Rhodopsin Fehlfaltung verursacht progressive Netzhautdegeneration genannt Retinitis pigmentosa. Während eine traditionelle bildgebende Methode nur begrenzte Kapazitäten zur Quantifizierung des Rhodopsin-Transports hat, ermöglicht dieser neu entwickelte bildbasierte Assay ein Screening mit hohem Durchsatz, wodurch Fehlalarme vermieden werden. Diese Technik ermöglicht eine schnelle Bewertung der Arzneimittelpharmakodynamik.
Im Auge der Rettung der Faltung von krankheitserregenden Rhodopsin, so beschleunigt das Potenzial für eine Behandlung für die leise unbehandelte und blendende Krankheit, Retinitis pigmentosa. Die zelluläre Lokalisierung eines Membranproteins ist sehr wichtig für seine Funktion. Diese Methode kann leicht modifiziert und angewendet werden, um den Transport jedes anderen Membranproteins von Interesse zu quantifizieren.
Stellen Sie sicher, dass Sie eine Plattenkarte erstellen und vorsichtig Flüssigkeit aus jedem Brunnen der Platte hinzufügen und aspirieren, um die Zellzahl und die Immunzustandsbedingungen zwischen den Zellen konsistent zu halten. Dies ergibt einen hohen Z-Faktor und zuverlässige Ergebnisse. Zu Beginn, Samen 5000 Zellen pro Well in einem schwarz wandigen, klaren Boden, Polylysin behandelt 384-Well-Platte.
Inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius mit fünf Prozent CO2 für drei Stunden, damit die Zellen an der Unterseite der Platte befestigt werden. Als nächstes verwenden Sie eine Mehrkanalpipette, um 10 Mikroliter pro Bohrgut von 5X Arbeitslösungen hinzuzufügen, gemäß einer vorgegebenen Plattenkarte, wie hier gezeigt. Fügen Sie nun 10 Mikroliter pro Brunnen von 2%DMSO zu den Spalten 22 und 24 hinzu.
Fügen Sie außerdem 10 Mikroliter pro Brunnen von 25 Mikromolar 9-cis-retinal zu Spalte 23 in einem dunklen Raum unter dunklem roten Licht hinzu. Wenn alle verschiedenen Prüfmassen geladen sind, bedecken Sie die Platte mit Aluminiumfolie und brüten sie 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius. Nehmen Sie die 384-Well-Platte in einem dunklen Raum mit dunklem roten Licht heraus.
Hier, mit 8-Kanal-Aspirator, verbunden mit einer Vakuum-Sammelflasche, um sanft das Medium aus den Brunnen der Platte zu aspirieren. Als nächstes verwenden Sie eine Mehrkanalpipette, um 20 Mikroliter pro Brunnen mit frisch zubereitetem 4%Paraformaldehyd auf die gesamte 384-Well-Platte zu legen und die Zellen für 20 Minuten bei Raumtemperatur zu fixieren. Legen Sie die Platte nach der Fixierung in normales Licht.
Verwenden Sie dort einen 8-Kanal-Aspirator, um das Paraformaldehyd in jedem Brunnen zu saugen, und verwenden Sie eine Mehrkanalpipette, um 50 Mikroliter pro Bohrwert PBS hinzuzufügen. Aspirieren und ersetzen Sie die PBS für insgesamt drei Waschzyklen. Dann fügen Sie 20 Mikroliter pro Brunnen von 5%Ziegenserum zu jedem Brunnen hinzu und brüten die Platte bei Raumtemperatur für 30 Minuten.
Nach der Inkubation, aspirieren Sie die Brunnen, und fügen Sie 15 Mikroliter von 20 Mikrogramm pro Milliliter B630 Anti-Rhodopsin-Antikörper, in 1%Ziegenserum zu den Brunnen in den Reihen A zu O.Next, fügen Sie 15 Mikroliter pro Brunnen von 1%Ziegenserum zu Zeile P für die sekundäre Antikörper nur Kontrollgruppe. Inkubieren Sie die Platte bei Raumtemperatur für 90 Minuten oder bei vier Grad Celsius über Nacht. Dann bedecken Sie die Platte mit Aluminiumfolie, um Photobleichungen der Fluorophore zu vermeiden.
Als nächstes waschen Sie die Platte dreimal mit 50 Mikroliter pro Brunnen von PBS. Nach der letzten Wäsche, aspirieren Sie die PBS, und fügen Sie 15 Mikroliter pro Brunnen von fünf Mikrogramm pro Milliliter Cy3-konjugierten Ziege Anti-Maus-Anti-Maus-IgG-Antikörper. Bedecken Sie die Platte mit Aluminiumfolie und bebrüten Sie die Proben eine Stunde lang bei Raumtemperatur.
Waschen Sie den Teller nach der Inkubation dreimal. Fügen Sie dann 50 Mikroliter pro Bohrgut PBS hinzu, die ein Mikrogramm pro Milliliter Hoechst-Färbung bei Raumtemperatur für 15 Minuten enthalten. Schließlich die Brunnenplatte mit einer transparenten Folie versiegeln, mit Aluminiumfolie bedecken und bis zu einer Woche bei vier Grad Celsius lagern.
Entfernen Sie die Folie und legen Sie die Probenplatte in einen hochwertigen Imager, wobei A1 in der oberen linken Ecke der Platte positioniert ist. Öffnen Sie anschließend die Bildaufnahmesoftware, um Parameter für die Bildaufnahme einzurichten. Öffnen Sie das Setup-Fenster für die Plattenerfassung, und erstellen Sie eine neue Einstellung, oder laden Sie eine vorhandene Setup-Datei.
Wählen Sie das 20-fache Objektiv aus und richten Sie pixelbinning als zwei ein, sodass die kalibrierte Pixelgröße 0,80 x 0,80 Mikrometer beträgt. Legen Sie dann die Scanzeilen auf 2000 und die Bildgröße auf 1000 x 1000 Pixel pro Standort fest. Wählen Sie als Nächstes den zu bebildernden Plattentyp aus.
Verwenden Sie die vom Hersteller bereitgestellten Informationen, um die Plattenabmessungen auszufüllen. Wählen Sie nun die Brunnen aus, die zusammen mit vier Sites abgebildet werden sollen, die pro Brunnen abgebildet werden sollen. Vermeiden Sie die Seite des Brunnens, die von den Aspirationsspitzen berührt werden.
Wählen Sie für die Bildgebung Anregungslaser als 405, 488 und 461 Nanometer aus. Wählen Sie dann die Emissionsfilter für DAPI-, FITC- und Texas Red-Kanäle aus. Optimieren Sie die Laserleistung und die Gewinne jedes Kanals, um sicherzustellen, dass die positiven Kontrollbrunnen nicht gesättigt sind.
Wählen Sie gut aus, um den Fokus für den Autofokus zu aktivieren. Wählen Sie dann den ersten Brunnen aus, der erworben werden soll, und legen Sie den Automatischen Fokus der Site für alle Standorte fest. Wählen Sie außerdem vier Mittelwerte pro Zeile für jeden Kanal aus, und optimieren Sie den Z-Offset-Wert für jeden Kanal.
Überprüfen Sie, dass alles richtig eingerichtet ist, indem Sie zuerst zwei bis drei Brunnen an den Ecken der Platte testen, um sicherzustellen, dass die Bilder für alle getesteten Brunnen im Fokus stehen. Überprüfen Sie anschließend, ob Bilder von allen Standorten pro Well Zellen mit mehr als 40 % Zusammenfluss aufweisen. Überprüfen Sie schließlich, ob die Fluoreszenzintensitäten in allen Kanälen in den 100%-Kontrollbrunnen alle etwa zur Hälfte gesättigt sind.
Speichern Sie dann die Bildaufnahmemethode, und führen Sie die gesamte Platte aus. Beobachten Sie den Imager, bis er die Aufnahme von Bildern aus der ersten Spalte der Platte abgeschlossen hat, um die Bildqualität zu überprüfen, bevor der Bildleiter verlassen wird. Wenn Sie fertig sind, entfernen Sie die Platte und lagern Sie sie bei vier Grad Celsius für die zukünftige Verwendung.
Ziehen Sie Bilddaten mit einer Bildanalysesoftware mit hohem Inhalt heraus. Wählen Sie eine der 100%-Kontrollbohrungen in Spalte 23 aus, um die Parameter einzurichten. Wählen Sie zunächst die Multi-Wellenlängen-Zellbewertung als Analysemethode aus, und beginnen Sie mit der Konfiguration der zusätzlichen Einstellungen.
Definieren Sie die Kerne mithilfe von Bildern aus dem DAPI-Kanal. Vorschau, um sicherzustellen, dass die definierten Kernformen in der ausgewählten gut passt gut mit den Kernbildern. Definieren Sie als Nächstes die Form der Zelle im FITC-Kanal, in dem Rhodopsin-Venus abgebildet wird.
Um dies zu erreichen, richten Sie minimale und maximale Durchmesser jeder Zelle, minimale Fluoreszenzintensität über dem Hintergrund sowie minimale Fläche jeder Zelle ein. Definieren Sie nun die Rhodopsin-Zell-Oberflächen-Fleckenbereiche im Texas Red-Kanal, indem Sie den minimalen und maximalen Durchmesser der Zellform, die Minimalfluoreszenzintensität über dem Hintergrund sowie die minimale Fläche jeder gefärbten Zelle einrichten. Testen Sie den aktuellen Algorithmus in fünf Bohrungen, um festzustellen, ob die Einstellungen optimiert sind.
Speichern Sie dann die Einstellungen, und schließen Sie das Konfigurationsfenster. Führen Sie alle Brunnen mit der optimierten Analysemethode aus. Exportieren Sie nach Abschluss die Objektnummer als intakte Zellennummer.
Exportieren Sie die durchschnittliche Intensität des FITC-Kanals als Rhodopsin-Venus-Intensität, und exportieren Sie die durchschnittliche Intensität des Texas Red Channel als Rhodopsin-Intensität auf der Zelloberfläche. Verwenden Sie die Tabellenkalkulationssoftware, um für jeden Parameter eine zweifarbige Heatmap zu erstellen. Ordnen Sie den Namen der Zelllinien auf der x-Achse und die Verbindungen auf der y-Achse an.
Hier behandelten unsere Bilder von P23H Rhodopsin Venus U2OS-Zellen, die Venusfluoreszenz in Grün und Zelloberfläche Immunfärbung in Rot exdrücken. Die Zellen wurden entweder mit DMSO oder fünf mikromolaren 9-cis-retinalen behandelt. Der Rhodopsin-Transport-Assay, der die Rhodopsin-Menge in der ganzen Zelle unter verschiedenen Bedingungen vergleicht, zeigt eine signifikante Erholung in der P23H-Mutanten-Zelllinie, wenn er mit 9-cis-retinal behandelt wird.
Darüber hinaus sind die Rhodopsin-Intensität auf der Zelloberfläche und das Verhältnis von Rhodopsin-Färbung auf der Zelloberfläche zur Rhodopsin-Venus-Intensität in der ganzen Zelle für die P23H-Mutation nicht signifikant niedriger als bei der mit DMSO behandelten Wildtyp-Rhodopsin. Eine Heatmap ist eine effiziente Möglichkeit, die durchschnittliche Rhodopsinmenge und Lokalisierung pro Zelle über mehrere Mutanten hinweg zu vergleichen. Hier werden Wildtypkontrollen und sechs Rhodopsin-Mutationen horizontal aufgelistet, und die Auswirkungen von zusammengesetzten Behandlungen werden vertikal verglichen.
In Übereinstimmung mit früheren Studien sind die Rhodopsinintensität auf der Zelloberfläche und das Verhältnis von Rhodopsinfleck auf der Zelloberfläche zur Rhodopsin-Venusintensität für die sechs Mutanten niedriger als bei dem mit DMSO behandelten Wildtyp. Die Verbindungen eins, zwei, sechs und neun erhöhten signifikant das Verhältnis von Rhodopsin-Färbung auf der Zelloberfläche zu Rhodopsin-Venus-Intensität in T4R, P23H, D190N und P267L Rhodopsin-Mutanten, was darauf hindeutet, dass diese Verbindungen den Transport dieser Rhodopsin-Mutanten zur Plasmamembran retten. Beachten Sie, dass Zellen vor der Fixierung zwischen 50 und 70 % konfluent sein müssen, da dies für die Bildanalyse von entscheidender Bedeutung ist.
Außerdem zeigten wir Bilder eines Brunnens über die gesamte Platte. Stellen Sie sicher, dass Bilder im Fokus stehen und dass die Fluoreszenz, die nicht beendet wird, den gesamten Schwellenwert für jeden Kanal hat. Bis zu einer Auswahl Verbindungen, die falsch gefaltet Rhodopsin Transport zu retten, können wir den Prozess validieren, dann die Wirksamkeit dieser Verbindungen in vivo übergeben, mit einem Maus-Modell, das die Rhodopsin P23H Mutant.
Diese Methode ermöglicht es uns, Membranproteinmenge und ihre Lokalisierung zu quantifizieren. Daher ist es ein großartiges Werkzeug für Mikrofehler auf Membranprotein pro Assist speichern und Abbau gestartet. Paraformaldehyd, wie in diesem Experiment, hat Verfahren mit dem Umgang mit diesem Reagenz.
Es wird unter der Haube getan werden. Abfälle, einschließlich dieses Reagenzes, sollten ordnungsgemäß als gefährliche Chemikalie entsorgt werden.
