Antikörper werden routinemäßig in Labortechniken eingesetzt und ihre therapeutischen und diagnostischen Anwendungen werden schnell erweitert. Eine schnelle und genaue Antigen-Antikörper-Bindungscharakterisierung ist für diese Anwendungen von entscheidender Bedeutung. Die Massenphotometrie misst schnell Bindungsaffinitäten mit extrem geringen Materialmengen.
Es ist keine Etikettierung oder Immobilisierung erforderlich und Aus demselben Experiment können Informationen über Proteinoligomerisierung und Reinheit gewonnen werden. Dieses Protokoll kann nicht nur zur Untersuchung von Antikörpern, sondern auch zur Messung starker Protein-Protein-Bindungen für Proteine mit einer Molekularmasse von mehr als 50 Kilodaltonen verwendet werden. Beginnen Sie mit Soft-Tip-Zangen und waschen Sie Flaschen, um 24 mal 50 Millimeter Abdeckungen von oben nach unten mit destilliertem Wasser, Ethanol, destilliertem Wasser, Isopropanol und destilliertem Wasser sequenziell zu spülen.
Nach der letzten Wäsche trocknen Sie die Abdeckungen mit einem Strom von sauberem Stickstoff in die gleiche Richtung, um eine Kontamination durch die Zange zu vermeiden. Spülen Sie 24 mal 24 Millimeter Abdeckungen mit destilliertem Wasser und Ethanol, wie gezeigt, gefolgt von der Trocknung mit einem Strom von sauberem Stickstoff. Nach dem Trocknen einen 24 mal 24 Millimeter großen Deckelaufschlag auf ein Stück Aluminiumfolie legen und Doppelbandstreifen auf den Deckelbeschlag legen.
Dann den 24 mal 24 Millimeter großen Deckel aus der Folie schneiden und die Folie vorsichtig auf die Arbeitsseite des 24 mal 50 Millimeter großen Deckels drücken. Um Antikörper-Antigen-Proben für die Affinitätsmessungen vorzubereiten, filtern Sie mindestens zwei Milliliter PBS durch einen 0,22-Mikron-Spritzenfilter, um Staubpartikel und Aggregate zu entfernen, und zentrifugieren Sie die antigenen Antikörper- und Antigenbestände von Interesse. Messen Sie die UV-Absorption von 280 Nanometern der Antikörper- und Antigenbestände, um ihre tatsächlichen Konzentrationen zu bestimmen, und erstellen Sie eine Titrationsreihe von Antikörper-Antigen-Gemischen im entsprechenden Bereich von Antigenkonzentrationen in einem Endvolumen von 50 Mikrolitern pro Probe.
Dann inkubieren Sie die Antigen-Antikörper-Mischungen für ca. 10 Minuten bei Raumtemperatur, damit die Bindungsreaktion das chemische Gleichgewicht erreicht. Um die Antikörper-Antigen-Affinität durch Massenphotometrie zu bewerten, tragen Sie einen Tropfen Mikroskop-Tauchöl auf das Instrumentenobjektiv auf und legen Sie die Durchflusskammer auf die Bühne des Mikroskops. Fügen Sie 10 Mikroliter gefilterten PBS an ein Ende des Durchflusskammerkanals hinzu.
Der Puffer wird durch Kapillarwirkung in den Kanal einlaufen. Verwenden Sie in der Registerkarte Fokussteuerung der Datenerfassungssoftware die Tasten für die grobe Stufenbewegung nach oben und unten, um die ersten Anpassungen vorzunehmen, und klicken Sie auf Schärfe, um die Schärfesignalanzeige anzuzeigen. Verwenden Sie die Schaltflächen für die Feineinstellung nach oben und unten, um den Schärfewert zu maximieren, und klicken Sie auf Fokus und Sperrfokus festlegen, um die Fokusverfolgungsfunktion zu aktivieren.
Ein Bild eines sauberen Dias sollte einen Signalwert von 0,05%Load 20 Mikroliter der ersten Antikörper-Antigen-Probe haben, wie gezeigt, und die Flüssigkeit vom anderen Ende mit einem kleinen Stück Blotpapier bloten. Klicken Sie sofort nach dem Laden auf Datensatz, um die entsprechende Anzahl von Frames zu erhalten, die 100 Sekunden Daten entsprechen. Geben Sie am Ende des Datenerfassungszeitraums einen Dateinamen für die Daten ein, und klicken Sie auf OK, und klicken Sie dann auf Beispiel, um die Datei zu speichern.
Um die Massenphotometriedaten zu analysieren, öffnen Sie die Interessendatei, und klicken Sie auf Analysieren. Klicken Sie auf Laden, um die Kalibrierungsfunktion zu laden, auf Datei zu klicken und Die Ergebnisse zu speichern, um die analysierten Daten zu speichern. Um die relativen Konzentrationen jeder Art in der Probe zu erhalten, öffnen Sie die Veranstaltungen angepasst.
csv-Datei, kopieren Sie die Daten in Spalte M in die entsprechende Plot- und Analysesoftware, und verwenden Sie die Histogrammfunktion der Plotstatistik, um die molekulare Massenverteilung zu zeichnen. Doppelklicken Sie auf das Histogramm, um das Ploteigenschaftenfenster zu öffnen, das automatische Binning zu deaktivieren und eine Lagerplatzgröße von 2,5 Kilodaltons auszuwählen. Um die Lagerplatzzentren zu erstellen und Daten zu zählen, klicken Sie auf Anwenden und los.
Um das Histogramm an Gaußsche Funktionen anzupassen, wählen Sie die Abschnittszentren und -zählungen aus, und klicken Sie auf die Analysespitzen und die Menüfunktion für die Mehrfachanpassung mit mehreren Spitzenzeiten. Doppelklicken Sie, um die ungefähren Spitzenpositionen im Verteilungsdiagramm anzugeben, und klicken Sie auf NL-anpassung öffnen. Überprüfen Sie die festen Kontrollkästchen für die XC-Spitzenzentren und legen Sie ihre Werte auf die erwarteten Molekularmassen des freien Antikörpers und der Einzel- und Doppel-Antigen-Antikörper-Komplexe fest.
Aktivieren Sie die Freigabeoption für die Breitenparameter, und klicken Sie auf Passen. Die angepassten Spitzenhöhenwerte der Gaußschen Komponenten stellen die relative Konzentration jeder Art in der Probe dar. Verwenden Sie dann die Gleichung, um den Konzentrationsanteil jeder Art aus den Spitzenhöhenwerten zu berechnen.
Um Gleichgewichtskonstanten mithilfe eines Tabellenkalkulationsprogramms zu berechnen, öffnen Sie die Dissoziationskonstantberechnung. xlsx-Arbeitsblatt. In diesem Arbeitsblatt können die gelb hervorgehobenen Zellenwerte in den Zeilen 1 bis 10 geändert werden, um die Gleichgewichtskonstantenberechnungen durchzuführen.
Geben Sie die geschätzten Dissoziationskonstantenwerte in nanomolaren Einheiten in die Zellen B1 und B2 ein. Wenn die geschätzten Dissoziationskonstantenwerte nicht bekannt sind, lassen Sie die Standardwerte in den Zellen B1 und B2 unverändert. Geben Sie die Gesamtantikörper- und Gesamtantigenkonzentrationen in Nanomolareinheiten in die Zellen D2 und E2 ein und geben Sie die berechneten Bruchwerte für jede Spezies in die Zellen F2, G2 und H2 ein. Fügen Sie bei der globalen Analyse der Titration die entsprechenden Datenfraktionswerte in die Zeilen 2 bis 10 hinzu. Wählen Sie im Fenster Solverparameter Zelle B15 für das festgelegte Zielfeld und die Zellen B1 bis B2 für das Feld durch Ändern variabler Zellen aus.
Wählen Sie die Min-Schaltfläche für die Option zu aus, und aktivieren Sie das Kontrollkästchen Nicht eingeschränkte Variablen nicht negativ machen, und wählen Sie dann GRG nichtlinear als Lösungsmethode aus, und klicken Sie auf Lösen. Die am besten fitungsdissoziationskonstanten Werte werden in den Zellen B1 und B2 angezeigt. Und die endgültige Summe der quadrierten Fehler wird in Zelle B15 angezeigt. In diesem repräsentativen Experiment wurde eine Titrationsreihe mit dem antihumanen Thrombin-Antikörper in einer festen Konzentration von 25 Nanomolaren und 0, 7,5, 15, 30, 60 und 120 nanomolaren humanen Alpha-Thrombin-Konzentrationen durchgeführt, um die molekularen Massenverteilungen der Antigen-Antikörper-Gemischs und der Antikörper-Nur-Probe zu erhalten.
Die besten Passpunkthöhenparameter der Gaußschen Komponenten wurden normalisiert, um Artenkonzentrationsfraktionen zu erhalten. Die Konzentrationsfraktionswerte wurden dann global fit, um die Antigen-Antikörper-Bindungsaffinitäten zu erhalten. Die experimentellen Konzentrationsfraktionen und die globalen Passungsergebnisse für den freien Antikörper, den einzelnen Antigen-Antikörper-Komplex und den doppelten Antigenkomplex könnten dann geplottet werden.
Um genaue KD-Werte zu erhalten, müssen Proteinkonzentrationen sorgfältig ausgewählt werden, um alle Reaktionsarten zu bevölkern. Wir empfehlen, eine Titrationsserie mit einer Reihe von Antigenkonzentrationen vorzubereiten. Nach dem Anpassen der Daten kann die Fehlerprojektionsmethode verwendet werden, um den Anpassungsfehler zu erhalten, aber es ist besser, das Experiment zu wiederholen und die Standardabweichungen der durchschnittlichen Bindungsaffinitätswerte zu berechnen.
