Dieses Projekt war teilweise Unterstützung von Johns Hopkins Universität, Büro des Propstes durch die Gateway Science Initiative.

Hinweis: Metagenomische DNA wird aus dem Boden (Baltimore County, Maryland) mit einer im Handel erhältlichen Boden genomische Isolation gereinigt kit (siehe Tabelle der Materialien). Mit einer UV-Spektralphotometer (siehe Tabelle der Materialien), die gereinigte genomische DNA sollte haben ein 260/280 (nm) Verhältnis &#62; 1,8 und 260/230 Verhältnis zwischen 2.0-2.2 um sicherzustellen, dass die Probe ist frei von Verunreinigungen. Die Höhe der genomischen DNA erforderlich für NS reicht von 200 ng zu 2 µg.
1. schnelle Bibliothek Zubereitungsart (kurzes Protokoll)
Hinweis: Dies ist ein kurzes Protokoll. Sehen Sie Tabelle der Materialien für das schnelle Sequencing Kit.
<ol>
	<li>In einem 0,2 mL dünnwandigen Rohr (siehe Tabelle der Materialien) addieren Sie 200 ng des hohen Molekulargewichts DNA in einem Finale des Volumens von 7,5 µL destilliertes Wasser.</li>
	<li>Fügen Sie 2,5 µL Fragmentierung Mix (FM) aus dem schnellen Bibliothek Vorbereitungssatz und Mischung sanft durch Umkehrung. Puls-Zentrifuge nach unten drehen (1.000 x g für 5 s).</li>
	<li>Legen Sie die Probe in einem Thermocycler (siehe Tabelle der Materialien) für eine Runde bei 30 ° C für 1 min, gefolgt von 75 ° C für 1 min. entfernen die Rohr- und Puls Zentrifuge, die Probe zu spinnen.</li>
	<li>Fügen Sie 1 µL schnelle Adapter und 0,2 µL Blunt/TA-Ligase-master-Mix, und speichern Sie die angepasste und gefesselte Bibliothek auf Eis. Hinweis: Wenn mit dem kurzen Protokoll mit Schritt 8 fortfahren.</li>
</ol>
(2) Ligation Sequenzierung Protokoll (lang): Metagenomische DNA-Fragmentierung
Hinweis: Siehe Tabelle der Materialien für die Ligatur Sequencing Kit.
<ol>
	<li>Verdünnen Sie 1 µg gereinigten genomic DNA zu einem Endvolumen von 46 µL in entionisiertem Wasser.</li>
	<li>Übertragung die Probe zu einer DNA-Fragmentierung Rohr (siehe Tabelle der Materialien) und für 1 min bei Raumtemperatur bei 8.000 x g mit einem Microcentrifuge Zentrifugieren (siehe Tabelle der Materialien), ca. 8 kb genomische Fragmente zu produzieren. Stellen Sie sicher, dass die Flüssigkeit in dem Sammelrohr bestanden hat.</li>
	<li>Invertieren Sie die Fragmentierung Röhre, Rückkehr in die Zentrifuge und Zentrifuge für 1 min die fragmentierten genomischen DNA in die untere Kammer zu sammeln.</li>
	<li>Die fragmentierten genomischen DNA an eine sterile Low-DNA-Bindung-1,5 mL-Tube übertragen, und einen Teil auf einem niedrigen Prozentsatz Agarose-Gel (0,6 %) um Fragmentierung zu bestätigen zu analysieren &#62; 30 kb.</li>
</ol>
(3) fragmentiert genomische DNA-Ende-Vorbereitung
<ol>
	<li>Mit 800 ng fragmentierten genomic DNA in 45 µL deionisiertes Wasser hinzufügen 7 µL-Ende-Prep-Reaktion (siehe Tabelle der Materialien), 3 µL Enzym-Mix-Puffer (siehe Tabelle der Materialien), und 5 µL Nuklease Wasser frei.</li>
	<li>Mix von Inversion und Puls Zentrifuge (1.000 x g für 5 s).</li>
	<li>Probe auf einem 0,2 mL dünnwandigen Rohr übertragen und Probe für 5 min bei 20 ° C, gefolgt von Inkubation bei 65 ° C für 5 min inkubieren.</li>
	<li>Puls-Zentrifuge, Inhalt auf den Boden des Rohres zu bringen.</li>
	<li>Übertragen Sie Probe auf einem 1,5 mL niedrig-DNA-Bindung Microcentrifuge Schlauch.</li>
	<li>Bereiten Sie magnetische Beads (siehe Tabelle der Materialien). Fügen Sie 60 µL resuspendierte Perlen der Ende Prep Reaktion aus Schritt 3.5 und Mix durch pipettieren.</li>
	<li>Auf einem Rotator-Mixer bei 100 u/min (siehe Tabelle der Materialien) für 5 min bei Raumtemperatur inkubieren.</li>
	<li>Pulse Zentrifugieren die Probe zu pellet-Perlen, dann legen Sie die Probe neben Magnet.</li>
	<li>Sobald die Perlen der Magnet eingehalten werden, pipette überstand und verwerfen.</li>
	<li>Entfernen Sie das Rohr aus Magnet und waschen Perlen mit 200 µL von frisch zubereiteten 70 % Ethanol durch Pipettieren sanft auf die Probe.</li>
	<li>Puls-Zentrifuge, pellet-die Perlen und der Magnet wieder.</li>
	<li>Den Überstand entfernen und entsorgen. Wiederholen Sie den Waschschritt erneut mit 200 µL 70 % Ethanol.</li>
	<li>Puls die Röhre, Rückkehr zu den Magneten Zentrifugieren und alle 70 % Ethanol waschen zu entfernen.</li>
	<li>Öffnen Sie mit dem Microcentrifuge Schlauch Deckel, lassen Sie die Perlen an der Luft trocknen für 5 min bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Entfernen Sie das Rohr aus Magnet und auszusetzen Sie das Pellet in 31 µL steriler, Nuklease-freie Wasser. 2 min bei Raumtemperatur inkubieren.</li>
	<li>Zurückkehren Sie das Rohr zu den Magneten, bis die Perlen oelletiert haben und das Eluat klar ist.</li>
	<li>Übertragen Sie das Eluat auf einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch. Mit 1 µL der Probe, quantifizieren die Ende vorbereitet DNA mit einem UV-Spektralphotometer bei 260 nm (siehe Tabelle der Materialien). Hinweis: Sollte die prozentuale Erholung ~ 70 % (700 ng) aus einer Start Konzentration von 1 µg genomische DNA.</li>
</ol>
(4) Adapter und Tether Ergänzung zu Ende vorbereitet genomische DNA-Fragmente
<ol>
	<li>Mischen der Blunt/TA-Ligase Röhren master-Mix durch Umkehrung, und dann Puls Zentrifuge Inhalt auf den Boden zu bringen.</li>
	<li>Fügen Sie mithilfe 30 µL DNA Ende vorbereitet-20 µL des Adapter-Mix und 50 µL Blunt/TA-Ligatur-master-Mix.</li>
	<li>Durch Umkehrung, Puls-Zentrifuge, mischen und 10 min bei Raumtemperatur inkubieren.</li>
</ol>
(5) magnetische BEad Vorbereitung
<ol>
	<li>Vortex tube Perlen und dann Transfer 50 µL des suspendierten Perlen zu einer 1,5 mL Microfuge.</li>
	<li>Platzieren Sie das Rohr auf den Magneten zu die Perlen Pellets bis das Eluat genehmigt.</li>
	<li>Den Überstand entfernen und entsorgen.</li>
	<li>100 µL der Wulst Bindung Puffer hinzufügen (siehe Tabelle der Materialien für Bead-Kit), die Perlen, Wirbel, Perlen, Aufschwemmen pellet die Perlen auf den Magneten, den Überstand entfernen und entsorgen. Wiederholen Sie das Waschen mit 100 µL Bindung Puffer.</li>
	<li>Die gewaschenen Perlen 100 µL der Wulst Bindung Puffer hinzufügen. Wirbel um die Perlen aufzuwirbeln.</li>
</ol>
6. Bibliothek Reinigung
<ol>
	<li>Fügen Sie mithilfe einer Mikropipette P200 40 µL Perlen aus dem vorherigen Schritt zur genomischen DNA angepasst/angebunden. Mischen Sie die Probe durch Pipettieren sorgfältig.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Probe auf einem Rotator-Mixer bei 100 u/min für 5 min bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Legen Sie die Probe auf den Magneten und lassen Sie die Perlen zu begleichen. Pipette aus der Überstand und entsorgen.</li>
	<li>Die Perlen in 140 µL Wulst Bindung Puffer durch Pipettieren aufzuwirbeln. Legen Sie die Probe gegen den Magneten, den Überstand verwerfen und waschen wieder mit einer anderen 140 µL Wulst Bindung Puffer.</li>
	<li>Puls Zentrifugieren Sie das Rohr, das Rohr auf den Magneten zu platzieren, für 2 min. entfernen den restlichen Wulst Bindung Puffer aus dem Pellet.</li>
</ol>
7. die Elution der Bibliothek von Magnet-Perlen
<ol>
	<li>Aufschwemmen der magnetischen Beads in 15 µL Elution Puffer durch pipettieren. Inkubieren Sie die Probe für 10 min bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Legen Sie das Rohr gegen den Magneten zu die Perlen Pellets.</li></ol>Wenn die Lösung löscht, entfernen Sie 15 µL Eluat und Transfer zu einem 1,5 mL Microfuge Schlauch zu, und legen Sie die Probe auf dem Eis.
	<li>Die Bibliothek mit einer UV-Spektralphotometer zu quantifizieren. Hinweis: Sollte die prozentuale Erholung ~ 25 % (250 ng) aus einer Start Konzentration von 1 µg genomische DNA.</li>

8. starten eine Run/Qualitätskontrolle
<ol>
	<li>Messzelle aus der Verpackung nehmen und portable, Echtzeit-Sequenzer die Durchflusszelle zuordnen (siehe Tabelle der Materialien).</li>
	<li>Sequencer über USB-Kabel an einen Computer anschließen und die Sequenzer-Software zu starten (siehe Tabelle der Materialien).</li>
	<li>Klicken Sie auf "Connect" Gerät durch die Sequenzer-Software, wählen Sie "NC_Platform_QC.py", und klicken Sie auf "Start".</li>
	<li>Die Qualitätskontrolle (QC) dauert ca. 6-7 min. in Anspruch; Suchen Sie nach einem "Sea of Green" (große Flächen des Ausgangs) auf die QC-Anzeige zu bestätigen, dass es genügend aktive Poren (&#62; 800) für die DNA-Sequenzierung.</li>
</ol>
9. starten einen Sequenzierung Run
<ol>
	<li>Öffnen Sie die Sequenzierung Programm; ein Dialogfeld wird angezeigt. Proben-ID im Feld name der Probenmaterials.</li>
	<li>Klicken Sie auf das Feld "Flow Cell-ID" und geben Sie den Code auf dem Aufkleber auf der Oberseite der Durchflusszelle gefunden.</li>
	<li>Den Fluss Zelle Deckel öffnen und dann schieben Sie die Probe-Port-Abdeckung nach rechts (im Uhrzeigersinn) so dass die Probenöffnung sichtbar ist. Wenn der Port geöffnet, überprüfen Sie für eine kleine Blase ist. Wenige Mikroliter der Puffer einschließlich der Blase zu entfernen.</li>
	<li>Vergewissern Sie sich, dass über das Sensor-Array gibt es Puffer. Machen den Priming-Puffer durch das Mischen von 480 µL Puffer mit Kraftstoff-Gemisch ausgeführt (RBF-1, siehe die Tabelle der Materialien) (Achten Sie darauf, mischen Sie gründlich erste) mit 520 µL Nuklease-freies Wasser.</li>
	<li>Die Grundierung Hafen 800 µL des Puffers Priming hinzufügen. Heben Sie vorsichtig den Deckel "SpotOn" zugänglich zu machen.</li>
	<li>Fügen Sie nach 5 min eine zusätzliche 200 µL Puffer Grundierung zu Priming-Port hinzu.</li>
</ol>
10. Laden der Bibliothek
<ol>
	<li>Vor der Vorbereitung des Bibliothek Ortes der folgenden Reagenzien auf Eis: RBF-1 (aus dem Sequencing Kit), angepasst und angebunden, und Bibliothek laden Perlen (LLB; aus dem Sequencing Kit).</li>
	<li>Eine 0,2 mL Zentrifugenröhrchen fügen Sie hinzu, 25,5 µL RBF und 12 µL Nuklease-freies Wasser bei Raumtemperatur aufbewahrt.</li>
	<li>Mischen Sie die LLB durch Pipettieren wechselvollen. Das 0,2 µL Rohr 26,5 µL der LLB hinzufügen. Mischen Sie die Reagenzien durch Pipettieren wechselvollen. Hinweis: Die LLB neigt dazu, aus der Mischung zu begleichen.</li>
	<li>Das 0,2 µL Rohr 11 µL der angepasst und gefesselte Bibliothek hinzufügen. Abmischen von Inversion und Spin durch Zentrifugation Puls.</li>
	<li>Fügen Sie 75 µL Probe aus Schritt 9.4 tropfenweise an den "SpotOn"-Port. Stellen Sie sicher, dass jeder Tropfen in den Hafen fließt, bevor Sie den nächsten hinzufügen.</li>
	<li>Sorgfältig ersetzen Sie die Probe-Port-Abdeckung zu, so dass der Spund der Hafen einläuft, und setzen Sie den Deckel des Gerätes.</li>
</ol>
11. eine Sequenzierung Software Protokoll Skript gestartet wird
<ol>
	<li>Öffnen Sie das Dropdown-Menü unter "Select-Programm" und wählen Sie "48 Stunden Sequenzierung."</li>
	<li>Klicken Sie auf die Schaltfläche "Ausführen" um das Skript zu starten.</li>
	<li>Überprüfen Sie die Ergebnisse des scan-Mux in der Benachrichtigung-Stream für die Anzahl der aktiven Poren in der scan-MUXberichtet. Hinweis: Diese Zahl kann abweichen von der Anzahl der Poren in den QC laufen und ein großen Unterschied kann auf ein Problem hinweist.<ol>
		<li>Wenn es eine signifikante Reduktion der aktiven Poren aus dem QC-Lauf starten Sie die Software, und wenn es noch ein signifikanter Unterschied, den Computer neu starten.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Überprüfen Sie, dass die Kühlkörper-Temperatur 34 ° C ist, wie die Sequenzierung Software Skript berichtet. Hinweis: Wenn die Temperatur nicht bei 34 ° C ist dann es nicht genügend aktive Poren für den Lauf.</li>
	<li>Überprüfen Sie das Histogramm lesen Sie Längen zu bestimmen, ob die Sequenz Längen erwarteten und für den experimentellen Entwurf geeignet sind.</li>
	<li>Schließen Sie die Desktop-Agent mithilfe von "x. beenden die Sequenzer-Software in der Nähe" schließen Sie die Web-GUI. Trennen Sie das Gerät vom Computer.</li>
</ol>
12. Analyse ausführen und Ergebnisse
Hinweis: Während der Sequenzierung Ausführung, können die Daten überwacht werden mit dem "Bericht anzeigen"-Programm, mit dem Desktop-Agent. Während oder nach Abschluss des Laufs Dateien stehen in einem FAST5 Dateiformat, in dem Daten → liest → pass Ordner (Standard). Wenn dieser Ordner geöffnet ist, während Sequenzierung aktiv ist, kann der Computer fixieren.
<ol>
	<li>Zum ansehen und bearbeiten Sequenzen, ein "HDFViewer" herunterladen.</li>
	<li>Um die Sequenzierung Dateien anzuzeigen, direkt zu öffnen die HDF Viewer → offene Daten Ordner → wählen Sie, die alle Datei-Typen → wählen Sie C: Laufwerk (Standard) → Daten auswählen → Wählen Sie liest → select Pass.</li>
	<li>Finden Sie und wählen Sie die FASTQ-Datei im linken Drop-Down-Menü; Dateien werden geöffnet und können im FASTQ-Format gespeichert werden. Hinweis: Für die Zwecke der Student Experiment wurden Sequenzen von 350 Nukleotide oder länger zur weiteren Analyse ausgewählt. Ausgang aus der Basis Berufung ermöglicht dem Benutzer, Sequenz liest basierend auf Größe zu sortieren. FASTQ-Dateien können über BLAST (NCBI) oder anderen Bioinformatik-Programme analysiert werden.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Quick, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time,+portable+genome+sequencing+for+Ebola+surveillance.">Real-time, portable genome sequencing for Ebola surveillance.</a> Nature. 530 (7589), 228-232 (2016).</li><li>Greninger, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+metagenomics+identification+of+viral+pathogens+in+clinical+samples+by+real-time+nanopore+sequencing+analysis.">Rapid metagenomics identification of viral pathogens in clinical samples by real-time nanopore sequencing analysis.</a> Genome Med. 7, 99 (2015).</li><li>Quick, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+draft+sequencing+and+real-time+nanopore+sequencing+in+a+hospital+outbreak+of+Salmonella.">Rapid draft sequencing and real-time nanopore sequencing in a hospital outbreak of Salmonella.</a> Genome Biology. 16, 114 (2015).</li><li>Ashton, P. 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Die Autoren haben keine Angaben.

Viele nächste Generation Sequenzierung Methoden erzeugt wurden und jedes hängt von Sequenzierung durch Synthese aber Erkennung Plattformen zur Identifizierung von Nukleotide unterscheiden. NS, die jüngste Ergänzung zum Marktplatz, verwendet eine andere Methode völlig, die erfordert keiner Sequenzierung Reaktion oder Nukleotide bezeichnet. Diese Methode nutzt kostenlos Differential bereits eingebaute Nukleotide eine elektrifizierte Pore durchschreiten. Die Identifizierung der einzelnen Nukleotid erfolgt durch Modulation des elektrischen Stroms durch die verschiedenen Basen als Durchgang durch die Nanopore. Dieses gebündelte System ermöglicht dem Benutzer viele Fragmente zu einem Zeitpunkt zu sequenzieren. Durch die beiden Stränge der DNA-Sequenzierung, die Genauigkeit der Sequenz wird deutlich erhöht und die Sequenzer-Software, die auf einem Laptopcomputer geladen werden kann, verarbeitet die Signale und die Sequenz informiert, die analysiert werden können.
Detektion der spezifischen Basis in die Vorlage aufgenommen hängt Pyrosequenzierung, eine Abfolge von Synthese (SBS)-Methode, die Luciferase Assay und der Erzeugung von Chemolumineszenz Signale8. In Ion Halbleiter Sequenzierung wird die freigesetzte Wasserstoff-Ionen, die den pH-Wert sinkt durch eine Ionen-Sensor9erkannt. Echtzeit-Sequenzierung Einzelmolekül richtet sich nach der Null Modus Welle Führer (ZMW)10, die für die Erkennung ein fluoreszierendes Molekül markiert, die eingebaute Nukleotid beleuchtet. SBS verwendet eine einzigartige Methode, um die Ziel DNA zu verstärken, so dass einzigartige Sequenzen generierten13sind. Erkennung des zusätzlichen Nukleotids wird erreicht, wenn die Fluoreszenz des tagged Nukleotids aufgezeichnet wird. NS hat auf der anderen Seite einzigartige Vorteil gegenüber anderen Methoden, dass es begrenzte technischen Ressourcen erfordert, tragbar ist, lange Sequenzierung liest produziert, keine vorherige DNA Verstärkung erfordert und zu einem reduzierten Preis im Vergleich zu anderen betrieben werden kann. Unsere Schüler fanden das neuere, schnelle Bibliothek Prep Protokoll, unkompliziert und offen für eine drei-Stunden-Labor-Klasse sein. Einige der Fragen, denen, die wir begegnet, sind Luftblasen in der Messzelle, die schwer zu entfernen waren, es erforderte erhebliche Rechenleistung (ein Terabyte Speicherkapazität) ist die aktuelle Ausgabe von Daten in einer Datei FAST5 und die Sequenzierung Durchflusszelle hat eine begrenzte Haltbarkeit davor verschlechtert sich. Darüber hinaus weitere Nachteile der NS-Ligation Sequenzierung Protokoll (lange) ist, dass es erfordert mehrere Bibliothek Vorbereitungsschritte, erfordert Erfahrung in molekularbiologischen Techniken und reduzierte Sequenzierung Treue im Vergleich zu einigen erzeugt Sequenzierung Methoden3. Jedoch die jüngsten Fortschritte mit der neuen schnellen Bibliothek Vorbereitungssatz erfordert nur 10 min für Bibliothek Vorbereitung und hat eine reduzierte Sequenzierung Fehlerquote unter Beweis gestellt. Die neue Bibliothek Vorbereitung Methode war sehr zugänglich für den Einsatz in einem Labor-Klasse.
Besonders in den QC der Durchflusszelle gibt es mehrere wichtige Schritte in das Protokoll. Dazu gehören Durchführung einer ersten QC innerhalb von fünf Tagen nach Erhalt der Messzelle und mit ihnen innerhalb von 8 Wochen. Obwohl wir Durchflusszellen, die über 8 Wochen waren verwendet haben, ist die Anzahl der Poren öffnen/aktive stark reduziert. Es ist wichtig, dass Experimente geplant sind, um eine Zeitleiste zu passen, wo maximale Nutzung der die Durchflusszellen erreicht. Wir haben die Reinigung Protokoll verwendet und wiederverwendet die Durchflusszellen mit Erfolg.
Untersuchen die Metagenomik der Erde repräsentieren eine ungenutzte genetisches Reservoir der mikrobiellen Diversität. Z. B. ein Gramm Boden wird voraussichtlich zwischen 10 enthalten7 - 109 prokaryotische Zellen14. Bodenorganismen sind darüber hinaus eine Hauptquelle von neuartigen Naturprodukte, Enzyme und Antibiotika. Daher stellt Boden Metagenomik DNA-Sequenzanalyse ein wertvolles Lehrvideos Instrument für Studierende auf allen Ebenen der Bildung. Der NS-Technologie Benutzerfreundlichkeit und niedrige Kosten machen dieses System sehr effektiv Lehrmittel. Studenten können Sequenz Umweltproben und nach Abschluss der Sequenz zur Verfügung Bioinformatik-Werkzeuge verwenden, um zu identifizieren und zu charakterisieren, Mikroben und Metagenomik-Sequenzen in Proben. Mit der NS-Technologie, haben Studenten echte praktische Erfahrung, die bis jetzt von wegen der fortgeschrittenen technischen Know-how und hohe Reagenz, Ausrüstung und Wartung Kosten in anderen Sequenzierung Plattformen für den Einsatz in Laborübungen erreichen hat. Einer unserer Schüler (J. Harrison, persönliche Mitteilung) berichtete kürzlich, den Einsatz dieser Technologie in ein Umweltprojekt Überwachung der landwirtschaftlichen Böden. Wir rechnen damit, dass viele weitere Anwendungen für diese Technologie im Bereich Bildung.

Das Ziel dieses Verfahrens ist für die Vorbereitung einer ökologischen DNA-Bibliothek für die Sequenzierung, Nutzung eines Nanopore Fluß Zelle Sequenzierung Geräts erforderlichen Schritte demonstrieren und die generierte DNA-Sequenzen mit Systemsoftware analysieren und das National Center for Biotechnology Information (NCBI) Bioinformatik, mikrobielle Spezies im Boden zu identifizieren. Derzeit verlangen die meisten DNA-Sequenzierung-Plattformen eine große Investition in technische Schulungen und komplexe Instrumentierungen, was nicht machbar in Ressource armen Umgebungen oder im Feldeinsatz ist. Die Nanopore-Sequenzierung (NS)-Plattform beseitigt diese Probleme mit einer kostengünstigen, einfach zu bedienen, Protokoll Bibliothek Vorbereitung und einem tragbaren Gerät, zu sequenzieren und analysieren eine Vielzahl von verschiedenen Arten von Nukleinsäuren1,3. Wir haben mehrere Labor-Klassen für Master-Studierende die NS-Plattform integriert.
Nanopore Technologie für Sequenzierung Biomoleküle hat breite Anwendungen in den Lebenswissenschaften, einschließlich Ermittlung der bakterielle und virale Erreger1,2,6, ökologischen Biodiversität gezeigt. Studien, Lebensmittel-Sicherheit monitoring, Genomanalyse3,5und Charakterisierung von bakteriellen Resistenz gegen Antibiotika4. NS ist eine schnelle und genaue Methode zur Sequenz Nukleinsäuren, die auf dem Prinzip der basiert "Sequenzierung Strang" durch das Erkennen von elektrischen Störungen durch individuelle Nukleotidbasen wenn einzelne stranded DNA eine Nanopore in einem elektrifizierten eingefügt durchläuft synthetische Polymermembran. Die Schritte bei der Vorbereitung von DNA für NS 3' dA-Tailing genomische Fragmente, Adapter und Haltegurt Glühen an die DNA, Genom Fragmentierung und Ende Reparatur enthalten DNA Bibliothek Reinigung und die Bibliothek in der Nanopore-Flow-Zelle-Gerät laden. Zersplitterung des Genoms in ~ 8 kb Größe wird durch Zentrifugieren 1-2 µg genomische DNA durch ein g-Tube Fragmentierung Rohr erreicht. Die fragmentierten genomischen Enden sind dann repariert und angebundene mit Poly-dA mit einem kommerziell erhältlichen Kit. Einzelnen gestrandeten Adapter Sequenzen, die kompatibel mit dem Nanopore motor Protein sind, werden hinzugefügt, DNA-enden, die verwendet werden, um die DNA-Sequenz durch die Nanopore (Abbildung 1) zu führen. Der Haltegurt-Sequenzen sind für DNA-Reinigung und zur Lokalisierung der DNA-Moleküle an die Pore Membran erforderlich. Die Haarnadel entsteht durch Ligation einen Haarnadel-Adapter an einem Ende der dA tailed Bibliothek. Die Haarnadel-Strukturen an den Enden der DNA erlaubt das Auslesen der Sense und Antisense Stränge wie die DNA durch die Nanopore (Abbildung 2). Die vorbereitete genomische Bibliothek wird dann aus der Reaktion gereinigt, mit Streptavidin-Perlen mit einem magnetischen Feld, gefolgt von der Probe in die Nanopore Messzelle für die Analyse zu laden.
Die sequenzierte DNA bemisst sich für Qualität und Sequenzierung liest, die akzeptabel für die Analyse sind unterliegen dann mehrere Bioinformatik, Mikroben zu identifizieren. Die Sequenzen sind in einer FASTQ aus einem FAST5 Format "übersetzt". Im FASTQ-Format können die Sequenzen dann BLAST Analyse genutzt werden.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:625px;" width="626">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Thermal Cycler</td>
			<td style="width:124px;">LifeECO</td>
			<td style="width:119px;">BTC42096</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Covaris g-TUBE</td>
			<td style="width:124px;">Covaris</td>
			<td align="right" style="width:119px;">520079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;">NEBNext End Repair Module</td>
			<td style="width:124px;">New England BioLab</td>
			<td style="width:119px;">E7546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Eppendorf LoBind Centrifuge Tubes</td>
			<td style="width:124px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">Z666505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">NEB Blunt/TA Ligase Master Mix</td>
			<td style="width:124px;">New England BioLab</td>
			<td style="width:119px;">MO367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MyOne C1 Strepavidin Beads</td>
			<td style="width:124px;">Thermo Fisher</td>
			<td align="right">65001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Eppendorf microcentrifuge</td>
			<td style="width:124px;">Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>Model 5420</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nanodrop UV spectrophotometer</td>
			<td style="width:124px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">ND-2000</td>
			<td>Model 2000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Belly Dancer Orbital Shaker</td>
			<td style="width:124px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">Z768499</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Power Soil DNA Isolation Kit</td>
			<td style="width:124px;">MO BIO</td>
			<td style="width:119px;">12888-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ligation Sequencing Kit 2D</td>
			<td style="width:124px;">Oxford Nanopore&#160;</td>
			<td style="width:119px;">SQK-LSK208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Rapid Sequencing Kit for Genomic DNA</td>
			<td style="width:124px;">Oxford Nanopore&#160;</td>
			<td style="width:119px;">SQK-RAD002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">End-Prep Reaction Buffer and enzyme mix (NEB Blunt/TA Ligase Naster Mix)</td>
			<td style="width:124px;">New England BioLab</td>
			<td style="width:119px;">MO367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">AmPure XP Magnetic Beads</td>
			<td style="width:124px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">A63880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Basic Starter Pack&#160;</td>
			<td style="width:124px;">Oxford Nanopore&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Includes MinION&#160; Sequencing Device and Flow Cell</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MinKNOW software</td>
			<td style="width:124px;">Oxford Nanopore&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:216px;">Rapid Sequencing Kit for Genomic DNA</td>
			<td style="width:124px;">Oxford Nanopore&#160;</td>
			<td style="width:119px;">SQK-RAD002</td>
			<td style="width:167px;">Includes Running Buffer with Fuel (RBF), Fragmentation Mix (FRM) Rapid Adapter (RAD) Library Lodaing Beads (LLB)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

nanopore dna sequencing for metagenomic soil analysis

Dieser Artikel beschreibt die Schritte zum Aufbau einer DNA-Bibliothek von Boden, Zubereitung und Verwendung der Durchflusszelle Nanopore und Analyse von DNA-Sequenzen identifiziert mittels Computersoftware. Nanopore DNA-Sequenzierung ist eine flexible Technik, die ermöglicht schnelle mikrobielle Genomsequenzierung, bakterieller und viraler Spezies zu identifizieren um Bakterienstämme zu charakterisieren und zu genetische Mutationen zu erkennen, die Resistenz gegenüber Antibiotika verleihen. Nanopore (NS) für Life Sciences-Sequenzierung Vorteile seine geringe Komplexität, reduzierte Kosten und schnelle Echtzeit-Sequenzierung des gereinigten genomischer DNA, PCR-Amplifikate, cDNA Proben oder RNA. NS ist ein Beispiel für "Strang Sequenzierung" einhergehende DNA Sequenzierung durch die Führung von stranded DNA Moleküls durch eine Nanopore, die in eine synthetische Polymermembran eingesetzt wird. Die Membran hat einen elektrischen Strom angewendet über es, so wie die einzelnen Basen durch die Nanopore den elektrischen Strom in unterschiedlichem Maße durch die vier Nukleotidbasen gestört wird. Die Identifizierung der einzelnen Nukleotid erfolgt durch den Nachweis der charakteristischen Modulation des elektrischen Stroms durch die verschiedenen Basen als Durchgang durch die Nanopore. Das NS-System besteht aus einem handheld, Stromversorgung über USB portable Gerät und ein Einweg-Messzelle, die ein Nanopore Array enthält. Das tragbare Gerät steckt in einem standard-Notebook-Computer, der liest und zeichnet die DNA-Sequenz mit Computersoftware.

Die experimentelle Design und Nanopore Technologie zur Verfügung gestellt, einer schnelle und kostengünstigen Methode für Studierende zu Boden DNA-Sequenz. Die repräsentative Ausführung übergeben der Qualitätskontrolle Parameter mit mehr als 800 Poren zur Sequenzierung. Der Lauf führte über 125.000 liest, die für das Studium mit einer medianen Sequenz Länge von 5,38 kb. Sequenzen sind ein Qualitätsfaktor und nur diese Sequenzen mit akzeptablen Resultate wurden dann analysiert. Als Ausgang für die Sequenzierung ist die Reaktion in FAST5 Format, die nicht von Programmen wie BLAST (NCBI), akzeptiert die Sequenzen im HDF Viewer angesehen wurden, die die Sequenzen in FASTQ Format wandelt, die kompatibel zur Explosion Analyse ist. In Zukunft werden Iterationen der Software, die Daten als FASTQ Format, wodurch die Notwendigkeit für die HDF-Viewer zur Verfügung. Siehe ergänzende Abbildungen 1, 2 und 3.
Fünfzig Sequenzen von über 350 Nukleotide in der Länge waren Gegenstand der Analyse von BLASTN (Nukleotide Nukleotid-Datenbank) oder SEQUENZIERT (Nukleotide in Aminosäuresequenz übersetzt) (NCBI), Organismen in der Bodenprobe zu identifizieren. In Anbetracht der Zeit Zwänge der Klasse und, dass der Schwerpunkt des Kurses auf Labormethoden und nicht Bioinformatik, wir haben die Studenten Sequenzen innerhalb dieser Parameter zu analysieren. Unsere Bioinformatik-Klassen können die Daten für die Entwicklung des Pipeline-Analyse-Tools verwenden. Dieser Analyseebene Bioinformatik fällt nicht in die Labor-basierte Klasse. Tabelle 1 finden Sie eine Liste der Organismen, die mit e-Werte von weniger als 4 e-04 identifiziert wurden. Allgemein, e-Werte von weniger als 4 e-04 zeigen starke Ähnlichkeit zwischen der Eingabesequenz (Abfrage) und die aufeinander abgestimmten Reihenfolge. Die Organismen gekennzeichnet durch BLASTN (gegen die nicht-redundanten (nr)-Datenbank) sind aus einer Vielzahl von Arten und stehen für weitere genomische und Protein-Analysen. In diesem Beispiel des Bodens, die aus einem Garten in Baltimore County, MD kam war nie getestet worden, so gab es keine vorherigen Daten aus, um festzustellen, was Organismen im Boden sein könnte. BLASTN Analyse (anhand der nr-Datenbank) die Analyse ergab auch, gab es Sequenzen keine Ähnlichkeiten in der nr-Datenbank. Um festzustellen, ob dies wirklich neuartige Sequenzen sind, ist weitere Studien erforderlich. Analyse der mehrere Sequenzen von SEQUENZIERT ergab mehrere Proteine von Organismen, die nicht in der BLASTN Analyse dargestellt. Tabelle 2 listet einige mögliche Proteine einschließlich Endopeptidasen und ATPasen-ähnliche Proteine. Mit dieser Bibliothek von Sequenzen, haben Studenten die Möglichkeit, komplexere Bioinformatik Tools verwenden, um weitere Analyse durchführen, wenn der Kursleiter die Regie.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55979/55979fig1.jpg"> 
Abbildung 1 : Genomic Bibliothek Vorbereitung. Schritte zur Vorbereitung der genomischen DNA-Bibliothek für die Sequenzierung mit Nanopore Technologie. Diese Zahl wurde mit den erforderlichen Berechtigungen geändert. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55979/55979fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55979/55979fig2.jpg"> 
Abbildung 2 . Schaltplan der DNA-Sequenzierung mit einer Nanopore. DNA, die durch eine Nanopore Membran mit elektrisches Signal Erzeugung und Basis-Identifikation. Diese Zahl wurde mit den erforderlichen Berechtigungen geändert. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55979/55979fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Organismus</td>
			<td>e-Wert</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomyces-sp.</td>
			<td>3.00E-06</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nocardoides sp.</td>
			<td>5.00E-04</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gordonia sp.</td>
			<td>5.00E-04</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyphomicrobium nitrativorens</td>
			<td>1.00E-139</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Starkeya-Novelle</td>
			<td>1.00E-31</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyphomicrobium denitrificans</td>
			<td>1.00E-30</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibomicrobium sp.</td>
			<td>5.00E-17</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pseudomonas sp.</td>
			<td>2.00E-15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodothemus marinus</td>
			<td>1.00E-17</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Turneiella parva</td>
			<td>2.00E-24</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli</td>
			<td>0.00E + 00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bradyrhizobium sp.</td>
			<td>3.00E-30</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gemmatirosa kalamazoonesis</td>
			<td>1.00E-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Burkholderia sp.</td>
			<td>8.00E-10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sphingomonas sp.</td>
			<td>8.00E-10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellumonas sp.</td>
			<td>6.00E-11</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabelle 1: ausgewählte Ergebnisse der BLASTN Analyse. Boden Metagenomik DNA-Sequenzen BLASTN Ähnlichkeitssuche anhand der NCBI-nicht-redundanten Nukleotid-Datenbank unterzogen. Die gemeldeten Daten haben e-Werte von 4 X e-4 oder weniger.
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Protein</td>
			<td>Organismus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypothetische protein</td>
			<td>Acidobacter Bakterium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SAM-abhängige-methyltransferase</td>
			<td>H. denitrificans</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATPase</td>
			<td>Jannaschia sp.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endopeptidase</td>
			<td>Shigella sonnei</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lyse protein</td>
			<td>E. coli</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabelle 2: ausgewählte Ergebnisse der Analyse SEQUENZIERT. Boden Metagenomik DNA-Sequenzen SEQUENZIERT Ähnlichkeitssuche anhand der NCBI-nicht-redundanten Protein-Datenbank unterzogen.
<img alt="Supplemental Figure 1" src="/files/ftp_upload/55979/55979supfig1.jpg"> 
Ergänzende Abbildung1: Plattform QC Ergebnisse. Die Ergebnisse der QC-Plattform. In der oberen rechten Ecke sind die Ergebnisse des QZ für aktive Poren. Jeder Quadrant der Durchflusszelle ist für aktive Poren getestet. Die Hauptseite ist dynamisch und ändert sich wie jeder Quadrant getestet wird. In diesem Lauf waren 1.414 einzelne Poren erkannt.<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55979/55979supfig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Supplemental Figure 2" src="/files/ftp_upload/55979/55979supfig2.jpg"> 
Ergänzende Abbildung2: zu FASTQ Dateien Dateien konvertieren FAST5. Hier ist auf der rechten Seite die Ausgabe der Daten aus der Sequenzierung Flucht. Jede Zeile repräsentiert eine einzelne Sequenz. Die linke Seite der Abbildung zeigt die markierte Sequenz von der rechten Seite im HDF Viewer, der die Sequenz in eine FASTQ-Datei umwandelt, die zur weiteren Analyse verwendet werden können. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55979/55979supfig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Supplemental Figure 3" src="/files/ftp_upload/55979/55979supfig3.jpg"> 
Ergänzende Abbildung 3: Beispiel FASTQ Sequenz im HDF Viewer. Diese Sequenz (gelesen 803) ist in eine FASTQ-Datei, die Nukleotide FAST5 Daten umwandelt. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55979/55979supfig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

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Nanopore DNA Sequencing for Metagenomic Soil Analysis

Nanopore Technologie für Sequenzierung Biomoleküle hat breite Anwendungen in den Lebenswissenschaften einschließlich der Identifizierung von Krankheitserregern, Lebensmittelüberwachung Sicherheit, Genomanalyse, metagenomic Umweltüberwachung und Charakterisierung von bakteriellen Antibiotika-Resistenz. In diesem Artikel wird das Verfahren für die metagenomische Boden DNA-Sequenzierung zur Speziesidentifizierung mit Nanopore Sequenzierung Technik demonstriert.

Nanopore DNA-Sequenzierung für metagenomische Bodenanalyse

This article describes the steps for construction of a DNA library from soil, preparation and use of the nanopore flow cell, and analysis of the DNA ...

nanopore-dna-sequencing-for-metagenomic-soil-analysis

Research

JoVE Journal

Environment

30.2K Aufrufe.  Johns Hopkins University. Nanopore Technologie für Sequenzierung Biomoleküle hat breite Anwendungen in den Lebenswissenschaften einschließlich der Identifizierung von Krankheitserregern, Lebensmittelüberwachung Sicherheit, Genomanalyse, metagenomic Umweltüberwachung und Charakterisierung von bakteriellen Antibiotika-Resistenz. In diesem Artikel wird das Verfahren für die metagenomische Boden DNA-Sequenzierung zur Speziesidentifizierung mit Nanopore Sequenzierung Technik demonstriert.

Serie: Nanopore DNA Sequencing for Metagenomic Soil Analysis

Design and Operation of a Continuous 13C and 15N Labeling Chamber for Uniform or Differential, Metabolic and Structural, Plant Isotope Labeling

Tracing rare stable isotopes from plant material through the ecosystem provides the most sensitive information about ecosystem processes; from CO2 fluxes and soil organic matter formation to small-scale stable-isotope biomarker probing. Coupling multiple stable isotopes such as 13C with 15N, 18O or&#160;2H has the potential to reveal even more information about complex stoichiometric relationships during biogeochemical transformations. Isotope labeled plant material has been used in various studies of litter decomposition and soil organic matter formation1-4. From these and other studies, however, it has become apparent that structural components of plant material behave differently than metabolic components (i.e. leachable low molecular weight compounds) in terms of microbial utilization and long-term carbon storage5-7. The ability to study structural and metabolic components separately provides a powerful new tool for advancing the forefront of ecosystem biogeochemical studies. Here we describe a method for producing 13C and 15N labeled plant material that is either uniformly labeled throughout the plant or differentially labeled in structural and metabolic plant components.
Here, we present the construction and operation of a continuous 13C and 15N labeling chamber that can be modified to meet various research needs. Uniformly labeled plant material is produced by continuous labeling from seedling to harvest, while differential labeling is achieved by removing the growing plants from the chamber weeks prior to harvest. Representative results from growing Andropogon gerardii Kaw demonstrate the system&#39;s ability to efficiently label plant material at the targeted levels. Through this method we have produced plant material with a 4.4 atom%13C and 6.7 atom%15N uniform plant label, or material that is differentially labeled by up to 1.29 atom%13C and 0.56 atom%15N in its metabolic and structural components (hot water extractable and hot water residual components, respectively). Challenges lie in maintaining proper temperature, humidity, CO2 concentration,&#160;and light levels in an airtight 13C-CO2 atmosphere for successful plant production. This chamber description represents a useful research tool to effectively produce uniformly or differentially multi-isotope labeled plant material for use in experiments on ecosystem biogeochemical cycling.

Design and Operation of a Continuous 13C and 15N Labeling Chamber for Uniform or Differential, Metabolic and Structural, Plant Isotope Labeling

This method explains how to build and operate a continuous 13C and 15N isotope labeling chamber for uniform or differential plant tissue labeling. Representative results from metabolic and structural labeling of Andropogon gerardii are discussed.

Aufbau und Betrieb einer Dauer<sup&gt; 13</sup&gt; C und<sup&gt; 15</sup&gt; N Labeling Kammer für Uniform oder Differential, Stoffwechsel-und Struktur, Pflanze Isotope Labeling

Tracing rare stable isotopes from plant material through the ecosystem provides the most sensitive information about ecosystem processes; from CO2 fluxes ...

Forschung

Umwelt

Experimental Protocol for Manipulating Plant-induced Soil Heterogeneity

Coexistence theory has often treated environmental heterogeneity as being independent of the community composition; however biotic feedbacks such as plant-soil feedbacks (PSF) have large effects on plant performance, and create environmental heterogeneity that depends on the community composition. Understanding the importance of PSF for plant community assembly necessitates understanding of the role of heterogeneity in PSF, in addition to mean PSF effects. Here, we describe a protocol for manipulating plant-induced soil heterogeneity. Two example experiments are presented: (1) a field experiment with a 6-patch grid of soils to measure plant population responses and (2) a greenhouse experiment with 2-patch soils to measure individual plant responses. Soils can be collected from the zone of root influence (soils from the rhizosphere and directly adjacent to the rhizosphere) of plants in the field from conspecific and heterospecific plant species. Replicate collections are used to avoid pseudoreplicating soil samples. These soils are then placed into separate patches for heterogeneous treatments or mixed for a homogenized treatment. Care should be taken to ensure that heterogeneous and homogenized treatments experience the same degree of soil disturbance. Plants can then be placed in these soil treatments to determine the effect of plant-induced soil heterogeneity on plant performance. We demonstrate that plant-induced heterogeneity results in different outcomes than predicted by traditional coexistence models, perhaps because of the dynamic nature of these feedbacks. Theory that incorporates environmental heterogeneity influenced by the assembling community and additional empirical work is needed to determine when heterogeneity intrinsic to the assembling community will result in different assembly outcomes compared with heterogeneity extrinsic to the community composition.

Understanding the role of environmental heterogeneity in species coexistence has typically focused on types of heterogeneity that are extrinsic to the community&#8217;s species composition. We provide novel detailed methods for creating soil heterogeneity treatments using soils subject to plant-soil feedback conditioning, or heterogeneity intrinsic to the community composition.

Versuchsprotokoll für die Manipulation von Plant-induzierte Bodenheterogenität

Coexistence theory has often treated environmental heterogeneity as being independent of the community composition; however biotic feedbacks such as ...

Air-sampled Filter Analysis for Endotoxins and DNA Content

Outdoor aerosol research commonly uses particulate matter sampled on filters. This procedure enables various characterizations of the collected particles to be performed in parallel. The purpose of the method presented here is to obtain a highly accurate and reliable analysis of the endotoxin and DNA content of bio-aerosols extracted from filters. The extraction of high molecular weight organic molecules, such as lipopolysaccharides, from sampled filters involves shaking the sample in a pyrogen-free water-based medium. The subsequent analysis is based on an enzymatic reaction that can be detected using a turbidimetric measurement. As a result of the high organic content on the sampled filters, the extraction of DNA from the samples is performed using a commercial DNA extraction kit that was originally designed for soils and modified to improve the DNA yield. The detection and quantification of specific microbial species using quantitative polymerase chain reaction (q-PCR) analysis are described and compared with other available methods.

Two complementary analyses of atmospheric biological particles from air sampled filters are described herein: the extraction and detection of endotoxin, and of DNA.

Air-abgetastete Filteranalyse für Endotoxine und DNA-Gehalt

Outdoor aerosol research commonly uses particulate matter sampled on filters. This procedure enables various characterizations of the collected particles ...

A Protocol for Collecting and Constructing Soil Core Lysimeters

Leaching of nutrients from land applied fertilizers and manure used in agriculture can lead to accelerated eutrophication of surface water. Because the landscape has complex and varied soil morphology, an accompanying disparity in flow paths for leachate through the soil macropore and matrix structure is present. The rate of flow through these paths is further affected by antecedent soil moisture. Lysimeters are used to quantify flow rate, volume of water and concentration of nutrients leaching downward through soils. While many lysimeter designs exist, accurately determining the volume of water and mass balance of nutrients is best accomplished with bounded lysimeters that leave the natural soil structure intact. 
Here we present a detailed method for the extraction and construction of soil core lysimeters equipped with soil moisture sensors at 5 cm and 25 cm depths. Lysimeters from four different Coastal Plain soils (Bojac, Evesboro, Quindocqua and Sassafras) were collected on the Delmarva Peninsula and moved to an indoor climate controlled facility. Soils were irrigated once weekly with the equivalent of 2 cm of rainfall to draw down soil nitrate-N concentrations. At the end of the draw down period, poultry litter was applied (162 kg TN ha-1) and leaching was resumed for an additional five weeks. Total recovery of applied irrigation water varied from 71% to 85%. Nitrate-N concentration varied over the course of the study from an average of 27.1 mg L-1 before litter application to 40.3 mg L-1 following litter application. While greatest flux of nutrients was measured in soils dominated by coarse sand (Sassafras) the greatest immediate flux occurred from the finest textured soil with pronounced macropore development (Quindocqua).

A detailed method for extraction and assembly of intact soil core lysimeters and their use for study of leachate and associated loss of nutrients from surface applied poultry litter is demonstrated.

Ein Protokoll zum Sammeln und Konstruieren von Bodenkern Lysimeter

Leaching of nutrients from land applied fertilizers and manure used in agriculture can lead to accelerated eutrophication of surface water. Because the ...

A Gusseted Thermogradient Table to Control Soil Temperatures for Evaluating Plant Growth and Monitoring Soil Processes

Thermogradient tables were first developed in the 1950s primarily to test seed germination over a range of temperatures simultaneously without using a series of incubators. A temperature gradient is passively established across the surface of the table between the heated and cooled ends and is lost quickly at distances above the surface. Since temperature is only controlled on the table surface, experiments are restricted to shallow containers, such as Petri dishes, placed on the table. Welding continuous aluminum vertical strips or gussets perpendicular to the surface of a table enables temperature control in depth via convective heat flow. Soil in the channels between gussets was maintained across a gradient of temperatures allowing a greater diversity of experimentation. The gusseted design was evaluated by germinating oat, lettuce, tomato, and melon seeds. Soil temperatures were monitored using individual, battery-powered dataloggers positioned across the table. LED lights installed in the lids or along the sides of the gradient table create a controlled temperature chamber where seedlings can be grown over a range of temperatures. The gusseted design enabled accurate determination of optimum temperatures for fastest germination rate and the highest percentage germination for each species. Germination information from gradient table experiments can help predict seed germination and seedling growth under the adverse soil conditions often encountered during field crop production. Temperature effects on seed germination, seedling growth, and soil ecology can be tested under controlled conditions in a laboratory using a gusseted thermogradient table.

Traditional thermogradient tables create a range of temperatures across the surface. Welding gussets perpendicular to the surface of a thermogradient table will control temperature in depth increasing possible research applications.

Ein Gusseted Thermogradient Tabelle zur Bekämpfung von Bodentemperaturen für das Pflanzenwachstum Beurteilung und Überwachung von Bodenprozessen

Thermogradient tables were first developed in the 1950s primarily to test seed germination over a range of temperatures simultaneously without using a ...

Protocols for Quantifying Transferable Pesticide Residues in Turfgrass Systems

Plant canopies in established turfgrass systems can intercept an appreciable amount of sprayed pesticides, which can be transferred through various routes onto humans. For this reason, transferable pesticide residue experiments are required for registration and re-registration by the United States Environmental Protection Agency (USEPA). Although such experiments are required, limited specificity is required pertaining to experimental approach. Experimental approaches used to assess pesticide transfer to humans including hand wiping with cotton gloves, modified California roller (moving a roller of known mass over cotton cloth) and soccer ball roll (ball wrapped with sorbent strip) over three treated turfgrass species (creeping bentgrass, hybrid bermudagrass and tall fescue maintained at 0.4, 5 and 9 cm, respectively) are presented. The modified California roller is the most extensively utilized approach to date, and is best suited for use at low mowing heights due to its reproducibility and large sampling area. The soccer ball roll is a less aggressive transfer approach; however, it mimics a very common occurrence in the most popular international sport, and has many implications for nondietary pesticide exposure from hand-to-mouth contact. Additionally, this approach may be adjusted for other athletic activities with limited modification. Hand wiping is the best approach to transfer pesticides at higher mowing heights, as roller-based approaches can lay blades over; however, it is more subjective due to more variable sampling pressure. Utility of these methods across turfgrass species is presented, and additional considerations to conduct transferable pesticide residue research in turfgrass systems are discussed.

Transferable pesticide residue experiments in turfgrass systems are integral components of human risk exposure assessments. Experimental approaches to measure transferable residues should be adjusted to the human interaction of interest and turfgrass system dynamics. Three transferable pesticide residue protocols are presented and the suitability across three turfgrass systems is discussed.

Protokolle für die Quantifizierung tragbare Pestizidrückstände in Turfgrass Systeme

Plant canopies in established turfgrass systems can intercept an appreciable amount of sprayed pesticides, which can be transferred through various routes ...

A Lipid Extraction and Analysis Method for Characterizing Soil Microbes in Experiments with Many Samples

Microbial communities are important drivers and regulators of ecosystem processes. To understand how management of ecosystems may affect microbial communities, a relatively precise but effort-intensive technique to assay microbial community composition is phospholipid fatty acid (PLFA) analysis. PLFA was developed to analyze phospholipid biomarkers, which can be used as indicators of microbial biomass and the composition of broad functional groups of fungi and bacteria. It has commonly been used to compare soils under alternative plant communities, ecology, and management regimes. The PLFA method has been shown to be sensitive to detecting shifts in microbial community composition.
An alternative method, fatty acid methyl ester extraction and analysis (MIDI-FA) was developed for rapid extraction of total lipids, without separation of the phospholipid fraction, from pure cultures as a microbial identification technique. This method is rapid but is less suited for soil samples because it lacks an initial step separating soil particles and begins instead with a saponification reaction that likely produces artifacts from the background organic matter in the soil. 
This article describes a method that increases throughput while balancing effort and accuracy for extraction of lipids from the cell membranes of microorganisms for use in characterizing both total lipids and the relative abundance of indicator lipids to determine soil microbial community structure in studies with many samples. The method combines the accuracy achieved through PLFA profiling by extracting and concentrating soil lipids as a first step, and a reduction in effort by saponifying the organic material extracted and processing with the MIDI-FA method as a second step.

The article describes a method that increases throughput while balancing effort and accuracy for extraction of lipids from the cell membranes of microorganisms for use in characterizing both total lipids and the relative abundance of indicator lipids to determine soil microbial community structure in studies with many samples.

Eine Lipid-Extraktions- und Analysemethode zur Charakterisierung von Boden-Mikroben in Experimenten mit vielen Proben

Microbial communities are important drivers and regulators of ecosystem processes. To understand how management of ecosystems may affect microbial ...

Measuring and Mapping Patterns of Soil Erosion and Deposition Related to Soil Carbonate Concentrations Under Agricultural Management

Spatial patterns of soil erosion and deposition can be inferred from differences in ground elevation mapped at appropriate time increments. Such changes in elevation are related to changes in near-surface soil carbonate (CaCO3) profiles. The objective is to describe a simple conceptual model and detailed protocol for repeatable field and laboratory measurements of these quantities. Here, accurate elevation is measured using a ground-based differential global positioning system (GPS); other data acquisition methods could be applied to the same basic method. Soil samples are collected from prescribed depth intervals and analyzed in the lab using an efficient and precise modified pressure-calcimeter method for quantitative analysis of inorganic carbon concentration. Standard statistical methods are applied to point data, and representative results show significant correlations between changes in soil surface layer CaCO3 and changes in elevation consistent with the conceptual model; CaCO3 generally decreased in depositional areas and increased in erosional areas. Maps are derived from point measurements of elevation and soil CaCO3 to aid analyses. A map of erosional and depositional patterns at the study site, a rain-fed winter wheat field cropped in alternating wheat-fallow strips, shows the interacting effects of water and wind erosion affected by management and topography. Alternative sampling methods and depth intervals are discussed and recommended for future work relating soil erosion and deposition to soil CaCO3.

Spatial patterns of soil erosion and deposition can be inferred from differences in ground elevation mapped at appropriate time increments. Such changes in elevation are related to changes in near-surface soil carbonates. Repeatable methods for field and laboratory measurements of these quantities and data analysis methods are described here.

Messung und Mapping-Muster von Erosion und Ablagerung im Zusammenhang mit Boden-Karbonat-Konzentrationen unter Landbewirtschaftung

Spatial patterns of soil erosion and deposition can be inferred from differences in ground elevation mapped at appropriate time increments. Such changes ...

Collection and Extraction of Occupational Air Samples for Analysis of Fungal DNA

Traditional methods of identifying fungal exposures in occupational environments, such as culture and microscopy-based approaches, have several limitations that have resulted in the exclusion of many species. Advances in the field over the last two decades have led occupational health researchers to turn to molecular-based approaches for identifying fungal hazards. These methods have resulted in the detection of many species within indoor and occupational environments that have not been detected using traditional methods. This protocol details an approach for determining fungal diversity within air samples through genomic DNA extraction, amplification, sequencing, and taxonomic identification of fungal internal transcribed spacer (ITS) regions. ITS sequencing results in the detection of many fungal species that are either not detected or difficult to identify to species level using culture or microscopy. While these methods do not provide quantitative measures of fungal burden, they offer a new approach to hazard identification and can be used to determine overall species richness and diversity within an occupational environment.

Determining the fungal diversity within an environment is a method utilized in occupational health studies to identify health hazards. This protocol describes DNA extraction from occupational air samples for amplification and sequencing of fungal ITS regions. This approach detects many fungal species that can be overlooked by traditional assessment methods.

Erfassung und Gewinnung von betrieblichen Luftproben für Analyse der Pilz DNA

Traditional methods of identifying fungal exposures in occupational environments, such as culture and microscopy-based approaches, have several ...

Isolation and Analysis of Microbial Communities in Soil, Rhizosphere, and Roots in Perennial Grass Experiments

Plant and soil microbiome studies are becoming increasingly important for understanding the roles microorganisms play in agricultural productivity. The purpose of this manuscript is to provide detail on how to rapidly sample soil, rhizosphere, and endosphere of replicated field trials and analyze changes that may occur in the microbial communities due to sample type, treatment, and plant genotype. The experiment used to demonstrate these methods consists of replicated field plots containing two, pure, warm-season grasses (Panicum virgatum and Andropogon gerardii) and a low-diversity grass mixture (A. gerardii, Sorghastrum nutans, and Bouteloua curtipendula). Briefly, plants are excavated, a variety of roots are cut and placed in phosphate buffer, and then shaken to collect the rhizosphere. Roots are brought to the laboratory on ice and surface sterilized with bleach and ethanol (EtOH). The rhizosphere is filtered and concentrated by centrifugation. Excavated soil from around the root ball is placed into plastic bags and brought to the lab where a small amount of soil is taken for DNA extractions. DNA is extracted from roots, soil, and rhizosphere and then amplified with primers for the V4 region of the 16S rRNA gene. Amplicons are sequenced, then analyzed with open access bioinformatics tools. These methods allow researchers to test how the microbial community diversity and composition varies due to sample type, treatment, and plant genotype. Using these methods along with statistical models, the representative results demonstrate there are significant differences in microbial communities of roots, rhizosphere, and soil. Methods presented here provide a complete set of steps for how to collect field samples, isolate, extract, quantify, amplify, and sequence DNA, and analyze microbial community diversity and composition in replicated field trials.

Excavation of plant roots from the field as well as processing of samples into endosphere, rhizosphere, and soil are described in detail, including DNA extraction and data analysis methods. This paper is designed to enable other laboratories to use these techniques for the study of soil, endosphere, and rhizosphere microbiomes.

Isolierung und Analyse der mikrobiellen Lebensgemeinschaften im Boden, Rhizosphäre und Wurzeln in mehrjährige Grass Experimente

Plant and soil microbiome studies are becoming increasingly important for understanding the roles microorganisms play in agricultural productivity. The ...