Das hier beschriebene Rekonstitutions- und Fusionsprotokoll ist eine effiziente Möglichkeit, membrangebundene Proteine in einem Modell lipid-Bilayer- und Lipid-Mixing durch Fusionsproteine zu untersuchen. Hier beschreiben wir eine waschmittelunterstützte Rekonstitution von rekombinantem Drosophila Atlastin, einem ER-Fusionsprotein, in vorgeformte Phosphatidylcholin-Liposomen. Die Fusion von Atlastin-Proteoliposomen wird dann mit einem FRET-basierten Lipid-Mischtest gemessen.
Einer der Hauptvorteile der waschmittelunterstützten Rekonstitution ist, dass das Protein in Waschmittel nicht Trocken- oder Lösungsmitteln ausgesetzt ist. Wir zeigen hier auch, dass die Rekonstitutionsorientierung von Atlastin sehr effizient ist. Ein weiterer Vorteil des FRET-basierten Lipid-Mixing-Assays ist, dass die Liposomen nicht mit einem Farbstoff beladen werden müssen, und es gibt keine Notwendigkeit für zusätzliche Dialyse-Schritte.
Um dieses Verfahren zu beginnen, bereiten Sie die Lipidmischungbestände in Chloroform vor, wie im Textprotokoll beschrieben. Fügen Sie einen Mikrocurie pro Milliliter DPPC zu den Lipidmischungen hinzu, um sicherzustellen, dass mindestens acht Mikroliter dieses Bestands reserviert werden. Übertragen Sie die gewünschte Menge der Lipidmischungen in Feuersteinglasröhren.
Dann trocknen Sie das Lipid unter einem sanften Strom von Stickstoffgas für ca. 10 Minuten, bis kein Chloroform mehr sichtbar ist. Trocknen Sie den resultierenden Lipidfilm weiter in einem Trockenbau, indem Sie 30 Minuten lang saugen. Danach fügen Sie genügend A100 mit 10% Glycerin, zweimillimolarem 2-Mercaptoethanol und ein Millimolar EDTA in den Lipidfilm, um die Konzentration wieder auf 10 Millimolar zu bringen.
Den Lipidfilm wieder aufbrechen, indem Sie bei Raumtemperatur 15 Minuten leicht wirbeln. Die hydratisierten Lipide in flüssigem Stickstoff einfrieren. Um die Liposomen aufzutauen, lassen Sie die Lösung 30 Sekunden bei Raumtemperatur sitzen und übertragen Sie sie dann wieder ins Wasser, um schneller aufzutauen.
Wiederholen Sie diesen Frost-Tau-Zyklus insgesamt 10 Mal. Danach verwenden Sie einen Mini-Extruder, um die Lipide durch Polycarbonat-Filter zu passieren, mit einer Porengröße von 100 Nanometern, 19 Mal. Um die Gesamtfettkonzentration der Liposomen zu bestimmen, fügen Sie vier Mikroliter Lipidbestand und Lysosomen zu drei Millilitern Szintillationscocktail hinzu.
Messen Sie die durchschnittlichen Anzahlen pro Minute für Bestand und Liposomen und berechnen Sie die Liposomenkonzentration, wie im Textprotokoll beschrieben. Bewahren Sie die Liposomen bis zu einer Woche bei vier Grad Celsius auf. Mischen Sie zunächst die entsprechende Menge an Puffer, zusätzlichem Reinigungsmittel und Protein in einer 0,5-Milliliter-Röhre, wie im Textprotokoll beschrieben.
Fügen Sie die Liposomen schnell hinzu und wirbeln Sie sofort für fünf Sekunden, um die Mischung zu homogenisieren. Inkubieren Sie die Reaktion in einem Nutator bei vier Grad Celsius für eine Stunde. Während dieser Inkubation 0,2 Gramm Polystyrol adsorbierende Perlen wiegen und in ein Mikrozentrifugenrohr übertragen.
Fügen Sie einen Milliliter Methanol in die Röhre, und mischen Sie für eine Minute, um die Perlen zu entgasen. Dann das Methanol mit einer 21-Spur oder höher Nadel ansaugen. Um mit dem Waschen der Perlen zu beginnen, fügen Sie Ihnen Wasser hinzu.
Lassen Sie die Perlen mit dem Wasser für fünf Minuten mischen, dann das Wasser aspirieren. Wiederholen Sie diesen Wasserwaschvorgang viermal. Danach wasserauftragen, um die Polystyroladsorbent-Perle auf ein Volumen von einem Milliliter mit einer Endkonzentration von 0,2 Gramm pro Milliliter zu bringen.
Berechnen Sie die Menge an Polystyrol adsorbent Perlen benötigt, um alle Reinigungsmittel in jeder Probe adsorbieren, wie im Textprotokoll beschrieben. Schneiden Sie eine Pipettenspitze, um die Perlenschlämme zu sammeln. Übertragen Sie die berechnete Menge an Perlenschlämme auf ein 0,5-Milliliter-Rohr und saugen Sie das Wasser an.
Fügen Sie die Proben in die Röhre mit den Perlen, und in einem Nutator bei vier Grad Celsius für eine Stunde inkubieren. Übertragen Sie die Proben in ein frisches Rohr mit neuen Perlen, um sicherzustellen, dass die alten Perlen zurückbleiben. Unter den gleichen Bedingungen erneut inkubieren.
Wiederholen Sie diesen Vorgang des Übertragens und Inkubierens der Perlen zweimal. Danach die Probe in eine neue Röhre mit frischen Perlen geben und durch Übernacht bei vier Grad Celsius bebrüten. Am nächsten Tag die Probe bei 16 000 mal g und vier Grad Celsius für 10 Minuten aus den Perlen und der Zentrifuge entfernen, um die unlöslichen Proteinaggregate zu pellet.
Stellen Sie den Überstand wieder her und bestimmen Sie die endgültige Lipidkonzentration durch Flüssigszintillationszählung, wie im Textprotokoll beschrieben. Zunächst bringen Sie die Spender- und Akzeptorproteoliposomen auf eine Konzentration von je 0,15 Millimolar in A100, die Glycerin, Beta-Mercaptoethanol, EDTA und Magnesiumchlorid enthält. Übertragen Sie jede Reaktion auf einen Brunnen in einer flachen 96-Well-Platte, die für die Fluoreszenzmessung geeignet ist, und stellen Sie sicher, dass mindestens vier Reaktionen vorbereitet werden, einschließlich einer Dreifach- und einer No-GTP-Negativkontrolle.
Legen Sie die Platte bei 37 Grad Celsius in einen vorgeheizten Plattenleser. Messen Sie die NBD-Fluoreszenz jede Minute für fünf Minuten. Fügen Sie dann fünf Millimolar GTP, um Fusion zu induzieren.
Messen Sie die NBD-Fluoreszenz jede Minute für eine Stunde mit der gleichen Anregung und Emission wie zuvor. Danach fügen Sie fünf Mikroliter von 2,5%n-Dodecyl beta-D-Maltoside in die Brunnen, um die Proteoliposomen aufzulösen, und messen Sie die maximale NBD-Fluoreszenz jede Minute für 15 Minuten mit der gleichen Anregung und Emission. In dieser Studie wird rekombinantes Drosophila-Atlastin gereinigt und zu vorgeformten Liposomen rekonstituiert.
Die Wirksamkeit der Atlastin-Rekonstitution wird durch schwimmende rekonstituierte Proteoliposomen in einem diskontinuierlichen Ozorgradienten bestimmt. Proben der oberen, mittleren und unteren Gradientenschichten werden von SDS-PAGE und Coomassie-Färbung geerntet und analysiert. Die Quantifizierung des Gels durch Densitometrie zeigt eine sehr hohe Effizienz der Rekonstitution mit vernachlässigbaren Verlusten, wobei 96% des gesamten Proteins als Proteoliposomen gefunden werden, die in die oberste Schicht schwammen.
Weniger als 1% des Proteins ist nicht rekonstituiert und findet sich in der mittleren Schicht, und nur 3% ist unrekonstituiert oder aggregiert und in die untere Schicht sedimentiert. Die Ausrichtung von Atlastin nach Rekonstitution wird durch Thrombinspaltungstests quantifiziert. Die Proben werden mit SDS-PAGE- und Coomassie-Färbung analysiert und durch Densitometrie quantifiziert.
Der größte Teil des rekonstituierten Proteins ist zerklebend, wobei nur 7% vor der Protease geschützt sind. Die Kinetik und das Ausmaß der atlastinvermittelten proteoliposomen Fusion werden durch Lipid-Mixing-Assays analysiert. Eine Inkubation von fünf Minuten wird durchgeführt, bevor die Fusion mit GTP zum Nullzeitpunkt induziert wird.
Nach einer Stunde wurde n-Dodecyl beta-D-Maltoside hinzugefügt, um die Proteoliposomen zu slubilisieren und die maximale fluoreszierende Resonanztransferfreisetzung zu erhalten. Das Fusionsmaximum im Lauf wird auf 11% der maximalen Fluoreszenz gesehen. Lipide werden in Chloroform gelöst.
Bei der Vorbereitung der Lipidmischungen, stellen Sie sicher, dass dies schnell zu tun, auf einer chemischen Haube, und auf Eis, um jede Verdunstung zu vermeiden. Es ist möglich, Atlastin-Proteoliposomen mittels Mikroskopie zu analysieren, um die Auswirkungen eines Membranankers auf Liposomenform und -größe zu visualisieren. Diese Methode wurde erweitert, um andere membranverankerte Proteine zu untersuchen und zu untersuchen, wie sich das Verhalten in einem Modelllipid-Doppelschicht verhalten.
Dieses Protokoll verwendet titrierte Lipide, um Lipidmischungen zu quantifizieren. Achten Sie bei der Arbeit mit radioaktiven Stoffen auf die notwendigen Vorsichtsmaßnahmen.
