik - Vorrichtung , um lineare Agarose Kanäle gebaut , die Drosophila - Larven (Abbildung 1) aufnehmen kann. Bei Drosophila - Larven in dieser linearen Agarose - Kanäle , um ihre Verhaltensrepertoire platziert wird kriechen begrenzt, die für eine detaillierte Beobachtung der Dynamik der Larven Strukturen über den Crawl - Zyklus erlaubt. Eine erfolgreiche Aufnahme tritt auf, wenn eine Larve eine Reihe von rhythmischen Schritten <st...

Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist , Drosophila Larve Crawling im Detail zu studieren. Versuche zur Fortbewegung haben eine wichtige Rolle bei der Entwicklung und Erprobung von Theorien über die Motorsteuerung 2 gewonnen. Traditionell Fortbewegung wurde in Wassertiere (zB Blutegel, Neunauge, Kaulquappe) 3 untersucht. Die repetitive Charakter der Fortbewegung bei diesen Tieren wurde für die Analyse der biophysikalischen Ereignisse Lokomotion Fahren für die Untersuchung von Rhythmogenese, erlaubt, und für die neuronalen Feuerungsmuster Überwachung, die Fortbewegung begleiten. Die Verwendung von Drosophila - Larven für Studien der Fortbewegung stellt eine einzigartige Kombination von Vorteilen gegenüber anderen Modellsystemen: facile Genetik, gut charakterisierte Entwicklung, einem Körper, der auf den ersten und zweiten instars optisch klar ist, und einer laufenden Übertragung elektronenmikroskopische Rekonstruktion des gesamten Nervensystem 4-6. Allerdings Drosophila Larve LokBewegung auf flachen offenen Flächen ist etwas komplex einschließlich Pausen, dreht sich, und mäandernden kriecht 7. Diese Veröffentlichung stellt eine Methode lineare Agarose - Kanäle zu verwenden Drosophila Larven Bewegungsverhalten , so dass Larven zu führen perform nachhaltig, gerade, rhythmische Crawling Verhalten. Studium Drosophila Larven Verhalten in Agarose - Kanäle statt Verhalten auf flachen Oberflächen offen, hat mehrere Vorteile. Erstens ermöglicht es Forschern speziell auszuwählen Verhalten von den vielen Bewegungen kriechen, die Teil des Larven- Verhaltensrepertoire sind. Zweitens durch die Breite des Kanals gegenüber dem Larven- Körpergröße anpassen, können Kriechgang eingestellt werden. Drittens Kanäle ermöglichen die Larve aus dorsalen, ventralen oder lateralen Seite je nach betrachtet werden, wie die Larve geladen und innerhalb des Kanals ausgerichtet ist. Diese Vielseitigkeit in Larven Orientierung ermöglicht eine beliebige Struktur von Interesse während kriechen ständig sichtbar sein. Vierte,Kanäle sind für den Einsatz mit einer Vielzahl von Mikroskopen und Ziele zugänglich. Zum Beispiel können lineare Kanäle für niedrigaufgelöste Bildgebung auf Hellfeld Stereoskope und / oder für die hochauflösende Bildgebung auf Spinnscheiben - konfokale Mikroskope 1 verwendet werden. Fünftens kann dieses Verfahren mit optogenetische / thermogene neuronal Manipulationen in jedem genetischen Hintergrund in Kombination verwendet werden. Schließlich, da sowohl der Larvenkörper (in erster und zweiter instars) und Agarose-Kanäle optisch klar sind, können Kanäle verwendet werden, wenn die dynamischen Bewegungen oder Veränderungen in der Fluoreszenzintensität von Larven Strukturen von genetisch kodierten fluoreszierenden Sonden markiert studieren. Das beschriebene Verfahren eignet sich für detaillierte kinematische Studien der ersten und zweiten Instar Drosophila Larven Verhalten. Diese Veröffentlichung analysiert die dynamischen Veränderungen in der Fluoreszenzintensität des ZNS bei Vorwärtslarven Crawling die Verwendung von Kanälen zu veranschaulichen und als Vorläufer neuronal Kalzium-Imaging.

<table><tbody><tr><td>6 oz square Drosophila bottle</td><td>Scimart</td><td>DR-103</td><td></td></tr><tr><td>agar</td><td>sigma</td><td>A1296</td><td></td></tr><tr><td>sucrose</td><td>sigma</td><td>S9378</td><td></td></tr><tr><td>apple juice</td><td></td><td></td><td>not from concentrate</td></tr><tr><td>Tegosept</td><td>Fisher</td><td>T2300</td><td>methyl-p-hydroxybenzoate</td></tr><tr><td>35 x 10 mm round petri dish</td><td>Fisher</td><td>351008</td><td></td></tr><tr><td>baker&#039;s yeast</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PDMS casting mold</td><td>FlowJem</td><td></td><td>can be requested from authors</td></tr><tr><td>Isopropyl alcohol</td><td>Fisher</td><td>A417-1</td><td></td></tr><tr><td>laboratory wipes</td><td>Fisher</td><td>06-666-11</td><td></td></tr><tr><td>canned air</td><td>Fisher</td><td>18-431</td><td></td></tr><tr><td>10 cm petri dish</td><td>BioPioneer</td><td>GS82-1473-001</td><td></td></tr><tr><td>agarose</td><td>Fisher</td><td>50-444-176</td><td></td></tr><tr><td>razor blade</td><td>Fisher</td><td>12-640</td><td></td></tr><tr><td>forceps</td><td>FST</td><td>11241-40</td><td></td></tr><tr><td>22 x 40 cover glass, #1.5</td><td>Fisher</td><td>50-365-605</td><td></td></tr><tr><td>Fiji (version 1.51d)</td><td>NIH</td><td></td><td>fiji.sc</td></tr><tr><td>Excel 2016</td><td>Microsoft</td><td></td><td>www.microsoftstore.com</td></tr><tr><td>MATLAB R2016</td><td>Mathworks</td><td></td><td>www.mathworks.com</td></tr></tbody></table>

using linear agarose channels to study drosophila larval crawling behavior

Drosophila Larven Crawling zeichnet sich als ein leistungsfähiges Modell neuronalen Kontrolle von sensomotorischen Verhalten zu studieren. Allerdings Larven Crawling Verhalten auf flachen offenen Flächen ist komplex, einschließlich: Pausieren, Drehen und mäandernden. Diese Komplexität im Repertoire der Bewegung behindert detaillierte Analyse der Ereignisse während eines einzelnen Crawl Schrittzyklus auftreten. Um dieses Hindernis zu überwinden, lineare Agarose-Kanäle wurden gemacht, das Larven Verhalten gerade, nachhaltig, rhythmische Crawling beschränken. Grundsätzlich weil Agarose - Kanäle und die Drosophila Larvenkörper sind beide optisch klare, die Bewegung der Larven Strukturen durch genetisch kodierten fluoreszierenden Sonden markiert kann in intakten, sich frei bewegenden Larven beobachtet werden. In der Vergangenheit wurden Larven in linearen Kanälen und kriechenden auf der Ebene des gesamten Organismus, Segment- und Muskel wurden 1 analysiert platziert. In Zukunft Larven in den Kanälen kriechen können für Kalzium-Imaging verwendet werden neuro zu überwachennal Aktivität. Darüber hinaus können diese Verfahren mit Larven von jedem Genotyp werden verwendet und mit jedem Forscher gestalteten Kanal. Damit das Protokoll unten dargestellt ist breit anwendbar für Studien , die die Drosophila Larve als Modell Motorsteuerung zu verstehen , verwenden.

Dieser Artikel beschreibt ein Verfahren zum Führen von Drosophila Larve Verhalten mit Agarose - Kanäle und für die Dynamik der Larven Strukturen über einen Crawl - Zyklus zu messen. Larvae in linearen Kanälen führen nachhaltige Anfälle von rhythmischen Crawling (Abbildung 3). Da sowohl Larven und Kanäle optisch klar sind, können Kanäle verwendet werden, mit Larven exprimieren Fluoreszenzsonden in jeder Struktur von Interesse bekundet. Wir nahmen Larven...

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Using Linear Agarose Channels to Study Drosophila Larval Crawling Behavior

Die Drosophila Larve ist ein leistungsfähiges Modellsystem neuronale Kontrolle des Verhaltens zu untersuchen. Diese Veröffentlichung beschreibt die Verwendung von linearen Agarose-Kanäle nachhaltig Anfälle von linearen Crawling und Methoden zu entlocken, die Dynamik der Larven Strukturen bei wiederholten kriechenden Verhalten zu quantifizieren.

Linear Agarose Kanäle zu studieren<em&gt; Drosophila</em&gt; Larval Krabbeln Verhalten

Drosophila larval crawling is emerging as a powerful model to study neural control of sensorimotor behavior. However, larval crawling behavior on flat ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Using Linear Agarose Channels to Study Drosophila Larval Crawling Behavior

7.4K Aufrufe.  University of Chicago.  Die Drosophila Larve ist ein leistungsfähiges Modellsystem neuronale Kontrolle des Verhaltens zu untersuchen. Diese Veröffentlichung beschreibt die Verwendung von linearen Agarose-Kanäle nachhaltig Anfälle von linearen Crawling und Methoden zu entlocken, die Dynamik der Larven Strukturen bei wiederholten kriechenden Verhalten zu quantifizieren. 

Serie: Using Linear Agarose Channels to Study Drosophila Larval Crawling Behavior

High-resolution Measurement of Odor-Driven Behavior in Drosophila Larvae

Olfactory responses in Drosophila larvae have been traditionally studied in Petri dishes comprising a single peripheral odor source. In this behavioral paradigm, the experimenter usually assumes that the rapid diffusion of odorant molecules from the source leads to the creation of a stable gradient in the dish. To establish a quantitative correlation between sensory inputs and behavioral responses, it is necessary to achieve a more thorough characterization of the odorant stimulus conditions. In this video article, we describe a new method allowing the construction of odorant gradients with stable and controllable geometries. We briefly illustrate how these gradients can be used to screen for olfactory defects (full and partial anosmia) and to study more subtle features of chemotaxis behavior.

In this video article, we describe a new method allowing the construction of odorant gradients with stable and controllable geometries. We briefly illustrate how these gradients can be used to screen for olfactory defects (full and partial anosmia) and to study more subtle features of chemotaxis behavior.

Hochauflösende Messung von Odor-Driven Behavior in Drosophila-Larven

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Forschung

Biologie

Using Microfluidics Chips for Live Imaging and Study of Injury Responses in Drosophila Larvae

Live imaging is an important technique for studying cell biological processes, however this can be challenging in live animals. The translucent cuticle of the Drosophila larva makes it an attractive model organism for live imaging studies. However, an important challenge for live imaging techniques is to noninvasively immobilize and position an animal on the microscope. This protocol presents a simple and easy to use method for immobilizing and imaging Drosophila larvae on a polydimethylsiloxane (PDMS) microfluidic device, which we call the 'larva chip'. The larva chip is comprised of a snug-fitting PDMS microchamber that is attached to a thin glass coverslip, which, upon application of a vacuum via a syringe, immobilizes the animal and brings ventral structures such as the nerve cord, segmental nerves, and body wall muscles, within close proximity to the coverslip. This allows for high-resolution imaging, and importantly, avoids the use of anesthetics and chemicals, which facilitates the study of a broad range of physiological processes. Since larvae recover easily from the immobilization, they can be readily subjected to multiple imaging sessions. This allows for longitudinal studies over time courses ranging from hours to days. This protocol describes step-by-step how to prepare the chip and how to utilize the chip for live imaging of neuronal events in 3rd instar larvae. These events include the rapid transport of organelles in axons, calcium responses to injury, and time-lapse studies of the trafficking of photo-convertible proteins over long distances and time scales. Another application of the chip is to study regenerative and degenerative responses to axonal injury, so the second part of this protocol describes a new and simple procedure for injuring axons within peripheral nerves by a segmental nerve crush.

Using Microfluidics Chips for Live Imaging and Study of Injury Responses in Drosophila Larvae

Drosophila larvae are an attractive model system for live imaging due to their translucent cuticle and powerful genetics. This protocol describes how to utilize a single-layer PDMS device, called the &#39;larva chip&#39; for live imaging of cellular processes within neurons of 3rd instar Drosophila larvae.

Mit Mikrofluidik-Chips für Live-Imaging-und Studienverletzungs Antworten in<em&gt; Drosophila</em&gt; Larven

Live imaging is an important technique for studying cell biological processes, however this can be challenging in live animals. The translucent cuticle of ...

Biotechnik

A Burrowing/Tunneling Assay for Detection of Hypoxia in Drosophila melanogaster Larvae

Oxygen deprivation in animals can result from exposure to low atmospheric oxygen levels or from internal tissue damage that interferes with oxygen distribution. It is also possible that aberrant behavior of oxygen-sensing neurons could induce hypoxia-like behavior in the presence of normal oxygen levels. In D. melanogaster, development at low oxygen levels results in inhibition of growth and sluggish behavior during the larval phases. However, these established manifestations of oxygen deficit overlap considerably with the phenotypes of many mutations that regulate growth, stress responses or locomotion. As result, there is currently no assay available to identify i) cellular hypoxia induced by a mutation or ii) hypoxia-like behavior when induced by abnormal neuronal behavior.
We have recently identified two distinctive behaviors in D. melanogaster larvae that occur at normal oxygen levels in response to internal detection of hypoxia. First, at all stages, such larvae avoid burrowing into food, often straying far away from a food source. Second, tunneling into a soft substratum, which normally occurs during the wandering third instar stage is completely abolished if larvae are hypoxic. The assay described here is designed to detect and quantitate these behaviors and thus to provide a way to detect hypoxia induced by internal damage rather than low external oxygen. Assay plates with an agar substratum and a central plug of yeast paste are used to support animals through larval life. The positions and state of the larvae are tracked daily as they proceed from first to third instar. The extent of tunneling into the agar substratum during wandering phase is quantitated after pupation using NIH ImageJ. The assay will be of value in determining when hypoxia is a component of a mutant phenotype and thus provide insight into possible sites of action of the gene in question.

A Burrowing/Tunneling Assay for Detection of Hypoxia in Drosophila melanogaster Larvae

The protocol describes a simple assay to identify Drosophila melanogaster larvae that are experiencing hypoxia under normal atmospheric oxygen levels. This protocol allows hypoxic larvae to be distinguished from other mutants that show overlapping phenotypes such as sluggishness or slow growth.

Ein Graben/Tunneling Test zur Erkennung von Hypoxie in Drosophila Melanogaster Larven

Oxygen deprivation in animals can result from exposure to low atmospheric oxygen levels or from internal tissue damage that interferes with oxygen ...

Verhalten

Methods to Assay Drosophila Behavior

Drosophila melanogaster, the fruit fly, has been used to study molecular mechanisms of a wide range of human diseases such as cancer, cardiovascular disease and various neurological diseases1. We have optimized simple and robust behavioral assays for determining larval locomotion, adult climbing ability (RING assay), and courtship behaviors of Drosophila. These behavioral assays are widely applicable for studying the role of genetic and environmental factors on fly behavior. Larval crawling ability can be reliably used for determining early stage changes in the crawling abilities of Drosophila larvae and also for examining effect of drugs or human disease genes (in transgenic flies) on their locomotion. The larval crawling assay becomes more applicable if expression or abolition of a gene causes lethality in pupal or adult stages, as these flies do not survive to adulthood where they otherwise could be assessed. This basic assay can also be used in conjunction with bright light or stress to examine additional behavioral responses in Drosophila larvae. Courtship behavior has been widely used to investigate genetic basis of sexual behavior, and can also be used to examine activity and coordination, as well as learning and memory. Drosophila courtship behavior involves the exchange of various sensory stimuli including visual, auditory, and chemosensory signals between males and females that lead to a complex series of well characterized motor behaviors culminating in successful copulation. Traditional adult climbing assays (negative geotaxis) are tedious, labor intensive, and time consuming, with significant variation between different trials2-4. The rapid iterative negative geotaxis (RING) assay5 has many advantages over more widely employed protocols, providing a reproducible, sensitive, and high throughput approach to quantify adult locomotor and negative geotaxis behaviors. In the RING assay, several genotypes or drug treatments can be tested simultaneously using large number of animals, with the high-throughput approach making it more amenable for screening experiments.

Methods to Assay Drosophila Behavior

Drosophila melanogaster is a genetically and behaviorally tractable model system that has been used to understand the molecular and cellular basis of many important biological processes for over a century 1. Drosophila has been well exploited to gain insights into the genetic basis of fly behavior.

Methoden zum Test Drosophila Verhalten

Drosophila melanogaster, the fruit fly, has been used to study molecular mechanisms of a wide range of human diseases such as cancer, cardiovascular ...

Neurowissenschaften

Functional Analysis of the Larval Feeding Circuit in Drosophila

The serotonergic feeding circuit in Drosophila melanogaster larvae can be used to investigate neuronal substrates of critical importance during the development of the circuit. Using the functional output of the circuit, feeding, changes in the neuronal architecture of the stomatogastric system can be visualized. Feeding behavior can be recorded by observing the rate of retraction of the mouth hooks, which receive innervation from the brain. Locomotor behavior is used as a physiological control for feeding, since larvae use their mouth hooks to traverse across an agar substrate. Changes in feeding behavior can be correlated with the axonal architecture of the neurites innervating the gut. Using immunohistochemistry it is possible to visualize and quantitate these changes. Improper handling of the larvae during behavior paradigms can alter data as they are very sensitive to manipulations. Proper imaging of the neurite architecture innervating the gut is critical for precise quantitation of number and size of varicosities as well as the extent of branch nodes. Analysis of most circuits allow only for visualization of neurite architecture or behavioral effects; however, this model allows one to correlate the functional output of the circuit with the impairments in neuronal architecture.

Functional Analysis of the Larval Feeding Circuit in Drosophila

The feeding circuit in Drosophila melanogaster larvae serves a simple yet powerful model that allows changes in feeding rate to be correlated with alterations in the stomatogastric neural circuitry. This circuit is composed of central serotonergic neurons that send projections to the mouth hooks as well as the foregut.

Funktionelle Analyse der Larvenfütterung Circuit in Drosophila</i

The serotonergic  feeding circuit in Drosophila  melanogaster larvae can be used to investigate neuronal substrates of  critical importance during the ...

An Affordable and Efficient "Homemade" Platform for Drosophila Behavioral Studies, and an Accompanying Protocol for Larval Mitochondrial Respirometry

The usefulness of Drosophila as a model organism for the study of human diseases, behaviors and basic biology is unquestionable. Although practical, Drosophila research lacks popularity in developing countries, possibly due to the misinformed idea that establishing a lab and performing relevant experiments with such tiny insects is difficult and requires expensive, specialized apparatuses. Here, we describe how to build an affordable flylab to quantitatively analyze a myriad of behavioral parameters in D. melanogaster, by 3D-printing many of the necessary pieces of equipment. We provide protocols to build in-house vial racks, courtship arenas, apparatuses for locomotor assays, etc., to be used for general fly maintenance and to perform behavioral experiments using adult flies and larvae. We also provide protocols on how to use more sophisticated systems, such as a high resolution oxygraph, to measure mitochondrial oxygen consumption in larval samples, and show its association with behavioral changes in the larvae upon the xenotopic expression of the mitochondrial alternative oxidase (AOX). AOX increases larval activity and mitochondrial leak respiration, and accelerates development at low temperatures, which is consistent with a thermogenic role for the enzyme. We hope these protocols will inspire researchers, especially from developing countries, to use Drosophila to easily combine behavior and mitochondrial metabolism data, which may lead to information on genes and/or environmental conditions that may also regulate human physiology and disease states.

<meta charset="utf8"></head><body>Eine erschwingliche und effiziente "hausgemachte" Plattform für Drosophila-Verhaltensstudien und ein begleitendes Protokoll für die mitochondriale Respirometrie vo

We provide protocols for anyone with a "maker culture" mind to start building a flylab for quantitative analysis of a myriad of behavioral parameters in Drosophila melanogaster, by 3D-printing many of the necessary pieces of equipment. We also describe a high resolution respirometry protocol using larvae to combine behavioral and mitochondrial metabolism data.

Eine erschwingliche und effiziente "hausgemachte" Plattform für Drosophila-Verhaltensstudien und ein begleitendes Protokoll für die mitochondriale Respirometrie von Larven

The usefulness of Drosophila as a model organism for the study of human diseases, behaviors and basic biology is unquestionable. Although practical, ...

A Simple Technique to Assay Locomotor Activity in Drosophila

Drosophila melanogaster is an ideal model organism for studying various diseases due to its abundance of advanced genetic manipulation techniques and diverse behavioral features. Identifying behavioral deficiency in animal models is a crucial measure of disease severity, for example, in neurodegenerative diseases where patients often experience impairments in motor function. However, with the availability of various systems to track and assess motor deficits in fly models, such as drug-treated or transgenic individuals, an economical and user-friendly system for precise evaluation from multiple angles is still lacking. A method based on the AnimalTracker application programming interface (API) is developed here, which is compatible with the Fiji image processing program, to systematically evaluate the movement activities of both adult and larval individuals from recorded video, thus allowing for the analysis of their tracking behavior. This method requires only a high-definition camera and a computer peripheral hardware integration to record and analyze behavior, making it an affordable and effective approach for screening fly models with transgenic or environmental behavioral deficiencies. Examples of behavioral tests using pharmacologically treated flies are given to show how the techniques can detect behavioral changes in both adult flies and larvae in a highly repeatable manner.

A Simple Technique to Assay Locomotor Activity in Drosophila

The present protocol assesses the locomotor activity of Drosophila by tracking and analyzing the movement of flies in a hand-made arena using open-source software Fiji, compatible with plugins to segment pixels of each frame based on high-definition video recording to calculate parameters of speed, distance, etc.

Eine einfache Technik zur Bestimmung der lokomotorischen Aktivität in Drosophila

Drosophila melanogaster is an ideal model organism for studying various diseases due to its abundance of advanced genetic manipulation techniques and ...

Measurement of Larval Activity in the Drosophila Activity Monitor

Drosophila larvae are used in many behavioral studies, yet a simple device for measuring basic parameters of larval activity has not been available. This protocol repurposes an instrument often used to measure adult activity, the TriKinetics Drosophila activity monitor (MB5 Multi-Beam Activity Monitor) to study larval activity. The instrument can monitor the movements of animals in 16 individual 8 cm glass assay tubes, using 17 infrared detection beams per tube. Logging software automatically saves data to a computer, recording parameters such as number of moves, times sensors were triggered, and animals&#8217; positions within the tubes. The data can then be analyzed to represent overall locomotion and/or position preference as well as other measurements. All data are easily accessible and compatible with basic graphing and data manipulation software. This protocol will discuss how to use the apparatus, how to operate the software and how to run a larval activity assay from start to finish.

Measurement of Larval Activity in the Drosophila Activity Monitor

This report describes a method for measuring Drosophila larval activity using the TriKinetics Drosophila Activity Monitor. The device employs infrared beams to detect movements of up to 16 individual animals. Data can be analyzed to represent motion parameters including rates and the positions of the animals within the assay chambers.

Die Messung der Aktivität in der Larven<em&gt; Drosophila</em&gt; Activity Monitor

Drosophila larvae are used in many behavioral studies, yet a simple device for measuring basic parameters of larval activity has not been available. This ...

Light Spot-Based Assay for Analysis of Drosophila Larval Phototaxis

The larvae of Drosophila melanogaster show obvious light-avoiding behavior during the foraging stage. Drosophila larval phototaxis can be used as a model to study animal avoidance behavior. This protocol introduces a light-spot assay to investigate larval phototactic behavior. The experimental set-up includes two main parts: a visual stimulation system that generates the light spot, and an infrared light-based imaging system that records the process of larval light avoidance. This assay allows tracking of the behavior of larva before entering, during encountering, and after leaving the light spot. Details of larval movement including deceleration, pause, head casting, and turning can be captured and analyzed using this method.

Light Spot-Based Assay for Analysis of Drosophila Larval Phototaxis

This protocol introduces a light-spot assay to investigate Drosophila larval phototactic behavior. In this assay, a light spot is generated as light stimulation, and the process of larval light avoidance is recorded by an infrared light-based imaging system.

Licht-Spot-basierter Assay zur Analyse von Drosophila Larval Phototaxis

The larvae of Drosophila melanogaster show obvious light-avoiding behavior during the foraging stage. Drosophila larval phototaxis can be used as a model ...

Linear Agarose Kanäle zu studieren

Zusammenfassung

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Methoden zum Test Drosophila Verhalten

Funktionelle Analyse der Larvenfütterung Circuit in Drosophila

Eine erschwingliche und effiziente "hausgemachte" Plattform für Drosophila-Verhaltensstudien und ein begleitendes Protokoll für die mitochondriale Respirometrie von Larven

Eine erschwingliche und effiziente "hausgemachte" Plattform für Drosophila-Verhaltensstudien und ein begleitendes Protokoll für die mitochondriale Respirometrie von Larven

Eine einfache Technik zur Bestimmung der lokomotorischen Aktivität in Drosophila

Die Messung der Aktivität in der Larven

Licht-Spot-basierter Assay zur Analyse von Drosophila Larval Phototaxis