This research was supported by the research programs of the National Research Foundation of Korea (NRF) (NRF-2015R1A1A1A05001548 and NRF-2015R1A5A1037668).

Experimente mit Blutproben wurden in Übereinstimmung mit den einschlägigen Gesetzen und Richtlinien des Instituts durchgeführt. Die Proben wurden die restlichen Blutproben, die in der Einrichtung in klinischen Tests erfasst und verarbeitet worden war. 1. PT-AS Optischer Aufbau HINWEIS: Man kann eine leere Mikro Kapillare für einen anfänglichen PT-AS-Setup verwenden. <ol><li> Halterung einen leeren Mikro Kapillarrohr mit inneren und äußeren Durchmessern von 200 bis 330 &amp; mgr; m sind, und eine Länge von mehr als ~ 5 cm auf einem Kapillarrohr fixture. Im Handel erhältliche Faser Vorrichtungen können als der Rohrbefestigung verwendet werden. </li><li> Sichere Verankerung eines 650 - nm - Laserpointer, dh die Sonde Lichtquelle, die Kapillare zu beleuchten. Der Sondenstrahl sollte größer sein als das Kapillarrohr sein. Legen Sie einen Bildschirm (zB weißes Papier) hinter der Kapillare eine Winkel periodisches Muster zu beobachten. </li><li> Für den Erfassungsteil, entfernen Sie alle Linsen in einer Webcam direkt auf die scatt zu erfassenEring Muster. Positionieren der Webcam hinter dem Kapillarröhrchen in einem Winkel von 25-35 ° gegenüber der Sondenstrahlrichtung. Stellen Sie sicher , dass die Winkel periodisches Muster durch das Kapillarrohr erzeugt wird, kann mit dem Detektor (Figur 1) gemessen werden. Beobachten der Winkel periodisches Muster in der Mitte des Bildsensors, wenn der Bildsensor richtig positioniert ist. </li><li> Positionieren Sie einen 532-nm-PT Anregungslichtquelle das Kapillarrohr zu beleuchten. Positionieren der PT-Lichtquelle in einem beliebigen Winkel, solange die PT Anregungslicht überlappt Sondenstrahl auf der Kapillarröhre und erreicht nicht den Detektor direkt. PT Anregung von Blutproben mit hoher optischer Leistung verbessert typischerweise die PT-AS Empfindlichkeit, da sie auf eine größere Änderung in der RI führt. <ol><li> Verwenden Sie die höchste optische Leistung des PT Anregungslichtquelle verwendet wird. Darüber hinaus sicherstellen, dass die PT Anregungslicht die Sonde Licht auf die Kapillare überlappt. Verwenden Sie eine Strahlgröße des PT-Anregungslichtmindestens zweimal der des Sondenlichts das gesamte Probenvolumen zu erhitzen. </li></ol></li><li> Legen Sie ein Langpassfilter vor dem Detektor die 532-nm-Licht zu blockieren und nur die 650-nm-Sonde Licht messen. </li><li> Installieren Sie einen optischen Chopper in dem Pfad des PT Anregungslicht vor der Kapillare zu beleuchten. Der optische Chopper verwendet, um die PT Anregungslichtintensität zu modulieren. </li></ol> 2. Blut Probenvorbereitung <ol><li> Zeichnen Sie 6 ml frisches Vollblut bei anämischen Zustand in Äthylendiamintetraessigsäure Blutprobenröhrchen, und die Proben gut mischen. Keine andere Verarbeitung erforderlich ist. </li><li> Messen Sie die Blutproben mit dem PT-AS Sensor innerhalb von 24 Stunden der Extraktion Koagulation zu verhindern. </li></ol> 3. PT-AS Messprotokolle <ol><li> Laden einer Mikro Kapillarrohr mit einer Blutprobe zu messen. Füllen Sie das Kapillarrohr mit dem Blut durch Kapillarwirkung durch den Schlauch in das Blut s platzierenreichlich. Die minimale Probenmenge erforderlich für die Messung wird durch den Innendurchmesser des Kapillarrohrs und der Sondenstrahlgröße bestimmt. <ol><li> Verwenden ein Rohr mit einem Innendurchmesser von 200 um. Die Sondenstrahlgröße betrug 2 mm in den repräsentativen Ergebnissen, was darauf hindeutet, dass die Messung kann mit einem Probenvolumen von&gt; 63 nl durchgeführt werden. </li></ol></li><li> Montieren Sie das Kapillarröhrchen an der vorgesehenen Position in der Halterung. </li><li> Schalten Sie die 650 nm Sonde Laser die Blut geladen Mikro Kapillare zu beleuchten. Die Winkel periodische Muster sollte mit der Webcam beobachtet werden. </li><li> Schalten Sie den 532-nm PT Anregungslaser das Rohr zu beleuchten. </li><li> Führen des optischen Zerhackers die Intensität des PT Anregungslicht bei 2 Hz zu modulieren. HINWEIS: Die Gründe für die Auswahl dieser Betriebszustand ist in Diskussion und Kim et al. 12. <ol><li> Montieren Sie einen Chopperrads in der Motorkopfanordnung der optischen ChopperSystem. </li><li> Schalten Sie die Chopper-Steuerung ein, und verwenden Sie den Drehknopf in der Konsole die Modulationsfrequenz einzustellen. </li><li> Führen Sie den Chopper mit dem Regler. </li></ol></li><li> Notieren Sie sich die schwankende Streumuster über die Webcam für 5 Sekunden in MPEG-4 (mp4) Format. </li></ol> 4. Signalverarbeitung HINWEIS: PT-AS Signalverarbeitung wurde unter Verwendung eines Labor-entwickelten MATLAB-Code ausgeführt. <ol><li> Laden Sie die Videodatei die Bilder zu extrahieren. Für jedes Bild [Figur 2 (a) für einen repräsentativen Bild sehen], erhalten , um den gemittelten Streumuster , das durch den Mittelwert der Pixelwerte entlang der vertikalen Richtung Berechnung [Figur 2 (b, c)]. </li><li> Auswerten der Fourier des gemittelten Streumuster transformieren, und berechnet die Phase bei der Spitzenortsfrequenz. Diese Vorgänge sind für alle Rahmen aller aufgenommenen Bilder. </li><li> die Phasenwerte unter Verwendung von allen Bildern erhalten, zeichnen die zeitliche PhaseFluktuation [2 (d)]. Beachten Sie, dass die Phase an der PT Modulationsfrequenz schwankt. Nehmen der Fourier-Transformation der Phasenschwankung in der Zeitdomäne zu transformieren und zu erhalten, die Größe bei der Modulationsfrequenz. Dieses Signal wird als die PT-AS - Signal [Bild 2 (e)]. </li><li> Messung der [Hb] von einer Blutprobe durch die PT-AS Signals in das Umwandlungs entsprechenden [Hb], um die Kalibrierungskurve unter Verwendung von in Protokoll 5 erhalten wird. </li></ol> 5. PT-AS Kalibrierungs <ol><li> Bereiten Sie Blutproben, mit [Hb] Werte , die gleichmäßig in dem Erfassungsbereich des PT-AS Sensor verteilt sind (zB 0 - 18 g / dl). </li><li> Vor der Kalibrierung quantifizieren die [Hb] -Werte der Proben eines Referenz Hämatologie-Analysators. Messen Sie die PT-AS Signale der Proben. </li><li> Leiten Sie eine Eichkurve betreffend [Hb] zu dem PT-AS-Signal durch eine lineare Durchführen der kleinsten Quadrate, [Hb] = A [PT-AS Signal] + B, der experimental Ergebnisse. Für die Betriebsbedingungen in Tabelle 1 angegebenen, ist die Beziehung zwischen [Hb] und der PT-AS - Signal wurde zu sein [Hb] = 5,13 [PT-AS - Signal] gefunden - 0,09. Verwenden Sie MATLAB-Code die lineare Anpassung auszuführen. </li></ol>

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Chem. 59 (10), 1506-1513 (2013).</li><li>Zhu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cost-effective+and+rapid+blood+analysis+on+a+cell-phone.">Cost-effective and rapid blood analysis on a cell-phone.</a> Lab Chip. 13 (7), 1282-1288 (2013).</li><li>Poga&#269;nik, L., Franko, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+organophosphate+and+carbamate+pesticides+in+vegetable+samples+by+a+photothermal+biosensor.">Detection of organophosphate and carbamate pesticides in vegetable samples by a photothermal biosensor.</a> Biosens. Bioelectron. 18 (1), 1-9 (2003).</li></ol>

No conflict of interest is declared.

Der PT-Sensor AS stellt eine rein optische Methode, die für direktes [Hb] Messung von nicht verarbeiteten Blutproben. Das Verfahren quantifiziert [Hb] im Blut die intrinsische PT Reaktion von Hämoglobin-Moleküle in den Erythrozyten verwendet wird. Unter Beleuchtung mit 532-nm-Licht absorbieren Hb-Moleküle die Lichtenergie und Wärme erzeugen. Die sich ergebende Temperaturanstieg ändert den RI der Blutprobe. Die hohe Empfindlichkeit von RI BSI wurde nutzten diese RI Veränderung im Blut zu messen. Zuvor haben wir ge...

Ein Bluttest wird häufig durchgeführt, insgesamt die menschliche Gesundheit zu bewerten und Biomarkern zur Erkennung bestimmter Krankheiten im Zusammenhang. Zum Beispiel dient die Cholesterinkonzentration im Blut als Kriterium für Hyperlipidämie, die in engem Zusammenhang mit Herz-Kreislauf-Erkrankungen und Pankreatitis zusammenhängt. Die Blutzucker Inhalte sollten häufig gemessen werden, da die Glucosespiegel mit Komplikationen wie diabetischer Ketoazidose und hyperglycemic hyperosmolar Syndrom assoziiert ist. Schwere Erkrankungen wie Malaria, Human Immunodeficiency Virus und Acquired Immune Deficiency Syndrome werden durch Blutuntersuchungen diagnostiziert, und die Quantifizierung von Blutkomponenten, einschließlich Erythrozyten, Thrombozyten und Leukozyten ermöglicht Screening von Bauchspeicheldrüsen- und Nierenerkrankungen. Hämoglobin (Hb), eine kritische Komponente von Blut, macht etwa 96% der Erythrozyten auf, und transportiert Sauerstoff an menschlichen Organen. Wesentliche Veränderung seiner Massenkonzentration ([Hb]) kann mir zeigentabolic Veränderungen, Leber - Gallen - Erkrankungen und neurologischen, Herz - Kreislauf- und endokrinologischen Störungen 1. [Hb] wird deshalb routinemäßig bei Bluttests gemessen. Insbesondere anämischen Patienten, Dialysepatienten und schwangere Frauen sind stark zu überwachen [Hb] als eine wichtige Aufgabe 2 empfohlen. Verschiedene [Hb] Nachweisverfahren so entwickelt worden. Das Hämoglobin Cyanid - Verfahren, eines der am häufigsten verwendeten Techniken für die [Hb] Quantifizierung verwendet Kaliumcyanid (KCN) 3 , um die Lipid - Doppelschicht von Erythrozyten zu zerstören. Das Cyanid Hämoglobin durch die chemische weist eine hohe Absorption im Bereich von 540 nm erzeugt; Somit [Hb] Messungen können über kolorimetrische Analyse durchgeführt werden. Dieses Verfahren wird weithin aufgrund seiner Einfachheit verwendet, aber die verwendeten Chemikalien (zB KCN und Dimethyllaurylamin oxide) sind toxisch für den Menschen und die Umwelt. Der Hämatokrit Regelung misst die Volumenverhältnis der roten Blutkörperchen im Vergleich zur Gesamtblut volume durch zentrifugale Trennung; jedoch erfordert sie einen relativ großen Blutvolumen (50-100 ul) 4. Spektrophotometrie Methoden Maßnahme [Hb] genau ohne Einsatz von Chemikalien, sondern Messungen bei mehreren Wellenlängen und einem großen Blutvolumen werden 5,6 erforderlich. In ähnlicher Weise mehrere optische Verfahren zur Messung von [Hb] wurden einschließlich der Nachweismethoden auf Basis von Lichtstreuung vorgeschlagen, aber ihre Messgenauigkeit hängt stark von der Genauigkeit der theoretischen Blutmodell. Um diese Einschränkungen zu überwinden, [Hb] Nachweisverfahren basierend auf dem Lichtwärmeumsetzmaterial (PT) Wirkung von Hb wurden kürzlich 7 vorgeschlagen. Hb, die hauptsächlich aus Eisenoxiden besteht, absorbiert bei 532 nm Licht und wandelt die Lichtenergie in Wärme 8-10. Diese PT Temperaturerhöhung kann optisch erfasst werden, indem eine Änderung des Brechungsindex (RI) von Blutproben zu messen. Yim et al. Arbeitnehmer spektral-Domäne optische Kohärenz reflectometry den PT optischen Pfad-Längenänderung in einem Blut enthaltenden Kammer 11 zu messen. Obwohl das Verfahren chemikalienfreie und direkte [Hb] Messung ermöglicht, kann die Verwendung eines Spektrometers und eine interferometrische Anordnung ihrer Miniaturisierung behindert. Wir stellten kürzlich eine alternative [Hb] Erfassungsverfahren, bezeichnet als photothermische Winkellichtstreuung (PT-AS) Sensor, der für die Miniaturisierung und 12 besser geeignet ist. Der PT-AS-Sensor nutzt die hohe RI Empfindlichkeit des Rückstreu Interferometrie (BSI) PT Änderungen in der RI einer Blutprobe in ein Kapillarrohr zu messen. BSI wurden verwendet RI verschiedener Lösungen zu messen 13-15 und biochemische Wechselwirkungen in freier Lösung 16 zu überwachen. Der PT-AS Sensor verwendet ähnliche optische Anordnung, wie sie in BSI, sondern verbindet Setup Lichtwärmeumsetzmaterial Anregung PT Anstieg von RI in Blutproben zu messen. Arbeitsweise des BSI und der PT-AS-Sensoren werden an anderer Stelle ausführlich beschrieben <sup&gt; 12,15. PT-AS Sensor nachgewiesen hoher Empfindlichkeit [Hb] Messung über einen weiten Erfassungsbereich (0,35 bis 17,9 g / dl) und ist in der Lage mit Probenvolumina von &lt;100 nl Betrieb. Kein Vorkonditionierung der Blutprobe erforderlich ist, und die Messzeit beträgt nur ca. 5 sec. Hier ist der Versuchsaufbau und ein detailliertes Messprotokoll beschrieben. Representative PT-AS Ergebnisse werden unter Verwendung von Blutproben von anämischen Patienten zur Verfügung gestellt, und die Ergebnisse werden verglichen, die aus einem Hämatologie-Analysator die Genauigkeit des PT-AS-Sensor zu bewerten.

<table><tbody><tr><td>650 nm laser pointer</td><td>LASMAC</td><td>LED-1</td><td>Probe light</td></tr><tr><td>Hollow round glass capillaries</td><td>VitroCom</td><td>CV2033</td><td>Blood sample container</td></tr><tr><td>Webcam</td><td>Logitech</td><td>C525</td><td>CMOS optical sensor</td></tr><tr><td>Optical chopper system</td><td>Thorlabs</td><td>MC2000-EC</td><td>Optical chopper</td></tr><tr><td>Plastic long-pass filter</td><td>Edmund Optics</td><td>#43-942</td><td>To reject 532-nm PT excitation light</td></tr><tr><td>Fiber clamp</td><td>Thorlabs</td><td>SM1F1-250</td><td>Capillary tube fixture</td></tr><tr><td>EDTA coated blood sampling tube</td><td>Greiner Bio-One</td><td>VACUETTE 454217</td><td>Blood sampling &amp;amp; anticoagulating</td></tr><tr><td>Hematology analyzer</td><td>Siemens AG</td><td>ADVIA 2120i</td><td>Reference hematology analyzer</td></tr></tbody></table>

a rapid and chemical-free hemoglobin assay with photothermal angular light scattering

Photothermischen Winkellichtstreuung (PT-AS) ist ein neues optisches Verfahren zur Messung der Hämoglobinkonzentration ([Hb]) von Blutproben. Auf der Basis der intrinsischen Lichtwärmeumsetzmaterial Reaktion von Hämoglobin-Molekülen ermöglicht der Sensor mit hoher Empfindlichkeit, chemikalienfreie Messung von [Hb]. [Hb] Erfassungsfähigkeit mit einem Grenzwert von 0,12 g / dl über den Bereich von 0,35 bis 17,9 g / dl zuvor nachgewiesen wurde. Das Verfahren kann leicht unter Verwendung von preiswerten elektronischen Geräten wie beispielsweise ein Laser-Pointer und eine Webcam implementiert werden. Die Verwendung einer Mikro Kapillarrohr als Blutbehälter ermöglicht auch die Hämoglobin-Assay mit einem Nanoliter-Maßstab Blutvolumen und niedrigen Betriebskosten. Hier detaillierte Anweisungen für den PT-AS optischen Aufbau und Signalverarbeitungsverfahren werden vorgestellt. Experimentelle Protokolle und repräsentative Ergebnisse für Blutproben in anämischen Zuständen ([Hb] = 5,3, 7,5 und 9,9 g / dl) sind ebenfalls vorgesehen, und die Messungen werden mit denen verglichen froma Hämatologieanalysator. Seine Einfachheit in der Implementierung und Betrieb sollte ihre breite Akzeptanz in der klinischen Laboratorien und mit beschränkten Ressourcen ermöglichen.

Ein Hämoglobin-Assay wurde unter Verwendung des PT-Sensors AS durchgeführt und seine Messungen wurden mit denen von einem Hämatologie-Analysator verglichen. Das Experiment wurde mit einer PT Anregungslichtintensität von 1,4 W / cm 2, PT Modulationsfrequenz von 2 Hz und Messzeit von 5 sec durchgeführt. Tabelle 1 faßt die experimentellen Bedingungen. Die Strahlgrößen der Sonde und PT Anregungslicht waren 5,5 und 2 mm. Die Webcam aufgezeichnet, die Bilder...

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A Rapid and Chemical-free Hemoglobin Assay with Photothermal Angular Light Scattering

A photo-thermal angular light scattering (PT-AS) sensor enables the rapid and chemical-free hemoglobin assay of nanoliter-scale blood samples. Here, details of the PT-AS setup and a measurement protocol for the hemoglobin concentration in blood are provided. Representative results for anemic blood samples are also presented.

Eine schnelle und Chemiefreie Hämoglobin-Assay mit Photothermische Winkellichtstreuung

Photo-thermal angular light scattering (PT-AS) is a novel optical method for measuring the hemoglobin concentration ([Hb]) of blood samples. On the basis ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

9.6K Aufrufe.  Yonsei University. A photo-thermal angular light scattering (PT-AS) sensor enables the rapid and chemical-free hemoglobin assay of nanoliter-scale blood samples. Here, details of the PT-AS setup and a measurement protocol for the hemoglobin concentration in blood are provided. Representative results for anemic blood samples are also presented.

Serie: A Rapid and Chemical-free Hemoglobin Assay with Photothermal Angular Light Scattering

Antigens Protected Functional Red Blood Cells By The Membrane Grafting Of Compact Hyperbranched Polyglycerols

Red blood cell (RBC) transfusion is vital for the treatment of a number of acute and chronic medical problems such as thalassemia major and sickle cell anemia 1-3. Due to the presence of multitude of antigens on the RBC surface (~308 known antigens 4), patients in the chronic blood transfusion therapy develop alloantibodies due to the miss match of minor antigens on transfused RBCs 4, 5. Grafting of hydrophilic polymers such as polyethylene glycol (PEG) and hyperbranched polyglycerol (HPG) forms an exclusion layer on RBC membrane that prevents the interaction of antibodies with surface antigens without affecting the passage of small molecules such as oxygen ,glucose, and ions3. At present no method is available for the generation of universal red blood donor cells in part because of the daunting challenge presented by the presence of large number of antigens (protein and carbohydrate based) on the RBC surface and the development of such methods will significantly improve transfusion safety, and dramatically improve the availability and use of RBCs. In this report, the experiments that are used to develop antigen protected functional RBCs by the membrane grafting of HPG and their characterization are presented. HPGs are highly biocompatible compact polymers 6, 7, and are expected to be located within the cell glycocalyx that surrounds the lipid membrane 8, 9 and mask RBC surface antigens10, 11.

The cell membrane modification of red blood cells (RBCs) with hyperbranched polyglycerol (HPG) is presented. Modified RBCs were characterized by aqueous two phase partitioning, osmotic fragility and complement mediated lysis. The camouflage of surface proteins and antigens was evaluated using the flow cytometry and Micro Typing System (MTS) blood phenotyping cards.

Antigene geschützten funktionellen Red Blood Cells durch die Membran Pfropfung von Compact hyperverzweigten Polyglycerinen

Red blood cell (RBC) transfusion is vital for the treatment of a number of acute and chronic medical problems such as thalassemia major and sickle cell ...

Forschung

Immunologie und Infektion

A Rhodopsin Transport Assay by High-Content Imaging Analysis

Rhodopsin misfolding mutations lead to rod photoreceptor death that is manifested as autosomal dominant retinitis pigmentosa (RP), a progressive blinding disease that lacks effective treatment. We hypothesize that the cytotoxicity of the misfolded rhodopsin mutant can be alleviated by pharmacologically stabilizing the mutant rhodopsin protein. The P23H mutation, among the other Class II rhodopsin mutations, encodes a structurally unstable rhodopsin mutant protein that is accumulated in the endoplasmic reticulum (ER), whereas the wild type rhodopsin is transported to the plasma membrane in mammalian cells. We previously performed a luminescence-based high-throughput screen (HTS) and identified a group of pharmacological chaperones that rescued the transport of the P23H rhodopsin from ER to the plasma membrane. Here, using an immunostaining method followed by a high-content imaging analysis, we quantified the mutant rhodopsin protein amount in the whole cell and on the plasma membrane. This method is informative and effective to identify true hits from false positives following HTS. Additionally, the high-content image analysis enabled us to quantify multiple parameters from a single experiment to evaluate the pharmacological properties of each compound. Using this assay, we analyzed the effect of 11 different compounds towards six RP associated rhodopsin mutants, obtaining a 2-D pharmacological profile for a quantitative and qualitative understanding about the structural stability of these rhodopsin mutants and efficacy of different compounds towards these mutants.

Here, we described a high-content imaging method to quantify the transport of rhodopsin mutants associated with retinitis pigmentosa. A multiple-wavelength scoring analysis was used to quantify rhodopsin protein on the cell surface or in the whole cell.

Ein Rhodopsin Transport Test von High-Content Imaging-Analyse

Rhodopsin misfolding mutations lead to rod photoreceptor death that is manifested as autosomal dominant retinitis pigmentosa (RP), a progressive blinding ...

Chemie

Rapid Determination of Antibody-Antigen Affinity by Mass Photometry

Measurements of the specificity and affinity of antigen-antibody interactions are critically important for medical and research applications. In this protocol, we describe the implementation of a new single-molecule technique, mass photometry (MP), for this purpose. MP is a label- and immobilization-free technique that detects and quantifies molecular masses and populations of antibodies and antigen-antibody complexes on a single-molecule level. MP analyzes the antigen-antibody sample within minutes, allowing for the precise determination of the binding affinity and simultaneously providing information on the stoichiometry and the oligomeric state of the proteins. This is a simple and straightforward technique that requires only picomole quantities of protein and no expensive consumables. The same procedure can be used to study protein-protein binding for proteins with a molecular mass larger than 50 kDa. For multivalent protein interactions, the affinities of multiple binding sites can be obtained in a single measurement. However, the single-molecule mode of measurement and the lack of labeling imposes some experimental limitations. This method gives the best results when applied to measurements of sub-micromolar interaction affinities, antigens with a molecular mass of 20 kDa or larger, and relatively pure protein samples. We also describe the procedure for performing the required fitting and calculation steps using basic data analysis software.

We describe a single-molecule approach to antigen-antibody affinity measurements using mass photometry (MP). The MP-based protocol is fast, accurate, uses a very small amount of material, and does not require protein modification.

Schnelle Bestimmung der Antikörper-Antigen-Affinität durch Massenphotometrie

Measurements of the specificity and affinity of antigen-antibody interactions are critically important for medical and research applications. In this ...

Biochemie

Time-resolved F&#246;rster Resonance Energy Transfer Assays for Measurement of Endogenous Phosphorylated STAT Proteins in Human Cells

The Janus kinase (JAK)/signal transducer and activator of transcription (STAT) signaling pathway plays a crucial role in mediating cellular responses to cytokines and growth factors. STAT proteins are activated by tyrosine phosphorylation mediated mainly by JAKs. The abnormal activation of STAT signaling pathways is implicated in many human diseases, especially cancer and immune-related conditions. Therefore, the ability to monitor STAT protein phosphorylation within the native cell signaling environment is important for both academic and drug discovery research. The traditional assay formats available to quantify phosphorylated STAT proteins include western blotting and the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). These heterogeneous methods are labor-intensive, low-throughput, and often not reliable (specific) in the case of western blotting. Homogeneous (no-wash) methods are available but remain expensive. 
Here, detailed protocols are provided for the sensitive, robust, and cost-effective measurement in a 384-well format of endogenous levels of phosphorylated STAT1 (Y701), STAT3 (Y705), STAT4 (Y693), STAT5 (Y694/Y699), and STAT6 (Y641) in cell lysates from adherent or suspension cells using the novel THUNDER time-resolved F&#246;rster resonance energy transfer (TR-FRET) platform. The workflow for the cellular assay is simple, fast, and designed for high-throughput screening (HTS). The assay protocol is flexible, uses a low-volume sample (15 &#181;L), requires only one reagent addition step, and can be adapted to low-throughput and high-throughput applications. Each phospho-STAT sandwich immunoassay is validated under optimized conditions with known agonists and inhibitors and generates the expected pharmacology and Z'-factor values. As TR-FRET assays are ratiometric and require no washing steps, they provide much better reproducibility than traditional approaches. Together, this suite of assays provides new cost-effective tools for a more comprehensive analysis of specific phosphorylated STAT proteins following cell treatment and the screening and characterization of specific and selective modulators of the JAK/STAT signaling pathway.

Time-resolved F&#246;rster resonance energy transfer cell-based assay protocols are described for the simple, specific, sensitive, and robust quantification of endogenous phosphorylated signal transducer and activator of transcription (STAT) 1/3/4/5/6 proteins in cell lysates in a 384-well format.

Zeitaufgelöste Förster-Resonanz-Energietransfer-Assays zur Messung von endogenen phosphorylierten STAT-Proteinen in menschlichen Zellen

The Janus kinase (JAK)/signal transducer and activator of transcription (STAT) signaling pathway plays a crucial role in mediating cellular responses to ...

Magnetic Levitation Coupled with Portable Imaging and Analysis for Disease Diagnostics

Currently, many clinical diagnostic procedures are complex, costly, inefficient, and inaccessible to a large population in the world. The requirements for specialized equipment and trained personnel require that many diagnostic tests be performed at remote, centralized clinical laboratories. Magnetic levitation is a simple yet powerful technique and can be applied to levitate cells, which are suspended in a paramagnetic solution and placed in a magnetic field, at a position determined by equilibrium between a magnetic force and a buoyancy force. Here, we present a versatile platform technology designed for point-of-care diagnostics which uses magnetic levitation coupled to microscopic imaging and automated analysis to determine the density distribution of a patient's cells as a useful diagnostic indicator. We present two platforms operating on this principle: (i) a smartphone-compatible version of the technology, where the built-in smartphone camera is used to image cells in the magnetic field and a smartphone application processes the images and to measures the density distribution of the cells and (ii) a self-contained version where a camera board is used to capture images and an embedded processing unit with attached thin-film-transistor (TFT) screen measures and displays the results. Demonstrated applications include: (i) measuring the altered distribution of a cell population with a disease phenotype compared to a healthy phenotype, which is applied to sickle cell disease diagnosis, and (ii) separation of different cell types based on their characteristic densities, which is applied to separate white blood cells from red blood cells for white blood cell cytometry. These applications, as well as future extensions of the essential density-based measurements enabled by this portable, user-friendly platform technology, will significantly enhance disease diagnostic capabilities at the point of care.

We present a magnetic levitation technique coupled with automated imaging and analysis in both a smartphone-compatible device and a device with embedded imaging and processing. This is applied to measure the density distribution of cells with two demonstrated biomedical applications: sickle cell disease diagnosis and separating white and red blood cells.

Magnetic Levitation Gekoppelt mit tragbaren Imaging und Analyse für Krankheitsdiagnostik

Currently, many clinical diagnostic procedures are complex, costly, inefficient, and inaccessible to a large population in the world. The requirements for ...

Biotechnik

Rapid Homogeneous Detection of Biological Assays Using Magnetic Modulation Biosensing System

A magnetic modulation biosensing system (MMB) [1,2] rapidly and homogeneously detected biological targets at low concentrations without any washing or separation step. When the IL-8 target was present, a 'sandwich'-based assay attached magnetic beads with IL-8 capture antibody to streptavidin coupled fluorescent protein via the IL-8 target and a biotinylated IL-8 antibody. The magnetic beads are maneuvered into oscillatory motion by applying an alternating magnetic field gradient through two electromagnetic poles. The fluorescent proteins, which are attached to the magnetic beads are condensed into the detection area and their movement in and out of an orthogonal laser beam produces a periodic fluorescent signal that is demodulated using synchronous detection. The magnetic modulation biosensing system was previously used to detect the coding sequences of the non-structural Ibaraki virus protein 3 (NS3) complementary DNA (cDNA) [2]. The techniques that are demonstrated in this work for external manipulation and condensation of particles may be used for other applications, e.g. delivery of magnetically-coupled drugs in-vivo or enhancing the contrast for in-vivo imaging applications.

Magnetic modulation biosensing system is utilized to rapidly, sensitively and simply detect biological assays, such as DNA molecules and proteins.

Schnelle Homogene Detektion von biologischen Assays mit magnetischen Modulation Biosensorik-System

A magnetic modulation biosensing system (MMB) [1,2] rapidly and homogeneously detected biological targets at low concentrations without any washing or ...

Biologie

Simultaneous Evaluation of Cerebral Hemodynamics and Light Scattering Properties of the In Vivo Rat Brain Using Multispectral Diffuse Reflectance Imaging

The simultaneous evaluation of cerebral hemodynamics and the light scattering properties of in vivo rat brain tissue is demonstrated using a conventional multispectral diffuse reflectance imaging system. This system is constructed from a broadband white light source, a motorized filter wheel with a set of narrowband interference filters, a light guide, a collecting lens, a video zoom lens, and a monochromatic charged-coupled device (CCD) camera. An ellipsoidal cranial window is made in the skull bone of a rat under isoflurane anesthesia to capture in vivo multispectral diffuse reflectance images of the cortical surface. Regulation of the fraction of inspired oxygen using a gas mixture device enables the induction of different respiratory states such as normoxia, hyperoxia, and anoxia. A Monte Carlo simulation-based multiple regression analysis for the measured multispectral diffuse reflectance images at nine wavelengths (500, 520, 540, 560, 570, 580, 600, 730, and 760 nm) is then performed to visualize the two-dimensional maps of hemodynamics and the light scattering properties of the in vivo rat brain.

Simultaneous Evaluation of Cerebral Hemodynamics and Light Scattering Properties of the In Vivo Rat Brain Using Multispectral Diffuse Reflectance Imaging

The simultaneous evaluation of cerebral hemodynamics and the light scattering properties of in vivo rat brain tissue is demonstrated using a conventional multispectral diffuse reflectance imaging system.

Die gleichzeitige Auswertung der zerebralen Hämodynamik und Lichtstreuungseigenschaften der<em&gt; In Vivo</em&gt; Rattenhirn Mit Multispektral Diffuse Reflectance Imaging

The simultaneous evaluation of cerebral hemodynamics and the light scattering properties of in vivo rat brain tissue is demonstrated using a conventional ...

Neurowissenschaften

A Precision Medicine Tool for Measurement and Monitoring of Hemoglobin S in Sickle Cell Disease Patients Receiving Transfusion Therapy

Sickle cell disease (SCD) causes many severe health complications, including anemia, stroke, and acute chest syndrome. Red blood cell transfusion is the most commonly used therapy to treat or prevent these devastating complications. Other therapies include hydroxyurea therapy as well as bone marrow transplantation. Chronic intermittent transfusion is especially indicated to prevent recurrent strokes. However, transfusion therapy is associated with significant adverse effects (e.g., alloimmunization and iron overload). The point-of-care (POC) lateral flow immunoassay used here quantifies the %HbS in 15 min using a small patient blood sample. Utilizing this information, the healthcare provider is able to adjust blood transfusion volume for SCD patients to achieve the desired target HbS (most often &#60;30%), while reducing the risk of transfusion-related complications. When compared to laboratory hemoglobin electrophoresis data for 38 whole blood samples, the POC test performed with very high correlation and linear fit (slope = 0.9949, R2 = 0.9751). The strong agreement between the two hemoglobin S percentage (%HbS) quantifying methods shows that 89.5% of samples fall within &#177;5.2% HbS bias. The calibration for quantifying %HbS is built into the device to allow for an automated quantification of %HbS. This time- and cost-effective POC test thus allows the healthcare provider to make timely informed decisions when treating SCD patients, using accurate and updated data.

We have developed a point-of-care immunoassay to rapidly quantify hemoglobin S (HbS) levels during transfusion therapy for sickle cell disease (SCD) patients. By applying a small amount of treated blood to the device, the healthcare provider can determine the %HbS in a SCD patient to immediately inform clinical decisions.

Sickle cell disease (SCD) causes many severe health complications, including anemia, stroke, and acute chest syndrome. Red blood cell transfusion is the ...

Medizin

Homogeneous Time-resolved F&#246;rster Resonance Energy Transfer-based Assay for Detection of Insulin Secretion

The detection of insulin secretion is critical for elucidating mechanisms of regulated secretion as well as in studies of metabolism. Though numerous insulin assays have existed for decades, the recent advent of homogeneous time-resolved F&#246;rster Resonance Energy Transfer (HTRF) technology has significantly simplified these measurements. This is a rapid, cost-effective, reproducible, and robust optical assay reliant upon antibodies conjugated to bright fluorophores with long lasting emission which facilitates time-resolved F&#246;rster Resonance Energy Transfer. Moreover, HTRF insulin detection is amenable for the development of high-throughput screening assays. Here we use HTRF to detect insulin secretion in INS-1E cells, a rat insulinoma-derived cell line. This allows us to estimate basal levels of insulin and their changes in response to glucose stimulation. In addition, we use this insulin detection system to confirm the role of dopamine as a negative regulator of glucose-stimulated insulin secretion (GSIS). In a similar manner, other dopamine D2-like receptor agonists, quinpirole, and bromocriptine, reduce GSIS in a concentration-dependent manner. Our results highlight the utility of the HTRF insulin assay format in determining the role of numerous drugs in GSIS and their pharmacological profiles.

Here, we present homogeneous time resolved FRET (HTRF) as an efficient method for rapid detection of insulin secreted from cells.

Homogene Zeitaufgelösten Förster Resonanz Energie Transfer-basierten Test zur Erkennung von Insulin-Sekretion

The detection of insulin secretion is critical for elucidating mechanisms of regulated secretion as well as in studies of metabolism. Though numerous ...

<meta charset="utf8"></head><body>Optimierung der VIS-SWIR-Spektroskopie für biologische Moleküle

Characterization of Biological Absorption Spectra Spanning the Visible to the Short-Wave Infrared

For noninvasive light-based physiological monitoring, optimal wavelengths of individual tissue components can be identified using absorption spectroscopy. However, because of the lack of sensitivity of hardware at longer wavelengths, absorption spectroscopy has typically been applied for wavelengths in the visible (VIS) and near-infrared (NIR) range from 400 to 1,000 nm. Hardware advancements in the short-wave infrared (SWIR) range have enabled investigators to explore wavelengths in the ~1,000 nm to 3,000 nm range in which fall characteristic absorption peaks for lipid, protein, and water. These molecules are difficult to visualize in the VIS-NIR and can provide label-free sources of biological contrast. Furthermore, lower SWIR absorption has been observed for melanin, the primary chromophore responsible for skin pigmentation. In vivo&#160;optical devices like clinically standard pulse oximeters have been found to have reduced accuracy in people with darkly pigmented skin, possibly because of the stronger melanin absorption in the VIS range. Thus, error associated with skin pigmentation could be reduced by using devices operating in the SWIR. Optical instrument design is facilitated by the understanding of the absorption properties of core tissue components from the VIS to the SWIR range. This article describes protocols and instrumentation for obtaining VIS-SWIR absorption spectra of common tissue absorbers: oxygenated hemoglobin, deoxygenated hemoglobin, melanin, water, and lipid.

<meta charset="utf8"></head><body>Charakterisierung biologischer Absorptionsspektren vom sichtbaren bis zum kurzwelligen Infrarot

Biological samples have distinct optical characteristics in the short-wave infrared (SWIR) compared to the visible (VIS) and near-infrared (NIR) wavelength ranges. However, recording pure SWIR absorption spectra is challenging and rarely conducted for biological molecules. This article presents a method to characterize the VIS-SWIR absorption spectra of biological absorbers.

Charakterisierung biologischer Absorptionsspektren vom sichtbaren bis zum kurzwelligen Infrarot

For noninvasive light-based physiological monitoring, optimal wavelengths of individual tissue components can be identified using absorption spectroscopy. ...