Authors would like to thank Andrew Bird for the silage samples and Audrey Farbos of the Exeter Sequencing Service for her assistance in preparing DNA sequencing libraries. Exeter Sequencing Service and Computational core facilities at the University of Exeter. Medical Research Council Clinical Infrastructure award (MR/M008924/1). Wellcome Trust Institutional Strategic Support Fund (WT097835MF), Wellcome Trust Multi User Equipment Award (WT101650MA) and BBSRC LOLA award (BB/K003240/1).

1. Site Location <ol><li> Sammeln Sie die Silage Probe aus einer geeigneten Stelle wie einer Farm. Hier wurde der Bauernhof in Ballydulea, Co. Cork, Irland (51 ° 51&#39;58.4 &quot;N 8 ° 16&#39;48.7&quot; W). </li></ol> 2. DNA-Extraktion HINWEIS: DNA-Extraktion wurde ein kommerzieller Kit folgenden Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Eine negative Kontrolle, die keine Probe enthielt, wurde in der gesamten Bibliothek Herstellungsverfahren verwendet. <ol><li> In 100 bis 400 mg der Probe bis 978 &amp; mgr; l Natriumphosphat-Puffer und 122 ul Boden Lysepuffer in den Lyse Rohre geliefert. </li><li> Homogenisieren Proben durch die Lyse Rohre in den Homogenisator für 40 s bei einer Geschwindigkeit von 6,0 m / s setzen. </li><li> Centrifuge Lysate bei 14000 × g für 15 min und den Überstand auf eine saubere Mikrozentrifugenröhrchen mit 250 ul Proteinpräzipitates Solution (PPS). Mischen Sie die Lösung durch Umkehren 10-mal und Zentrifugebei 14000 × g für 5 min. </li><li> Fügen Sie den Überstand in 1 ml DNA-Bindungsmatrix in einem sauberen 15 ml-Zentrifugenröhrchen. Mischen Sie die Lösung durch das Rohr ständig für 3 min zu invertieren. Lassen Sie die Mischung für 3 Minuten absetzen, verwerfen dann 500 &amp; mgr; l Überstand. Mischen Sie die verbleibende Überstand. </li><li> Übertragung von 600 &amp; mgr; l der Suspension auf einem Spinfilter und Zentrifuge bei 14.000 × g für 1 min. Entsorgen Sie das Filtrat und wiederholen Sie den Vorgang mit der verbleibenden Suspension. </li><li> Hinzufügen 500 ul Waschpuffer auf die DNA-Bindungsmatrix innerhalb des Spinfilter, mischen durch Pipettieren, dann Zentrifugieren bei 14.000 × g für 1 min. </li><li> Entsorgen Sie das Filtrat und Zentrifuge wieder den Spinfilter bei 14.000 × g für 2 min alle Waschpuffer entfernt wird, um sicherzustellen. Trocknen Sie die Spinfilter bei 23 ° C für 5 min. </li><li> Pre-warm (70 ° C) der DNase-freiem Wasser (DES) und resuspendieren die DNA-Bindungsmatrix in 100 ul DES innerhalb des Spinfilter. Übertragen Sie die Spinfilter auf ein sauberes 1,5 ml Mikrozentrifugen tuund Zentrifuge bei 14.000 × g für 1 min DNA zu eluieren. Lagern Sie die gereinigte DNA bei -20 ° C bis zur weiteren Analyse durchgeführt wird. </li></ol> 3. DNA-Reinigung mit DNA Purification Beads HINWEIS: Vor metagenomic Bibliothek Vorbereitung der extrahierten DNA wurde unter Verwendung von Reinigungsperlen gereinigt, um eine reine DNA-Probe, um sicherzustellen, erhalten. <ol><li> Inkubieren der Perlen bei 23 ° C für 30 min vor dem Gebrauch. Hinzufügen 2 Volumina Kügelchen zu der DNA-Probe und inkubiere die Lösung bei 23 ° C für 5 min. </li><li> Legen Sie die Proben auf eine Trennung Magnet für 5 min und dann den Überstand verwerfen. Waschen Sie die Perlen zweimal mit 200 &amp; mgr; l frischem 80% igem Ethanol (EtOH). Luft trocknen die Kügelchen für 10 min. </li><li> Entfernen Sie die Proben aus dem Trennmagneten und 50 &amp; mgr; l Elutionspuffer (EB), mischen durch Pipettieren. </li><li> Inkubieren der Suspension bei 23 ° C für 5 min, wonach die Proben wieder auf die Trennmagnet für 3 min schalten. </li><li> Transfer den Überstand, der die DNA enthält, in ein sauberes Röhrchen. Entsorgen Sie die Perlen. </li><li> Quantifizieren der gereinigten DNA gemäß Abschnitt vier. </li></ol> 4. Quantifizierung der gereinigten DNA HINWEIS: Die gereinigte DNA wurde quantifiziert den Anweisungen des Herstellers nach einem Fluorometer und doppelsträngige (dsDNA) High Sensitivity (HS) Assay-Kit. <ol><li> Bereiten Sie eine Arbeitslösung unter Verwendung von 199: 1-Verhältnis von Puffer zu Reagenz. </li><li> Fügen Sie 10 ul jeder DNA-Standard bis 190 &amp; mgr; l der Arbeitslösung. </li><li> In 10 ul gereinigter DNA zu 190 &amp; mgr; l der Lösung arbeiten. Das Endvolumen sollte 200 &amp; mgr; l sein. Inkubieren Standard und DNA-Proben bei 23 ° C für 2 min. </li><li> Analysieren Standards, bevor die DNA-Proben auf dem Fluorometer die Anweisungen auf dem Bildschirm verwendet wird. </li></ol> 5. Shotgun Sequencing Bibliothek Vorbereitung HINWEIS: Die Shotgun-Sequenzierung Bibliothek wurde unter Verwendung einerkommerzielle Bibliothek Vorbereitung Kit Anweisungen des Herstellers verwendet wird. <ol><li> Verdünnen Sie die DNA-Proben auf 0,2 ng / &amp; mgr; l unter Verwendung von EB. Alle , die Probe ist bereits unterhalb dieser Konzentration, dh die negative Kontrolle wird an der aktuellen Konzentration gelassen. </li><li> Mix 5 &amp; mgr; l der gereinigten DNA mit 10 &amp; mgr; l Puffer und 5 &amp; mgr; l Enzymgemisch. Inkubieren Proben bei 55 ° C für 5 min. </li><li> In 5 &amp; mgr; l Puffer zu neutralisieren und Inkubation der Lösung bei 23 ° C für 5 min. </li><li> Werden 5 &amp; mgr; l von jeder der probenspezifischen Sequenzindizes und 15 &amp; mgr; l PCR-Mastermix. </li><li> In einem Thermocycler, Inkubation der Proben bei 72 ° C für 3 min, 95 ° C für 30 s, vor 12 Zyklen von 95 ° C für 10 s, 55 ° C für 30 s und 72 ° C für 30 s. Inkubieren Proben schließlich bei 72 ° C für 5 min. </li><li> Reinige den vorbereiteten DNA des Wulstes Reinigung wie zuvor, aber mit einer endgültigen Elution von 30 &amp; mgr; l EB verwendet wird. </li></ol> 6. Library Quantität und Qualität prüfen HINWEIS: Die Menge und die Qualität der hergestellten Bibliotheken wurden unter Verwendung eines kommerziellen Kits und Instrumentierungs beurteilt. <ol><li> Inkubieren Sie die Komponenten des Kits bei 23 ° C für 30 Minuten vor der Verwendung. </li><li> Fügen Sie 2 &amp; mgr; l DNA bis 2 &amp; mgr; l Puffer und vortex für 1 min bei 2000 Upm. </li><li> Drehen um die Probe nach unten zu gewährleisten, ist es an der Unterseite des Rohres ist. </li><li> Setzen Sie die Probenröhrchen, Analyseband und Spitzen in das Gerät, und führen Sie Analyse, wie durch die Software gerichtet. </li></ol> 7. DNA - Sequenzierung <ol><li> Übertragen Sie die vorbereiteten und quantifizierten DNA - Sequenzierung Bibliotheken Proben auf eine Sequenzierdienstleister und Sequenz mit 300 bp gepaart Ende Sequenzierung 45. </li></ol> 8. Analyse von Roh-Sequenzdaten HINWEIS: Die Befehle für jedes Programm ein Linux-Betriebssystem verwenden, werden unter dem Protokollschritt gezeigt. Die Pipeline für s verwendetequence Datenanalyse ist in Abbildung 1 dargestellt. Die Programme sind vor der Analyse durch den Benutzer installiert werden. Dieser Prozess sollte für jede Probe einzeln durchgeführt werden. <ol><li> Analyse und Visualisierung von Daten DNA - Sequenz FastQC mit 46 eingeben , indem Sie auf der Kommandozeile / path-to-file / fastqc, gefolgt von der Vorwärts- und Rückwärts rohen raw_read1.fastq raw_read2.fastq liest. </li><li> einen Ausgabeordner angeben, indem Sie -o output_fastqc und das Dateiformat der rohen Lese Dateien durch -f fastq eingeben. </li><li> Sehen Sie sich die Ausgabedatei (Abbildung 2). path-to-file / fastqc raw_read1.fastq raw_read2.fastq -o output_directory -f fastq. </li></ol> 9. Qualitätskontrolle Trimming und Filtern von Sequenzdaten <ol><li> Führen Sie das Trimmen Programm, Trimmomatic 28 durch in die Kommandozeile java -jar / path-to-file / trimmomatic-0.35.jar eingeben. </li><li> Geben Sie die Dateien gepaart Ende Dateien durch Eingabe von &quot;PE&quot;. Staat, dass 16 zentrale prHOLZBEARBEITUNGS- Einheiten (CPUs) sollte 16 -threads durch die Eingabe von dem Programm verwendet werden. </li><li> Führen Sie die beiden Dateien in der QC-Überprüfung durch die Namen der rohen vorwärts eingeben und rückwärts liest. Das Präfix der Ausgabedateien wird durch die Eingabe einer -baseout Silage bestimmt. </li><li> Definieren Sie die Optionen für das Programm von ILLUMINACLIP eingeben: NexteraPE-PE.fa: 2: 30: 10 LEADING: 3 TRAILING: 3 SLIDINGWINDOW: 4: 20 ERNTE: 200 HEADCROP: 15 MINLEN: 36. </li><li> Wenn Sie fertig sind, analysieren die getrimmten Sequenzen unter Verwendung von FastQC wie zuvor, und die Ausgabe auf den Roh-Sequenzdaten zu vergleichen, um sicherzustellen, wurde erfolgreich durchgeführt trimmen. HINWEIS: Das Software-Tool, Trimmomatic, getrimmt liest weiter durch führende niedrige Qualität oder N-Basen zu entfernen (unter Qualität 3), Entfernen von geringer Qualität oder N Basen Hinter (unter Qualität 3) und jede Abtastung mit einem 4-Sockel breite Schiebefenster lesen. Die Parameter wurden eingestellt für das Schneiden, wenn die durchschnittliche Qualität pro Base unter 20 fällt und dann unter 36 Basen jeder liest lange fallen zu lassen. Schließlich wurden 15 Basen abgeschnitten from Kopf jeder lesen und wurden liest abgeschnitten vom Beginn des Lese 200 Basen zu halten. Dieser letzte Schritt wurde durchgeführt, einige Qualitätsprobleme zu überwinden, wenn die Sequenzierung lang (&gt; 200 bp) liest. Diese können für bestimmte Proben 28 eingestellt werden. java -jar /path-to-file/trimmomatic-0.35.jar PE -threads 16 raw_read1.fastq raw_read2.fastq -baseout Silage ILLUMINACLIP: NexteraPE-PE.fa: 2: 30: 10 LEADING: 3 TRAILING: 3 SLIDINGWINDOW: 4 : 20 ERNTE: 200 HEADCROP: 15 MINLEN: 36 </li></ol> 10. Metagenom Versammlung <ol><li> das ungepaarte Merge, liest, indem Sie Katze durch das ungepaarte liest gefolgt getrimmt; silage_read1_unpaired.fastq silage_read2_unpaired.fastq. Schreiben Sie die Dateien in eine neue Datei, indem Sie&gt; silage_merged_unpaired.fastq Katze silage_read1_unpaired.fastq silage_read2_unpaired.fastq&gt; silage_merged_unpaired.fastq </li><li> Um de novo die sequenzierte DNA montieren, verwenden Sie Spades (St. Petersburg Genom Assembler) 30 , indem Sie / path-to-file / spades.py. Gibt an, dass 16 CPUs, indem Sie -t 16 und dass der metagenomic Parameter angewendet sollte, indem Sie --meta verwendet werden sollen. </li><li> Identifizieren Sie die nach vorne getrimmt liest mit -1 silage_read1_paired.fastq und die Rückseite liest von -2 silage_read2_paired.fastq. Das fusionierte ungepaarten liest werden durch -s silage_merged_unpaired.fastq angegeben. </li><li> Definieren Sie den Ausgabeordner von silage_spades eingeben -o. path-to-file / spades.py -t 16 --meta -1 silage_read1_paired.fastq -2 silage_read2_paired.fastq -s silage_merged_unpaired.fastq -o silage_spades </li></ol> 11. Gepaart-End Read Overlap <ol><li> Merge Paare der DNA - Sequenz liest FLASH (schnelle Verstellung des Kurz Liest) unter Verwendung von 29 durch die Eingabe in Kommandozeile / path-to-file / Blitz. Gibt an, dass 16 CPUs sollten über -t 16 und die Ausgabe Präfix, indem Sie -o Silage verwendet werden. </li><li> Identifizieren getrimmten liest von silage_trimmed_R1.fastq silage_trimmed_R2.fastq eingeben path-to-file / flash t 16 -o geflasht silage_read1_paired.fastq silage_read2_paired.fastq </li></ol> 12. taxonomische <ol><li> Typ / path-to-file / kraken und die Datenbank angeben, indem Sie --db / path-to-file / Standard. </li><li> Definieren Sie, dass 16 CPUs sollten, indem Sie --threads 16 und identifizieren einen Ausgabeordner unter Verwendung --output FLASHed_silage_extendedFrags_kraken.txt verwendet werden. Geben Sie den Eingabedateinamen; FLASHed_silage.extendedFrags.fastq path-to-file / kraken --db Standard --thread 16 --output FLASHed_silage_extendedFrags_kraken.txt FLASHed_silage.extendedFrags.fastq HINWEIS: Die Einstufung der DNA - Sequenz zusammengesetzt Gerüste mit Kraken 7 gegen die jüngsten, abgeschlossen wurde Standard - Kraken - Datenbank , die alle verfügbaren Prokaryote Genomsequenzen enthalten. </li><li> Transfer Spalten 2 und 3 aus der Ausgabedatei und in eine neue Datei durch die Eingabe einer Schnitt -f2,3 FLASHed_silage_extendedFrags_kraken.txt&gt; FLASHed_silage_extendedFrags_kraken.int </li><li&gt; Die Ausgabedatei in Web-Browser öffnen. schneiden -f2,3 FLASHed_silage_extendedFrags_kraken.txt&gt; FLASHed_silage_extendedFrags_kraken.int </li><li> Importieren Sie die neue Datei in Krona 12 durch ktImportTaxonomy eingeben. Geben Sie die Eingabedatei durch FLASHed_silage_extendedFrags_kraken.int eingeben. Identifizieren Sie die Ausgabedatei von FLASHed_silage_extendedFrags_kraken.out.html eingeben -o. path-to-file / ktImportTaxonomy FLASHed_silage_extendedFrags_kraken.int -o FLASHed_silage_extendedFrags_kraken.out.html </li></ol> 13. Funktions Annotation <ol><li> Gehen Sie auf die MG-RAST 47 Website, http://metagenomics.anl.gov/. Registrieren Sie sich als neuer Benutzer, falls erforderlich. in, klicken Sie auf die Schaltfläche &quot;Hochladen&quot; Nach der Anmeldung. Laden Sie die zusammengebauten Gerüsten aus Schritt 10. </li><li> Sobald die Dateien hochgeladen haben, klicken Sie auf &quot;Senden&quot; und folgen Sie den Anweisungen und warten auf die Fertigstellung der Analyse. </li><li> Nachdem die Analyse abgeschlossen ist, sehen Sie den Link per em gesendetail von MG-RAST oder alternativ klicken Sie auf &quot;Progress&quot;. Es gibt eine Liste der abgeschlossenen Aufträge. Klicken Sie auf den entsprechenden Job-ID und dann auf den Link zum &quot;Download-Seite&quot;. </li><li> Auf der Download-Seite unter der Überschrift &quot;Protein Clustering 90%&quot;, klicken Sie auf das Protein, um die vorhergesagten Protein Datei, 550.cluster.aa90.faa zum Download bereit. </li><li> Um die Proteine zu klassifizieren als mutmaßlich Zugehörigkeit zu einer bestimmten cazy Enzymklasse, zu vergleichen , die heruntergeladenen Proteine an die cazy Datenbank 48. Laden Sie die Kohlenhydrat-aktive Enzyme Database (cazy) von Dateien sind: AA.zip, CE.zip, GH.zip, GT.zip und PL.zip. Diese Dateien repräsentieren die folgenden Enzymklassen jeweils: Hilfs Aktivitäten (AA), Carbohydrate Esterasen (CE), Glycosidhydrolasen (GH), Glycosyltransferasen (GT) und Polysaccharidlyasen (PL). </li><li> Entpacken Sie die Datenbankdateien und mit Anmerkungen versehen, die die Proteine ​​durch die Bestimmung der Protein Ähnlichkeit mit den cazy Datenbank Proteine, die die USEARCH UBLAST algor mitithm 49. Um eine Bash-Schleife (for i in * .txt) über die 5-Datenbank TXT-Dateien Typ iterieren &quot;for i in * .txt; do&quot;. </li><li> Führen Sie USEARCH, indem Sie / path-to-file / usearch8 mit dem Parameter -ublast um den ublast Algorithmus zu verwenden. Geben Sie dann den Namen der Datei Proteinsequenz heruntergeladen von MG-RAST &quot;mgmXXXXXX.3.550.cluster.aa90.faa&quot;. </li><li> Um die Datenbankdatei angeben , um Typ verwendet werden &quot;-db $ i&quot; und die E-Wertschwelle bei 1e -5, Typ &quot;-evalue 1e-5&quot; zu spezifizieren. </li><li> Um die Suche nach der Entdeckung einer Zielsequenz zu beenden und damit , dass die Proteinsequenz Klassifizierung als zu der Zielenzymklasse, zB GH, Typ &quot;-masaccepts 1&quot; gesetzt . </li><li> Um festzulegen, dass 16 CPUs sollten Typ verwendet werden &quot;-threads 16&quot; und das Format der Ausgabedatei als ATAB-separierte Texttyp &quot;-blast6out&quot; angeben. Um die Ausgabedateityp &quot;$ i.ublast&quot; identifizieren. Um die Bash-Schleife zu beenden, typ &quot;; getan&quot; für i in * .txt; do / path-to-file / usearch8 -ublast ../mgmXXXXXX.3.550.cluster.aa90.faa -db $ i -evalue 1e-5 -maxaccepts 1 -threads 16 -blast6out $ i.ublast; erledigt </li></ol> 14. Visualizing cazy Annotation <ol><li> Um die Ausgabe von der cazy Annotation als Venn-Diagramm visualisieren, Protein-ID-Listen für jede Enzymklasse mit einer Bash-Schleife erzeugen. Geben Sie &quot;for i in * .ublast; do&quot;. </li><li> Um Spalte 1 aus der Ausgabedatei übertragen und in eine neue Datei, geben Sie &quot;cat $ i | cut -f 1&gt; $ i.list&quot;. </li><li> Beenden Sie die Schleife und geben Sie &quot;; done&quot;. </li><li> Öffnen Sie die .list Dateien in einem Texteditor. Gehen Sie auf die Webseite, wählen Sie die Anzahl der Sätze als 5 und fügen Sie den Inhalt der einzelnen Listendatei in einer separaten Box. Laden Sie das resultierende Diagramm als SVG-Datei. für i in * .ublast; tun cat $ i | cut -f 1&gt; $ i.list; erledigt </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Während eine in silico Analyse kann einen hervorragenden Einblick in die mikrobiellen Gemeinschaften geben , die in Umweltproben vorhanden sind, ist es wichtig , dass die taxonomische Klassifikationen zeigte mit entsprechenden Kontrollen und dass eine geeignete Tiefe der Sequenzierung erreicht wurde , in Verbindung durchgeführt werden , um die gesamte zu erfassen Bevölkerung derzeit 51. Mit jeder Computeranalyse, gibt es viele Wege ein ähnliches Ziel zu erreichen. Die Methoden , die wir in dieser Studie verwendet wurden , sind Beispiele für geeignete und einfache Methoden, die zusammengebracht wurden , um eine Reihe von Analysen auf der Silage microbiome zu erzielen. Eine Vielzahl und eine ständig wachsende Zahl von Bioinformatik - Tools und Techniken zur Verfügung metagenomic Daten zu analysieren, zum Beispiel Phylosift 8 und MetaPhlAn2 52, und diese sollten für ihre Relevanz für die Probe und die Analyse req auf die Untersuchung vor ausgewertet werdenuired 53. Metagenomanalyse Methoden werden von den Datenbanken zur Verfügung begrenzt für die Einstufung, Sequenzierung Tiefe und die Qualität der Sequenzierung. Die bioinformatische Verarbeitung hier demonstriert wurde auf lokaler, Hochleistungs-Maschine durchgeführt; jedoch Cloud-basierte Systeme sind ebenfalls erhältlich. Diese Cloud-basierte Dienste ermöglichen die Vermietung der notwendigen Rechenleistung, ohne die hohen Kosten Investition eines geeigneten leistungsfähigen lokalen Arbeitsplatz haben. Eine mögliche Anwendung dieser Methode wäre Silage in der Landwirtschaft vor seiner Verwendung zu beurteilen, daher sicherstellen, dass keine potenziell schädlichen Bakterien vorhanden sind, um sie in die Lebensmittelkette zu verhindern.

Metagenomics ist die direkte Analyse von DNA aus biologischen Gemeinschaften innerhalb Umweltproben 1 gefunden gereinigt und wurde ursprünglich verwendet , kultivierbarer Bakterien in Sedimenten 2 gefunden zu erkennen. Metagenomics wurde für eine Reihe von Anwendungen, beispielsweise die Identifizierung der humanen microbiome 3, Klassifizieren mikrobiellen Populationen im Meer 4 und auch für die Analyse der Bakteriengemeinschaften, entwickeln sich auf Kaffeemaschinen 5 eingesetzt. Die Einführung der nächsten Generation-Sequencing-Technologien führte zu größeren Sequenzierungsdurchsatz und Ausgang. Folglich wurde DNA Sequenzierung wirtschaftlichere 6 und die Tiefe der Sequenzierung werden , die stark erhöhte durchgeführt hat werden kann, Metagenomics werden ein leistungsfähiges, analytisches Werkzeug ermöglicht. &quot;Front-end&quot; Verbesserungen in der praktischen, molecular Aspekt metagenomic Sequenzierung haben , das Wachstum der in getriebensilico Bioinformatik - Tools zur Verfügung für die taxonomische Klassifizierung 7-9, funktionelle Annotation 10,11 und visuelle Darstellung 12,13 von DNA - Sequenzdaten. Die zunehmende Zahl der zur Verfügung stehenden, sequenziert pro- und eukaryotischen Genomen 14 ermöglicht eine weitere Genauigkeit bei der Klassifizierung von mikrobiellen Gemeinschaften, die gegen ausnahmslos durchgeführt werden , ein &quot;Back-End&quot; Referenzdatenbank von sequenzierten Genome 15. Zwei Hauptansätze für Metagenom-Analyse übernommen werden. Die herkömmlicheren Verfahren ist die Analyse der 16S rRNA-Gen codierende Region der bakteriellen Genoms. Die 16S - rRNA ist stark zwischen Prokaryonten Spezies konserviert , aber weist neun hypervariablen Regionen (V1 - V9) , die zur Spezies Identifizierung 16 ausgenutzt werden kann. Die Einführung von mehr Sequenzierung (≤ 300 bp paarigen end) für die Analyse von DNA-Sequenzen erlaubt Spanning zwei hypervariablen Regionen, insbesonderedie V3 - V4 Bereich 17. Advances in anderen Sequenzierungstechnologien, wie Oxford Nanopore 18 und PacBio 19, erlauben die gesamte 16S - rRNA - Gen angrenzend sequenziert werden. Während 16S rDNA basierte Bibliotheken einen gezielten Ansatz zur Identifizierung von Arten liefern und den Nachweis von geringer Kopienzahl DNA ermöglichen, die in gereinigten Proben, Shotgun-Sequenzierung Bibliotheken ermöglichen die Detektion von Spezies natürlicherweise vorkommt, die DNA-Bereiche enthalten, die entweder nicht amplifizierbare durch die 16S sind rRNA Marker Primersequenzen verwendet werden, oder weil die Unterschiede zwischen der Template - Sequenz und die Verstärkungsprimersequenz sind zu groß , 20,21. Obwohl weiterhin DNA - Polymerasen eine hohe Genauigkeit der DNA - Replikation, können Basisfehler dennoch während des PCR - Amplifikation auftreten und auf diese eingebauten Fehler in falsche Klassifizierung der ursprünglichen Spezies 22 führen kann. Vorspannungen in der PCR-Amplifikation des Templates seqüsse kann auch auftreten; Sequenzen von DNA mit einem hohen GC - Gehalt kann unter im endgültigen Amplikon Pool 23 und ähnlich unnatürliche Basenmodifikationen, wie Thymin Glykol dargestellt werden, können DNA - Polymerasen , wodurch Fehler in der Amplifikation von DNA - Sequenzen 24 stoppen. Im Gegensatz dazu ist eine Shotgun-Sequenzierung DNA-Bibliothek eine DNA-Bibliothek, die unter Verwendung aller der gereinigten DNA hergestellt worden ist, die aus einer Probe und anschließend fragmentiert in kürzere DNA-Kettenlängen vor der Herstellung für die Sequenzierung extrahiert wurde. Taxonomische Klassifizierung von DNA - Sequenzen , die durch Shotgun - Sequenzierung erzeugt wird genauer , wenn im Vergleich zu 16S - rRNA - Amplikon - Sequenzierung 25, obwohl der finanzielle Aufwand eine zuverlässige Sequenzierungstiefe zu erreichen ist erforderlich größer als die der Amplikon - Sequenzierung 26. Der große Vorteil der Shotgun-Sequenzierung Metagenom ist, dass sequenzierten Regionen der verschiedenen Genomen in der Probe für die Gen-Prospektion zur Verfügung stehen, sobald sie gewesen seinwurde 27 taxonomisch klassifiziert. Metagenom-Sequenzdaten werden von einer ständig wachsenden Palette bioinformatischer Tools analysiert. Diese Werkzeuge sind in der Lage eine Vielzahl von Anwendungen auszuführen, zum Beispiel Qualitätskontrolle Analyse der Roh - Sequenzdaten 28, der gekoppelten Ende überlappende liest 29, de novo Assemblierung von Sequenz liest zu Contigs und Gerüsten 30,31, taxonomische Klassifizierung und Visualisierung der Sequenz liest und montierten Sequenzen 7,12,32,33 und die funktionelle Annotation von montierten Sequenzen 34,35. Silage, von den Landwirten auf der ganzen Welt aus fermentiertem Getreide hergestellt wie Mais (Zea Mays) wird überwiegend als Viehfutter verwendet. Silage wird mit dem Bakterium Lactobacillus sp behandelt. zu unterstützen 36 Gärung bis heute, aber es gibt begrenzte Kenntnis der anderen in Silage gefunden mikrobiellen Populationen. Die fermentation Prozess kann zu unerwünschten und potenziell schädlichen Mikroorganismen führen , dass weit verbreitet in der Silage 37. Neben Hefen und Schimmelpilze, Bakterien sind besonders anpassungsfähig an die anaerobe Umgebung in Silagen Fermentieren und häufiger im Zusammenhang mit Erkrankungen bei Nutztieren sind statt der Abbau der Silage 38. Buttersäurebakterien können versehentlich aus dem Boden zugesetzt werden , bleibt , wenn die Silage Silos Füllen und sind in der Lage , die Milchsäure, ein Produkt von anaerober Digestion, um Buttersäure zu konvertieren, wodurch der pH - Wert der Silage Erhöhung 39. Dieser Anstieg des pH - Wertes kann in Fäulnisbakterien zu einem Aufschwung führen , die normalerweise nicht in der Lage sein würde , 38 Wachstum unter optimalen Silagefermentationsbedingungen aufrecht zu erhalten. Clostridium spp. , Listeria spp. und Bacillus spp. sind von besonderer Bedeutung, vor allem in Silage für Milchvieh Futtermittel, wie Bakteriensporen, die die gastr überlebt habenointestinal - Darm - Trakt 40 können die Nahrungskette gelangen, führen zu Verderb von Lebensmitteln und in seltenen Fällen von Mensch und Tier Todesfälle 37,39,41-44. Hinzu kommt, dass es schwierig ist, die genaue wirtschaftlichen Auswirkungen der tierärztlichen Behandlung und Vieh Verlust von Silage Verderb verursacht abschätzen zu können, ist es wahrscheinlich zu einer Farm schädlich sein, wenn ein Ausbruch stattfinden war. Es wird vermutet, dass durch eine Metagenom-Ansatz können wir die mikrobiellen Populationen zu klassifizieren, die in Silageproben vorhanden sind und weiterhin mikrobielle Gemeinschaften mit Silage Verderb verbunden sind, identifizieren, die wiederum würde möglicherweise eine schädliche Wirkung auf das Vieh haben, so dass Abhilfemaßnahmen zu vor der Silage genommen ist als Nahrungsquelle verwendet werden.

<table><tbody><tr><td>FastDNA SPIN Kit for Soil</td><td>MP Bio</td><td>116560200</td><td>DNA Extraction</td></tr><tr><td>DNA FastPrep</td><td>MP Bio</td><td>116004500</td><td>DNA Extraction</td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP beads</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63880</td><td>DNA Purification</td></tr><tr><td>Elution Buffer</td><td>Qiagen</td><td>19806</td><td>DNA Purification</td></tr><tr><td>Qubit Fluorometer</td><td>Thermo Fisher</td><td>Q33216</td><td>DNA Quantification</td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td><td>Thermo Fisher</td><td>Q32854</td><td>DNA Quantification</td></tr><tr><td>Nextera XT DNA Library Prep Kit</td><td>Illumina</td><td>FC-131-1024</td><td>Library Preparation</td></tr><tr><td>Nextera XT Index Kit</td><td>Illumina</td><td>FC-131-1001</td><td>Library Preparation</td></tr><tr><td>TapeStation 2200</td><td>Agilent</td><td>G2964AA</td><td>DNA Quantification</td></tr><tr><td>HS D100 ScreenTape</td><td>Agilent</td><td>5067-5584</td><td>DNA Quantification</td></tr><tr><td>HS D100 ScreenTape Reagents</td><td>Agilent</td><td>5067-5585</td><td>DNA Quantification</td></tr><tr><td>TapeStation Tips</td><td>Agilent</td><td>5067-5153</td><td>DNA Quantification</td></tr><tr><td>TapeStation Tubes</td><td>Agilent</td><td>401428 and 401425</td><td>DNA Quantification</td></tr><tr><td>HiSeq 2500</td><td>Illumina</td><td></td><td>DNA Sequencing - provided by a sequencing service</td></tr><tr><td>High Power Analysis Workstation</td><td>Various</td><td></td><td>Local or cloud based, user preferred system</td></tr></tbody></table>

metagenomic analysis of silage

Metagenomics is defined as the direct analysis of deoxyribonucleic acid (DNA) purified from environmental samples and enables taxonomic identification of the microbial communities present within them. Two main metagenomic approaches exist; sequencing the 16S rRNA gene coding region, which exhibits sufficient variation between taxa for identification, and shotgun sequencing, in which genomes of the organisms that are present in the sample are analyzed and ascribed to "operational taxonomic units"; species, genera or families depending on the extent of sequencing coverage. 
In this study, shotgun sequencing was used to analyze the microbial community present in cattle silage and, coupled with a range of bioinformatics tools to quality check and filter the DNA sequence reads, perform taxonomic classification of the microbial populations present within the sampled silage, and achieve functional annotation of the sequences. These methods were employed to identify potentially harmful bacteria that existed within the silage, an indication of silage spoilage. If spoiled silage is not remediated, then upon ingestion it could be potentially fatal to the livestock.

Vor der bioinformatischen Verarbeitung, liest wurden Rohsequenz getrimmt und Adapter wurden mit Trimmomatic Software 28 entfernt. Nach dem Trimmen und Filterungsschritt liest die Anzahl von bis zu 50% der Sequenz reduziert liest (Tabelle 1). Die durchschnittliche Basis phred Stand&gt; 30 nach Qualitätskontrolle (Abbildung 2). Paare von DNA - Sequenzen , die wurden überlappende Bereiche hatten 29 FLASH Software verschmolzen mit zu erzeugen einzelne länger liest, nicht überlappende liest in einer separaten Datei gespeichert. 45.47% liest (105.343) erfolgreich kombiniert. Im Anschluss an die Überlagerung von liest FLASH mit der liest, sind die resultierenden Fragmente erweitert bakterielle taxonomische Klassifizierung mit Kraken - Software 7 und wurden anschließend visualisiert mit Krona Software (Abbildung 3) unterzogen wurden . <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; Die Mehrheit der Bakterienarten, die in der Silage Metagenom sind innerhalb von 4 prokaryotischen phyla gefunden: Firmicutes (34%), Actinobacteria (28%), Proteo (27%) und Bacteroidetes (7%) . Die Verteilung der Klassen , die innerhalb dieser Stämme können in Abbildung 4 zu sehen ist. Die häufigsten Arten in der Metagenom waren Lactobacillus spp. (24%; Firmicutes), Corynebacterium spp. (8%; Actinobacteria), Propionibacterium spp. (3%; Actinobacteria) und Prevotella spp. (3%; Bacteroidetes). Arten wichtig für die Tiergesundheit und in Krankheit in Verbindung gebracht wurden ebenfalls beobachtet; Clostridium spp. (1%) , Bacillus spp. (0,6%), Listeria spp. (0,2%) vorhergesagt wurden, die in der Silage Probe sein. Functional Annotation wurde am durchgeführt montiert liest. Die Metagenom wurde mit der Pik montiert Assembler 30 der zugeschnittene und filtriertPaired-End und ungepaarten liest Erzeugung 92.284 Gerüste. Um Cellulasen zu identifizieren, wurden die Proteine ​​vorhergesagt MG-RAST mit und kommentierte die Kohlenhydrat-aktive Enzyme Datenbank unter Verwendung von (cazy). Von den 97.562 vorhergesagten Proteine wurden 6357 als mutmaßliche Kohlenhydrat-aktives Enzym kommentierte in einer der fünf Enzyme Klassen, die die cazy Datenbank (Abbildung 5) bilden. Die Ergebnisse wurden als ein Venn - Diagramm unter Verwendung von 50 InteractiVenn visualisiert Software die Verteilung von Protein Annotationen einschließlich derjenigen zeigt , die mehr als eine Cazy Enzymklasse Annotation. Davon wurden 3861 vorhergesagt Glycosid-Hydrolase-Aktivität aufweisen und im Labor weiter charakterisiert werden Funktion zu bestätigen. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/54936/54936fig1.jpg" /> Abbildung 1: Die bioinformatische Metagenomics Pipeline für die Analyse von Silage. Zwei Hauptansätze warenverwendet, um die microbiome von Silage, taxonomische Klassifizierung und funktionelle Annotation zu untersuchen. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54936/54936fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54936/54936fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/54936/54936fig2.jpg" /> Abbildung 2: Sequenz Qualität Per-Basis vor und nach dem Trimmen und Adapter Entfernen. Die pro-Basensequenz Qualität Plot von FASTQC zeigt die durchschnittliche phred Punktzahl über die Länge der Sequenz liest vor und nach der Qualitätskontrolle. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54936/54936fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54936/54936fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/54936/54936fig3.jpg" /> Abbildung 3: Die taxonomische Classification des bakteriellen Microbiome Solid Silage. Klassifizierung von getrimmt und überlappende Sequenz liest aus FLASH durchgeführt wurde Kraken 7 verwenden und anschließend mit Krone sichtbar gemacht . <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54936/54936fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54936/54936fig3large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/54936/54936fig4.jpg" /> Abbildung 4: Taxonomische Klassenverteilung des 4 am reichlichsten Phyla in der Bakterien Microbiome Solid Silage. Der Anteil der einzelnen Klassen von Bakterien innerhalb der vier am häufigsten vorkommende Stämme. Firmicutes: Clostridien (rot) und Bazillen (dunkelblau); Proteo: delta / epsilon (rosa), alpha (blassblau), Gamma (orange) und Beta (türkis); Bacteroidetes: Flavobacteriia (dunkelblau) und Bacteroidia(blasses Grün); Actinobacteria: Coriobacteriia (dunkelviolett) und andere Actinobacteria (dunkelgrün). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54936/54936fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54936/54936fig4large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/54936/54936fig5.jpg" /> Abbildung 5: cazy Annotation des Prognostizierte Proteome im festen Silage Microbiome. Venn-Diagramm der Verteilung der fünf Enzymklassen Cazy Annotationen in der vorhergesagten Proteoms von festen Silage microbiome zeigt. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54936/54936fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54936/54936fig5large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> # Raw liest </td><td rowspan="2"> # Filtered liest (gepaart) </td&gt; <td> # Filtered liest </td><td rowspan="2"> # Geflasht liest </td></tr><tr><td> (Gepaart) </td><td> (Ungepaarten) </td></tr><tr><td> 2.374.949 x2 </td><td> 231.679 x2 </td><td> 1892534 </td><td> 105343 </td></tr></tbody></table> Tabelle 1: Zusammenfassung Tabelle der Sequenzierung liest.

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Metagenomic Analysis of Silage

Metagenomics was used to investigate the microbiome of silage cattle feed. Analysis was performed by shotgun sequencing. This approach was used to characterize the composition of the microbial community within the cattle feed.

Metagenomanalyse von Silage

Metagenomics is defined as the direct analysis of deoxyribonucleic acid (DNA) purified from environmental samples and enables taxonomic identification of ...

Research

JoVE Journal

Genetics

18.1K Aufrufe.  University of Exeter. Metagenomics was used to investigate the microbiome of silage cattle feed. Analysis was performed by shotgun sequencing. This approach was used to characterize the composition of the microbial community within the cattle feed.

Serie: Metagenomic Analysis of Silage

Empirical, Metagenomic, and Computational Techniques Illuminate the Mechanisms by which Fungicides Compromise Bee Health

Growers often use fungicide sprays during bloom to protect crops against disease, which exposes bees to fungicide residues. Although considered &#34;bee-safe,&#34; there is mounting evidence that fungicide residues in pollen are associated with bee declines (for both honey and bumble bee species). While the mechanisms remain relatively unknown, researchers have speculated that bee-microbe symbioses are involved. Microbes play a pivotal role in the preservation and/or processing of pollen, which serves as nutrition for larval bees. By altering the microbial community, it is likely that fungicides disrupt these microbe-mediated services, and thereby compromise bee health. This manuscript describes the protocols used to investigate the indirect mechanism(s) by which fungicides may be causing colony decline. Cage experiments exposing bees to fungicide-treated flowers have already provided the first evidence that fungicides cause profound colony losses in a native bumble bee (Bombus impatiens). Using field-relevant doses of fungicides, a series of experiments have been developed to provide a finer description of microbial community dynamics of fungicide-exposed pollen. Shifts in the structural composition of fungal and bacterial assemblages within the pollen microbiome are investigated by next-generation sequencing and metagenomic analysis. Experiments developed herein have been designed to provide a mechanistic understanding of how fungicides affect the microbiome of pollen-provisions. Ultimately, these findings should shed light on the indirect pathway through which fungicides may be causing colony declines.

Microbial consortia within bumble bee hives enrich and preserve pollen for bee larvae. Using next generation sequencing, along with laboratory and field-based experiments, this manuscript describes protocols used to test the hypothesis that fungicide residues alter the pollen microbiome, and colony demographics, ultimately leading to colony loss.

Empirische, metagenomischen und Computertechniken beleuchten die Mechanismen, durch welche Fungizide Kompromiss Bienengesundheit

Growers often use fungicide sprays during bloom to protect crops against disease, which exposes bees to fungicide residues. Although considered ...

Forschung

Umwelt

Exploring the Root Microbiome: Extracting Bacterial Community Data from the Soil, Rhizosphere, and Root Endosphere

The intimate interaction between plant host and associated microorganisms is crucial in determining plant fitness, and can foster improved tolerance to abiotic stresses and diseases. As the plant microbiome can be highly complex, low-cost, high-throughput methods such as amplicon-based sequencing of the 16S rRNA gene are often preferred for characterizing its microbial composition and diversity. However, the selection of appropriate methodology when conducting such experiments is critical for reducing biases that can make analysis and comparisons between samples and studies difficult. This protocol describes in detail a standardized methodology for the collection and extraction of DNA from soil, rhizosphere, and root samples. Additionally, we highlight a well-established 16S rRNA amplicon sequencing pipeline that allows for the exploration of the composition of bacterial communities in these samples, and can easily be adapted for other marker genes. This pipeline has been validated for a variety of plant species, including sorghum, maize, wheat, strawberry, and agave, and can help overcome issues associated with the contamination from plant organelles.

Here, we describe a protocol to obtain amplicon sequence data of soil, rhizosphere, and root endosphere microbiomes. This information can be used to investigate the composition and diversity of plant-associated microbial communities, and is suitable for the use with a wide range of plant species.

Die Wurzel Mikrobiom zu erkunden: Extrahieren von Bakteriengemeinschaft Daten aus dem Boden, die Rhizosphäre und die Wurzel Endosphere

The intimate interaction between plant host and associated microorganisms is crucial in determining plant fitness, and can foster improved tolerance to ...

Genetik

Nanopore DNA Sequencing for Metagenomic Soil Analysis

This article describes the steps for construction of a DNA library from soil, preparation and use of the nanopore flow cell, and analysis of the DNA sequences identified using computer software. Nanopore DNA sequencing is a flexible technique that allows for rapid microbial genome sequencing to identify bacterial and viral species, to characterize bacterial strains, and to detect genetic mutations that confer resistance to antibiotics. The advantages of nanopore sequencing (NS) for life sciences include its low complexity, reduced cost, and rapid real-time sequencing of purified genomic DNA, PCR amplicons, cDNA samples, or RNA. NS is an example of "strand sequencing" which involves sequencing DNA by guiding a single stranded DNA molecule through a nanopore that is inserted into a synthetic polymer membrane. The membrane has an electrical current applied across it, so as the individual bases pass through the nanopore the electrical current is disrupted to varying degrees by the four nucleotide bases. The identification of each nucleotide occurs by detecting the characteristic modulation of the electrical current by the different bases as they pass through the nanopore. The NS system consists of a handheld, USB powered portable device and a disposable flow cell that contains a nanopore array. The portable device plugs into a standard laptop computer that reads and records the DNA sequence using computer software.

Nanopore technology for sequencing biomolecules has wide applications in the life sciences, including identification of pathogens, food safety monitoring, genomic analysis, metagenomic environmental monitoring, and characterization of bacterial antibiotic resistance. In this article, the procedure for metagenomic soil DNA sequencing for species identification using the nanopore sequencing technology is demonstrated.

Nanopore DNA-Sequenzierung für metagenomische Bodenanalyse

This article describes the steps for construction of a DNA library from soil, preparation and use of the nanopore flow cell, and analysis of the DNA ...

Single-throughput Complementary High-resolution Analytical Techniques for Characterizing Complex Natural Organic Matter Mixtures

Natural organic matter (NOM) is composed of a highly complex mixture of thousands of organic compounds which, historically, proved difficult to characterize. However, to understand the thermodynamic and kinetic controls on greenhouse gas (carbon dioxide [CO2] and methane [CH4]) production resulting from the decomposition of NOM, a molecular-level characterization coupled with microbial proteome analyses is necessary. Further, climate and environmental changes are expected to perturb natural ecosystems, potentially upsetting complex interactions that influence both the supply of organic matter substrates and the microorganisms performing the transformations. A detailed molecular characterization of the organic matter, microbial proteomics, and the pathways and transformations by which organic matter is decomposed will be necessary to predict the direction and magnitude of the effects of environmental changes. This article describes a methodological throughput for comprehensive metabolite characterization in a single sample by direct injection Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry (FTICR-MS), gas chromatography mass spectrometry (GC-MS), nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy, liquid chromatography mass spectrometry (LC-MS), and proteomics analysis. This approach results in a fully-paired dataset which improves statistical confidence for inferring pathways of organic matter decomposition, the resulting CO2 and CH4 production rates, and their responses to environmental perturbation. Herein we present results of applying this method to NOM samples collected from peatlands; however, the protocol is applicable to any NOM sample (e.g., peat, forested soils, marine sediments, etc.).

This protocol describes a single throughput for complementary analytical and omics techniques culminating in a fully-paired characterization of natural organic matter and microbial proteomics in different ecosystems. This approach permits robust comparisons for identifying metabolic pathways and transformations important for describing greenhouse gas production and predicting responses to environmental change.

Single-Durchsatz ergänzende hochauflösende Analysetechniken für die Charakterisierung von komplexen natürlichen organischen Substanz Mischungen

Natural organic matter (NOM) is composed of a highly complex mixture of thousands of organic compounds which, historically, proved difficult to ...

Evaluating the Impact of Hydraulic Fracturing on Streams using Microbial Molecular Signatures

Hydraulic fracturing (HF), commonly called &#34;fracking&#34;, uses a mixture of high-pressure water, sand, and chemicals to fracture rocks, releasing oil and gas. This process revolutionized the U.S. energy industry, as it gives access to resources that were previously unobtainable and now produces two-thirds of the total natural gas in the United States. Although fracking has had a positive impact on the U.S. economy, several studies have highlighted its detrimental environmental effects. Of particular concern is the effect of fracking on headwater streams, which are especially important due to their disproportionately large impact on the health of the entire watershed. The bacteria within those streams can be used as indicators of stream health, as the bacteria present and their abundance in a disturbed stream would be expected to differ from those in an otherwise comparable but undisturbed stream. Therefore, this protocol aims to use the bacterial community to determine if streams have been impacted by fracking. To this end, sediment, and water samples, from streams near fracking (potentially impacted) and upstream or in a different watershed of fracking activity (unimpacted) must be collected. Those samples are then subjected to nucleic acid extraction, library preparation, and sequencing to investigate microbial community composition. Correlational analysis and machine learning models can subsequently be employed to identify which features are explanative of variation in the community, as well as identification of predictive biomarkers for fracking&#39;s impact. These methods can reveal a variety of differences in the microbial communities among headwater streams, based on the proximity to fracking, and serve as a foundation for future investigations on the environmental impact of fracking activities.

Here, we present a protocol to investigate the impacts of hydraulic fracturing on nearby streams by analyzing their water and sediment microbial communities.

Bewertung der Auswirkungen von Hydraulic Fracturing auf Bäche mit mikrobiellen molekularen Signaturen

Hydraulic fracturing (HF), commonly called &#34;fracking&#34;, uses a mixture of high-pressure water, sand, and chemicals to fracture rocks, releasing oil ...

Derivatization and Separation of Barley Flour Metabolites into Four Fractions

Metabolomic Analysis of Barley by Gas Chromatography/Mass Spectrometry

Climate change increases drought risk to agriculture and impacts both food nutrient content and overall food security. Metabolomics is one way to observe and quantify the impacts of drought on grain and other agricultural products. The identified metabolites may allow for the identification of the biochemical response that allows the plant to tolerate stressful environments. The methodology presented herein allowed for the total metabolomic analysis of barley flour using gas chromatography/mass spectrometry (GC/MS). 
Barley flour metabolite extracts were fractionated into four fractions based on polarity. To allow for analysis by GC/MS, metabolites were derivatized to increase volatility and metabolite separation: fatty acids esters were derivatized into fatty acid methyl esters; sugars were oximated into their straight chain form; and metabolites with hydroxyl groups were converted to their corresponding silyl ethers. The derivatized samples were injected into the GC/MS and the generated mass spectra were used for metabolite identification by comparing the generated spectra to the National Institute of Standards and Technology (NIST) Tandem Mass Spectra library. The method described here can also be used to examine the total metabolome for other plants, furthering our understanding of the biochemical responses of stressed plants.

A method for metabolomic analysis of barley is presented. The method entails fractionation and derivatization of metabolites and analysis thereof by gas chromatography/mass spectrometry (GC/MS). Metabolomic analysis can be used to determine the effect of intercropping and drought stress on the grain.

Climate change increases drought risk to agriculture and impacts both food nutrient content and overall food security. Metabolomics is one way to observe ...

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent. In the experiment, yeast is grown for 48 hours in 1/2X YPD broth containing 3X glucose. The culture is split into a control and treated group. The experiment culture is treated with 0.5 mM H2O2 in Hanks Buffered Saline (HBSS) for 1 hour. The control culture is treated with HBSS only. Total RNA is extracted from both cultures and is converted to a biotin-labeled cRNA product through a multistep process. The final synthesis product is taken back to the UVM Microarray Core Facility and hybridized to the Affymetrix yeast GeneChips. The resulting gene expression data are uploaded into bioinformatics data analysis software.

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent.

Microarray-Analyse für Saccharomyces cerevisiae</em

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen ...

Biologie

Purifying the Impure: Sequencing Metagenomes and Metatranscriptomes from Complex Animal-associated Samples

The accessibility of high-throughput sequencing has revolutionized many fields of biology. In order to better understand host-associated viral and microbial communities, a comprehensive workflow for DNA and RNA extraction was developed. The workflow concurrently generates viral and microbial metagenomes, as well as metatranscriptomes, from a single sample for next-generation sequencing. The coupling of these approaches provides an overview of both the taxonomical characteristics and the community encoded functions. The presented methods use Cystic Fibrosis (CF) sputum, a problematic sample type, because it is exceptionally viscous and contains high amount of mucins, free neutrophil DNA, and other unknown contaminants. The protocols described here target these problems and successfully recover viral and microbial DNA with minimal human DNA contamination. To complement the metagenomics studies, a metatranscriptomics protocol was optimized to recover both microbial and host mRNA that contains relatively few ribosomal RNA (rRNA) sequences. An overview of the data characteristics is presented to serve as a reference for assessing the success of the methods. Additional CF sputum samples were also collected to (i) evaluate the consistency of the microbiome profiles across seven consecutive days within a single patient, and (ii) compare the consistency of metagenomic approach to a 16S ribosomal RNA gene-based sequencing. The results showed that daily fluctuation of microbial profiles without antibiotic perturbation was minimal and the taxonomy profiles of the common CF-associated bacteria were highly similar between the 16S rDNA libraries and metagenomes generated from the hypotonic lysis (HL)-derived DNA. However, the differences between 16S rDNA taxonomical profiles generated from total DNA and HL-derived DNA suggest that hypotonic lysis and the washing steps benefit in not only removing the human-derived DNA, but also microbial-derived extracellular DNA that may misrepresent the actual microbial profiles.

Using the cystic fibrosis airway as an example, the manuscript presents a comprehensive workflow comprising a combination of metagenomic and metatranscriptomic approaches to characterize the microbial and viral communities in animal-associated samples.

Reinigung der Unreine: Sequencing Metagenomen und Metatranscriptomes von Complex Tierassoziierte Proben

The accessibility of high-throughput sequencing has revolutionized many fields of biology. In order to better understand host-associated viral and ...

A Hybrid DNA Extraction Method for the Qualitative and Quantitative Assessment of Bacterial Communities from Poultry Production Samples

The efficacy of DNA extraction protocols can be highly dependent upon both the type of sample being investigated and the types of downstream analyses performed. Considering that the use of new bacterial community analysis techniques (e.g., microbiomics, metagenomics) is becoming more prevalent in the agricultural and environmental sciences and many environmental samples within these disciplines can be physiochemically and microbiologically unique (e.g., fecal and litter/bedding samples from the poultry production spectrum), appropriate and effective DNA extraction methods need to be carefully chosen. Therefore, a novel semi-automated hybrid DNA extraction method was developed specifically for use with environmental poultry production samples. This method is a combination of the two major types of DNA extraction: mechanical and enzymatic. A two-step intense mechanical homogenization step (using bead-beating specifically formulated for environmental samples) was added to the beginning of the &#8220;gold standard&#8221; enzymatic DNA extraction method for fecal samples to enhance the removal of bacteria and DNA from the sample matrix and improve the recovery of Gram-positive bacterial community members. Once the enzymatic extraction portion of the hybrid method was initiated, the remaining purification process was automated using a robotic workstation to increase sample throughput and decrease sample processing error. In comparison to the strict mechanical and enzymatic DNA extraction methods, this novel hybrid method provided the best overall combined performance when considering quantitative (using 16S rRNA qPCR) and qualitative (using microbiomics) estimates of the total bacterial communities when processing poultry feces and litter samples.

A novel semi-automated hybrid DNA extraction method for use with environmental poultry production samples was developed and demonstrated improvements over a common mechanical and enzymatic extraction method in terms of the quantitative and qualitative estimates of the total bacterial communities.

Ein Hybrid-DNA-Extraktionsmethode für die qualitative und quantitative Bewertung der bakteriellen Gemeinschaften aus Zucht Proben

The efficacy of DNA extraction protocols can be highly dependent upon both the type of sample being investigated and the types of downstream analyses ...

Quasi-metagenomic Analysis of Salmonella from Food and Environmental Samples

Quasi-metagenomics sequencing refers to the sequencing-based analysis of modified microbiomes of food and environmental samples. In this protocol, microbiome modification is designed to concentrate genomic DNA of a target foodborne pathogen contaminant to facilitate the detection and subtyping of the pathogen in a single workflow. Here, we explain and demonstrate the sample preparation steps for the quasi-metagenomics analysis of Salmonella enterica from representative food and environmental samples including alfalfa sprouts, ground black pepper, ground beef, chicken breast and environmental swabs. Samples are first subjected to the culture enrichment of Salmonella for a shortened and adjustable duration (4&#8211;24 h). Salmonella cells are then selectively captured from the enrichment culture by immunomagnetic separation (IMS). Finally, multiple displacement amplification (MDA) is performed to amplify DNA from IMS-captured cells. The DNA output of this protocol can be sequenced by high throughput sequencing platforms. An optional quantitative PCR analysis can be performed to replace sequencing for Salmonella detection or assess the concentration of Salmonella DNA before sequencing.

Quasi-metagenomic Analysis of Salmonella from Food and Environmental Samples

Here, we present a protocol to prepare DNA samples from food and environmental microbiomes for concerted detection and subtyping of Salmonella through quasimetagenomic sequencing. The combined use of culture enrichment, immunomagnetic separation (IMS), and multiple displacement amplification (MDA) allows effective concentration of Salmonella genomic DNA from food and environmental samples.&#160;

Metagenomanalyse von Silage

Zusammenfassung

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