Die Autoren danken Wei Zhang von Guanhao Biotech für die Bereitstellung der dezellularen Gerüste. Wir danken Xiao-hong Peng für die hilfreichen Diskussionen. Diese Forschung wurde finanziell unterstützt von der Nationalen Naturwissenschaftlichen Stiftung von China (Projekt Nr.31322021).

Alle Experimente wurden vom Peking University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC, IACUC Nr. COE-LuoY-1) genehmigt. 1. Islet Isolation <ol><li> Vorbereitung von Reagenzien und Geräten. <ol><li> Rekonstituieren Sie Collagenase P Pulver (2 U / mg) in HBSS, um eine 5 mg / ml Lösung herzustellen, und filtrieren Sie sie durch einen 0,22 μm Filter, um die Bakterien zu entfernen. 0,6 ml Aliquot-Lösungen von Collagenase P in 15-ml-konischen Röhrchen vorbereiten und bei -20 ° C aufbewahren. HINWEIS: Während des Gebrauchs wird jedes Aliquot mit HBSS verdünnt, um 6-ml-Arbeitslösungen mit Endkonzentrationen von 0,5 mg / ml oder 1 U / ml (ausreichend zur Behandlung von 3 Mäusen) zu ergeben. Die Arbeitslösung wird innerhalb von 1 h auf Eis für den sofortigen Gebrauch aufbewahrt. Die Arbeitslösung sollte nicht für einen zusätzlichen Gebrauch wiederhergestellt oder wieder eingefroren werden. </li><li> Vorbereitung der Neutralisationslösung durch Zugabe von FBS (2,5%) und P / S (1%) in HBSS; Halten Sie die Lösung auf Eis. 60 ml Neutralisationslösung auf Trea vorbereitenT 6 Mäuse </li><li> Für das Islet-Kulturmedium wird D-Glucose (7 mM), FBS (10%) und P / S (1%) zu RPMI 1640 Medium gegeben. </li><li> Autoklavieren Sie die Chirurgiegeräte bei 115 ° C für 30 min und 15 psi Druck. </li></ol></li><li> Inflation der Bauchspeicheldrüse <ol><li> 12 ml Kollagenase-Arbeitslösung, wie in Schritt 1.1.1 angegeben, für 6 Mäuse (12 Wochen alt) vorbereiten. Füllen Sie die 10 ml Spritze mit 9 ml Arbeitslösung und verbinden Sie die Spritze mit der 27 G intravenösen Nadel. Die Spritze auf Eis aufbewahren und die Lösung innerhalb von 1 h verwenden. </li><li> Euthanisieren Sie die Maus durch zervikale Versetzung. Legen Sie die Maus in Rückenlage auf ein Papiertuch, wobei der Schwanz auf den Bediener zeigt. Spray den ganzen Körper mit 70% Ethanol, so dass es völlig nass. </li><li> Machen Sie eine V-Inzision, beginnend mit dem Genitalbereich und erstreckt sich bis zum Zwerchfell, mit Sektionsscheren und Pinzetten. Falten Sie die Haut über die Brust, um die Bauchhöhle vollständig zu enthüllen. </li><li> BewegungDen Darm auf der rechten Seite der Maus und setzen die Bauchspeicheldrüse und gemeinsame Gallengang. Greifen Sie den Duodenum sorgfältig mit Pinzette und ziehen Sie ihn, bis der Gallengang straff ist ( Abbildung 1A -1 und A-2 ). </li><li> Finde die Pfortader und Gallengang in die Leber. Klemmen Sie die Pfortader und den Gallengang mit einer mikroskopischen hämostatischen Klemme. HINWEIS: Die Klemmung verhindert eine übermäßige Blutung und den Eintritt der Kollagenase in die Leber. </li><li> Während sie den Darm noch mit der Pinzette halten, finden Sie die Lage der Ampulle, die den Gallengang und den Duodenum verbindet. Setzen Sie die 27G intravenöse Nadel in den gemeinsamen Gallengang durch die Ampulle ein ( Abbildung 1B -1 und B-2 ). </li><li> Geben Sie etwa 200 μl Collagenase-Arbeitslösung an, um zu überprüfen, ob die Kanüle den ganzen Weg durch Gallengang ist. Wenn die Kollagenase-Lösung beginnt, den Kanal zu füllen ( 1 und C2 ), die Nadel befindet sich im Lumen des Kanals; Klemmen Sie das Kanalsegment, das die Nadel enthält, mit einer hämostatischen Arterie-Klemme und geben den Rest der 2-ml-Lösung mit einer langsamen und konstanten Geschwindigkeit innerhalb von 1 min ab ( Abbildung 2A- 1 , A-2 und B-1 ). HINWEIS: Wenn das Gewebe, das den Kanal umgibt, aufzublasen beginnt ( Abbildung 2B -2 ), hat sich die Nadel durch die Wand des Gallenganges gestoßen, was es notwendig macht, die Nadel neu zu positionieren und den Gallengang wieder zu kanieren. Ähnlich, wenn das Duodenum beginnt zu blasen ( Abbildung 2C -1 und C-2 ), muss die Arterie hämostatische Klemme angepasst werden und die Gallengang wieder kanüliert werden. Als die Kollagenase-Lösung die Bauchspeicheldrüse füllt, pflanzt sich das Gewebe in der Nähe des Duodenums zuerst, gefolgt von der RegioN in der Nähe des Bauchspeicheldrüsenschwanzes Die Perfusion des Pankreasschwanzes (der Milzlappen) ist wichtig, um die Islet-Ausbeute zu maximieren. </li><li> Nach dem vollständigen Aufblasen der Bauchspeicheldrüse ( Abb. 2C -1 ) schieben Sie den Darm auf die linke Seite der Maus und entfernen Sie die Bauchspeicheldrüse, indem Sie am absteigenden Dickdarm beginnen. Benutze die Pinzette, um den Darm zu heben und ihn von der Pankreas mit einer anderen Pinzette zu trennen. Weiter, um die Bauchspeicheldrüse zu entfernen, bis sie von der Oberseite des Magens ungebunden ist. Schließlich hebe die Bauchspeicheldrüse aus dem Bauch und schneide es von der verbleibenden Milz frei. HINWEIS: Die gesamte Trennung sollte schnell durchgeführt werden, da die Verdauung während des Entfernungsvorgangs fortgesetzt wird. </li><li> Legen Sie die Bauchspeicheldrüse in eine leere 15-ml-Kegelröhre und lassen Sie sie auf Eis. Wiederholen Sie den obigen Vorgang für die verbleibenden Mäuse. Alle Bauchspeicheldrüse sollten innerhalb von 1 h weiterverarbeitet werden, um sofort nach Schritt 1.3 zu verhindern, um eine Überverdauung durch Kollagenase P zu verhindern/ Li&gt; </ol></li></ol><img alt="Abbildung 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/54995/54995fig1.jpg" /> Abbildung 1: Fotografien, die die Kanülierung des Gallenganges und die Perfusion der Bauchspeicheldrüse mit Kollagenaselösungen zeigen. ( A1 ) Ziehen des Duodenums, bis der Gallengang straff ist (Ampulla: die dreieckige, milchige Fläche auf der Oberfläche des Duodenums, Gallengang: die kordelartige milchige Struktur auf der Oberfläche). ( B1 ) Einsetzen der Nadel in den Gallengang von der Ampulle. ( C1 ) Aufblasen der Bauchspeicheldrüse mit der Injektion von Enzym. ( A2, B2 und C2 ) Karikaturbilder der in A1, B1 und C1 gezeigten Verfahren. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54995/54995fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> Abbildung 2: Fehlersuche für die Kanüle. ( A1 ) Die Nadelspitze, die in das Lumen des Gallenganges eingeführt ist. ( A2 ) Der Kanal mit Enzymlösungen gefüllt. ( B1 ) Die Nadel, die in das Lumen des Gallenganges eingeführt wurde, und die mit einem blauen Farbstoff gefüllte Leitung. ( B2 ) Aufgrund der ungeeigneten Kanülen befindet sich die Nadel unter dem Gallengang, und nach der Abgabe des blauen Farbstoffs wird nur eine aufgeblasene Kapsel beobachtet. ( C1 ) Eine erfolgreiche Kanülierung wird durch die Ausdehnung der Bauchspeicheldrüse belegt. ( C2 ) Durch unangemessenes Klemmen tritt blauer Farbstoff in den Duodenum ein und verursacht eine Dehnung. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54995/54995fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <ol start="3"><li> &lt;Stark&gt; Verdauung und Reinigung von Inselchen. <ol><li> Inkubieren Sie die konischen Röhrchen, die die perfundierte Pankreas bei 37 ° C für 17 min enthalten. HINWEIS: Die Inkubationszeit kann je nach Alter und Tierart variieren. </li><li> Beenden Sie die Verdauung, indem Sie 7 ml Neutralisationslösung hinzufügen und die Röhrchen auf Eis stellen. </li><li> Dissoziieren Sie das Gewebe, indem Sie die Röhrchen kräftig schütteln ( z. B. 20 mal in 10 s), bis feine Gewebepartikel erhalten werden. HINWEIS: Die Ertragsausbeute ist niedrig, wenn die Bauchspeicheldrüse nicht vollständig dissoziiert. </li><li> Filtern Sie die verdauten Gewebeproben durch 0,5 mm Maschendraht, um alle nicht verdauten Gewebestücke zu entfernen. Sammeln Sie die Insel-Suspensionen in einem neuen 50-ml-Kegelrohr. </li><li> Die Röhrchen für 3 min bei 230 xg und 4 ° C zentrifugieren und den Überstand sorgfältig ausgießen, ohne die Gewebepellets zu stören. </li><li> Die Pellets von 3 Mäusen in 4 ml Polysucrose-Dichtegradienten durch Vortexen sanft oder p resuspendierenDie Aufhängung auf und ab ein paar Mal. Langsam pipettieren 4 ml HBSS an der Seite des Röhrchens an die Spitze der Polysucrose-Lösungen. HINWEIS: Die beiden Lösungen sollten gut getrennte Schichten mit einer scharfen Schnittstelle sein. HINWEIS: Der Zusatz von HBSS sollte sorgfältig durchgeführt werden, ohne den Polysucrose-Dichtegradienten am Boden zu stören. </li><li> Die Suspension für 20 min bei 900 xg und 4 ° C zentrifugieren, indem man eine sehr langsame Beschleunigungsrate auswählt. Die Zentrifugation ohne Bremse beenden ANMERKUNG: Dies ist ein Schritt, um die Inselchen aus den exokrinen Zellen zu reinigen, wobei die meisten Inseln auf die Grenzfläche zwischen den Schichten von Polysucrose und HBSS und den meisten exokrinen Zellen, die sich am Boden absetzen, wandern. </li><li> Entfernen Sie die Gesamtheit der 8-ml-Überstandslösungen mit einer großvolumigen 15-ml-Pipette. Führen Sie die Lösungen durch ein umgekehrtes 70-μm-Sieb. HINWEIS: Die Inselchen werden weiter gereinigt und durch das Sieb zurückgehalten, während die exokrinen ZellenWird durch den Filter gehen. Achtung: Der Polysucorse-Dichtegradient ist zelltoxisch; Die Filtration hilft den Inselchen, die Polysucrose loszuwerden. </li><li> 2 ml kalte Neutralisationslösung in eine 35-mm-Petrischale pipettieren. Umkehren Sie den Zellsieb nach rechts, tauchen Sie die Oberfläche ein, die die Inselchen in der Lösung hält, und schütteln Sie sanft, um die Inselchen freizugeben. </li><li> Hand-Pick die Inselchen unter einem Mikroskop mit einer 20-μL-Pipette mit einer weißen Spitze. ANMERKUNG: Die Inselchen sind gelbliche, kompakte Zelle Aggregate ( Abbildung 3A ), während das kontaminierende exokrine Gewebe oder die Zellen eine schwärzliche und lockere Struktur unter dem Sektionsmikroskop haben. </li><li> Platzieren Sie etwa 200 Inseln in einer 35-mm-Schale mit 2 ml Kulturmedium und inkubieren bei 37 ° C in einem Inkubator, der mit 5% CO 2 für 12 h versorgt wird. HINWEIS: In der Regel können 150-300 Inselchen aus einer 12-wöchigen C57BL / 6J Maus geerntet werden. Die Inseln sind anfällig für die Bildung von Aggregaten während der Kultur,Und die großen Inseln (&gt; 300 μm) sind anfällig für zentrale Nekrose ( Abbildung 1B , Inset). Schütteln Sie die Suspension gut, um die Inseln in der Schale gleichmäßig zu verteilen und das Klumpen zu reduzieren. </li></ol></li></ol> 2. Inselkultur auf dem Gerüst HINWEIS: DCS hat eine Porosität von etwa 79%, eine Dicke von etwa 0,6 mm und eine Porengröße im Bereich von 12 bis 300 μm. <ol><li> Schneiden Sie die Gerüste in 7-mm-Scheiben, tränken Sie sie in 70% Ethanol und waschen Sie sie mit HBSS. Legen Sie die Gerüste in die 24-Well-Gewebekultureinsätze. HINWEIS: Wenn frische Inseln nach der Übernachtkultur gewonnen werden, erscheinen die Inseln hell und dicht mit glatten Rändern ( Abbildung 3B ). </li><li> Stanzen Sie die Schale und sammeln Sie die Inselchen aus der Mitte der Schale mit einer 20 μl Pipette mit einer weißen Spitze. Übertragen Sie die Inselchen auf die Gerüste (250 Inselchen / Gerüst) mit einer Pipette und fügen Sie 2 ml Kulturmedium hinzuder Brunnen. Kultur die Inselchen für 12 Stunden vor der Transplantation. </li></ol> 3. Insertransplantation auf der EFP-Seite <ol><li> Diabetes-Induktion bei Empfänger-Mäusen. <ol><li> Legen Sie C57BL / 6J Mäuse (mehr als 10 Wochen alt) in einem frischen Käfig mit einer Wasserversorgung aber kein Essen. Schnell die Mäuse für 10 Stunden vor der Induktion von Diabetes. </li><li> Vorbereiten von Pufferlösungen mit pH-Werten von 4,2-4,5 durch Mischen von 0,1 M Zitronensäure mit 0,1 M Natriumcitrat. Lösen Sie STZ (10 mg / ml) in den frisch hergestellten Puffer und sterilisieren Sie die Lösung, indem Sie sie durch ein 0,22 μm Filter passieren. HINWEIS: STZ ist lichtempfindlich und verliert innerhalb von 10 min die Aktivität. Immer die frische STZ-Lösung vor der Injektion vorbereiten. </li><li> Injizieren Sie jede Maus intraperitoneal mit STZ in einer Dosis von 140-150 mg / kg für jede C57BL / 6J Maus. HINWEIS: Die Dosis variiert je nach Alter und Tierart. Es wird empfohlen, eine kleine Dosierungsoptimierung durchzuführenSt für die gegebene Spezies vor Beginn des formalen Experiments. </li><li> Sammle das Schwanzvenenblut und überwache den Blutzucker mit einem Glukosemessgerät an den Tagen 2, 3 und 4 nach der STZ-Injektion. HINWEIS: Wenn die Tiere an zwei aufeinanderfolgenden Tagen hyperglykämisch (nicht-fastender Blutzucker&gt; 16,7 mM) sind, sind sie bereit für die Inseltransplantation. </li></ol></li><li> Transplantation von Inselchen zur EFP-Stelle. <ol><li> Betäubt die Mäuse mit pentobarbital intraperitoneal (50 mg / kg). Legen Sie die Maus in Rückenlage auf ein Papiertuch, wobei der Schwanz auf den Bediener zeigt. Rasieren Sie den Bauch ausgiebig, um das Fell von der Inzisionsstelle zu entfernen. Tape down die vier Gliedmaßen und tupfen Sie die Haut komplett mit wechselnden Alkohol und Iodophor Wipes bewegt sich kreisförmig, um die Inzisionsstelle zu sterilisieren. Drapieren Sie die Maus mit einem sterilen Tuch, nur den Zugang zum Schnittbereich. Machen Sie einen 7 mm Einschnitt durch die Peritonealwand in derMittellinie, nah am Genitalbereich. HINWEIS: Alle Instrumente, die während der Operation verwendet werden, einschließlich Handschuhe, sollten steril sein. </li><li> Vorsichtig holen und entfernen Sie die EFP aus der Bauchhöhle mit Pinzette. Verbreiten Sie die EFP auf benetzte sterile Gaze. Legen Sie das Gerüst, das Inselchen enthält, auf dem EFP und falten Sie das EFP, um das Transplantat zu wickeln. Sichern Sie den direkten Kontakt zwischen den Inselchen und EFP, indem Sie das EFP mit resorbierbaren 6-0 Nahtnähten nähen. Benetzen Sie die Oberfläche des EFP mit steriler Kochsalzlösung mit einem getränkten Wattestäbchen, um zu verhindern, dass das EFP austrocknet. </li><li> Legen Sie den EFP vorsichtig wieder in die Bauchhöhle. Schließen Sie den Schnitt durch Nähen der Peritonealwand und Klemmen der Dermalschicht mit Wundclips. </li><li> Buprenorphin (0,1 mg / kg) subkutan als Analgetikum injizieren. </li><li> 1 ml Salzlösung subkutan injizieren, um eine Austrocknung zu verhindern. </li><li> Lege die Maus in einen Käfig auf ein Heizkissen, bis sich die Maus von der Anästhesie erholt. </li><li> Überprüfen Sie die nicht-fastenden Glukose leVels zwei Tage später durch das Sammeln von Blut aus der Schwanzvene. Wenn Sie das Transplantat abholen, wiederholen Sie die oben genannten Transplantationsverfahren, ziehen Sie den EFP vorsichtig heraus, verwenden Sie 3-0 Naht, um das Ende des Fettkissens neben dem Nebenhoden zu lindern, die Blutgefäße zu verschließen, das EFP-Transplantat zu explantieren und es für die Histologie zu bewahren . ANMERKUNG: Das Explantieren der Inselchen sollte den Empfänger Mäusen hyperglykämisch innerhalb von 3 Tagen wiedergeben, was die Funktion des Transplantats bestätigt. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Shapiro, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Islet+transplantation+in+seven+patients+with+type+1+diabetes+mellitus+using+a+glucocorticoid-free+immunosuppressive+regimen.">Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen.</a> N Engl J Med. 343, 230-238 (2000).</li><li>Shapiro, A. M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=International+Trial+of+the+Edmonton+Protocol+for+Islet+Transplantation.">International Trial of the Edmonton Protocol for Islet Transplantation.</a> N Engl J Med. 355, 1318-1330 (2006).</li><li>Ryan, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Five-year+follow-up+after+clinical+islet+transplantation.">Five-year follow-up after clinical islet transplantation.</a> Diabetes. 54, 2060-2069 (2005).</li><li>Merani, S., Toso, C., Emamaullee, J., Shapiro, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+implantation+site+for+pancreatic+islet+transplantation.">Optimal implantation site for pancreatic islet transplantation.</a> Br J Surg. 95, 1449-1461 (2008).</li><li>Schmidt, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+islets+find+a+new+transplant+home+in+the+omentum.">Pancreatic islets find a new transplant home in the omentum.</a> Nat Biotechnol. 35 (1), (2017).</li><li>Dufour, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+ectopic+site+for+islet+transplantation,+using+biodegradable+scaffolds.">Development of an ectopic site for islet transplantation, using biodegradable scaffolds.</a> Tissue Eng. 11, 1323-1331 (2005).</li><li>Weaver, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+Release+of+Dexamethasone+from+Organosilicone+Constructs+for+Local+Modulation+of+Inflammation+in+Islet+Transplantation.">Controlled Release of Dexamethasone from Organosilicone Constructs for Local Modulation of Inflammation in Islet Transplantation.</a> Tissue Eng Part A. 21, 2250-2261 (2015).</li><li>Wang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+Micro+to+Macro:+The+Hierarchical+Design+in+a+Micropatterned+Scaffold+for+Cell+Assembling+and+Transplantation.">From Micro to Macro: The Hierarchical Design in a Micropatterned Scaffold for Cell Assembling and Transplantation.</a> Adv Mater. 29, (2017).</li><li>Blomeier, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymer+Scaffolds+as+Synthetic+Microenvironments+for+Extrahepatic+Islet+Transplantation.">Polymer Scaffolds as Synthetic Microenvironments for Extrahepatic Islet Transplantation.</a> Transplantation. 82, 452-459 (2006).</li><li>Gibly, R. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extrahepatic+islet+transplantation+with+microporous+polymer+scaffolds+in+syngeneic+mouse+and+allogeneic+porcine+models.">Extrahepatic islet transplantation with microporous polymer scaffolds in syngeneic mouse and allogeneic porcine models.</a> Biomaterials. 32, 9677-9684 (2011).</li><li>Moskalewski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Culture+of+the+Islets+of+Langerhans+of+the+Guinea+Pig.">Isolation and Culture of the Islets of Langerhans of the Guinea Pig.</a> Gen Comp Endocrinol. 5, 342-353 (1965).</li><li>Lacy, P. E., Kostianovsky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+the+isolation+of+intact+islets+of+Langerhans+from+the+rat+pancreas.">Method for the isolation of intact islets of Langerhans from the rat pancreas.</a> Diabetes. 16, 35-39 (1967).</li><li>Zmuda, E. J., Powell, C. A., Hai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Method+for+Murine+Islet+Isolation+and+Subcapsular+Kidney+Transplantation.">A Method for Murine Islet Isolation and Subcapsular Kidney Transplantation.</a> J Vis Exp. (50), (2011).</li><li>Li, D. S., Yuan, Y. H., Tu, H. J., Liang, Q. L., Dai, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+islet+isolation+from+mouse+pancreas.">A protocol for islet isolation from mouse pancreas.</a> Nat Protoc. 4, 1649-1652 (2009).</li><li>Stull, N. D., Breite, A., McCarthy, R., Tersey, S. A., Mirmira, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+Islet+of+Langerhans+Isolation+using+a+Combination+of+Purified+Collagenase+and+Neutral+Protease.">Mouse Islet of Langerhans Isolation using a Combination of Purified Collagenase and Neutral Protease.</a> J Vis Exp. (67), (2012).</li><li>Sakata, N., Yoshimatsu, G., Tsuchiya, H., Egawa, S., Unno, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+diabetes+mellitus+for+islet+transplantation.">Animal models of diabetes mellitus for islet transplantation.</a> Exp Diabetes Res. , 256707 (2012).</li><li>Schmidt, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+islets+find+a+new+transplant+home+in+the+omentum.">Pancreatic islets find a new transplant home in the omentum.</a> Nat Biotech. 35, 8-8 (2017).</li><li>Londono, R., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biologic+scaffolds+for+regenerative+medicine:+mechanisms+of+in+vivo+remodeling.">Biologic scaffolds for regenerative medicine: mechanisms of in vivo remodeling.</a> Ann Biomed Eng. 43, 577-592 (2015).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Pankreas-Perfusion und Verdauungszeit sind zwei Schlüsselparameter, die die Ertragsausbeute und -qualität beeinflussen. Moskalewski berichtete zuerst über die Verwendung einer rohen Kollagenase-Mischung, um gehackte Meerschweinchen-Pankreas zu verdauen 11 . Lacy et al. die Injektion von Enzymen in das Kanalsystem berichtet , die Bauchspeicheldrüse perfundieren, die die Insel Ausbeute 12 stark erhöht. Die duktale Perfusion des Enzyms ermöglicht die maximale E...

Typ 1 Diabetes mellitus (T1D) ist eine autoimmune endokrine Störung, in der Inselzellen durch das Immunsystem ablatiert werden, wodurch Patienten abhängig von der Injektion von exogenem Insulin für ihr ganzes Leben sind. Das Edmonton-Protokoll stellt einen Meilenstein in klinischen Studien der Inselentransplantation dar; Inselchen wurden durch die Pfortader infundiert und an der intrahepatischen Stelle transplantiert 1 . Doch zwei Haupthindernisse - unzureichende Quellen von Spenderinseln und schlechte Inselentransplantation - verhindern den breiten Erfolg der Inselentransplantation 2 . Normalerweise müssen Inselchen von drei kadaverischen Spendern gesammelt werden, um den hyperglykämischen Zustand eines Patienten umzukehren; Dies ist auf die geringe Ausbeute an Islet-Isolationsverfahren und den Inselverlust nach der Transplantation zurückzuführen. Insbesondere, obwohl die Nachtransplantationsinseln in sauerstoffreichem Blut gebadet wurden, zeigte der direkte Kontakt mit dem Blut oft das augenblicklich blutvermittelte Entzündungsmittel(IBMIR), die den akuten Verlust der Inselchen verursachen könnten. Langfristig wird angenommen, dass der allmähliche Verlust von Inselchen bei Patienten für den Tropfen der Diabetes-Umkehrraten in den klinischen Gruppen verantwortlich war, die im ersten Jahr 90% erreichen konnten und auf 30% und 10% um 2 und 5 sanken Jahre nach der Transplantation bzw. 3 . Die Islet-Transplantation an extrahepatischen Stätten war eine attraktive Strategie, um den direkten Kontakt von Inselchen mit Blut zu reduzieren und die Transplantationen im Vergleich zur intrahepatischen Infusion an definierbare Stellen zu beschränken. In den Nierenkapseln, Augen, Muskeln, Fettpolstern und subkutanen Räumen wurden in den vergangenen Jahren Untersuchungen durchgeführt, die zeigen, dass Inselchen an diesen Standorten in der Lage sind, zu überleben und zu funktionieren, um die Normoglykämie wiederherzustellen 4 . Darüber hinaus sind die Inselchen an diesen Standorten abrufbar, was eine Biopsie oder sogar für weitere Ersatzverfahren ermöglicht. Extrahepatische sDaher zeigen sie ein großes Potential für die klinische Transplantation 5 . Biomaterialbasierte Gerüste wurden intensiv für Zelltransplantation und Tissue Engineering untersucht. Dreidimensionale (3D) Gerüste enthalten in der Regel poröse Strukturen und können als zelluläre Schablonen dienen, um räumliche Struktur / Organisation von Zellen oder als Reservoirs zu erzeugen, um die kontrollierte Freisetzung von bioaktiven Cues zu ermöglichen. Gerüste wurden auch aus polymeren Materialien wie Poly (glycolid-L-lactid) 6 , Poly (dimethylsiloxan) 7 und thermoplastischem Poly (urethan) 8 hergestellt , um Inselchen im EFP zu transplantieren. Im Vergleich zur direkten Transplantation von Inselchen wurde festgestellt, dass die Verwendung von Gerüsten den Islet-Verlust verringert, indem das Auslaufen von Inselchen in den intraperitonealen Hohlraum 9 , 10 verhindert wird , was mechanischen Schutz und modu bereitstelltDie lokale entzündliche Reaktion. Die Gerüste können so entwickelt werden, um die Inselentransplantation an den Transplantationsstellen zu fördern 7 . In dieser Studie beabsichtigen wir, ein Paradigma der Inselentransplantation im EFP zu demonstrieren, das in Mäusemodellen mit einem DCS durchgeführt wird. Gerüste aus extrazellulären Matrizen haben in den letzten Jahren großes Interesse an der überlegenen Biokompatibilität und natürlicheren porösen Strukturen im Vergleich zu synthetischen Produkten. Hier beschreiben wir ein robustes Isolationsprotokoll, um Pankreasinseln mit hohen Ausbeuten von C57BL / 6J-Mäusen zu erhalten. DCSs, die aus dem Rinderpericardium verarbeitet wurden, wurden dann mit Eseln ausgesät und die Transplantate wurden in syngene diabetische Modelle in die EFP transplantiert. Die Normoglykämie bei Mäusen wurde innerhalb von 10 Tagen erreicht und bis zu 100 Tage bis zur Entfernung der Transplantate aufrechterhalten.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="364">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:127px;">Dissecting scissor</td>
			<td style="width:63px;">Ningbo Medical</td>
			<td style="width:91px;"></td>
			<td style="width:87px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:127px;">Forceps</td>
			<td style="width:63px;">Ningbo Medical</td>
			<td style="width:91px;"></td>
			<td style="width:87px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:127px;">0.5 mm diameter wire mesh</td>
			<td style="width:63px;">Ningbo Medical</td>
			<td style="width:91px;"></td>
			<td style="width:87px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:127px;">70 &#956;m cell strainer</td>
			<td style="width:63px;">Falcon</td>
			<td style="width:91px;">352350</td>
			<td style="width:87px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:127px;">Artery hemostatic clamp</td>
			<td style="width:63px;">Ningbo Medical</td>
			<td style="width:91px;"></td>
			<td style="width:87px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:127px;">Microscopic hemostatic clamp</td>
			<td style="width:63px;">Ningbo Medical</td>
			<td style="width:91px;"></td>
			<td style="width:87px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:127px;">Hemostatic forceps</td>
			<td style="width:63px;">Ningbo Medical</td>
			<td style="width:91px;"></td>
			<td style="width:87px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:127px;">Absorbable 6-0 PGLA sutures&#160;</td>
			<td style="width:63px;">JINHUAN</td>
			<td style="width:91px;"></td>
			<td style="width:87px;">With needle</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:127px;">Wound clip</td>
			<td style="width:63px;">Ningbo Medical</td>
			<td style="width:91px;"></td>
			<td style="width:87px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:127px;">Cotton swab</td>
			<td style="width:63px;">Ningbo Medical</td>
			<td style="width:91px;"></td>
			<td style="width:87px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:127px;">Gauze</td>
			<td style="width:63px;">Ningbo Medical</td>
			<td style="width:91px;"></td>
			<td style="width:87px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:127px;">Sterile drapes</td>
			<td style="width:63px;">Ningbo Medical</td>
			<td style="width:91px;"></td>
			<td style="width:87px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:127px;">10mL syringe</td>
			<td style="width:63px;">JINGHUAN</td>
			<td style="width:91px;"></td>
			<td style="width:87px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:127px;">1 mL syringe</td>
			<td style="width:63px;">JINGHUAN</td>
			<td style="width:91px;"></td>
			<td style="width:87px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:127px;">27G intravenous needle</td>
			<td style="width:63px;">JINGHUAN</td>
			<td style="width:91px;">0.45x15 RWSB</td>
			<td style="width:87px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:127px;">1.5 mL Eppendorf tube</td>
			<td style="width:63px;">Axygen</td>
			<td style="width:91px;"></td>
			<td style="width:87px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:127px;">15mL conical tube</td>
			<td style="width:63px;">Corning</td>
			<td style="width:91px;">430791</td>
			<td style="width:87px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:127px;">50mL conical tube</td>
			<td style="width:63px;">Corning</td>
			<td style="width:91px;">430829</td>
			<td style="width:87px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:127px;">35mm Non-treated&#160; Peri-dishes</td>
			<td style="width:63px;">Corning</td>
			<td style="width:91px;">430588</td>
			<td style="width:87px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:127px;">Transwell</td>
			<td style="width:63px;">Corning</td>
			<td style="width:91px;">3422</td>
			<td style="width:87px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:127px;">0.22 &#956;m filter</td>
			<td style="width:63px;">Pall</td>
			<td style="width:91px;">PN4612</td>
			<td style="width:87px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:127px;">10 mL serological pipet</td>
			<td style="width:63px;">Corning</td>
			<td style="width:91px;">4488</td>
			<td style="width:87px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:127px;">Pipet filler S1</td>
			<td style="width:63px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:91px;">9501</td>
			<td style="width:87px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:127px;">Pipette (2-20&#956;L)</td>
			<td style="width:63px;">Axygen</td>
			<td style="width:91px;">AP-20</td>
			<td style="width:87px;">AXYPETTM</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:127px;">Dissecting microscope</td>
			<td style="width:63px;">Olympus</td>
			<td style="width:91px;">SZ61</td>
			<td style="width:87px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:127px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:63px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:91px;">5810R</td>
			<td style="width:87px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:127px;">Hank&#8217;s balanced salt solution&#160;</td>
			<td style="width:63px;">Gibco</td>
			<td style="width:91px;">C14175500CP</td>
			<td style="width:87px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:127px;">Collagenase P</td>
			<td style="width:63px;">Roche</td>
			<td style="width:91px;">COLLP-RO</td>
			<td style="width:87px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:127px;">Histopaque 1077</td>
			<td style="width:63px;">Sigma</td>
			<td style="width:91px;">10771</td>
			<td style="width:87px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:127px;">RPMI 1640</td>
			<td style="width:63px;">Gibco</td>
			<td style="width:91px;">11879-20</td>
			<td style="width:87px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:127px;">FBS</td>
			<td style="width:63px;">Gibco</td>
			<td style="width:91px;">16000-044</td>
			<td style="width:87px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:127px;">D-glucose</td>
			<td style="width:63px;">Gibco</td>
			<td style="width:91px;">A24940-01</td>
			<td style="width:87px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:127px;">Glucose meter</td>
			<td style="width:63px;">Roche</td>
			<td style="width:91px;"></td>
			<td style="width:87px;">ACCU-CHEK</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:127px;">Penicillin-streptomycin</td>
			<td style="width:63px;">Gibco</td>
			<td style="width:91px;">15140-122</td>
			<td style="width:87px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:127px;">Streptozotocin</td>
			<td style="width:63px;">Sigma</td>
			<td style="width:91px;">V900890</td>
			<td style="width:87px;">VetecTM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:127px;">Chloral hydrate</td>
			<td style="width:63px;">J&#38;K</td>
			<td style="width:91px;">C0073</td>
			<td style="width:87px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:127px;">Sodium citrate</td>
			<td style="width:63px;">Sigma</td>
			<td style="width:91px;">71497</td>
			<td style="width:87px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:127px;">Citric acid</td>
			<td style="width:63px;">Sigma</td>
			<td style="width:91px;">C2404</td>
			<td style="width:87px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:127px;">Iodophors</td>
			<td style="width:63px;">Ningbo Medical</td>
			<td style="width:91px;"></td>
			<td style="width:87px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:127px;">C57BL/6J, 10-12 weeks old</td>
			<td style="width:63px;">VitalRiver</td>
			<td style="width:91px;"></td>
			<td style="width:87px;">Beijing, China</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:127px;">Decellularized scaffold</td>
			<td style="width:63px;">Guanhao Biotec</td>
			<td style="width:91px;">131102</td>
			<td style="width:87px;">Guangzhou, China</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

scaffold-supported transplantation of islets in the epididymal fat pad of diabetic mice

Die Islet-Transplantation wurde klinisch als wirksam bei der Behandlung von Typ-1-Diabetes erwiesen. Allerdings kann die aktuelle intrahepatische Transplantationsstrategie akute Vollblutreaktionen hervorrufen und zu einer schlechten Inselentransplantation führen. Hier berichten wir über ein robustes Protokoll zur Transplantation von Inselchen an der extrahepatischen Transplantationsstelle - dem epididymalen Fettpolster (EFP) - bei einem diabetischen Mausmodell. Ein Protokoll zur Isolierung und Reinigung von Inselchen mit hohen Ausbeuten von C57BL / 6J-Mäusen wird beschrieben, sowie ein Transplantationsverfahren, das durch Seeding-Inseln auf ein dezelluläres Gerüst (DCS) durchgeführt wird und sie an der EFP-Stelle in syngenen C57BL / 6J-Mäusen, die Diabetiker übertragen werden, implantiert Durch Streptozotocin. Das DCS-Transplantat, das 500 Inseln enthält, hat den hyperglykämischen Zustand innerhalb von 10 Tagen umgekehrt, während die freien Inseln ohne DCS mindestens 30 Tage benötigt werden. Die Normoglykämie wurde bis zu 3 Monate aufrechterhalten, bis das Transplantat explantiert wurde. Abschließend erhöhte DCS die Einlagerung von Inselchen in tDie extrahepatische Stelle des EFP, die leicht abgerufen werden könnte und eine reproduzierbare und nützliche Plattform für die Untersuchung der Gerüstmaterialien sowie andere Transplantationsparameter für eine erfolgreiche Insert-Engagement zur Verfügung stellen könnte.

Unsere Klemmmethode, die mit einer mikroskopischen hämostatischen Klemme durchgeführt wird, ist im Vergleich zur Naht-Ligationstechnik einfach und zeitsparend. Es dauerte etwa 4 h, um etwa 1.200 Inselchen aus 6 Mäusen zu isolieren und zu reinigen. Die frisch isolierten Inseln hatten typischerweise eine grobe Peripherie unter einem optischen Mikroskop ( Fig. 3A ). Sobald sich die Inselchen aus dem Isolationsprozeß erholten, sahen sie hell und fest und erh...

Watch this Scientific Journal Video about Scaffold-supported Transplantation of Islets in the Epididymal Fat Pad of Diabetic Mice at JoVE.com

Scaffold-supported Transplantation of Islets in the Epididymal Fat Pad of Diabetic Mice

Dieses Protokoll zeigt die Mäuseinselisolation und die Aussaat auf ein dezelluläres Gerüst. Gerüstunterstützte Inselchen wurden in das epididymale Fettpolster von Streptozotocin (STZ) -induzierten diabetischen Mäusen transplantiert. Islets überlebten an der Transplantationsstelle und umkehrten den hyperglykämischen Zustand.

Gerüstgestützte Transplantation von Inseln in der epididymalen Fettauflage von diabetischen Mäusen

Islet transplantation has been clinically proven to be effective at treating type 1 diabetes. However, the current intrahepatic transplantation strategy ...

scaffold-supported-transplantation-islets-epididymal-fat-pad-diabetic

Research

JoVE Journal

Bioengineering

10.0K Aufrufe.  Peking University.  Dieses Protokoll zeigt die Mäuseinselisolation und die Aussaat auf ein dezelluläres Gerüst. Gerüstunterstützte Inselchen wurden in das epididymale Fettpolster von Streptozotocin (STZ) -induzierten diabetischen Mäusen transplantiert. Islets überlebten an der Transplantationsstelle und umkehrten den hyperglykämischen Zustand. 

Serie: Scaffold-supported Transplantation of Islets in the Epididymal Fat Pad of Diabetic Mice

Quantification of Global Diastolic Function by Kinematic Modeling-based Analysis of Transmitral Flow via the Parametrized Diastolic Filling Formalism

Quantitative cardiac function assessment remains a challenge for physiologists and clinicians.&#160;Although historically invasive methods have comprised the only means available, the development of noninvasive imaging modalities (echocardiography, MRI, CT) having high temporal and spatial resolution provide a new window for quantitative diastolic function assessment. Echocardiography is the agreed upon standard for diastolic function assessment, but indexes in current clinical use merely utilize selected features of chamber dimension (M-mode) or blood/tissue motion (Doppler) waveforms without incorporating the physiologic causal determinants of the motion itself.&#160;The recognition that all left ventricles (LV) initiate filling by serving as mechanical suction pumps allows global diastolic function to be assessed based on laws of motion that apply to all chambers. What differentiates one heart from another are the parameters of the equation of motion that governs filling. Accordingly, development of the Parametrized Diastolic Filling (PDF) formalism&#160;has shown that the entire range of clinically observed early transmitral flow (Doppler E-wave) patterns are extremely well fit by the laws of damped oscillatory motion.&#160;This permits analysis of individual E-waves in accordance with a causal mechanism (recoil-initiated suction) that yields three (numerically) unique lumped parameters whose physiologic analogues are chamber stiffness (k), viscoelasticity/relaxation (c), and load (xo).&#160;The recording of transmitral flow (Doppler E-waves) is standard practice in clinical cardiology and, therefore, the echocardiographic recording method is only briefly reviewed. Our focus is on determination of the PDF parameters from routinely recorded E-wave data.&#160;As the highlighted results indicate, once the PDF parameters have been obtained from a suitable number of load varying E-waves, the investigator is free to use the parameters or construct indexes from the parameters (such as stored energy 1/2kxo2, maximum A-V pressure gradient kxo, load independent index of diastolic function, etc.) and select the aspect of physiology or pathophysiology to be quantified.

Accurate, causality-based quantification of global diastolic function has been achieved by kinematic modeling-based analysis of transmitral flow via the Parametrized Diastolic Filling (PDF) formalism. PDF generates unique stiffness, relaxation,&#160;and load parameters and elucidates &#39;new&#39; physiology while providing sensitive and specific indexes of dysfunction.

Quantifizierung der globalen diastolischen Funktion durch kinematische Modellierung basierende Analyse der transmitralen Fluss über die diastolische Füllung Parametrisierte Formalismus

Quantitative cardiac function assessment remains a challenge for physiologists and clinicians.&#160;Although historically invasive methods have comprised ...

Forschung

Biotechnik

Gene Transfection toward Spheroid Cells on Micropatterned Culture Plates for Genetically-modified Cell Transplantation

To improve the therapeutic effectiveness of cell transplantation, a transplantation system of genetically modified, injectable spheroids was developed. The cell spheroids are prepared in a culture system on micropatterned plates coated with a thermosensitive polymer. A number of spheroids are formed on the plates, corresponding to the cell adhesion areas of 100 &#181;m diameter that are regularly arrayed in a two-dimensional manner, surrounded by non-adhesive areas that are coated by a polyethylene glycol (PEG) matrix. The spheroids can be easily recovered as a liquid suspension by lowering the temperature of the plates, and their structure is well maintained by passing them through injection needles with a sufficiently large caliber (over 27 G). Genetic modification is achieved by gene transfection using the original non-viral gene carrier, polyplex nanomicelle, which is capable of introducing genes into cells without disrupting the spheroid structure. For primary hepatocyte spheroids transfected with a luciferase-expressing gene, the luciferase is sustainably obtained in transplanted animals, along with preserved hepatocyte function, as indicated by albumin expression. This system can be applied to a variety of cell types including mesenchymal stem cells.

This protocol describes a cell transplantation system using genetically modified, injectable spheroids. Cell spheroids are cultured on micropatterned culture plates and recovered after gene introduction using polyplex nanomicelles. This system facilitates prolonged transgene expression from the transplanted cells in host animals while maintaining the innate function of the cells.

Gentransfektion in Richtung Spheroid Zellen auf mikrostrukturierten Kulturplatten für genetisch veränderte Zelltransplantation

To improve the therapeutic effectiveness of cell transplantation, a transplantation system of genetically modified, injectable spheroids was developed. ...

Procedure for Decellularization of Rat Livers in an Oscillating-pressure Perfusion Device

Decellularization and recellularization of parenchymal organs may enable the generation of functional organs in vitro, and several protocols for rodent liver decellularization have already been published. We aimed to improve the decellularization process by construction of a proprietary perfusion device enabling selective perfusion via the portal vein and/or the hepatic artery. Furthermore, we sought to perform perfusion under oscillating surrounding pressure conditions to improve the homogeneity of decellularization. The homogeneity of perfusion decellularization has been an underestimated factor to date. During decellularization, areas within the organ that are poorly perfused may still contain cells, whereas the extracellular matrix (ECM) in well-perfused areas may already be affected by alkaline detergents. Oscillating pressure changes can mimic the intraabdominal pressure changes that occur during respiration to optimize microperfusion inside the liver. In the study presented here, decellularized rat liver matrices were analyzed by histological staining, DNA content analysis and corrosion casting. Perfusion via the hepatic artery showed more homogenous results than portal venous perfusion did. The application of oscillating pressure conditions improved the effectiveness of perfusion decellularization. Livers perfused via the hepatic artery and under oscillating pressure conditions showed the best results. The presented techniques for liver harvesting, cannulation and perfusion using our proprietary device enable sophisticated perfusion set-ups to improve decellularization and recellularization experiments in rat livers.

The presented techniques for liver harvesting, cannulation and perfusion using our proprietary device enable sophisticated perfusion set-ups to improve decellularization and recellularization experiments in rat livers.

Verfahren für Dezellularisierung von Rattenlebern in einer oszillierenden Druck Perfusionsvorrichtung

Decellularization and recellularization of parenchymal organs may enable the generation of functional organs in vitro, and several protocols for rodent ...

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and dampen loads in the spine. The IVD consists of a proteoglycan-rich nucleus pulposus (NP) and a collagen-rich annulus fibrosis (AF) sandwiched by cartilaginous end-plates. Together with the adjacent vertebrae, the vertebrae-IVD structure forms a functional spine unit (FSU). These microstructures contain unique cell types as well as unique extracellular matrices. Whole organ culture of the FSU preserves the native extracellular matrix, cell differentiation phenotypes, and cellular-matrix interactions. Thus, organ culture techniques are particularly useful for investigating the complex biological mechanisms of the IVD. Here, we describe a high-throughput approach for culturing whole lumbar mouse FSUs that provides an ideal platform for studying disease mechanisms and therapies for the IVD. Furthermore, we describe several applications that utilize this organ culture method to conduct further studies including contrast-enhanced microCT imaging and three-dimensional high-resolution finite element modeling of the IVD.

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

Whole organ culture of the intervertebral disc (IVD) preserves the native extracellular matrix, cell phenotypes, and cellular-matrix interactions. Here we describe an IVD culture system using mouse lumbar and caudal IVDs in their functional spinal units and several applications utilizing this system.

Ein<em&gt; In Vitro</em&gt; Organ Culture Modell der Murine Bandscheiben

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...

An Ultrasonic Tool for Nerve Conduction Block in Diabetic Rat Models

Nerve conduction block with a high intensity-focused ultrasound (HIFU) transducer has been performed in normal and diabetic animal models recently. HIFU can reversibly block the conduction of peripheral nerves without damaging the nerves while using an appropriate ultrasonic parameter. Temporary and partial block of the action potentials of nerves shows that HIFU has the potential to be a useful clinical treatment for pain relief. This work demonstrates the procedures for suppressing the action potentials of neuropathic nerves in diabetic rats in vivo using an HIFU transducer. The first step is to generate adult male diabetic neuropathic rats by streptozotocin (STZ) injection. The second step is to evaluate the peripheral diabetic neuropathy in STZ-induced diabetic rats by an electronic von Frey probe and a hot plate. The final step is to record in vivo extracellular action potentials of the nerve exposed to HIFU sonication. The method showed here may benefit the study of ultrasound analgesic applications.

This work presents the methodology of applying high intensity-focused ultrasound to block the action potentials of diabetic neuropathic nerves.

Ein Ultraschall Werkzeug für die Nervenleitung blockieren in diabetischen Ratten Modelle

Nerve conduction block with a high intensity-focused ultrasound (HIFU) transducer has been performed in normal and diabetic animal models recently. HIFU ...

Surface Engineering of Pancreatic Islets with a Heparinized StarPEG Nanocoating

Cell surface engineering can protect implanted cells from host immune attack. It can also reshape cellular landscape to improve graft function and survival post-transplantation. This protocol aims to achieve surface engineering of pancreatic islets using an ultrathin heparin-incorporated starPEG (Hep-PEG) nanocoating. To generate the Hep-PEG nanocoating for pancreatic islet surface engineering, heparin succinimidyl succinate (Heparin-NHS) was first synthesized by modification of its carboxylate groups using N-(3-dimethylamino propyl)-N'-ethyl carbodiimide hydrochloride (EDC) and N-hydroxysuccinimide (NHS). The Hep-PEG mixture was then formed by crosslinking of the amino end-functionalized eight-armed starPEG (starPEG-(NH2)8) and Heparin-NHS. For islet surface coating, mouse islets were isolated via collagenase digestion and gradient purification using Histopaque. Isolated islets were then treated with ice cold Hep-PEG solution for 10 min to allow covalent binding between NHS and the amine groups of islet cell membrane. Nanocoating with the Hep-PEG incurs minimal alteration to islet size and volume and heparinization of the islets with Hep-PEG may also reduce instant blood-mediated inflammatory reaction during islet transplantation. This "easy-to-adopt" approach is mild enough for surface engineering of living cells without compromising cell viability. Considering that heparin has shown binding affinity to multiple cytokines, the Hep-PEG nanocoating also provides an open platform that enables incorporation of unlimited functional biological mediators and multi-layered surfaces for living cell surface bioengineering.

This protocol aims to achieve surface engineering of pancreatic islets using a heparin-incorporated starPEG nanocoating via pseudo-bioorthogonal chemistry between the N-hydroxysuccinimide groups of the nanocoating and the amine groups of islet cell membrane.

Oberflächentechnik von pankreatischen kleinen Inseln mit einer Heparinisierten StarPEG NanoCoatings

Cell surface engineering can protect implanted cells from host immune attack. It can also reshape cellular landscape to improve graft function and ...

A Novel Surgical Technique As a Foundation for In Vivo Partial Liver Engineering in Rat

Organ engineering is a novel strategy to generate liver organ substitutes that can potentially be used in transplantation. Recently, in vivo liver engineering, including in vivo organ decellularization followed by repopulation, has emerged as a promising approach over ex vivo liver engineering. However, postoperative survival was not achieved. The aim of this study is to develop a novel surgical technique of in vivo selective liver lobe perfusion in rats as a prerequisite for in vivo liver engineering. We generate a circuit bypass only through the left lateral lobe. Then, the left lateral lobe is perfused with heparinized saline. The experiment is performed with 4 groups (n = 3 rats per group) based on different perfusion times of 20 min, 2 h, 3 h, and 4 h. Survival, as well as the macroscopically visible change of color and the histologically determined absence of blood cells in the portal triad and the sinusoids, is taken as an indicator for a successful model establishment. After selective perfusion of the left lateral lobe, we observe that the left lateral lobe, indeed, turned from red to faint yellow. In a histological assessment, no blood cells are visible in the branch of the portal vein, the central vein, and the sinusoids. The left lateral lobe turns red after reopening the blocked vessels. 12/12 rats survived the procedure for more than one week. We are the first to report a surgical model for in vivo single liver lobe perfusion with a long survival period of more than one week. In contrast to the previously published report, the most important advantage of the technique presented here is that perfusion of 70% of the liver is maintained throughout the whole procedure. The establishment of this technique provides a foundation for in vivo partial liver engineering in rats, including decellularization and recellularization.

A Novel Surgical Technique As a Foundation for In Vivo Partial Liver Engineering in Rat

We establish a novel surgical technique for an in vivo single liver lobe perfusion model in rat as a prerequisite for further studying in vivo partial liver engineering in the future.

Eine neuartige Operationstechnik als Grundlage für In Vivo teilweise Leber Engineering in der Ratte

Organ engineering is a novel strategy to generate liver organ substitutes that can potentially be used in transplantation. Recently, in vivo liver ...

A Tripeptide-Stabilized Nanoemulsion of Oleic Acid

We describe a method to produce a nanoemulsion composed of an oleic acids-Pt(II) core and a lysine-tyrosine-phenylalanine (KYF) coating (KYF-Pt-NE). The KYF-Pt-NE encapsulates Pt(II) at 10 wt. %, has a diameter of 107 &#177; 27 nm and a negative surface charge. The KYF-Pt-NE is stable in water and in serum, and is biologically active. The conjugation of a fluorophore to KYF allows the synthesis of a fluorescent nanoemulsion that is suitable for biological imaging. The synthesis of the nanoemulsion is performed in an aqueous environment, and the KYF-Pt-NE forms via self-assembly of a short KYF peptide and an oleic acids-platinum(II) conjugate. The self-assembly process depends on the temperature of the solution, the molar ratio of the substrates, and the flow rate of the substrate addition. Crucial steps include maintaining the optimal stirring rate during the synthesis, permitting sufficient time for self-assembly, and pre-concentrating the nanoemulsion gradually in a centrifugal concentrator.

This protocol describes an efficient method to synthesize a nanoemulsion of an oleic acids-platinum(II) conjugate stabilized with a lysine-tyrosine-phenylalanine (KYF) tripeptide. The nanoemulsion forms under mild synthetic conditions via self-assembly of the KYF and the conjugate.

Ein Tripeptid-stabilisierten Nanoemulsion Ölsäure

We describe a method to produce a nanoemulsion composed of an oleic acids-Pt(II) core and a lysine-tyrosine-phenylalanine (KYF) coating (KYF-Pt-NE). The ...

Transplantation of a 3D Bioprinted Patch in a Murine Model of Myocardial Infarction

Testing regenerative properties of 3D bioprinted cardiac patches in vivo using murine models of heart failure via permanent left anterior descending (LAD) ligation is a challenging procedure and has a high mortality rate due to its nature. We developed a method to consistently transplant bioprinted patches of cells and hydrogels onto the epicardium of an infarcted mouse heart to test their regenerative properties in a robust and feasible way. First, a deeply anesthetized mouse is carefully intubated and ventilated. Following left lateral thoracotomy (surgical opening of the chest), the exposed LAD is permanently ligated and the bioprinted patch transplanted onto the epicardium. The mouse quickly recovers from the procedure after chest closure. The advantages of this robust and quick approach include a predicted 28-day mortality rate of up to 30% (lower than the 44% reported by other studies using a similar model of permanent LAD ligation in mice). Moreover, the approach described in this protocol is versatile and could be adapted to test bioprinted patches using different cell types or hydrogels where high numbers of animals are needed to optimally power studies. Overall, we present this as an advantageous approach which may change preclinical testing in future studies for the field of cardiac regeneration and tissue engineering.

This protocol aims to transplant a 3D bioprinted patch onto the epicardium of infarcted mice modeling heart failure. It includes details regarding anesthesia, the surgical chest opening, permanent ligation of the left anterior descending (LAD) coronary artery and application of a bioprinted patch onto the infarcted area of the heart.

Transplantation eines biobedruckten 3D-Patches in einem Murine-Modell des Myokardinfarkts

Testing regenerative properties of 3D bioprinted cardiac patches in vivo using murine models of heart failure via permanent left anterior descending (LAD) ...

Doxycycline Loaded Collagen-Chitosan Composite Scaffold for the Accelerated Healing of Diabetic Wounds

One major complication of diabetes mellitus is diabetic wounds (DW). The prolonged phase of inflammation in diabetes obstructs the further stages of an injury leading to delayed wound healing. We selected doxycycline (DOX), as a potential drug of choice, due to its anti-bacterial properties along with its reported anti-inflammatory properties. The current study aims to formulate DOX loaded collagen-chitosan non-crosslinked (NCL) &amp; crosslinked (CL) scaffolds and evaluate their healing ability in diabetic conditions. The characterization result of scaffolds reveals that the DOX-CL scaffold holds ideal porosity, a low swelling &amp; degradation rate, and a sustained release of DOX compared to the DOX-NCL scaffold. The in vitro studies reveal that the DOX-CL scaffold was biocompatible and enhanced cell growth compared with CL scaffold treated and control groups. The anti-bacterial studies have shown that the DOX-CL scaffold was more effective than the CL scaffold against the most common bacteria found in DW. Using the streptozotocin and high-fat diet-induced DW model, a significantly (p&#8804;0.05) faster rate of wound contraction in the DOX-CL scaffold treated group was observed compared to those in CL scaffold treated and control groups. The use of the DOX-CL scaffold can prove to be a promising approach for local treatment for DWs.

The prepared DOX-CL scaffold satisfied the prerequisites of an ideal DW dressing in mechanical strength, porosity, water absorption, degradation rate, sustained release, anti-bacterial, biocompatibility, and anti-inflammatory properties, which are considered to be essential for the recovery of damaged tissue in DWs.

Doxycyclin-belastetes Kollagen-Chitosan-Verbundgerüst zur beschleunigten Heilung diabetischer Wunden

One major complication of diabetes mellitus is diabetic wounds (DW). The prolonged phase of inflammation in diabetes obstructs the further stages of an ...