Name: scaffold-supported transplantation of islets in the epididymal fat pad of diabetic mice
Uploaded: 2017-07-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 57 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Scaffold-supported Transplantation of Islets in the Epididymal Fat Pad of Diabetic Mice at JoVE.com

Gli autori vorrebbero ringraziare Wei Zhang da Guanhao Biotech per fornire gli scaffali decellulari. Ringraziamo Xiao-hong Peng per le discussioni utili. Questa ricerca è stata sostenuta finanziariamente dalla National Science Foundation della Cina (progetto n.31322021).

Tutti gli esperimenti sono stati approvati dal comitato istituzionale per la cura e l&#39;uso degli animali di Pechino (IACUC, IACUC no COE-LuoY-1). 1. Isolazione Isolamento <ol><li> Preparazione di reagenti e attrezzature. <ol><li> Ricostituire la polvere di collagenasi P (2 U / mg) in HBSS per ottenere una soluzione da 5 mg / mL e filtrarlo attraverso un filtro da 0,22 μm per rimuovere i batteri. Preparare soluzioni da 0,6 ml di aliquota di collagenasi P in 15 ml di tubi conici e conservare a -20 ° C. NOTA: Durante l&#39;uso, ogni aliquota viene diluita con HBSS per dare 6 ml di soluzioni di lavoro con concentrazioni finali di 0,5 mg / ml, o 1 U / ml (sufficiente per il trattamento di 3 topi). La soluzione di lavoro viene mantenuta in ghiaccio per un uso immediato entro 1 h. La soluzione di lavoro non deve essere ripristinata o re-congelata per un ulteriore utilizzo. </li><li> Preparare la soluzione di neutralizzazione aggiungendo FBS (2,5%) e P / S (1%) in HBSS; Mantenere la soluzione su ghiaccio. Preparare a trea 60 ml di soluzione di neutralizzazioneT 6 topi. </li><li> Per il terreno di coltura di isole, aggiungere D-glucosio (7 mM), FBS (10%) e P / S (1%) al supporto RPMI 1640. </li><li> Autoclave gli strumenti chirurgici a 115 ° C per 30 minuti e 15 psi di pressione. </li></ol></li><li> Inflazione del pancreas. <ol><li> Preparare 12 ml di soluzione di collagenasi, come specificato nel punto 1.1.1, per 6 topi (12 settimane). Riempire la siringa da 10 ml con 9 ml di soluzione di lavoro e collegare la siringa all&#39;ago intravenoso di 27 G. Conservare la siringa sul ghiaccio e utilizzare la soluzione entro 1 ora. </li><li> Eutanizzare il mouse dalla dislocazione cervicale. Posizionare il mouse in posizione supina su un tovagliolo di carta, con la coda rivolta verso l&#39;operatore. Spruzzare tutto il corpo con il 70% di etanolo, rendendolo completamente umido. </li><li> Fai un&#39;incisione a V, partendo dall&#39;area genitale e estendendola al diaframma, usando forbici e pinze per dissezione. Piegate la pelle sul petto per rivelare completamente la cavità addominale. </li><li> MossaL&#39;intestino a destra del mouse e esporre il pancreas e il canale biliare comune. Afferrate attentamente il duodeno con la pinza e tirarla fino a che il condotto biliare non è tirato ( Figura 1A -1 e A-2 ). </li><li> Trovare la vena portale e il canale biliare che porta nel fegato. Morsettiamo la vena porta e il canale biliare con un morsetto emostatico microscopico. NOTA: Il bloccaggio impedisce l&#39;eccessivo sanguinamento e l&#39;ingresso della collagenasi nel fegato. </li><li> Pur mantenendo l&#39;intestino con le pinze, individuare la posizione dell&#39;ampolla che collega il canale biliare e il duodeno. Inserire l&#39;ago per via endovenosa 27G nel canale biliare comune attraverso l&#39;ampolla ( Figura 1B -1 e B-2 ). </li><li> Dispensare circa 200 μL di soluzione di lavoro collagenasi per verificare se la cannulazione è tutta la via attraverso il dotto biliare. Se la soluzione collagenasi inizia a riempire il condotto ( 1 e C2 ), l&#39;ago si trova nel lumen del condotto; Bloccare il segmento del condotto contenente l&#39;ago utilizzando un morsetto emostatico dell&#39;arteria e dispensare il resto della 2 ml di soluzione a una velocità lenta e costante entro 1 min ( Figura 2A -1 , A-2 e B-1 ). NOTA: Se il tessuto che circonda il condotto inizia a gonfiarsi ( Figura 2B -2 ), l&#39;ago è penetrato attraverso la parete del condotto biliare, rendendo necessario riposizionare l&#39;ago e provare nuovamente a cannolare il dotto biliare. Allo stesso modo, se il duodeno inizia a gonfiarsi ( Figura 2C -1 e C-2 ), il morsetto emostatico dell&#39;arteria deve essere regolato e il canale biliare re-cannulato. Poiché la soluzione collagenasi riempie il pancreas, il tessuto vicino al duodeno si gonfia prima, seguito dal regioN vicino alla coda pancreatica. La perfusione della coda pancreatica (il lobo dello splenicolo) è importante per massimizzare il rendimento delle isole. </li><li> Dopo l&#39;inflazione completa del pancreas ( Figura 2C -1 ), spingere l&#39;intestino verso il lato sinistro del mouse e rimuovere il pancreas partendo dal colon discendente. Usare le pinze per sollevare l&#39;intestino e separarlo dal pancreas con un&#39;altra coppia di pinze. Continuare a rimuovere il pancreas fino a quando non è attaccato dalla parte superiore dello stomaco. Infine, sollevate il pancreas dall&#39;addome e tagliatelo dalla rimanente milza. NOTA: L&#39;intera separazione deve essere eseguita rapidamente, in quanto la digestione continua durante il processo di rimozione. </li><li> Posizionare il pancreas in un tubo vuoto da 15 ml e lasciarlo su ghiaccio. Ripetere la procedura sopra descritta per i topi rimanenti. Tutti i pancreas dovrebbero essere ulteriormente trattati entro 1 ora immediatamente seguendo il punto 1.3 per prevenire l&#39;eccessiva digestione da parte della collagenasi P. &lt;/ Li&gt; </ol></li></ol><img alt="Figura 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/54995/54995fig1.jpg" /> Figura 1: Fotografie che mostrano la cannulazione del canale biliare e la perfusione del pancreas con soluzioni collagenasi. ( A1 ) Tirare il duodeno finché il condotto biliare è tesa. (Ampolla: l&#39;area triangolare, lattea sulla superficie del duodeno; il canale biliare: la struttura lattiginosa a forma di cordone sulla superficie). ( B1 ) Inserimento dell&#39;ago nel condotto biliare dall&#39;ampolla. ( C1 ) Inflare il pancreas con l&#39;iniezione di enzimi. ( A2, B2 e C2 ) Le immagini del fumetto delle procedure descritte rispettivamente in A1, B1 e C1. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54995/54995fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> Figura 2: Risoluzione dei problemi per la cannulazione. ( A1 ) La punta dell&#39;ago inserita nel lumen del canale biliare. ( A2 ) Il condotto è riempito con soluzioni enzimatiche. ( B1 ) L&#39;ago inserito nel lumen del canale biliare e il condotto riempito con un colorante blu. ( B2 ) A causa della cannulazione inappropriata, l&#39;ago è sotto il canale biliare e solo una capsula gonfiata viene osservata dopo l&#39;erogazione del colorante blu. ( C1 ) Una cannulazione di successo è evidenziata dalla distensione del pancreas. ( C2 ) A causa di bloccaggio inadeguato, il colorante blu entra nel duodeno e provoca distensione. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54995/54995fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> <ol start="3"><li> &lt;Forte&gt; Digestione e purificazione di isole. <ol><li> Incubare i tubi conici contenenti il ​​pancreas perfuso a 37 ° C per 17 minuti. NOTA: Il tempo di incubazione può variare con l&#39;età e le specie dell&#39;animale. </li><li> Terminare la digestione aggiungendo 7 mL di soluzione di neutralizzazione e mettendo i tubi sul ghiaccio. </li><li> Dissociare il tessuto scuotendo i tubi vigorosamente ( ad esempio, 20 volte in 10 s) fino a ottenere particelle di tessuto fine. NOTA: la resa dell&#39;isola sarà bassa se il pancreas non si dissociano completamente. </li><li> Filtrare i campioni di tessuto digerente attraverso una maglia metallica da 0,5 mm per rimuovere eventuali frammenti di tessuto non digeriti. Raccogliere le sospensioni in un nuovo tubo conico da 50 ml. </li><li> Centrifugare i tubi per 3 min a 230 xg e 4 ° C e versare con cura il supernatante, senza disturbare i pellet di tessuto. </li><li> Resuspendere i pellet da 3 topi in 4 ml di gradiente di densità di polysucrose vorticando delicatamente o pPonendo la sospensione su e giù alcune volte. Lentamente pipettare 4 ml di HBSS lungo il lato del tubo in cima alle soluzioni di polisolfuro. NOTA: Le due soluzioni devono essere strati separati con un&#39;interfaccia nitida. NOTA: L&#39;aggiunta di HBSS deve essere eseguita con cautela senza disturbare il gradiente di densità del polysucrose in basso. </li><li> Centrifugare la sospensione per 20 minuti a 900 xg e 4 ° C selezionando un tasso di accelerazione molto lento. Terminare la centrifugazione senza freni. NOTA: Si tratta di un passo per purificare le isolette dalle cellule esocrine, con la maggior parte delle isole che migrano all&#39;interfaccia tra gli strati di polisolfuro e HBSS e la maggior parte delle cellule esocrine che si stabiliscono in basso. </li><li> Rimuovere l&#39;insieme delle soluzioni di supernatante da 8 ml utilizzando una pipetta da 15 ml di grandi dimensioni. Passare le soluzioni attraverso un filtro invertito da 70 μm. NOTA: le isole saranno ulteriormente purificate e conservate dal filtro, mentre le cellule esocrinePasserà attraverso il filtro. Attenzione: il gradiente di densità del polysucorse è cellulare-tossico; La filtrazione aiuterà le isole a sbarazzarsi del polisolfuro. </li><li> Pipettare 2 ml di soluzione di neutralizzazione fredda in un piatto di Petri da 35 mm. Invertire il filtro della cella a destra, immergere la superficie mantenendo le isole nella soluzione e scuotere delicatamente per liberare le isole. </li><li> Raccogliere manualmente le isole sotto un microscopio usando una pipetta da 20 μl con una punta bianca. NOTA: Le isole sono aggregati di cellule gialle e compatte ( Figura 3A ), mentre i tessuti o le cellule esocrini contaminanti hanno una struttura nera e sciolta sotto il microscopio di dissezione. </li><li> Inserire circa 200 isole in un piatto da 35 mm con 2 ml di terreno di coltura e incubare a 37 ° C in un incubatore fornito con 5% di CO 2 per 12 h. NOTA: Solitamente 150-300 isole possono essere raccolte da un mouse C57BL / 6J di 12 settimane. Le isole sono inclini a formare aggregati durante la cultura,E le grandi isole (&gt; 300 μm) sono suscettibili di necrosi centrale ( figura 1B , inset). Agitare bene la sospensione per distribuire uniformemente le isole nel piatto e per ridurre il clumping. </li></ol></li></ol> 2. Cultura dell&#39;isola sul ponteggio NOTA: DCS ha una porosità di circa il 79%, uno spessore di circa 0,6 mm e una portata che va da 12 a 300 μm. <ol><li> Tagliare i ponteggi in dischi da 7 mm, immergerli in etanolo al 70% e lavare con HBSS. Inserire i ponteggi negli inserti della coltura dei tessuti da 24 pozzetti. NOTA: quando le isole fresche vengono recuperate dopo la coltura durante la notte, le isolette appaiono luminose e strette, con bordi lisci ( Figura 3B ). </li><li> Girare il piatto e raccogliere le isole dal centro del piatto utilizzando una pipetta da 20 μl con punta bianca. Trasferire le isole ai ponteggi (250 isole / ponteggio) usando una pipetta e aggiungere 2 ml di terreno di coltura ail pozzo. Coltivi le isole per 12 ore prima del trapianto. </li></ol> 3. Ispirazione trapianto al sito EFP <ol><li> Induzione del diabete nei topi riceventi. <ol><li> Metti i topi C57BL / 6J (più di 10 settimane) in una gabbia fresca con acqua, ma senza cibo. Fast i topi per 10 ore prima dell&#39;induzione del diabete. </li><li> Preparare soluzioni tampone con valori pH di 4.2-4.5 mescolando 0,1 M acido citrico con 0,1 M citrato di sodio. Sciogliere STZ (10 mg / mL) nel tampone appena preparato e sterilizzare la soluzione passandola attraverso un filtro da 0,22 μm. NOTA: STZ è sensibile alla luce e perde attività entro 10 minuti; Preparare sempre la soluzione fresca STZ prima dell&#39;iniezione. </li><li> Iniettare ogni topo intraperitonealmente con STZ ad una dose di 140-150 mg / kg per ogni mouse C57BL / 6J. NOTA: La dose varia a seconda dell&#39;età e della specie dell&#39;animale. Si raccomanda di eseguire un&#39;ottimizzazione di dosaggio in piccole dimensioniSt per la specie data prima di iniziare l&#39;esperimento formale. </li><li> Raccogliere il sangue della coda della coda e controllare il glucosio nel sangue con un misuratore di glucosio nei giorni 2, 3 e 4 iniezione post-STZ. NOTA: quando gli animali sono iperglicemici (glucosio nel sangue non digiuno&gt; 16,7 mM) in due giorni consecutivi, sono pronti per il trapianto di isole. </li></ol></li><li> Trapianto di isole al sito EFP. <ol><li> Anestetizzare i topi con pentobarbital consegnato intraperitonealmente (50 mg / kg). Posizionare il mouse in posizione supina su un tovagliolo di carta, con la coda rivolta verso l&#39;operatore. Rasare l&#39;addome ampiamente per rimuovere la pelliccia da tutto il sito di incisione. Tape giù i quattro arti e tamponare completamente la pelle con alcool alternato e salviettine iodofori spostati in modo circolare per sterilizzare il sito di incisione. Togliere il mouse con un drappo sterile, consentendo solo l&#39;accesso all&#39;area di incisione. Effettuare un&#39;incisione di 7 mm attraverso la parete peritoneale dellaMidline, vicino alla zona genitale. NOTA: Tutti gli strumenti utilizzati durante l&#39;intervento chirurgico, inclusi i guanti, devono essere sterili. </li><li> Afferrare delicatamente e rimuovere l&#39;EFP dalla cavità addominale usando le pinze. Spalmare l&#39;EFP sulla garza sterile bagnata. Collocare gli isolotti contenenti l&#39;impalcatura sul EFP e piegare l&#39;EFP per avvolgere il trapianto. Proteggere il contatto diretto tra isole e EFP suturando l&#39;EFP con suture assorbibili 6-0. Bagnare la superficie dell&#39;EPP con salina sterile usando un tampone di cotone imbevuto per evitare che l&#39;EFP si asciughi. </li><li> Mettere delicatamente il EFP nella cavità addominale. Chiudere l&#39;incisione suturando la parete peritoneale e bloccando lo strato dermico con le clip della ferita. </li><li> Iniettare buprenorfina (0,1 mg / kg) sottocutanea come analgesico. </li><li> Iniettare 1 ml di salina sottocutanea per prevenire la disidratazione. </li><li> Posizionare il mouse in una gabbia su un tappetino di riscaldamento fino a quando il topo recupera dall&#39;anestesia. </li><li> Controllare il glucosio non digiunatoVela due giorni dopo raccogliendo sangue dalla vena della coda. Se si recupera l&#39;innesto, ripetere le procedure sopra descritte, estrarre delicatamente l&#39;EFP, utilizzare la sutura 3-0 per legare l&#39;estremità del grasso adiacente all&#39;epididimo, occludere i vasi sanguigni, esplodere l&#39;innesto EFP e conservarlo per istologia . NOTA: Spiegare le isole dovrebbero rendere nuovamente i topi riceventi iperglicemici entro 3 giorni, confermando la funzione dell&#39;innesto. </li></ol></li></ol>

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Gli autori non hanno niente da rivelare.

La perfusione del pancreas e il tempo di digestione sono due parametri chiave che influenzano la resa e la qualità delle isole. Moskalewski ha segnalato per la prima volta l&#39;uso di una miscela di collagenasi grezzo per la digestione del pancreas di guinea pig macinato 11 . Lacy et al. Ha segnalato l&#39;iniezione di enzimi nel sistema del condotto per perfezionare il pancreas, che ha notevolmente aumentato il rendimento delle isole 12 . La perfusione duttale ...

Il diabete mellito di tipo 1 (T1D) è un disturbo endocrino autoimmune in cui le cellule delle isole vengono ablate dal sistema immunitario, rendendo i pazienti dipendenti dall&#39;iniezione di insulina esogena per tutta la vita. Il protocollo di Edmonton rappresenta una pietra miliare negli studi clinici del trapianto di isole; Isole sono state infuse attraverso la vena portale e trapiantate nel sito intraepatico 1 . Tuttavia, due principali ostacoli, inadeguate fonti di isole donatrici e una scarsa assunzione di isole, impediscono l&#39;ampio successo del trapianto di isole 2 . Di solito, isolotti devono essere raccolti da tre donatori cadaverici per invertire la condizione iperglicemica di un paziente; Ciò è dovuto alla bassa resa delle procedure di isolamento delle isole e alla perdita di isole dopo il trapianto. In particolare, sebbene gli isolotti post-trapiantati venissero bagnati in sangue ricco di ossigeno, il contatto diretto con il sangue evocava spesso l&#39;inflamma istantanea mediata dal sangue(IBMIR), che potrebbe causare la perdita acuta delle isole. A lungo termine, si pensa che la graduale perdita di isolotti nei pazienti rappresentasse la diminuzione dei tassi di inversione del diabete nei gruppi clinici, che potrebbero raggiungere il 90% nel primo anno e scendere al 30% e al 10% per 2 e 5 Anni post-trapianto, rispettivamente 3 . Il trapianto delle isole nei siti extraepatici è stata una strategia attraente per ridurre il contatto diretto delle isole con il sangue e confinare i trapianti in posizioni più definibili rispetto all&#39;infezione intraepatica. Gli studi sono stati condotti negli anni passati nella capsula, nell&#39;occhio, nel muscolo, nei grassi e negli spazi sottocutanei, mostrando che le isole in questi siti sono in grado di sopravvivere e di funzionare per ripristinare la normoglicemia 4 . Inoltre, le isole in questi siti sono recuperabili, rendendo possibile la biopsia o persino per ulteriori procedure di sostituzione. Extrahepatic sPertanto dimostrano un grande potenziale per il trapianto clinico 5 . Gli scaffold basati su biomateria sono stati studiati intensamente per il trapianto di cellule e l&#39;ingegneria dei tessuti. Gli scaffoldi tridimensionali (3D) di solito contengono strutture porose e possono servire come modelli cellulari per generare struttura spaziale / organizzazione di cellule o come serbatoi per fornire il rilascio controllato di segnali bioattivi. I ponteggi sono stati inoltre fabbricati in materiali polimerici come poli (glicolide-L-lattido) 6 , poli (dimetilsilossano) 7 e poli (uretano) termoplastico 8 , a isole di trapianto nell&#39;EFP. Rispetto al trapianto diretto delle isole, è stato riscontrato l&#39;utilizzo di scaffold per ridurre la perdita di isole, prevenendo la perdita di isole nella cavità intraperitoneale 9 , 10 , fornendo protezione meccanica e moduLa reazione infiammatoria locale. Gli scaffold possono pertanto essere sviluppati per promuovere l&#39;assunzione di isole nei siti di trapianto 7 . In questo studio intendiamo dimostrare un paradigma del trapianto di isole nell&#39;EFP, eseguito nei modelli di topi usando un DCS. Gli scaffali derivati ​​da matrici extracellulari hanno attirato grande interesse negli ultimi anni a causa della biocompatibilità superiore e delle strutture porose più naturali rispetto ai prodotti sintetici. Qui descriviamo un robusto protocollo di isolamento per ottenere isole pancreatiche a rese elevate da topi C57BL / 6J. I DCS elaborati dal pericardio bovino sono stati poi seminati con isole e gli innesti sono stati trapiantati nell&#39;EFP nei modelli diabetici singenici. La normoglicemia nei topi è stata raggiunta entro 10 giorni ed è stata mantenuta fino a 100 giorni, fino alla rimozione degli innesti.

<table><tbody><tr><td>Dissecting scissor</td><td>Ningbo Medical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Ningbo Medical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.5 mm diameter wire mesh</td><td>Ningbo Medical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>70 &amp;mu;m cell strainer</td><td>Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Artery hemostatic clamp</td><td>Ningbo Medical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopic hemostatic clamp</td><td>Ningbo Medical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hemostatic forceps</td><td>Ningbo Medical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Absorbable 6-0 PGLA sutures&amp;nbsp;</td><td>JINHUAN</td><td></td><td>With needle</td></tr><tr><td>Wound clip</td><td>Ningbo Medical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cotton swab</td><td>Ningbo Medical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gauze</td><td>Ningbo Medical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sterile drapes</td><td>Ningbo Medical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10mL syringe</td><td>JINGHUAN</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 mL syringe</td><td>JINGHUAN</td><td></td><td></td></tr><tr><td>27G intravenous needle</td><td>JINGHUAN</td><td>0.45x15 RWSB</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL Eppendorf tube</td><td>Axygen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>15mL conical tube</td><td>Corning</td><td>430791</td><td></td></tr><tr><td>50mL conical tube</td><td>Corning</td><td>430829</td><td></td></tr><tr><td>35mm Non-treated&amp;nbsp; Peri-dishes</td><td>Corning</td><td>430588</td><td></td></tr><tr><td>Transwell</td><td>Corning</td><td>3422</td><td></td></tr><tr><td>0.22 &amp;mu;m filter</td><td>Pall</td><td>PN4612</td><td></td></tr><tr><td>10 mL serological pipet</td><td>Corning</td><td>4488</td><td></td></tr><tr><td>Pipet filler S1</td><td>Thermo Scientific</td><td>9501</td><td></td></tr><tr><td>Pipette (2-20&amp;mu;L)</td><td>Axygen</td><td>AP-20</td><td>AXYPET&lt;sup&gt;TM&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>Dissecting microscope</td><td>Olympus</td><td>SZ61</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>Hank&amp;rsquo;s balanced salt solution&amp;nbsp;</td><td>Gibco</td><td>C14175500CP</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase P</td><td>Roche</td><td>COLLP-RO</td><td></td></tr><tr><td>Histopaque 1077</td><td>Sigma</td><td>10771</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco</td><td>11879-20</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>D-glucose</td><td>Gibco</td><td>A24940-01</td><td></td></tr><tr><td>Glucose meter</td><td>Roche</td><td></td><td>ACCU-CHEK</td></tr><tr><td>Penicillin-streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Streptozotocin</td><td>Sigma</td><td>V900890</td><td>Vetec&lt;sup&gt;TM&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>Chloral hydrate</td><td>J&amp;amp;K</td><td>C0073</td><td></td></tr><tr><td>Sodium citrate</td><td>Sigma</td><td>71497</td><td></td></tr><tr><td>Citric acid</td><td>Sigma</td><td>C2404</td><td></td></tr><tr><td>Iodophors</td><td>Ningbo Medical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6J, 10-12 weeks old</td><td>VitalRiver</td><td></td><td>Beijing, China</td></tr><tr><td>Decellularized scaffold</td><td>Guanhao Biotec</td><td>131102</td><td>Guangzhou, China</td></tr></tbody></table>

scaffold-supported transplantation of islets in the epididymal fat pad of diabetic mice

Il trapianto delle isole è stato clinicamente dimostrato efficace nel trattamento del diabete di tipo 1. Tuttavia, l&#39;attuale strategia intraepatica di trapianto può comportare reazioni sanguigne intere acute e provocare un cattivo ingrasso di isole. Qui riportiamo un robusto protocollo per il trapianto di isole nel sito di trapianto extraepatico, il pad di grasso epididimo (EFP), in un modello di topi diabetici. Viene descritto un protocollo per isolare e purificare isole a rendimenti elevati da topi C57BL / 6J, nonché un metodo di trapianto eseguito da isole isolanti su un basamento decellulato (DCS) e implantarli sul sito EFP in topi sintesi C57BL / 6J resi diabetici Da streptozotocina. L&#39;innesto DCS contenente 500 isole ha invertito la condizione iperglicemica entro 10 giorni, mentre gli isolotti liberi senza DCS hanno richiesto almeno 30 giorni. La normoglicemia è stata mantenuta fino a 3 mesi fino a quando l&#39;innesto è stato esplorato. In conclusione, DCS ha potenziato l&#39;inserimento di isole in tIl sito extraepatico dell&#39;EFP, che potrebbe essere facilmente recuperato e potrebbe fornire una piattaforma riproducibile e utile per indagare i materiali dello scaffold, così come altri parametri di trapianto necessari per un successo nell&#39;inserimento delle isole.

Il nostro metodo di bloccaggio, eseguito utilizzando un morsetto emostatico microscopico, è semplice e risparmio di tempo rispetto alla tecnica di ligation della sutura. Ci sono voluti circa 4 ore per isolare e purificare circa 1.200 isole da 6 topi. Gli isolotti freschi isolati hanno tipicamente avuto una periferia ruvida sotto un microscopio ottico ( Figura 3A ). Una volta che le isole recuperate dal processo di isolamento, sembravano brillanti e stretti ...

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Scaffold-supported Transplantation of Islets in the Epididymal Fat Pad of Diabetic Mice

Questo protocollo dimostra l&#39;isolamento delle isole murine e la semina su un impalcatura decellulare. Isole supportate da ponteggi sono state trapiantate nel pad di grasso epididimo di topi diabetici indotti da streptozotocina (STZ). Isole sopravvissute al sito di trapianto e invertite la condizione iperglicemica.

Il trapianto di isole nel supporto del grasso epididimico dei topi diabetici

Islet transplantation has been clinically proven to be effective at treating type 1 diabetes. However, the current intrahepatic transplantation strategy ...

scaffold-supported-transplantation-islets-epididymal-fat-pad-diabetic

Research

JoVE Journal

Bioengineering

10.0K Views.  Peking University.  Questo protocollo dimostra l'isolamento delle isole murine e la semina su un impalcatura decellulare. Isole supportate da ponteggi sono state trapiantate nel pad di grasso epididimo di topi diabetici indotti da streptozotocina (STZ). Isole sopravvissute al sito di trapianto e invertite la condizione iperglicemica. 

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A Method for Murine Islet Isolation and Subcapsular Kidney Transplantation

Since the early pioneering work of Ballinger and Reckard demonstrating that transplantation of islets of Langerhans into diabetic rodents could normalize their blood glucose levels, islet transplantation has been proposed to be a potential treatment for type 1 diabetes 1,2. More recently, advances in human islet transplantation have further strengthened this view 1,3. However, two major limitations prevent islet transplantation from being a widespread clinical reality: (a) the requirement for large numbers of islets per patient, which severely reduces the number of potential recipients, and (b) the need for heavy immunosuppression, which significantly affects the pediatric population of patients due to their vulnerability to long-term immunosuppression. Strategies that can overcome these limitations have the potential to enhance the therapeutic utility of islet transplantation.
Islet transplantation under the mouse kidney capsule is a widely accepted model to investigate various strategies to improve islet transplantation. This experiment requires the isolation of high quality islets and implantation of islets to the diabetic recipients. Both procedures require surgical steps that can be better demonstrated by video than by text. Here, we document the detailed steps for these procedures by both video and written protocol. We also briefly discuss different transplantation models: syngeneic, allogeneic, syngeneic autoimmune, and allogeneic autoimmune.

Transplantation of isolated islets has been proposed to be a potential treatment for type 1 diabetes. Here we describe a method to isolate islets from mouse pancreata and transplant them to the subcapsular space of the kidney.

Un metodo per isolamento Islet murini e trapianto renale subcapsulare

Since the early pioneering work of Ballinger and Reckard demonstrating that transplantation of islets of Langerhans into diabetic rodents could normalize ...

Ricerca

Medicina

Transplantation of Pancreatic Islets Into the Kidney Capsule of Diabetic Mice

Our protocol was developed to cleanly and easily deliver islets or cells under the kidney capsule of diabetic or normal mice. We found that it was easier to concentrate the islets or cells into pellets in the final delivery tubing (PE50) used to transplant the cells under the kidney capsule. This technique provides both speed and ease while reducing any undue stress to the cells or to the mouse.

Loading: Settled, hand picked, islets or pelleted cells are carefully aspirated off the bottom of a 1.5 mL microcentrifuge tube using a p200 pipetteman and a straight, thin-wall pipette tip. A length of PE50 tubing is attached to the pipette tip using a small silicone adapter tubing. Cells are allowed to settle, in the tip, and then are transferred to the PE50 tubing by slowly dialing the pipetteman. Once the cells are near the end of the PE50 tubing, a kink is made and the silicone adaptor tubing is placed over the kink. The PE50 tubing is transferred to a 15 mL conical containing a cut 5 mL pipet, and the PE50 tubing is taped over the side of the 5 mL pipet to prevent curling during centrifuging. Cells are allowed to reach 1,000 rpm and stopped.
Transplantation: Recipient mice are anesthetized, shaved, and cleaned. A small incision is made on the left flank of the mouse and the kidney is exposed. The kidney, fat, and tissue are kept moist with normal saline swab. The distal end of the PE50 is attached to a Hamilton screw drive syringe, containing a pipette tip, using the silicone adaptor tubing. A small nick is made on the right flank side of the kidney, not too large nor too deep. The beveled end of the PE50 tubing, nearest the cells, is carefully placed under the capsule, the tubing is moved around gently to make space while swabbing normal saline; a dry capsule can tear easily. A small air bubble is delivered under the capsule by slowly dialing the syringe screw drive. Islets are then slowly delivered behind the air bubble. Once the islets have been delivered kidney homeostasis is maintained and the knick is cauterized with low heat. The kidney is placed back into the cavity and the peritoneum and skin are sutured and stapled. Mice are immediately treated with Flunixin and Buprenorphine s.q. and placed in a cage on a heating pad.

Our protocol was developed to cleanly and easily deliver islets or cells under the kidney capsule of mice. Cells are concentrated into pellets in the final tubing used for transplanting the cells under the kidney capsule. The ease of this technique reduces stress to the cells and the mouse.

Il trapianto di isole pancreatiche nella capsula renale di topi diabetici

Our protocol was developed to cleanly and easily deliver islets or cells under the kidney capsule of diabetic or normal mice.  We found that it was easier ...

Biologia

Quantification of Global Diastolic Function by Kinematic Modeling-based Analysis of Transmitral Flow via the Parametrized Diastolic Filling Formalism

Quantitative cardiac function assessment remains a challenge for physiologists and clinicians.&#160;Although historically invasive methods have comprised the only means available, the development of noninvasive imaging modalities (echocardiography, MRI, CT) having high temporal and spatial resolution provide a new window for quantitative diastolic function assessment. Echocardiography is the agreed upon standard for diastolic function assessment, but indexes in current clinical use merely utilize selected features of chamber dimension (M-mode) or blood/tissue motion (Doppler) waveforms without incorporating the physiologic causal determinants of the motion itself.&#160;The recognition that all left ventricles (LV) initiate filling by serving as mechanical suction pumps allows global diastolic function to be assessed based on laws of motion that apply to all chambers. What differentiates one heart from another are the parameters of the equation of motion that governs filling. Accordingly, development of the Parametrized Diastolic Filling (PDF) formalism&#160;has shown that the entire range of clinically observed early transmitral flow (Doppler E-wave) patterns are extremely well fit by the laws of damped oscillatory motion.&#160;This permits analysis of individual E-waves in accordance with a causal mechanism (recoil-initiated suction) that yields three (numerically) unique lumped parameters whose physiologic analogues are chamber stiffness (k), viscoelasticity/relaxation (c), and load (xo).&#160;The recording of transmitral flow (Doppler E-waves) is standard practice in clinical cardiology and, therefore, the echocardiographic recording method is only briefly reviewed. Our focus is on determination of the PDF parameters from routinely recorded E-wave data.&#160;As the highlighted results indicate, once the PDF parameters have been obtained from a suitable number of load varying E-waves, the investigator is free to use the parameters or construct indexes from the parameters (such as stored energy 1/2kxo2, maximum A-V pressure gradient kxo, load independent index of diastolic function, etc.) and select the aspect of physiology or pathophysiology to be quantified.

Accurate, causality-based quantification of global diastolic function has been achieved by kinematic modeling-based analysis of transmitral flow via the Parametrized Diastolic Filling (PDF) formalism. PDF generates unique stiffness, relaxation,&#160;and load parameters and elucidates &#39;new&#39; physiology while providing sensitive and specific indexes of dysfunction.

Quantificazione di Global Funzione diastolica da Analisi basata su modellazione cinematica del flusso transmitralico tramite il formalismo di riempimento parametrizzate diastolica

Quantitative cardiac function assessment remains a challenge for physiologists and clinicians.&#160;Although historically invasive methods have comprised ...

Bioingegneria

Intra-Omental Islet Transplantation Using h-Omental Matrix Islet filliNG (hOMING)

Regenerative medicine based on cell therapy represents a new hope for curing disease. Current obstacles include proper in vivo validation of the efficiency of the therapy. For transfer to the recipient body, cells often need to be combined with biomaterials, especially hydrogels. However, validation of the efficacy of such a graft requires the right environment, the right hydrogel, and the right recipient site. The omentum might be such a site. Based on the example of islet transplantation, we developed the hOMING (h-Omental Matrix Islet filliNG) technique, which consists of the injection of the graft inside the tissue, in between the omental layers, to improve islet implantation and survival. To achieve this, islets have to be embedded in a hydrogel with a viscosity that enables its injection using an atraumatic needle. Syringes are loaded with a combination of hydrogel and islets. Several injections are performed inside the omental tissue at different entry points, and the deposition of the islet/hydrogel mixture is made along a line. We tested the feasibility of this innovative approach using dextran beads. The beads were well spread throughout the omental tissue, in close proximity to blood vessels. To test the efficacy of the graft, we transplanted islets into diabetic rats and perform a metabolic follow-up over two months. The transplanted islets exhibited a high rate of re-vascularization around and inside islets, and reversed diabetes. The hOMING technique could be applicable for other types of hydrogel or cell therapy, for cells with high metabolic activity.

Intra-Omental Islet Transplantation Using h-Omental Matrix Islet filliNG hOMING

Here, we present a protocol for in vivo validation of hydrogel-based cell therapy, illustrated by the example of islet transplantation. h-Omental Matrix Islet filliNG (hOMING) implantation allows implantation of a cell-hydrogel mixture between the omental layers, near to blood vessels, to maximize engraftment in a proper metabolic environment.

Utilizzo di trapianto dell'isolotto intra-omentale di riempimento Matrix isolotto h-omentale (hOMING)

Regenerative medicine based on cell therapy represents a new hope for curing disease. Current obstacles include proper in vivo validation of the ...

Intraportal Transplantation of Pancreatic Islets in Mouse Model

Pancreatic islet transplantation to reduce hyperglycemia is highly successful in rodents with chemically-induced diabetes. The most common transplantation site in experimental islet transplantation is the kidney capsule. However, as less is known about the interaction of pancreatic islets with blood constituents, it also makes sense to utilize the portal vein approach in experimental islet transplantation.
This protocol demonstrates an intraportal islet transplantation technique in NMRI nude mice. Streptozotocin (180 mg/kg) is injected intraperitoneally to induce hyperglycemia in recipient mice. They are considered as diabetic at a non-fasting blood glucose level greater than 20 mmol/L. One day prior to transplantation, mouse pancreatic islets are isolated from the donor pancreas by collagenase digestion; a minimum of 350 islets are utilized per diabetic recipient. Depending upon the islet isolation yield, two or more donor mice are utilized per recipient. After overnight culture at 37 &#176;C, islets are administered into the recipient liver via the portal vein. After surgery, the mice are protected in red Makrolon houses and observed until are awake. This protocol maintains glycemic control for 120 days in syngeneic mice and 15 days in allogeneic mice.

Pancreatic islet transplantation is a way to achieve normoglycemia in type 1 diabetes. This article focuses on the transplantation technique through the intraportal route to maintain normal glucose levels in diabetic mice.

Intraportal trapianto di isole pancreatiche nel modello del topo

Pancreatic islet transplantation to reduce hyperglycemia is highly successful in rodents with chemically-induced diabetes. The most common transplantation ...

Inguinal Subcutaneous White Adipose Tissue (ISWAT) Transplantation Model of Murine Islets

Pancreatic islet transplantation is a well-established therapeutic treatment for type 1 diabetes. The kidney capsule is the most commonly used site for islet transplantation in rodent models. However, the tight kidney capsule limits the transplantation of sufficient islets in large animals and humans. The inguinal subcutaneous white adipose tissue (ISWAT), a new subcutaneous space, was found to be a potentially valuable site for islet transplantation. This site has better blood supply than other subcutaneous spaces. Moreover, the ISWAT accommodates a larger islet mass than the kidney capsule, and transplantation into it is simple. This manuscript describes the procedure of mouse islet isolation and transplantation in the ISWAT site of syngeneic diabetic mouse recipients. Using this protocol, murine pancreatic islets were isolated by standard collagenase digestion and a basement membrane matrix hydrogel was used for fixing the purified islets in the ISWAT site. The blood glucose levels of the recipient mice were monitored for more than 100 days. Islet grafts were retrieved at day 100 after transplantation for histological analysis. The protocol for islet transplantation in the ISWAT site described in this manuscript is simple and effective.

Inguinal Subcutaneous White Adipose Tissue ISWAT Transplantation Model of Murine Islets

In this protocol, a method of murine islet isolation and transplantation into the inguinal subcutaneous white adipose tissue is described. Isolated syngeneic murine islets are transplanted into a murine recipient using a basement membrane hydrogel. The blood glucose level of the recipients is monitored, and histology analysis of the islet grafts is performed.

Modello di trapianto di Murine (ISWAT) del tessuto adiposo sottocutaneo inguinale (ISWAT)

Pancreatic islet transplantation is a well-established therapeutic treatment for type 1 diabetes. The kidney capsule is the most commonly used site for ...

Fat-Covered Islet Transplantation Using Epididymal White Adipose Tissue

Islet transplantation is a cellular replacement therapy for severe diabetes mellitus. The intraperitoneal cavity is typically the transplant site for this procedure. However, intraperitoneal islet transplantation has some limitations, including poor transplant efficacy, difficult graft detection ability, and a lack of graftectomy capability for post-transplant analysis. In this paper, "fat-covered islet transplantation", an intraperitoneal islet transplantation method that utilizes epididymal white adipose tissue, is used to assess the therapeutic effects of bioengineered islets. The simplicity of the method lies in the seeding of islets onto epididymal white adipose tissue and using the tissue to cover the islets. While this method can be categorized as an intraperitoneal islet transplantation technique, it shares characteristics with intra-adipose tissue islet transplantation. The fat-covered islet transplantation method demonstrates more robust therapeutic effects than intra-adipose tissue islet transplantation, however, including the improvement of blood glucose and plasma insulin levels and the potential for graft removal. We recommend the adoption of this method for assessing the mechanisms of islet engraftment into white adipose tissue and the therapeutic effects of bioengineered islets.

This fat-covered islet transplantation method is suitable for the detection of engrafted islets in the intraperitoneal cavity. Notably, it does not require the use of biobinding agents or suturing.

Trapianto di isole ricoperte di grasso utilizzando tessuto adiposo bianco epididimo

Islet transplantation is a cellular replacement therapy for severe diabetes mellitus. The intraperitoneal cavity is typically the transplant site for this ...

Minimizing Post-Infusion Portal Vein Bleeding during Intrahepatic Islet Transplantation in Mice

Although the liver is currently accepted as the primary transplantation site for human islets in clinical settings, islets are transplanted under the kidney capsule in most rodent preclinical islet transplantation studies. This model is commonly used because murine intrahepatic islet transplantation is technically challenging, and a high percentage of mice could die from surgical complications, especially bleeding from the injection site post-transplantation. In this study, two procedures that can minimize the incidence of post-infusion portal vein bleeding are demonstrated. The first method applies an absorbable hemostatic gelatin sponge to the injection site, and the second method involves penetrating the islet injection needle through the fat tissue first and then into the portal vein by using the fat tissue as a physical barrier to stop bleeding. Both methods could effectively prevent bleeding-induced mouse death. The whole liver section showing islet distribution and evidence of islet thrombosis post-transplantation, a typical feature for intrahepatic islet transplantation, were presented. These improved protocols refine the intrahepatic islet transplantation procedures and may help laboratories set up the procedure to study islet survival and function in pre-clinical settings.

Here we present refined surgical procedures on successfully performing intraportal islet transplantation, a clinically relevant but technically challenging surgical procedure, in mice.

Ridurre al minimo il sanguinamento della vena porta post-infusione durante il trapianto di isole intraepatiche nei topi

Although the liver is currently accepted as the primary transplantation site for human islets in clinical settings, islets are transplanted under the ...

A Method for Islet Transplantation to the Omentum in Mouse

Islet transplantation has been proposed to be a potential treatment for type 1 diabetes. Recent compelling evidence indicates that intravascular islet infusion is far from ideal and therefore, the omentum is re-emerging as a potentially valuable site for islet transplantation. This experiment requires the isolation of high quality islets and the implantation of the islets to the diabetic recipients. Transplantation to the omentum requires surgical steps that can be better demonstrated visually. Here, the detailed steps for this procedure are presented. Two methods of mixing the isolated islets with hydrogel before placing the mixture into the omental pouch of diabetic mice are described here. Different hydrogels are used for the different conditions. Blood glucose levels of diabetic mouse recipients of syngeneic islets in the omentum were monitored for up to 35 days. Some animals were sacrificed after 14 days to perform immuno-histochemical analysis. This pre-clinical transplantation approach can be used as preliminary data leading up to translation to clinical transplantation.

A method for the omental transplantation of islets in a mouse is introduced. The isolated islets are mixed with hydrogel and the mixture is placed into the omental pouch of a diabetic mouse. Then, the blood glucose is monitored, and immuno-histochemical analysis is performed.

Un metodo per il trapianto dell'isolotto al omento in Mouse

Islet transplantation has been proposed to be a potential treatment for type 1 diabetes. Recent compelling evidence indicates that intravascular islet ...

Murine Model of Islet Transplantation: A Surgical Method to Infuse Pancreatic Islets in Portal Vein and Prevention of Postoperative Bleeding

Source: Gou, W. et al. <a href="https://www.jove.com/v/62530">Minimizing Post-Infusion Portal Vein Bleeding during Intrahepatic Islet Transplantation in Mice.</a> J. Vis. Exp. (2021)
In this video, we describe a procedure to infuse pancreatic islet cells into the&#160;hepatic portal vein, followed by application of gel foam to successfully prevent bleeding. Postoperative bleeding is a common cause of high mortality during islet transplantation.

Modello murino di trapianto di isole: un metodo chirurgico per infondere le isole pancreatiche nella vena porta e prevenzione del sanguinamento postoperatorio

Source: Gou, W. et al. Minimizing Post-Infusion Portal Vein Bleeding during Intrahepatic Islet Transplantation in Mice. J. Vis. Exp. (2021)
In this video, ...