Authors would like to thank Andrew Bird for the silage samples and Audrey Farbos of the Exeter Sequencing Service for her assistance in preparing DNA sequencing libraries. Exeter Sequencing Service and Computational core facilities at the University of Exeter. Medical Research Council Clinical Infrastructure award (MR/M008924/1). Wellcome Trust Institutional Strategic Support Fund (WT097835MF), Wellcome Trust Multi User Equipment Award (WT101650MA) and BBSRC LOLA award (BB/K003240/1).

1. Site Location <ol><li> Raccogliere il campione insilato da un sito appropriato, come una fattoria. Qui, l&#39;azienda si trovava in Ballydulea, Co. Cork, Irlanda (51 ° 51&#39;58.4 &quot;N 8 ° 16&#39;48.7&quot; W). </li></ol> 2. DNA Extraction NOTA: estrazione del DNA è stata effettuata utilizzando un kit commerciale seguendo le istruzioni del produttore. Un controllo negativo, che conteneva nessun campione, è stata utilizzata in tutto il metodo di preparazione della libreria. <ol><li> Aggiungere 100 - 400 mg di campione di 978 microlitri tampone fosfato di sodio e 122 microlitri di tampone di lisi suolo nei tubi di lisi forniti. </li><li> Omogeneizzare campioni ponendo le provette di lisi in omogeneizzatore per 40 s ad una velocità di 6,0 m / s. </li><li> lisati centrifugare a 14000 g per 15 minuti e trasferire il surnatante in una provetta pulita micro-centrifuga contenente 250 ml di proteine ​​precipitato Solution (PPS). Mescolare la soluzione capovolgendo 10 volte e centrifugarea 14000 xg per 5 min. </li><li> Aggiungere il surnatante a 1 ml DNA matrice vincolante in 15 mL provetta pulita. Miscelare la soluzione invertendo la provetta costantemente per 3 min. Lasciare il composto di stabilirsi per 3 minuti, poi scarta 500 ml di surnatante. Mescolare il surnatante rimanente. </li><li> Trasferire 600 microlitri della sospensione ad un filtro rotativo e centrifugare a 14000 xg per 1 min. Eliminare il filtrato e ripetere il processo con la sospensione rimanente. </li><li> Aggiungere 500 ml di tampone di lavaggio alla matrice legame al DNA all&#39;interno del filtro di spin, mescolare pipettando, quindi si centrifuga a 14000 g per 1 min. </li><li> Eliminare il filtrato e centrifugare di nuovo il filtro rotativo a 14000 g per 2 minuti al fine di garantire tutti i tampone di lavaggio viene rimosso. Asciugare il filtro rotativo a 23 C per 5 min. </li><li> Pre-caldo (70 ° C) l&#39;acqua priva di DNasi (DES) e ri-sospendere la matrice di legame al DNA in 100 ml di DES all&#39;interno del filtro rotativo. Trasferire il filtro di selezione per un ambiente pulito 1,5 ml di micro-centrifuga tuessere e centrifugare a 14000 g per 1 minuto per eluire il DNA. Conservare il DNA purificato a -20 C fino al momento ulteriori analisi. </li></ol> 3. Perline di depurazione usando il DNA Purificazione del DNA NOTA: Prima di preparazione biblioteca metagenomica il DNA estratto è stato purificato con perline di depurazione al fine di garantire un campione di DNA puro è stato ottenuto. <ol><li> Incubare le perline a 23 C per 30 minuti prima dell&#39;uso. Aggiungere 2 volumi di perline per il campione di DNA e incubare la soluzione a 23 C per 5 min. </li><li> Porre i campioni su un magnete di separazione per 5 minuti e poi scartare il surnatante. Lavare le perle due volte con 200 microlitri fresca 80% di etanolo (EtOH). Far asciugare le perle per 10 min. </li><li> Rimuovere i campioni dal magnete separazione e aggiungere 50 ml di tampone di eluizione (EB), mescolare pipettando. </li><li> Incubare la sospensione a 23 C per 5 minuti, dopo di che posizionare i campioni indietro sul magnete di separazione per 3 min. </li><li> Transfer il surnatante, che contiene il DNA, in una provetta pulita. Eliminare le perline. </li><li> Quantificare il DNA purificato di cui al punto quattro. </li></ol> 4. La quantificazione del DNA purificato NOTA: DNA purificato è stato quantificato utilizzando un fluorimetro e kit di analisi a doppia elica (dsDNA) Alta sensibilità (HS) seguendo le istruzioni del produttore. <ol><li> Preparare una soluzione di lavoro con 199: 1 rapporto di tampone di reagente. </li><li> Aggiungere 10 ml di ogni standard DNA per 190 ml di soluzione di lavoro. </li><li> Aggiungere 10 ml di DNA purificato a 190 ml di soluzione di lavoro. Il volume finale deve essere di 200 microlitri. Incubare campioni standard e di DNA a 23 C per 2 min. </li><li> Analizzare gli standard prima che i campioni di DNA sul fluorimetro utilizzando le istruzioni sullo schermo. </li></ol> 5. Shotgun Sequencing Biblioteca Preparazione NOTA: La biblioteca shotgun sequencing è stato preparato utilizzando unkit commerciale di preparazione libreria utilizzando le istruzioni del produttore. <ol><li> Diluire i campioni di DNA a 0,2 ng / mL con EB. Ogni campione che è già sotto questa concentrazione, cioè il controllo negativo, è lasciato alla sua concentrazione di corrente. </li><li> Mescolare 5 ml di DNA purificato con 10 microlitri di buffer e 5 ml mix enzima. Incubare i campioni a 55 C per 5 min. </li><li> Aggiungere 5 ml di neutralizzare buffer e incubare la soluzione a 23 C per 5 min. </li><li> Aggiungere 5 ml di ciascuno degli indici di sequenziamento specifico campione e 15 ml di PCR master mix. </li><li> In un termociclatore, incubare i campioni a 72 C per 3 minuti, 95 C per 30 s, prima di 12 cicli di 95 C per 10 s, 55 C per 30 s e 72 C per 30 s. Incubare i campioni infine a 72 C per 5 min. </li><li> Purificare il DNA preparato utilizzando la purificazione tallone come prima, ma con un eluizione finale di 30 ml di EB. </li></ol> 6. Library quantità e di verifica della qualità NOTA: La quantità e qualità delle librerie preparati sono stati valutati utilizzando un kit commerciale e strumentazione. <ol><li> Incubare i componenti del kit a 23 C per 30 minuti prima dell&#39;uso. </li><li> Aggiungere 2 ml di DNA di 2 ml di tampone e vortex per 1 min a 2000 rpm. </li><li> Centrifugare il campione per assicurarsi che sia sul fondo della provetta. </li><li> Inserire le provette dei campioni, nastro analisi e suggerimenti nello strumento, ed eseguire analisi come indicato dal software. </li></ol> Il sequenziamento del DNA 7. <ol><li> Trasferire i preparati e quantificabili biblioteche sequenziamento del DNA di campioni ad un servizio di sequenziamento e la sequenza con 300 pb fine accoppiato sequenziamento 45. </li></ol> 8. L&#39;analisi di sequenza di dati grezzi NOTA: I comandi per ciascun programma usando un sistema operativo Linux sono mostrate sotto dello scalino protocollo. La conduttura utilizzata per sanalisi dei dati equence è mostrato in Figura 1. I programmi devono essere installati dall&#39;utente prima dell&#39;analisi. Questo processo deve essere eseguito singolarmente per ogni campione. <ol><li> Analizzare e visualizzare i dati di sequenza del DNA utilizzando FastQC 46 digitando alla riga di comando / path-to-file / fastqc, seguito dal avanti e indietro cruda legge raw_read2.fastq raw_read1.fastq. </li><li> Specificare una cartella di output digitando output_fastqc -o e il formato di file dei file di lettura prime da parte FASTQ -f. </li><li> Visualizzare il file di output (Figura 2). path-to-file / fastqc raw_read1.fastq raw_read2.fastq -o output_directory -f FASTQ. </li></ol> 9. Qualità controllo di guarnizione e filtraggio sequenza di dati <ol><li> Eseguire il programma di rifilatura, Trimmomatic 28 digitando nella riga di comando java -jar / path-to-file / trimmomatic-0.35.jar. </li><li> Specificare i file sono accoppiati i file finali digitando &#39;PE&#39;. Stato che il 16 pr centraleunità ocessing (CPU) devono essere utilizzati dal programma digitando -threads 16. </li><li> Elencare i due file per verificare QC digitando i nomi dei avanti prima e retromarcia legge. Il prefisso dei file di output viene determinata digitando insilato -baseout. </li><li> Definire le opzioni per il programma digitando ILLUMINACLIP: NexteraPE-PE.fa: 2: 30: 10 LEADER: 3 TRAILING: 3 SLIDINGWINDOW: 4: 20 CROP: 200 HEADCROP: 15 LUNMIN: 36. </li><li> Una volta completato, analizzare le sequenze tagliate utilizzando FastQC come prima e confrontare l&#39;output per i dati della sequenza prime per garantire il taglio è stato eseguito con successo. NOTA: Il software, Trimmomatic, rifilato legge ulteriormente rimuovendo leader di bassa qualità o basi N (al di sotto di qualità 3), la rimozione di uscita bassa qualità o basi N (al di sotto di qualità 3) e la scansione di ogni letto con un 4-base ampia finestra scorrevole. I parametri sono stati fissati per il taglio quando la qualità media per di base scende al di sotto di 20 e poi a rilasciare qualsiasi legge di sotto di 36 basi. Infine, 15 basi sono state tagliate from la testa di ogni legge e legge sono stati tagliati per mantenere 200 basi fin dall&#39;inizio della lettura. Questa fase finale è stata eseguita per superare alcuni problemi di qualità durante la sequenziazione lungo (&gt; 200 bp) legge. Questi possono essere regolati per i campioni specifici 28. java -jar /path-to-file/trimmomatic-0.35.jar PE -threads 16 raw_read1.fastq raw_read2.fastq -baseout insilato ILLUMINACLIP: NexteraPE-PE.fa: 2: 30: 10 LEADER: 3 TRAILING: 3 SLIDINGWINDOW: 4 : 20 CROP: 200 HEADCROP: 15 LUNMIN: 36 </li></ol> 10. Assemblea metagenoma <ol><li> Unire il spaiato, tagliati legge digitando cat seguito dal spaiato legge; silage_read1_unpaired.fastq silage_read2_unpaired.fastq. Scrivere i file in un nuovo file digitando&gt; silage_merged_unpaired.fastq cat silage_read1_unpaired.fastq silage_read2_unpaired.fastq&gt; silage_merged_unpaired.fastq </li><li> Per de novo assemblare il DNA sequenziato, usare picche (St. Petersburg genoma assembler) 30 digitando / path-to-file / spades.py. Specifica che 16 CPU devono essere utilizzati digitando -t 16 e che il parametro metagenomic dovrebbe applicata digitando --meta. </li><li> Identificare il rifilato in avanti si legge utilizzando -1 silage_read1_paired.fastq e il contrario si legge da -2 silage_read2_paired.fastq. Il spaiato fusione legge sono specificati dal silage_merged_unpaired.fastq -s. </li><li> Definire la cartella di output digitando -o silage_spades. path-to-file / spades.py -t 16 --meta -1 -2 silage_read1_paired.fastq silage_read2_paired.fastq -s silage_merged_unpaired.fastq -o silage_spades </li></ol> 11. associati-end Leggi Overlap <ol><li> Unisci coppie di sequenze di DNA letture di Uso del flash (rapido Lunghezza Regolazione del corto letture) 29 digitando nella riga di comando / path-to-file / flash. Specificare che 16 CPU dovrebbero essere usati usando -t 16 e il prefisso di uscita digitando -o insilati. </li><li> Identificare guarnite legge digitando silage_trimmed_R1.fastq silage_trimmed_R2.fastq path-to-file / flash -t 16 -o lampeggiavano silage_read2_paired.fastq silage_read1_paired.fastq </li></ol> 12. Classificazione tassonomica <ol><li> Tipo / path-to-file / kraken e specificare il database digitando --db / path-to-file / standard. </li><li> Definire che 16 CPU dovrebbero essere utilizzati digitando --threads 16 e individuare una cartella di output utilizzando --output FLASHed_silage_extendedFrags_kraken.txt. Digitare il nome del file di input; FLASHed_silage.extendedFrags.fastq path-to-file / standard di --db kraken --thread 16 --output FLASHed_silage_extendedFrags_kraken.txt FLASHed_silage.extendedFrags.fastq NOTA: Classificazione degli scaffold sequenza del DNA assemblati utilizzando Kraken 7 è stata completata contro il più recente, database standard Kraken che conteneva tutte le sequenze del genoma procariote disponibili. </li><li> colonne di trasferimento 2 e 3 del file di output e in un nuovo file digitando taglio -f2,3 FLASHed_silage_extendedFrags_kraken.txt&gt; FLASHed_silage_extendedFrags_kraken.int </li><li&gt; Aprire il file di output nel browser web. tagliare -f2,3 FLASHed_silage_extendedFrags_kraken.txt&gt; FLASHed_silage_extendedFrags_kraken.int </li><li> Importare il nuovo file in Krona 12 digitando ktImportTaxonomy. Specificare il file di input digitando FLASHed_silage_extendedFrags_kraken.int. Identificare il file di output digitando -o FLASHed_silage_extendedFrags_kraken.out.html. path-to-file / ktImportTaxonomy FLASHed_silage_extendedFrags_kraken.int -o FLASHed_silage_extendedFrags_kraken.out.html </li></ol> 13. annotazione funzionale <ol><li> Vai alla MG-RAST 47 siti, http://metagenomics.anl.gov/. Registrati come nuovo utente, se richiesto. Dopo il login, fare clic sul pulsante &quot;Upload&quot;. Carica i ponteggi montati dal punto 10. </li><li> Una volta che i file sono caricati, cliccare su &quot;Invia&quot; e seguire le istruzioni e attendere il completamento dell&#39;analisi. </li><li> Dopo l&#39;analisi è completa, visualizzare il link inviato via email da MG-RAST, o, in alternativa, cliccare su &quot;Progress&quot;. C&#39;è un elenco dei lavori completati. Fare clic sul relativo ID del processo e poi sul link alla pagina &quot;download&quot;. </li><li> Nella pagina di download, sotto il titolo &quot;Protein Clustering 90%&quot;, fai clic sul pulsante di proteine ​​per scaricare il file prevedeva proteina, 550.cluster.aa90.faa. </li><li> Per classificare le proteine come putativamente appartenenti a una particolare classe di enzimi cazy, confrontare le proteine scaricato al database Cazy 48. Scarica il database enzimi di carboidrati-attivi (cazy) dai file sono: AA.zip, CE.zip, GH.zip, GT.zip e PL.zip. Questi file rappresentano le seguenti classi di enzimi, rispettivamente: Attività ausiliari (AA), carboidrati esterasi (CE), glicoside idrolasi (GH), glicosil transferasi (GT) e polisaccaride liasi (PL). </li><li> Decomprimere i file di database e annotare le proteine ​​determinando la somiglianza proteina alle proteine ​​del database cazy utilizzando il Algor USEARCH UBLASTithm 49. Per utilizzare un ciclo bash (for i in * .txt) per scorrere la 5 database di tipo file .txt &quot;for i in * .txt; fare&quot;. </li><li> Eseguire USEARCH digitando / path-to-file / usearch8 con il parametro -ublast al fine di utilizzare l&#39;algoritmo ublast. Quindi digitare il nome del file di sequenza della proteina scaricato da MG-RAST, &quot;mgmXXXXXX.3.550.cluster.aa90.faa&quot;. </li><li> Per indicare il file del database da usare tipo &quot;-db $ i&quot; e per specificare la soglia di E-valore a 1e -5, digitare &quot;-evalue 1e-5&quot;. </li><li> Per terminare la ricerca dopo la scoperta di una sequenza bersaglio e quindi classificare tale sequenza proteica come appartenente alla classe enzima bersaglio, ad esempio GH, tipo &quot;-masaccepts 1&quot;. </li><li> Per definire che 16 CPU dovrebbero essere usati tipo &quot;-threads 16&quot; e per specificare il formato del file di output come tipo di testo &quot;-blast6out&quot; ATAB separati. Per identificare il tipo di file di output &quot;$ i.ublast&quot;. Per terminare il ciclo bash, tipo &quot;; fatto&quot; for i in * .txt; fare / path-to-file / usearch8 -ublast ../mgmXXXXXX.3.550.cluster.aa90.faa -db $ i -evalue 1e-5 -maxaccepts 1 -threads 16 -blast6out $ i.ublast; fatto </li></ol> 14. Visualizing Cazy annotazione <ol><li> Per visualizzare l&#39;output l&#39;annotazione cazy come un diagramma di Venn, generare elenchi di ID di proteine ​​per ogni classe di enzimi utilizzando un ciclo bash. Tipo &quot;for i in * .ublast; fare&quot;. </li><li> Per trasferire la colonna 1 dal file di output e in un nuovo file, digitare &quot;cat $ i | cut -f 1&gt; $ i.list&quot;. </li><li> Terminare il loop e tipo &quot;, fatto&quot;. </li><li> Aprire i file .list in un editor di testo. Vai al sito, selezionare il numero di set come 5 e incollare il contenuto di ogni file di elenco in una scatola separata. Scarica lo schema risultante come file .SVG. for i in * .ublast; fare cat $ i | tagliare -f 1&gt; $ i.list; fatto </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Mentre un analisi in silico può dare una visione eccellente alle comunità microbiche che sono presenti all&#39;interno di campioni ambientali, è fondamentale che le classificazioni tassonomiche dimostrato essere eseguita in associazione con relativi controlli e che una adeguata profondità di sequenziamento è stato raggiunto per catturare tutta popolazione presente 51. Con qualsiasi analisi computazionale, ci sono molti percorsi per raggiungere un obiettivo simile. I metodi che abbiamo usato in questo studio sono esempi di adatti e semplici metodi, che sono stati portati insieme per realizzare una serie di analisi sul microbiome insilato. Una varietà e un numero sempre crescente di strumenti di bioinformatica e le tecniche sono disponibili per analizzare i dati metagenomic, per esempio Phylosift 8 e MetaPhlAn2 52, e che devono essere valutati prima l&#39;indagine per la loro rilevanza per il campione e l&#39;analisi required 53. metodi di analisi metagenomiche sono limitati dai database per disponibili per la classificazione, la profondità sequenziamento e la qualità di sequenziamento. L&#39;elaborazione bioinformatica dimostrato qui è stata effettuata su un alto Macchina motorizzata locale; tuttavia i sistemi cloud-based sono inoltre disponibili. Questi servizi basati su cloud consentono per il noleggio della necessaria potenza di calcolo senza avere l&#39;investimento ad alto costo di un adeguato potente workstation locale. Un potenziale applicazione di questo metodo potrebbe essere quello di valutare insilato prima del suo utilizzo in agricoltura per garantire che nessun batteri potenzialmente nocivi sono presenti quindi impedendo loro di entrare nella catena alimentare.

Metagenomica è l&#39;analisi diretta del DNA purificato da comunità biologiche trovate all&#39;interno di campioni ambientali 1 ed è stato originariamente utilizzato per rilevare i batteri non coltivabili si trovano nei sedimenti 2. Metagenomics è stato ampiamente utilizzato per numerose applicazioni, come identificare microbiome umano 3, classificando popolazioni microbiche nell&#39;oceano 4 ed anche per l&#39;analisi delle comunità batteriche che si sviluppano su macchine da caffè 5. L&#39;introduzione di tecnologie di sequenziamento di nuova generazione ha portato una maggiore produttività e di uscita sequenziamento. Di conseguenza, sequenziamento del DNA è diventato più economico 6 e la profondità di sequenziamento che può essere eseguita è notevolmente aumentata, consentendo metagenomics diventare un potente strumento analitico. Miglioramenti &quot;front-end&quot; nella pratica, aspetto molecolare di sequenziamento metagenomica hanno guidato la crescita della astrumenti di bioinformatica silico disponibili per la classificazione tassonomica 7-9, annotazione funzionale 10,11 e 12,13 rappresentazione visiva dei dati di sequenza del DNA. Il crescente numero di disponibili, sequenziato procariote ed eucariote 14 genomi permette ulteriormente la precisione nella classificazione delle comunità microbiche, che sono sempre eseguite con un database di riferimento &quot;back-end&quot; dei genomi sequenziati 15. Due approcci principali possono essere adottati per l&#39;analisi metagenomica. Il metodo più convenzionale è l&#39;analisi del gene 16S rRNA regione codificante del genoma batterico. La 16S rRNA è altamente conservata tra le specie procarioti, ma presenta nove regioni iper-variabile (V1 - V9), che può essere sfruttata per l&#39;identificazione di specie 16. L&#39;introduzione di sequenziamento più (≤ 300 bp fine accoppiato) consentito per l&#39;analisi di sequenze di DNA che abbracciano due regioni iper-variabili, in particolareV3 - regione V4 17. I progressi nelle altre tecnologie di sequenziamento, come Oxford Nanopore 18 e PacBIO 19, permettono l&#39;intero gene 16S rRNA da sequenziare contiguo. Mentre librerie basate 16S rDNA forniscono un approccio mirato per l&#39;identificazione delle specie e consentono il rilevamento di basso numero di copie di DNA che si trova naturalmente all&#39;interno di campioni purificati, librerie shotgun sequencing consentono l&#39;individuazione di specie che possono contenere regioni del DNA che non sono né amplifiable dai 16S rRNA sequenze marcatore primers utilizzati, o perché le differenze tra la sequenza template e la sequenza di amplificazione Primer sono troppo grandi 20,21. Inoltre, anche se le DNA polimerasi hanno una elevata fedeltà della replicazione del DNA, errori base possono verificarsi comunque durante l&#39;amplificazione PCR e questi errori incorporati possono causare errata classificazione di specie 22 originario. Distorsioni nel amplificazione del modello ssPossono verificarsi anche influenze; sequenze di DNA con un alto contenuto di GC possono essere sotto rappresentato nella piscina amplicone finale 23 e allo stesso modo le modifiche di base innaturali, come la timina glicole, in grado di fermare la DNA polimerasi provocando fallimenti l&#39;amplificazione di sequenze di DNA 24. Al contrario, una libreria di DNA sequenziamento shotgun è una libreria di DNA che è stato preparato utilizzando tutto il DNA purificato che è stato estratto da un campione e successivamente frammentata in lunghezze di catena di DNA più brevi prima della preparazione per il sequenziamento. Classificazione tassonomica di sequenze di DNA generati dal sequenziamento shotgun è più accurato se confrontato 16S rRNA amplicone sequenziamento 25, anche se il costo finanziario necessario per raggiungere una profondità di sequenziamento affidabile è maggiore di quella di amplicone sequenziamento 26. Il vantaggio principale di shotgun sequencing metagenomica è che le regioni in sequenza dei vari genomi del campione sono disponibili per il gene prospezione una volta che sono statiè stato tassonomicamente classificato 27. i dati di sequenza metagenomic viene analizzato da una gamma sempre crescente di strumenti bioinformatici. Questi strumenti sono in grado di eseguire una grande varietà di applicazioni, per esempio, analisi di controllo della qualità dei dati di sequenza grezzi 28, sovrapposti di estremità accoppiati legge 29, de novo assemblaggio della sequenza legge al contig e ponteggi 30,31, classificazione tassonomica e visualizzazione di sequenza di letture e assemblato sequenze 7,12,32,33 e l&#39;annotazione funzionale delle sequenze assemblate 34,35. Insilato, prodotto dagli agricoltori di tutto il mondo a partire da cereali fermentati come il mais (Zea mays), viene prevalentemente utilizzato come mangime per il bestiame. Insilato è trattata con la sp batterio Lactobacillus. per aiutare la fermentazione 36, ma fino ad oggi, non vi è una conoscenza limitata delle altre popolazioni microbiche trovate in insilato. il enzimaticiprocesso n può portare a microrganismi indesiderati e potenzialmente nocivi diventando prevalente all&#39;interno del insilato 37. Oltre a lieviti e muffe, batteri sono particolarmente adattabile all&#39;ambiente anaerobica fermentazione insilati e sono più frequentemente associati a malattie del bestiame piuttosto che la degradazione della insilati 38. I batteri dell&#39;acido butirrico possono essere inavvertitamente aggiunti dal suolo rimane durante il riempimento dei silos insilato e sono in grado di convertire l&#39;acido lattico, un prodotto di digestione anaerobica, acido butirrico, aumentando così il pH della insilati 39. Questo aumento del pH può portare ad un aumento nei batteri alterativi che normalmente sarebbe in grado di sostenere la crescita in ottimali condizioni di fermentazione di insilato 38. Clostridium spp. , Listeria spp. e Bacillus spp. sono di particolare interesse, soprattutto in insilato per l&#39;alimentazione del bestiame da latte, come le spore batteriche che sono sopravvissuti distuointestinal tratto 40 può entrare nella catena alimentare, portare a deterioramento degli alimenti e, in rari casi, di animali e di decessi umani 37,39,41-44. Inoltre, mentre è difficile stimare l&#39;esatto impatto economico trattamento veterinario e zootecnico perdita causata da insilato deterioramento, è probabile che sia dannoso per una fattoria se un focolaio era a verificarsi. Si ipotizza che, utilizzando un approccio di metagenomica possiamo classificare le popolazioni microbiche che sono presenti nei campioni insilati e, inoltre, di identificare le comunità microbiche associate con insilato deterioramento che, a sua volta, potenzialmente avere un effetto negativo sul bestiame, consentendo azioni correttive per essere presa prima insilato deve essere utilizzato come fonte di cibo.

<table><tbody><tr><td>FastDNA SPIN Kit for Soil</td><td>MP Bio</td><td>116560200</td><td>DNA Extraction</td></tr><tr><td>DNA FastPrep</td><td>MP Bio</td><td>116004500</td><td>DNA Extraction</td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP beads</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63880</td><td>DNA Purification</td></tr><tr><td>Elution Buffer</td><td>Qiagen</td><td>19806</td><td>DNA Purification</td></tr><tr><td>Qubit Fluorometer</td><td>Thermo Fisher</td><td>Q33216</td><td>DNA Quantification</td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td><td>Thermo Fisher</td><td>Q32854</td><td>DNA Quantification</td></tr><tr><td>Nextera XT DNA Library Prep Kit</td><td>Illumina</td><td>FC-131-1024</td><td>Library Preparation</td></tr><tr><td>Nextera XT Index Kit</td><td>Illumina</td><td>FC-131-1001</td><td>Library Preparation</td></tr><tr><td>TapeStation 2200</td><td>Agilent</td><td>G2964AA</td><td>DNA Quantification</td></tr><tr><td>HS D100 ScreenTape</td><td>Agilent</td><td>5067-5584</td><td>DNA Quantification</td></tr><tr><td>HS D100 ScreenTape Reagents</td><td>Agilent</td><td>5067-5585</td><td>DNA Quantification</td></tr><tr><td>TapeStation Tips</td><td>Agilent</td><td>5067-5153</td><td>DNA Quantification</td></tr><tr><td>TapeStation Tubes</td><td>Agilent</td><td>401428 and 401425</td><td>DNA Quantification</td></tr><tr><td>HiSeq 2500</td><td>Illumina</td><td></td><td>DNA Sequencing - provided by a sequencing service</td></tr><tr><td>High Power Analysis Workstation</td><td>Various</td><td></td><td>Local or cloud based, user preferred system</td></tr></tbody></table>

metagenomic analysis of silage

Metagenomics is defined as the direct analysis of deoxyribonucleic acid (DNA) purified from environmental samples and enables taxonomic identification of the microbial communities present within them. Two main metagenomic approaches exist; sequencing the 16S rRNA gene coding region, which exhibits sufficient variation between taxa for identification, and shotgun sequencing, in which genomes of the organisms that are present in the sample are analyzed and ascribed to "operational taxonomic units"; species, genera or families depending on the extent of sequencing coverage. 
In this study, shotgun sequencing was used to analyze the microbial community present in cattle silage and, coupled with a range of bioinformatics tools to quality check and filter the DNA sequence reads, perform taxonomic classification of the microbial populations present within the sampled silage, and achieve functional annotation of the sequences. These methods were employed to identify potentially harmful bacteria that existed within the silage, an indication of silage spoilage. If spoiled silage is not remediated, then upon ingestion it could be potentially fatal to the livestock.

Prima di elaborazione bioinformatica, sequenza prime letture sono stati tagliati e gli adattatori sono stati rimossi utilizzando il software Trimmomatic 28. Dopo la fase di taglio e filtrazione, il numero di letture è stato ridotto al 50% della sequenza legge (Tabella 1). Il punteggio medio di base Phred era&gt; 30 dopo il controllo di qualità (Figura 2). Coppie di sequenze di DNA che avevano regioni sovrapposte sono state fuse con il software Flash 29 per generare singolo più si legge, non si sovrappongono letture di stati tenuti in un file separato. 45.47% legge (105.343) combinato con successo. A seguito della sovrapposizione di legge utilizzando Flash di legge, i frammenti estesi risultanti sono stati sottoposti batterica classificazione tassonomica utilizzando il software Kraken 7 e sono stati successivamente visualizzati con il software di Corona (Figura 3). <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; La maggior parte delle specie batteriche presenti nel metagenome insilati si trovano entro 4 phyla procariotica: Firmicutes (34%), Actinobacteria (28%), Proteobacteria (27%) e Bacteroidetes (7%) . La distribuzione delle classi presenti all&#39;interno di questi phyla può essere visto in Figura 4. La specie più abbondante nel metagenoma erano Lactobacillus spp. (24%; Firmicutes), Corynebacterium spp. (8%; Actinobacteria), Propionibacterium spp. (3%; Actinobacteria) e Prevotella spp. (3%; Bacteroidetes). sono state osservate anche specie importanti per la salute degli animali e implicati nella malattia; Clostridium spp. (1%) Bacillus spp. (0,6%), Listeria spp. (0,2%) sono stati previsto per essere presenti nel campione insilato. annotazione funzionale è stata eseguita su assemblato legge. Il metagenoma è stato assemblato utilizzando l&#39;assemblatore picche 30 utilizzando il rifilato e filtrataabbinato-end e spaiato letture di generare 92,284 ponteggi. Al fine di individuare cellulasi, le proteine ​​sono stati previsti con MG-RAST e annotati utilizzando il database di enzimi di carboidrati-attivi (Cazy). Dei 97,562 proteine previste, 6357 sono stati annotati come un enzima carboidrato-attiva putative in una delle cinque classi di enzimi che compongono il database cazy (Figura 5). I risultati sono stati visualizzati come un diagramma di Venn utilizzando il software InteractiVenn 50 che mostra la distribuzione delle annotazioni di proteine, tra cui quelli contenenti più di una classe di enzimi cazy annotazione. Di questi, 3861 sono stati previsti per avere attività idrolasi glicoside e sarà ulteriormente caratterizzato in laboratorio per confermare la funzione. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54936/54936fig1.jpg" /> Figura 1: bioinformatica Metagenomica Pipeline per l&#39;Analisi di insilati. Due approcci principali eranoutilizzato per indagare il microbioma di insilati, classificazione tassonomica e annotazione funzionale. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54936/54936fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/54936/54936fig2.jpg" /> Figura 2: Qualità Sequenza Per-base Prima e dopo il taglio e rimozione adattatore. La trama di qualità sequenza per-base dalla FASTQC mostra il punteggio medio Phred per tutta la lunghezza della sequenza di legge di controllo pre e post-qualità. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54936/54936fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54936/54936fig3.jpg" /> Figura 3: tassonomica Classificazione del batterica Microbiome di insilati Solid. Classificazione della sequenza tagliati e sovrapposti legge dal FLASH è stata effettuata utilizzando Kraken 7 e successivamente visualizzati con corona. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54936/54936fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54936/54936fig4.jpg" /> Figura 4: tassonomica Classe Distribuzione del 4 Phyla più abbondante nel batterica Microbiome di insilati Solid. La percentuale di ciascuna classe di batteri all&#39;interno delle quattro più abbondante phyla. Firmicutes: clostridi (rosso) e bacilli (blu scuro); Proteobacteria: Delta / Epsilon (rosa), alfa (azzurro), gamma (arancione) e beta (turchese); Bacteroidetes: Flavobacteriia (blu scuro) e Bacteroidia(verde pallido); Actinobacteria: Coriobacteriia (viola scuro) e altri Actinobacteria (verde scuro). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54936/54936fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/54936/54936fig5.jpg" /> Figura 5: cazy Annotazione del proteoma prevista nel solido insilato Microbiome. diagramma di Venn che mostra la distribuzione delle cinque classi di enzimi di annotazioni cazy nel proteoma previsto di microbiome insilato solido. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54936/54936fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> # Raw legge </td><td rowspan="2"> # Filtrata legge (in coppia) </td&gt; <td> # Filtrato legge </td><td rowspan="2"> # Lampeggiavano legge </td></tr><tr><td> (Accoppiato) </td><td> (Spaiato) </td></tr><tr><td> 2.374.949 x2 </td><td> 231.679 x2 </td><td> 1.892.534 </td><td> 105.343 </td></tr></tbody></table> Tabella 1: Tabella riassuntiva dei Sequencing Legge.

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Metagenomic Analysis of Silage

Metagenomics was used to investigate the microbiome of silage cattle feed. Analysis was performed by shotgun sequencing. This approach was used to characterize the composition of the microbial community within the cattle feed.

L&#39;analisi metagenomica di insilato

Metagenomics is defined as the direct analysis of deoxyribonucleic acid (DNA) purified from environmental samples and enables taxonomic identification of ...

Research

JoVE Journal

Genetics

18.1K Views.  University of Exeter. Metagenomics was used to investigate the microbiome of silage cattle feed. Analysis was performed by shotgun sequencing. This approach was used to characterize the composition of the microbial community within the cattle feed.

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Empirical, Metagenomic, and Computational Techniques Illuminate the Mechanisms by which Fungicides Compromise Bee Health

Growers often use fungicide sprays during bloom to protect crops against disease, which exposes bees to fungicide residues. Although considered &#34;bee-safe,&#34; there is mounting evidence that fungicide residues in pollen are associated with bee declines (for both honey and bumble bee species). While the mechanisms remain relatively unknown, researchers have speculated that bee-microbe symbioses are involved. Microbes play a pivotal role in the preservation and/or processing of pollen, which serves as nutrition for larval bees. By altering the microbial community, it is likely that fungicides disrupt these microbe-mediated services, and thereby compromise bee health. This manuscript describes the protocols used to investigate the indirect mechanism(s) by which fungicides may be causing colony decline. Cage experiments exposing bees to fungicide-treated flowers have already provided the first evidence that fungicides cause profound colony losses in a native bumble bee (Bombus impatiens). Using field-relevant doses of fungicides, a series of experiments have been developed to provide a finer description of microbial community dynamics of fungicide-exposed pollen. Shifts in the structural composition of fungal and bacterial assemblages within the pollen microbiome are investigated by next-generation sequencing and metagenomic analysis. Experiments developed herein have been designed to provide a mechanistic understanding of how fungicides affect the microbiome of pollen-provisions. Ultimately, these findings should shed light on the indirect pathway through which fungicides may be causing colony declines.

Microbial consortia within bumble bee hives enrich and preserve pollen for bee larvae. Using next generation sequencing, along with laboratory and field-based experiments, this manuscript describes protocols used to test the hypothesis that fungicide residues alter the pollen microbiome, and colony demographics, ultimately leading to colony loss.

Empirica, metagenomica e tecniche computazionali illuminano i meccanismi attraverso i quali salute delle API di fungicidi compromesso

Growers often use fungicide sprays during bloom to protect crops against disease, which exposes bees to fungicide residues. Although considered ...

Ricerca

Ambiente

Exploring the Root Microbiome: Extracting Bacterial Community Data from the Soil, Rhizosphere, and Root Endosphere

The intimate interaction between plant host and associated microorganisms is crucial in determining plant fitness, and can foster improved tolerance to abiotic stresses and diseases. As the plant microbiome can be highly complex, low-cost, high-throughput methods such as amplicon-based sequencing of the 16S rRNA gene are often preferred for characterizing its microbial composition and diversity. However, the selection of appropriate methodology when conducting such experiments is critical for reducing biases that can make analysis and comparisons between samples and studies difficult. This protocol describes in detail a standardized methodology for the collection and extraction of DNA from soil, rhizosphere, and root samples. Additionally, we highlight a well-established 16S rRNA amplicon sequencing pipeline that allows for the exploration of the composition of bacterial communities in these samples, and can easily be adapted for other marker genes. This pipeline has been validated for a variety of plant species, including sorghum, maize, wheat, strawberry, and agave, and can help overcome issues associated with the contamination from plant organelles.

Here, we describe a protocol to obtain amplicon sequence data of soil, rhizosphere, and root endosphere microbiomes. This information can be used to investigate the composition and diversity of plant-associated microbial communities, and is suitable for the use with a wide range of plant species.

Esplorare il microbioma radice: estrazione dei dati di comunità batteriche dal suolo e la rizosfera radice Endosphere

The intimate interaction between plant host and associated microorganisms is crucial in determining plant fitness, and can foster improved tolerance to ...

Genetica

Nanopore DNA Sequencing for Metagenomic Soil Analysis

This article describes the steps for construction of a DNA library from soil, preparation and use of the nanopore flow cell, and analysis of the DNA sequences identified using computer software. Nanopore DNA sequencing is a flexible technique that allows for rapid microbial genome sequencing to identify bacterial and viral species, to characterize bacterial strains, and to detect genetic mutations that confer resistance to antibiotics. The advantages of nanopore sequencing (NS) for life sciences include its low complexity, reduced cost, and rapid real-time sequencing of purified genomic DNA, PCR amplicons, cDNA samples, or RNA. NS is an example of "strand sequencing" which involves sequencing DNA by guiding a single stranded DNA molecule through a nanopore that is inserted into a synthetic polymer membrane. The membrane has an electrical current applied across it, so as the individual bases pass through the nanopore the electrical current is disrupted to varying degrees by the four nucleotide bases. The identification of each nucleotide occurs by detecting the characteristic modulation of the electrical current by the different bases as they pass through the nanopore. The NS system consists of a handheld, USB powered portable device and a disposable flow cell that contains a nanopore array. The portable device plugs into a standard laptop computer that reads and records the DNA sequence using computer software.

Nanopore technology for sequencing biomolecules has wide applications in the life sciences, including identification of pathogens, food safety monitoring, genomic analysis, metagenomic environmental monitoring, and characterization of bacterial antibiotic resistance. In this article, the procedure for metagenomic soil DNA sequencing for species identification using the nanopore sequencing technology is demonstrated.

Sequenziamento del DNA nanoporo per analisi Metagenomica del suolo

This article describes the steps for construction of a DNA library from soil, preparation and use of the nanopore flow cell, and analysis of the DNA ...

Single-throughput Complementary High-resolution Analytical Techniques for Characterizing Complex Natural Organic Matter Mixtures

Natural organic matter (NOM) is composed of a highly complex mixture of thousands of organic compounds which, historically, proved difficult to characterize. However, to understand the thermodynamic and kinetic controls on greenhouse gas (carbon dioxide [CO2] and methane [CH4]) production resulting from the decomposition of NOM, a molecular-level characterization coupled with microbial proteome analyses is necessary. Further, climate and environmental changes are expected to perturb natural ecosystems, potentially upsetting complex interactions that influence both the supply of organic matter substrates and the microorganisms performing the transformations. A detailed molecular characterization of the organic matter, microbial proteomics, and the pathways and transformations by which organic matter is decomposed will be necessary to predict the direction and magnitude of the effects of environmental changes. This article describes a methodological throughput for comprehensive metabolite characterization in a single sample by direct injection Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry (FTICR-MS), gas chromatography mass spectrometry (GC-MS), nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy, liquid chromatography mass spectrometry (LC-MS), and proteomics analysis. This approach results in a fully-paired dataset which improves statistical confidence for inferring pathways of organic matter decomposition, the resulting CO2 and CH4 production rates, and their responses to environmental perturbation. Herein we present results of applying this method to NOM samples collected from peatlands; however, the protocol is applicable to any NOM sample (e.g., peat, forested soils, marine sediments, etc.).

This protocol describes a single throughput for complementary analytical and omics techniques culminating in a fully-paired characterization of natural organic matter and microbial proteomics in different ecosystems. This approach permits robust comparisons for identifying metabolic pathways and transformations important for describing greenhouse gas production and predicting responses to environmental change.

Singolo-velocità effettiva complementari ad alta risoluzione tecniche analitiche per la caratterizzazione di miscele complesse di sostanza organica naturale

Natural organic matter (NOM) is composed of a highly complex mixture of thousands of organic compounds which, historically, proved difficult to ...

Evaluating the Impact of Hydraulic Fracturing on Streams using Microbial Molecular Signatures

Hydraulic fracturing (HF), commonly called &#34;fracking&#34;, uses a mixture of high-pressure water, sand, and chemicals to fracture rocks, releasing oil and gas. This process revolutionized the U.S. energy industry, as it gives access to resources that were previously unobtainable and now produces two-thirds of the total natural gas in the United States. Although fracking has had a positive impact on the U.S. economy, several studies have highlighted its detrimental environmental effects. Of particular concern is the effect of fracking on headwater streams, which are especially important due to their disproportionately large impact on the health of the entire watershed. The bacteria within those streams can be used as indicators of stream health, as the bacteria present and their abundance in a disturbed stream would be expected to differ from those in an otherwise comparable but undisturbed stream. Therefore, this protocol aims to use the bacterial community to determine if streams have been impacted by fracking. To this end, sediment, and water samples, from streams near fracking (potentially impacted) and upstream or in a different watershed of fracking activity (unimpacted) must be collected. Those samples are then subjected to nucleic acid extraction, library preparation, and sequencing to investigate microbial community composition. Correlational analysis and machine learning models can subsequently be employed to identify which features are explanative of variation in the community, as well as identification of predictive biomarkers for fracking&#39;s impact. These methods can reveal a variety of differences in the microbial communities among headwater streams, based on the proximity to fracking, and serve as a foundation for future investigations on the environmental impact of fracking activities.

Here, we present a protocol to investigate the impacts of hydraulic fracturing on nearby streams by analyzing their water and sediment microbial communities.

Valutazione dell'impatto della fratturazione idraulica sui flussi utilizzando le firme molecolari microbiche

Hydraulic fracturing (HF), commonly called &#34;fracking&#34;, uses a mixture of high-pressure water, sand, and chemicals to fracture rocks, releasing oil ...

Derivatization and Separation of Barley Flour Metabolites into Four Fractions

Metabolomic Analysis of Barley by Gas Chromatography/Mass Spectrometry

Climate change increases drought risk to agriculture and impacts both food nutrient content and overall food security. Metabolomics is one way to observe and quantify the impacts of drought on grain and other agricultural products. The identified metabolites may allow for the identification of the biochemical response that allows the plant to tolerate stressful environments. The methodology presented herein allowed for the total metabolomic analysis of barley flour using gas chromatography/mass spectrometry (GC/MS). 
Barley flour metabolite extracts were fractionated into four fractions based on polarity. To allow for analysis by GC/MS, metabolites were derivatized to increase volatility and metabolite separation: fatty acids esters were derivatized into fatty acid methyl esters; sugars were oximated into their straight chain form; and metabolites with hydroxyl groups were converted to their corresponding silyl ethers. The derivatized samples were injected into the GC/MS and the generated mass spectra were used for metabolite identification by comparing the generated spectra to the National Institute of Standards and Technology (NIST) Tandem Mass Spectra library. The method described here can also be used to examine the total metabolome for other plants, furthering our understanding of the biochemical responses of stressed plants.

A method for metabolomic analysis of barley is presented. The method entails fractionation and derivatization of metabolites and analysis thereof by gas chromatography/mass spectrometry (GC/MS). Metabolomic analysis can be used to determine the effect of intercropping and drought stress on the grain.

Climate change increases drought risk to agriculture and impacts both food nutrient content and overall food security. Metabolomics is one way to observe ...

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent. In the experiment, yeast is grown for 48 hours in 1/2X YPD broth containing 3X glucose. The culture is split into a control and treated group. The experiment culture is treated with 0.5 mM H2O2 in Hanks Buffered Saline (HBSS) for 1 hour. The control culture is treated with HBSS only. Total RNA is extracted from both cultures and is converted to a biotin-labeled cRNA product through a multistep process. The final synthesis product is taken back to the UVM Microarray Core Facility and hybridized to the Affymetrix yeast GeneChips. The resulting gene expression data are uploaded into bioinformatics data analysis software.

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent.

Microarray analisi per Saccharomyces cerevisiae</em

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen ...

Biologia

Purifying the Impure: Sequencing Metagenomes and Metatranscriptomes from Complex Animal-associated Samples

The accessibility of high-throughput sequencing has revolutionized many fields of biology. In order to better understand host-associated viral and microbial communities, a comprehensive workflow for DNA and RNA extraction was developed. The workflow concurrently generates viral and microbial metagenomes, as well as metatranscriptomes, from a single sample for next-generation sequencing. The coupling of these approaches provides an overview of both the taxonomical characteristics and the community encoded functions. The presented methods use Cystic Fibrosis (CF) sputum, a problematic sample type, because it is exceptionally viscous and contains high amount of mucins, free neutrophil DNA, and other unknown contaminants. The protocols described here target these problems and successfully recover viral and microbial DNA with minimal human DNA contamination. To complement the metagenomics studies, a metatranscriptomics protocol was optimized to recover both microbial and host mRNA that contains relatively few ribosomal RNA (rRNA) sequences. An overview of the data characteristics is presented to serve as a reference for assessing the success of the methods. Additional CF sputum samples were also collected to (i) evaluate the consistency of the microbiome profiles across seven consecutive days within a single patient, and (ii) compare the consistency of metagenomic approach to a 16S ribosomal RNA gene-based sequencing. The results showed that daily fluctuation of microbial profiles without antibiotic perturbation was minimal and the taxonomy profiles of the common CF-associated bacteria were highly similar between the 16S rDNA libraries and metagenomes generated from the hypotonic lysis (HL)-derived DNA. However, the differences between 16S rDNA taxonomical profiles generated from total DNA and HL-derived DNA suggest that hypotonic lysis and the washing steps benefit in not only removing the human-derived DNA, but also microbial-derived extracellular DNA that may misrepresent the actual microbial profiles.

Using the cystic fibrosis airway as an example, the manuscript presents a comprehensive workflow comprising a combination of metagenomic and metatranscriptomic approaches to characterize the microbial and viral communities in animal-associated samples.

Purificare l&#39;Impure: sequenziamento metagenomi e Metatranscriptomes da campioni complessi animali associate

The accessibility of high-throughput sequencing has revolutionized many fields of biology. In order to better understand host-associated viral and ...

A Hybrid DNA Extraction Method for the Qualitative and Quantitative Assessment of Bacterial Communities from Poultry Production Samples

The efficacy of DNA extraction protocols can be highly dependent upon both the type of sample being investigated and the types of downstream analyses performed. Considering that the use of new bacterial community analysis techniques (e.g., microbiomics, metagenomics) is becoming more prevalent in the agricultural and environmental sciences and many environmental samples within these disciplines can be physiochemically and microbiologically unique (e.g., fecal and litter/bedding samples from the poultry production spectrum), appropriate and effective DNA extraction methods need to be carefully chosen. Therefore, a novel semi-automated hybrid DNA extraction method was developed specifically for use with environmental poultry production samples. This method is a combination of the two major types of DNA extraction: mechanical and enzymatic. A two-step intense mechanical homogenization step (using bead-beating specifically formulated for environmental samples) was added to the beginning of the &#8220;gold standard&#8221; enzymatic DNA extraction method for fecal samples to enhance the removal of bacteria and DNA from the sample matrix and improve the recovery of Gram-positive bacterial community members. Once the enzymatic extraction portion of the hybrid method was initiated, the remaining purification process was automated using a robotic workstation to increase sample throughput and decrease sample processing error. In comparison to the strict mechanical and enzymatic DNA extraction methods, this novel hybrid method provided the best overall combined performance when considering quantitative (using 16S rRNA qPCR) and qualitative (using microbiomics) estimates of the total bacterial communities when processing poultry feces and litter samples.

A novel semi-automated hybrid DNA extraction method for use with environmental poultry production samples was developed and demonstrated improvements over a common mechanical and enzymatic extraction method in terms of the quantitative and qualitative estimates of the total bacterial communities.

Un ibrido metodo di estrazione del DNA per la valutazione delle comunità batteriche qualitativa e quantitativa di pollame campioni di produzione

The efficacy of DNA extraction protocols can be highly dependent upon both the type of sample being investigated and the types of downstream analyses ...

Quasi-metagenomic Analysis of Salmonella from Food and Environmental Samples

Quasi-metagenomics sequencing refers to the sequencing-based analysis of modified microbiomes of food and environmental samples. In this protocol, microbiome modification is designed to concentrate genomic DNA of a target foodborne pathogen contaminant to facilitate the detection and subtyping of the pathogen in a single workflow. Here, we explain and demonstrate the sample preparation steps for the quasi-metagenomics analysis of Salmonella enterica from representative food and environmental samples including alfalfa sprouts, ground black pepper, ground beef, chicken breast and environmental swabs. Samples are first subjected to the culture enrichment of Salmonella for a shortened and adjustable duration (4&#8211;24 h). Salmonella cells are then selectively captured from the enrichment culture by immunomagnetic separation (IMS). Finally, multiple displacement amplification (MDA) is performed to amplify DNA from IMS-captured cells. The DNA output of this protocol can be sequenced by high throughput sequencing platforms. An optional quantitative PCR analysis can be performed to replace sequencing for Salmonella detection or assess the concentration of Salmonella DNA before sequencing.

Quasi-metagenomic Analysis of Salmonella from Food and Environmental Samples

Here, we present a protocol to prepare DNA samples from food and environmental microbiomes for concerted detection and subtyping of Salmonella through quasimetagenomic sequencing. The combined use of culture enrichment, immunomagnetic separation (IMS), and multiple displacement amplification (MDA) allows effective concentration of Salmonella genomic DNA from food and environmental samples.&#160;

L'analisi metagenomica di insilato

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