In diesem Teilchen führen wir eine In-vitro-Rekonstitutionsplattform ein, die die Lipidumgebung der mitochondrieninneren Membran imitiert. Diese Plattform kann verwendet werden, um molekulare Mechanismen der mitochondrieninneren Membranfusion zu untersuchen. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie die quantitative Untersuchung von integralen Membranproteinen und membranassoziierten Proteinen in einer nahezu einheimischen Umgebung ermöglicht.
Mischen Sie zunächst die Lösungen A und B nach Manuskriptanweisungen, und erzeugen Sie dann die Lipidmischung, indem Sie das berechnete Volumen der Speicherlösung mit einer Glasspritze in Bernsteinfläschchen einteilen. Passen Sie das endgültige Volumen an, indem Sie den Durchstechflaschen zusätzliches Chloroform hinzufügen. Backen Mikroskop AbdeckungGlas gleitet bei 520 Grad Celsius für 30 Minuten.
Nach dem Backen auf Raumtemperatur abkühlen. Fügen Sie unter Rühren etwa 10 Gramm Natriumhydroxid zu 500 Milliliter Methanol hinzu. Rühren Sie für zwei Stunden, weiterhin Natriumhydroxid in die Lösung hinzufügen, bis ausgefällt beginnen zu zeigen.
Reinigen Sie die Glasgleletts in 10%Natriumdodecylsulfatlösung, mit Natriumhydroxid gesättigtem Methanol und 50 Millimolar-Salzsäure, wobei die Dias unter jeder Bedingung 30 Minuten lang sequenziell gebadet werden. Reinigen Sie die Glasgleitet in Reinstwasser für 10 Minuten zwischen jedem Zustand. Bewahren Sie das gereinigte Deckglas bis zu zwei Wochen in Salzsäurelösung abgedichtet auf, um eine gute Zweischichtqualität zu gewährleisten.
Reinigen Sie den Polytetrafluorethylen-Trog des Langmuir-Blodgett-Tauchsystems mit Chloroform und Reinstwasser, bis keine Benetzung beobachtet wird. Chloroform auf die Trogoberfläche sprühen und dreimal mit Zellulosetüchern gründlich abwischen, dann dreimal mit Reinstwasser abspülen und das Wasser durch Absaugen entfernen. Wenn Sie fertig sind, bedecken Sie die Oberfläche des Trogs mit sauberem Reinstwasser.
Nehmen Sie zwei Stücke oberflächenbehandeltes Deckglas aus der Reinigungslösung und spülen Sie sie ca. 30 Sekunden lang mit Reinstwasser ab. Legen Sie das Deckglas mit der Substratklemme auf, um die Glasgeuge zu halten. Tauchen Sie die Glasrutsche unter die Wasseroberfläche ein, indem Sie manuell auf den Dipper auf die Langmuir-Steuerung klicken.
Null die Filmwaage und sorgsam verteilt Lösung B Tropfen für Tropfen an der Luftwasserschnittstelle. Stellen Sie sicher, dass sich Lipide nur an der Luftwasserschnittstelle ausbreiten, ohne dass Chloroform- und Lipidtröpfchen auf den Boden der Polytetrafluorethylenoberfläche sinken, wodurch ein Lipidkanal entsteht und die Monolayerbildung verhindert wird. Beenden Sie das Hinzufügen von Lipiden, wenn die Filmbilanz ausgelesen wird, um 15 bis 20 Millinewton pro Meter.
Warten Sie 10 bis 15 Minuten, und starten Sie dann den Barriereregler, um die Oberfläche zu ändern, indem Sie auf Experiment starten klicken. Warten Sie, bis die Auslesung der Filmwaage auf 37 Millinewton pro Meter ansteigt, und halten Sie den Druck etwa 20 bis 30 Minuten. Heben Sie das Deckglas mit einer Geschwindigkeit von 22 Millimetern pro Minute an, während die Oberflächenspannung bei 37 Millinewton pro Meter bleibt.
Eine Lipid-Monoschicht mit Polymer-Tethering wird durch den Blodgett-Tauchprozess von der Luftwasserschnittstelle auf die Oberfläche des Deckglases übertragen und bildet die untere Packungsbeilage der Lipid-Bischicht. Reinigen Sie die Luftwasserschnittstelle durch Absaugen und spülen Sie den Trog mit Reinstwasser ab. Nach der Reinigung einer einwelligen Glasrutsche mit Chloroform, Ethanol und Reinstwasser, legen Sie sie auf den Trog unter der Wasserschicht.
Stellen Sie sicher, dass der Brunnen zur Luftwasserschnittstelle hin ausgerichtet ist und gießen Sie frisches Reinstwasser, bis die Glasrutsche vollständig abgedeckt ist, und tauchen Sie dann die Glasrutsche wie zuvor beschrieben unter die Wasseroberfläche. Halten Sie das Deckglas mit der Lipid-Monoschicht mit einem Silizium-Saugnapf und schieben Sie die Lipid-Monolayer vorsichtig an die Luftwasserschnittstelle. Halten Sie das Deckglas für zwei bis drei Sekunden an der Schnittstelle, dann drücken Sie es gegen die Folie.
Nehmen Sie die Rutsche mit dem Deckglas heraus. Nehmen Sie das Deckglas und die Zweischicht zu einem Epifluoreszenzmikroskop und bilden Sie die Lipid-Doppelschicht nach Texthandschriftrichtungen ab. Bereiten Sie eine Kristallisationsschale mit Reinstwasser vor und legen Sie einen sauberen Mikroskop-Bildring unter die Schale.
Tauchen Sie diese Rutsche und Deckglas, die die Lipid-Bi-Schicht unter dem Wasser enthalten. Trennen Sie vorsichtig die Folie und das Deckglas, halten Sie die Deckglasrutsche von unten und übertragen Sie das Deckglas in den Bildring. Ersetzen Sie das Reinstwasser im Bildring durch einen Bis-Tris-Natriumchloridpuffer, um sicherzustellen, dass die Lipid-Bi-Schicht keiner Luftblasen ausgesetzt ist.
1.1 nanomolar n-octyl-beta-glucopyranoside in die Lipid-Bischicht geben, dann sofort die Mischung aus 1,2 Nanomolar DDM und 1,3 Picomolen von gereinigtem L-OPA1 in den Bildring geben. Inkubieren Sie die Probe zwei Stunden lang mit niedriger Geschwindigkeit auf einem Tischschüttler. Verteilen Sie 30 Milligramm SM-2 Harzperlen in drei Milliliter Bis-Tris Puffer und schütteln.
Verwenden Sie eine Kunststoffpipette, um 5 bis 10 Mikroliter der SM-2 Harzperlen in den Bildring einzutragen und 10 Minuten lang zu bebrüten, und spülen Sie dann die Harzperlen. Das endige Volumen des Puffers im Bildring sollte 1,5 Milliliter betragen. Bereiten Sie ein Milligramm Lipidgemisch A in Chloroform-Lösung vor, verdampfen Sie dann Chloroform unter Stickstofffluss für 20 Minuten.
Halten Sie die Mischung über Nacht unter Vakuum, um einen Lipidfilm zu bilden. Bereiten Sie 50 Millimolar Calcium enthaltenden Puffer durch Auflösen von 15,56 Gramm Calcein in 50 Milliliter 1,5 Mol Natriumhydroxid-Lösung. Rühren Sie die Mischung bei Raumtemperatur, bis Calcein vollständig gelöst ist.
12,5 Millimolar Bistris und Reinstwasser für ein Endvolumen von 500 Millilitern hinzufügen und den pH-Wert auf 7,5 einstellen. Lipidfilm in Calcein enthaltenden Puffer abgeben, dann das Lipid vollständig hydratisieren, indem sie die Suspension 20 Minuten lang bei 65 Grad Celsius erhitzen. Form 200 Nanometer Liposomen über Extrusion mit einer Polycarbonatmembran.
Fügen Sie zwei Mikrogramm L-OPA1 in 0,5 Mikromolar DDM, 2,2 Milligramm Liposom und inkubieren die Lösung bei vier Grad Celsius für 1,5 Stunden. Entfernen Sie das Tensid durch Dialyse mit einer 3,5 Kilodalton-Dialysekassette gegen 250 Milliliter 25 Millimolar Bis-Tris, 150 Millimolar-Natriumchlorid und 50 Millimolar-Calciumpuffer bei vier Grad Celsius über Nacht, wobei der Puffer zweimal gewechselt wird. Entfernen Sie zusätzliches Kalkein mithilfe einer PD10-Entaltungsspalte, und fahren Sie dann mit der Bildgebung und Datenanalyse fort, wie im Textmanuskript beschrieben.
Epifluoreszenzmikroskopiebilder einer Lipid-Bischicht und ihrer Lipidfluidität sind hier dargestellt. Die Lipidverteilung wird vor und nach dem Photobleichen und die Homogenität vor und nach der Rekonstitution gezeigt. L-OPA1 rekonstituierte und Lipid-Bi-Schicht wurde durch Fluoreszenz-Korrelationsspektroskopie oder FCS validiert.
Die FCS-Kurven deuteten darauf hin, dass 75% von L-OPA1 in der Lipid-Bi-Schicht rekonstituiert wurden, was darauf hindeutet, dass L-OPA1 frei in der Polymer-gebundenen Lipid-Bi-Schicht diffundiert wird, mit dem Potenzial, sich selbst zu funktionellen Komplexen zu montieren. Fluoreszenz-Schrittbleiche zeigte an, dass durchschnittlich zwei bis drei Kopien von L-OPA1 in einem gegebenen Liposom rekonstituiert wurden. Die Größenverteilung von L-OPA1 rekonstituierten Proteoliposomen wurde nach der Rekonstitution mit DLS getestet und mit FCS überprüft.
Die Membran-Tethering wurde überwacht, indem das Signal von Texas Red auf der Oberfläche der Lipid-Bi-Schicht mittels TIRF-Mikroskopie beobachtet wurde. Membranlipid-De-Mixing oder Hämifusion wurde durch Texas Red überwacht, als der Liposomenmarker in die Lipid-Bi-Schicht diffundierte. Calcein-De-Quenching half dabei, die vollständige Fusionsporenbildung von nur lipid-De-Mixing zu unterscheiden, was einen Vergleich zwischen Bedingungen ermöglichte, unter denen Partikel bei der Hämifusion stagnieren, und Partikeln, die zur vollständigen Fusion übergehen.
Membran-Tethering wurde durch ein stabiles Lipidsignal von Liposomen angezeigt und Ergusssignal zeigte keine De-Quenching im Calcein-Signal, aber ein schneller Zerfall des Texas Red Signals deutete auf diffusion des Farbstoffs in die Lipid-Bi-Schicht hin. Volle Fusion beinhaltete sowohl Lipidzerfall als auch Inhaltsfreisetzung. Denken Sie beim Versuch dieses Partikels daran, sowohl das Deckglas als auch den Langmuir-Trog gründlich zu reinigen, um sicherzustellen, dass Zweischichten von hoher Qualität hergestellt werden.
Eine gute Luftqualität ist auch entscheidend, um Defekte in der Zweischicht zu verhindern. Diese Technik ebnet uns den Weg, neue Fragen in der Mitochondrien-Membrandynamik und -Organisation zu erforschen. Spannende Zukunftsexperimente umfassen die Erforschung des Einflusses von Zweischicht-Assimetrie, Membranpotenzial und krankheitsbedingten Mutanten in der inneren Membrandynamik der Mitochondrien.
