Name: cell-free dna integrity analysis in urine samples
Uploaded: 2017-01-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 58 s
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The authors thank Gr&#225;inne Tierney and Silvia Bellissimo for their editorial assistance.

Das Protokoll folgt den Richtlinien des IRST Human Research Ethics Committee. HINWEIS: In diesem Protokoll isolierten wir DNA aus Urinproben eine Integritätsanalyse UCF DNA durchzuführen. LNCaP und MRC-Zelllinien wurden verwendet Standards zu konstruieren. Techniken wie DNA - Extraktion, DNA - Quantifizierung (Spektralphotometer und real-time PCR für das Kontroll - Gen, STOX1) und Echtzeit - PCR für spezifische Onkogene wurden durchgeführt (Abbildung 1). 1. Urin Erhebung und Verarbeitung <ol><li> Besorgen Sie sich eine saubere Beifang ersten Morgenurinprobe in einem sauberen, trockenen, Plastikbecher. Sammeln mindestens 50 ml der Urinprobe. </li><li> Aufrechterhaltung des Urins bei 4 ° C für maximal 3 Stunden und an das Labor bei der gleichen Temperatur zu senden. </li><li> Mischen Sie jede Probe zweimal unmittelbar nach der Ankunft im Labor und den Transfer in zwei 50-ml konischen Boden Polypropylen-Röhrchen zu invertieren. </li><li> Zentrifugieren Sie die Röhrchenbei 850 xg für 10 min bei 4 ° C oder bei Raumtemperatur. </li><li> Vorsichtig 10 mL übertragen des oberen Teils des Urins Überstand in zwei 5-ml-Röhrchen, mit mindestens 2 ml des Überstandes über dem Zellpellet zu verlassen. HINWEIS: Übertragen des oberen Teils des Überstands verringert das Risiko einer Kontamination durch Zellen oder Zelltrümmer. Es gibt keine klare Abgrenzung zwischen den oberen und unteren Teil. </li><li> Entsorgen Sie das Pellet und gefrieren sofort den Überstand bei -80 ° C bis zur Verwendung. </li></ol> 2. DNA-Isolierung aus dem Urin Überstand und Zelllinien HINWEIS: Trennen Sie die DNA aus einer Zelllinie (zB LNCap für Prostatakrebs oder MRC für Blasenkrebs) unter Verwendung eines kommerziellen Kits und nach den Anweisungen des Herstellers. Isolierung von DNA aus dem Urin Überstand sollte mit dem kommerziellen Protokoll durchgeführt werden, wie folgt geändert: <ol><li> Auftauen ein Aliquot des Urins Überstand bei Raumtemperatur. &lt;/ Li&gt; <li> Vortex und mischen Sie die Urinprobe und 1 ml des Urins Überstand in eine klare 5-ml-Röhrchen. Frieren Sie den Restharn bei -80 ° C. </li><li> Füge 100 &amp; mgr; l Proteinase K direkt auf die Probe. </li><li> 1 ml AL-Puffer auf die Probe und mischen Sie gut durch Pipettieren. </li><li> Schließen die Röhrchen und Inkubation der Proben bei 56 ° C für 15 min. </li><li> Während der Inkubation vorbereiten eine Spalte für jede Probe und bereiten die Waschpuffer, AW1 und AW2, gemäß den Anweisungen des Herstellers (fügen Sie die angegebene Menge von 100% Ethanol). </li><li> Bringen Sie die Proben wieder auf Raumtemperatur und 1 mL absolutem Ethanol. Mischen Sie vollständig durch Pipettieren. </li><li> Hinzufügen 650 &amp; mgr; l der Mischung in Schritt erhaltenen 2,7 auf die Säule und Zentrifugieren es bei 6.000 × g für 1 min. </li><li> Entsorgen Sie das Rohr des Durchflusses und legen Sie die Spalte auf eine neue, saubere Sammelröhrchen enthält. Wiederholen Sie die Schritte 2.8 und 2.9 bis sich das gesamte Probenmischung verwendet wurde (5-mal). </li><li> In 500 &amp;# 181; l Puffer AW1 ohne den oberen Rand der Säule zu benetzen. Zentrifugieren es bei 6000 × g für 1 min. </li><li> Entsorgen Sie das Rohr des Durchflusses enthält, und ersetzen sie durch eine neue, saubere Sammelröhrchen. </li><li> Hinzufügen 500 ul Puffer AW2 ohne den oberen Rand der Säule zu benetzen. Zentrifuge bei voller Geschwindigkeit (20.000 × g) für 3 min. </li><li> Entsorgen Sie das Rohr des Durchflusses enthält, und ersetzen sie durch eine neue, saubere Sammelröhrchen. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 2.12 restliche Waschpuffer zu entfernen. </li><li> Die Säule in ein sauberes 1,5-ml-Röhrchen. Zugabe von 50 &amp; mgr; l Elutionspuffer AE und warten 7 min, um sicherzustellen, dass der Puffer benetzt die Säule. </li><li> Zentrifugieren es bei 8000 × g für 1 min. </li><li> Pipettieren Eluent aus Schritt 2.15 in die Mini-Säule zentrifugieren und es bei maximaler Geschwindigkeit für 1 Minute die maximale Rückgewinnung von DNA zu gewährleisten. </li></ol> 3. DNA-Quantifizierung und Verdünnung <ol><li> Mit einem Spektralphotometer, führen Sie die Quantifizierung von DNA aus Both die Zelllinie und die Urinproben Überstand. Verwenden Sie 2 ul der Probe auf einem Benchtop-Spektrometer, gemäß den Anweisungen des Herstellers. </li><li> Verdünne die Proben UCF DNA mit einer Konzentration von 1 ng / &amp; mgr; l zu erhalten und speichern die DNA bei -20 ° C, bis die DNA Integritätsanalyse. HINWEIS: Wenn die DNA-Menge nicht ausreicht, um mit Echtzeit-PCR (mindestens 100 ng), um fortzufahren, führen Sie eine neue DNA-Isolierungsverfahren. </li><li> Verdünne die DNA aus der Zelllinie Proben zu erhalten sechs Standards mit unterschiedlichen Konzentrationen: 0,001, 0,01, 0,1, 1, 0,5 und 2 ng / &amp; mgr; l, jeweils mit einem Volumen von 100 ul (ST1, ST2, ST3, ST4, ST5 und ST6). Bewahren Sie die Zelllinie DNA-Standards bei -20 ° C, bis die DNA-Integritätsanalyse. </li></ol> 4. DNA-Integritätstest - PCR <ol><li> Auftauen die Primer (die Konzentration ist abhängig von der Art des Assays), Grün supermix, Zelllinie DNA-Standards und UCF DNA verdünnten Proben auf Eis. </li><li> Bereiten Streifen Rohre in der Platte foder der 72-Well-Rotorscheibe. Aliquot 10 ul in zweifacher Ausfertigung für jeden Standard und verdünnte Probe und 10 &amp; mgr; l RNase-freies Wasser für die negative Kontrolle. </li><li> Bereiten einer Mischung aus 1 &amp; mgr; l jedes Primers (die Konzentrationen sind in Tabelle 1 angegeben), 12,5 &amp; mgr; l des grünen supermix und 6,5 &amp; mgr; l RNase-freiem Wasser für jede Probe. Wenn die Mischung vorbereitet, verwenden Sie die folgende Anzahl der Proben: 6-Normen für 2 Wiederholungen, Anzahl der Proben für 2 Wiederholungen, negative Kontrolle für 2 Wiederholungen und 2 zusätzliche Proben. </li><li> Aliquot 15 ul der Mischung in jede Vertiefung. Sie nicht die Rohre Pipette oder drehen. </li><li> Starten Sie das Protokoll mit den Bedingungen PCR in Tabelle 1 angegeben. HINWEIS: Für die UCF-DNA-Wert, 29 DNA-Proben für jede Echtzeit-Experiment verarbeitet wurden unter Verwendung des 72-Well-Rotorscheibe: 29 x 2 Proben + 6 x 2 Standards + negative Kontrolle x 2 = 72 (UCF DNA-Wert). HINWEIS: Das Protokoll für die Integritätsanalyse UCF DNA kann auchdurchgeführt andere Echtzeit-PCR Instrument (wenn ein anderes Gerät verwenden, können hinzugefügt werden müssen, ROX-Farbstoff). </li></ol> 5. DNA-Integritätstest - Datenanalyse und Interpretation HINWEIS: Die DNA UCF - Wert für jede Probe wurde durch eine Echtzeit - Gerät-Erfassungssystem - Software unter Verwendung einer Standardkurve Konstruktion für jede einzelne PCR - Gen Auswerte- und unter Verwendung von Standardkurve Interpolation erhalten, wie zuvor beschrieben , 7-9 (Abbildung 2). <ol><li> Bewerten Sie die Replikate; Probe repliziert mit einem Unterschied ≥1 Ct verworfen werden müssen, und in einem zweiten Versuch erneut ausgewertet. </li><li> Berechnen Sie die mittlere Ct für jede Probe und prüfen Proben mit einem Ct-Wert ≤ 36. </li><li> Bewerten Sie die Spezifität der PCR-Produkte Schmelzanalyse. </li><li> Bewerten Sie die Konzentration jedes Amplikon durch Interpolation mit der Standardkurve; einen Konzentrationswert (ng / ul) für jedes Amplifikat erhalten.</li>
</ol>

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S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+array+CGH+identifies+novel+regions+of+genomic+alteration+in+intermediate-risk+prostate+cancer.">High-resolution array CGH identifies novel regions of genomic alteration in intermediate-risk prostate cancer.</a> Prostate. 69 (10), 1091-1100 (2009).</li><li>Oxley, J. D., Winkler, M. H., Gillatt, D. A., Peat, D. 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The authors declare no competing financial interests.

UCF DNA Integritätsanalyse ist eine neue, nicht-invasive Methode zur Beurteilung DNA Integrität im Urin. Es wurde für die Frühdiagnose von Blasen 9 und Prostatakrebs 7,8 kürzlich vorgeschlagen. Eine Reihe von Vor- und Nachteilen der UCF DNA-Integritätstest werden hier diskutiert, zusammen mit Zukunftsperspektiven. Der Hauptvorteil dieses Ansatzes ist, daß es eine kostengünstige, nicht-invasive Methode bietet und ein einfaches Protokoll Urin als potentielle Quell...

Zellfreie DNA kann in Blut und Urin aufgrund von Zelltod durch apoptotische oder nekrotische Mechanismen nachgewiesen werden. Zellfreie DNA in Blut wurde für diagnostische und prognostische Zwecke in verschiedenen Krankheiten intensiv untersucht, insbesondere Krebs 1. Jedoch weniger ist über die Rolle der Harn- zellfreien (UCF) DNA bekannt. UCF DNA kann aus dem Blut , das durch die glomeruläre Filtrationssystems oder aus Zellen stammen , die mit diesem Körperflüssigkeit 2 (beispielsweise Urothelzellen oder Prostatazellen) direkt in Kontakt kommen. Die Verwendung von UCF DNA als Quelle von Biomarkern ist für die Frühdiagnose von Nieren-, Blasen- und Prostatakrebs durch den hohen Anteil der UCF DNA , das direkt von der Harnwege Zellen untersucht 3,4 hauptsächlich worden. Wenig ist bekannt über UCF-DNA und die besten Methoden zur Isolierung und Charakterisierung von ihm. Angesichts der Hypothese, dass die Tumorzellen freizusetzen längere DNA-Fragmente als normale Zellen, die Auswertungsder zellfreien DNA - Integrität wurde in einem Versuch untersucht, 5 den Ursprung der DNA in den Blutkreislauf zu erläutern. Einige Studien haben gezeigt , daß zellfreie DNA Integrität im Blut einen guten diagnostischen Test für viele Krebsarten darstellt 6, und die gleiche Hypothese in bezug auf Urin 7-9 vorgeschlagen. Dieses Dokument beschreibt ein neues Verfahren zur UCF DNA Integritätsanalyse mit einer potentiellen Anwendung auf Blasen- und Prostatakrebserkennung. Insbesondere wurde die Integrität der UCF DNA - Fragmente mehr als 250 bp in 4 Regionen getestet bekannt , eine erhöhte DNA - Kopienzahl in soliden Tumoren, einschließlich Prostata- und Blasenkrebs: c-MYC (8q24.21), HER2 (17q12.1 ), BCAS1 (20q13.2) und AR (Xq12) 14.10. Spezifische Onkogene, anstatt Zufallssequenzen wurden gewählt, um die Wahrscheinlichkeit, sie in der zellfreie Fraktion von Krebspatienten zu erhöhen. Einer der wichtigsten Vorteile derdieses Verfahren ist, dass es flexibel ist und dass andere Bereiche können auch auf der Grundlage der Tumorart und Eigenschaften gewählt werden.

<table><tbody><tr><td>QIAamp DNA Mini Kit&lt;br/&gt; &amp;nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>51304</td><td></td></tr><tr><td>iQ SYBR&amp;nbsp;Green Supermix, 100 x 50 &amp;micro;L rxns, 2.5 mL (2 x 1.25 mL)</td><td>Biorad</td><td>1708880</td><td></td></tr><tr><td>IDT custom DNA oligos&amp;nbsp;</td><td>IDT&amp;nbsp;</td><td></td><td>HPLC purification, 100nMole DNA oligo</td></tr><tr><td>NanoDrop 1000 Spectrophotometer</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>Other spectrophotometric methods could also be used to quantify DNA</td></tr><tr><td>Rotor-Gene 6000</td><td>Corbett</td><td></td><td>Another Real Time PCR instrument could also be used</td></tr><tr><td>microcentrifuge</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>one centrifuge for 50 mL tubes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>incubator</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>-80 &amp;deg;C freezer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>-20 &amp;deg;C freezer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 &amp;#956;L pipette</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>20 &amp;#956;L pipette</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>200 &amp;#956;L pipette</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1,000 &amp;#956;L pipette</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pipette tips (10; 20; 200; 1,000)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL tubes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 mL tubes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 mL tubes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rotor-Disc 72 Rotor</td><td>Corbett</td><td>9018899</td><td></td></tr><tr><td>Strip Tubes and Caps, 0.1 mL (250)</td><td>Qiagen</td><td>981103</td><td></td></tr><tr><td>Collection Tubes (2 mL)</td><td>Qiagen</td><td>19201</td><td></td></tr><tr><td>Buffer AL (264 mL)</td><td>Qiagen</td><td>19075</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K (10 mL)</td><td>Qiagen</td><td>19133</td><td></td></tr></tbody></table>

cell-free dna integrity analysis in urine samples

Obwohl die Anwesenheit zellfreie DNA in Plasma oder Serum von Zirkulieren einer geeigneten Quelle von Biomarkern für viele Krebsarten haben nur wenige Studien konzentrierten sich auf die mögliche Verwendung von zellfreien Urin (UCF) DNA weithin erwiesen hat. Ausgehend von den Hypothesen, die normale apoptotische Zellen produzieren stark fragmentierten DNA und dass Krebszellen schütten mehr DNA, die mögliche Rolle der UCF DNA-Integrität wurde als eine frühe Diagnosemarker ausgewertet Lage, die Unterscheidung zwischen Patienten mit Prostata- oder Blasenkrebs und gesunden Personen. C-MYC, BCAS1, HER2 und AR: A UCF DNA Integritätsanalyse wird auf der Grundlage von vier quantitative Echtzeit - PCR - Reaktionen von vier Sequenzen , die länger als 250 bp vorgeschlagen. Sequenzen, die häufig eine erhöhte DNA-Kopienzahl in der Blase und Prostata-Krebsarten wurden für die Analyse ausgewählt, aber das Verfahren ist flexibel, und diese Gene können mit anderen Genen von inte substituiert seinsich ausruhen. Die potentielle Nützlichkeit von UCF DNA als Quelle von Biomarkern bereits für urologische Malignitäten nachgewiesen und damit den Weg geebnet für weitere Untersuchungen auf UCF DNA Charakterisierung. Die UCF DNA-Integritätstest hat den Vorteil, dass sie nicht-invasive, schnelle und einfach durchzuführen, mit nur wenigen Milliliter Urin benötigt, um die Analyse durchzuführen.

Die gesamte freie DNA-Konzentration war quantifizierbare spektrophotometrisch für alle Proben analysiert, wobei eine Reihe von zwischen 1,51 und 138 ng / &amp; mgr; l zeigt. Fünf Kontrollproben wurden für die Reproduzierbarkeit der Daten verwendet: zwei unabhängige Echtzeit - Experimente durchgeführt wurden , für c-MYC, HER2, BCAS1, AR, und STOX1. Die Variationskoeffizienten (CV) wurden dann für jedes Gen (Tabelle 2) be...

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Cell-Free DNA Integrity Analysis in Urine Samples

A method for analyzing DNA integrity in the cell-free supernatant fraction of urine samples is proposed. The method is suitable for early detection of urological malignancies and has proven accurate for the early diagnosis of bladder cancer.

Zellfreie DNA-Integritätsanalyse in Urinproben

Although the presence of circulating cell-free DNA in plasma or serum has been widely shown to be a suitable source of biomarkers for many types of ...

cell-free-dna-integrity-analysis-in-urine-samples

Research

JoVE Journal

Cancer Research

13.7K Aufrufe.  Istituto Scientifico Romagnolo per lo Studio e la Cura dei Tumori (IRST) IRCCS. A method for analyzing DNA integrity in the cell-free supernatant fraction of urine samples is proposed. The method is suitable for early detection of urological malignancies and has proven accurate for the early diagnosis of bladder cancer.

Serie: Cell-Free DNA Integrity Analysis in Urine Samples

Single Droplet Digital Polymerase Chain Reaction for Comprehensive and Simultaneous Detection of Mutations in Hotspot Regions

Droplet digital polymerase chain reaction (ddPCR) is a highly sensitive quantitative polymerase chain reaction (PCR) method based on sample fractionation into thousands of nano-sized water-in-oil individual reactions. Recently, ddPCR has become one of the most accurate and sensitive tools for circulating tumor DNA (ctDNA) detection. One of the major limitations of the standard ddPCR technique is the restricted number of mutations that can be screened per reaction, as specific hydrolysis probes recognizing each possible allelic version are required. An alternative methodology, the drop-off ddPCR, increases throughput, since it requires only a single pair of probes to detect and quantify potentially all genetic alterations in the targeted region. Drop-off ddPCR displays comparable sensitivity to conventional ddPCR assays with the advantage of detecting a greater number of mutations in a single reaction. It is cost-effective, conserves precious sample material, and can also be used as a discovery tool when mutations are not known a priori.

Here, we present a protocol to accurately quantify multiple genetic alterations of a target region in a single reaction using drop-off ddPCR and a unique pair of hydrolysis probes.

Einzelne Tropfen digitale Polymerase-Kettenreaktion für umfassende und gleichzeitigen Nachweis von Mutationen im Hotspot-Regionen

Droplet digital polymerase chain reaction (ddPCR) is a highly sensitive quantitative polymerase chain reaction (PCR) method based on sample fractionation ...

Forschung

Genetik

Evaluation of Colorectal Cancer Risk and Prevalence by Stool DNA Integrity Detection

Nowadays, stool DNA can be isolated and analyzed by several methods. The long fragments of DNA in stool can be detected by a qPCR assay, which provides a reliable probability of the presence of pre-neoplastic or neoplastic colorectal lesions. This method, called fluorescence long DNA (FL-DNA), is a fast, non-invasive procedure that is an improvement upon the primary prevention system. This method is based on evaluation of fecal DNA integrity by quantitative amplification of specific targets of genomic DNA. In particular, the evaluation of DNA fragments longer than 200 bp allows for detection of patients with colorectal lesions with very high specificity. However, this system and all currently available stool DNA tests present some general issues that need to be addressed (e.g., the frequency at which tests should be carried out and optimal number of stool samples collected at each timepoint for each individual). However, the main advantage of FL-DNA is the possibility to use it in association with a test currently used in the CRC screening program, known as the immunochemical-based fecal occult blood test (iFOBT). Indeed, both tests can be performed on the same sample, reducing costs and achieving a better prediction of the eventual presence of colorectal lesions.

The presented diagnostic FL-DNA kit is a time-saving and user-friendly method to determine the reliable probability of the presence of colorectal cancer lesions.

Bewertung des Darmkrebsrisikos und der Prävalenz durch Stuhl-DNA-Integritätsnachweis

Nowadays, stool DNA can be isolated and analyzed by several methods. The long fragments of DNA in stool can be detected by a qPCR assay, which provides a ...

Krebsforschung

Detection and Monitoring of Tumor Associated Circulating DNA in Patient Biofluids

Complications associated with upfront and repeat surgical tissue sampling present the need for minimally invasive platforms capable of molecular sub-classification and temporal monitoring of tumor response to therapy. Here, we describe our dPCR-based method for the detection of tumor somatic mutations in cell free DNA (cfDNA), readily available in&#160;patient biofluids. Although limited in the number of mutations that can be tested for in each assay, this method provides a high level of sensitivity and specificity. Monitoring of mutation abundance, as calculated by MAF, allows for the evaluation of tumor response to therapy, thereby providing a much-needed supplement to radiographic imaging.

Here, we present a protocol to detect tumor somatic mutations in circulating DNA present in patient biological fluids (biofluids). Our droplet digital polymerase chain reaction (dPCR)-based method enables quantification of the tumor mutation allelic frequency (MAF), facilitating a minimally invasive complement to diagnosis and temporal monitoring of tumor response.

Nachweis und Überwachung von tumorassoziierter zirkulierender DNA in Biofluiden von Patienten

Complications associated with upfront and repeat surgical tissue sampling present the need for minimally invasive platforms capable of molecular ...

Detection of Cell-Free DNA in Blood Plasma Samples of Cancer Patients

Identifying mutations in tumors of cancer patients is a very important step in disease management. These mutations serve as biomarkers for tumor diagnosis as well as for the treatment selection and its response in cancer patients. The current gold standard method for detecting tumor mutations involves a genetic test of tumor DNA by means of tumor biopsies. However, this invasive method is difficult to be performed repeatedly as a follow-up test of the tumor mutational repertoire. Liquid biopsy is a new and emerging technique for detecting tumor mutations as an easy-to-use and non-invasive biopsy approach.
Cancer cells multiply rapidly. In parallel, numerous cancer cells undergo apoptosis. Debris from these cells are released into a patient&#8217;s circulatory system, together with finely fragmented DNA pieces, called cell-free DNA (cfDNA) fragments, which carry tumor DNA mutations. Therefore, for identifying cfDNA based biomarkers using liquid biopsy technique, blood samples are collected from the cancer patients, followed by the separation of plasma and buffy coat. Next, plasma is processed for the isolation of cfDNA, and the respective buffy coat is processed for the isolation of a patient&#39;s genomic DNA. Both nucleic acid samples are then checked for their quantity and quality; and analyzed for mutations using next-generation sequencing (NGS) techniques.
In this manuscript, we present a detailed protocol for liquid biopsy, including blood collection, plasma, and buffy coat separation, cfDNA and germline DNA extraction, quantification of cfDNA or germline DNA, and cfDNA fragment enrichment analysis.

In this paper we present a detailed protocol for non-invasive liquid biopsy technique, including blood collection, plasma and buffy coat separation, cfDNA and germline DNA extraction, quantification of cfDNA or germline DNA, and cfDNA fragment enrichment analysis.

Nachweis zellfreier DNA in Blutplasmaproben von Krebspatienten

Identifying mutations in tumors of cancer patients is a very important step in disease management. These mutations serve as biomarkers for tumor diagnosis ...

A Standardized Liquid Biopsy Preanalytical Protocol for Downstream Circulating-Free DNA Applications

The term liquid biopsy (LB) refers to molecules such as proteins, DNA, RNA, cells, or extracellular vesicles in blood and other bodily fluids that originate from the primary and/or metastatic tumor. LB has emerged as a mainstay in translational research and has started to become part of clinical oncology practice, providing a minimally invasive alternative to solid biopsy. The LB allows real-time monitoring of a tumor via a minimally invasive sample extraction, such as blood. The applications include early cancer detection, patient follow-up for the detection of disease progression, assessment of minimal residual disease, and potential identification of molecular progression and mechanism of resistance. In order to achieve a reliable analysis of these samples that can be reported in the clinic, the preanalytical procedures should be carefully considered and strictly followed. Sample collection, quality, and storage are crucial steps that determine their usefulness in downstream applications. Here, we present standardized protocols from our liquid biopsy working module for collecting, processing, and storing plasma and serum samples for downstream liquid biopsy analysis based on circulating-free DNA. The protocols presented here require standard equipment and are sufficiently flexible to be applied in most laboratories focused on biological procedures.

The liquid biopsy has revolutionized our approach to oncology translational studies, with sample collection, quality, and storage being crucial steps for its successful clinical application. Here we describe a standardized and validated protocol for downstream circulating-free DNA applications that can be applied in most translational research laboratories.

Ein standardisiertes präanalytisches Flüssigbiopsieprotokoll für nachgeschaltete zirkulatorfreie DNA-Anwendungen

The term liquid biopsy (LB) refers to molecules such as proteins, DNA, RNA, cells, or extracellular vesicles in blood and other bodily fluids that ...

Uracil-DNA Glycosylase Assay by Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-flight Mass Spectrometry Analysis

Uracil-DNA glycosylase (UDG) is a key component in the base excision repair pathway for the correction of uracil formed from hydrolytic deamination of cytosine. Thus, it is crucial for genome integrity maintenance. A highly specific, non-labeled, non-radio-isotopic method was developed to measure UDG activity. A synthetic DNA duplex containing a site-specific uracil was cleaved by UDG and then subjected to Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) analysis. A protocol was established to preserve the apurinic/apyrimidinic site (AP) product in DNA without strand break. The change in the m/z value from the substrate to the product was used to evaluate uracil hydrolysis by UDG. A G:U substrate was used for UDG kinetic analysis yielding the Km = 50 nM, Vmax = 0.98 nM/s, and Kcat = 9.31 s-1. Application of this method to a uracil glycosylase inhibitor (UGI) assay yielded an IC50 value of 7.6 pM. The UDG specificity using uracil at various positions within single-stranded and double-stranded DNA substrates demonstrated different cleavage efficiencies. Thus, this simple, rapid, and versatile MALDI-TOF MS method could be an excellent reference method for various monofunctional DNA glycosylases. It also has the potential as a tool for DNA glycosylase inhibitor screening.

A non-labeled, non-radio-isotopic method to assay uracil-DNA glycosylase activity was developed using MALDI-TOF mass spectrometry for direct apurinic/apyrimidinic site-containing product analysis. The assay proved to be quite simple, specific, rapid, and easy to use for DNA glycosylase measurement.

Uracil-DNA-Glykosylase-Assay durch matrixgestützte Laserdesorption/Ionisations-Time-of-Flight-Massenspektrometrie-Analyse

Uracil-DNA glycosylase (UDG) is a key component in the base excision repair pathway for the correction of uracil formed from hydrolytic deamination of ...

Biochemie

Quantification of three DNA Lesions by Mass Spectrometry and Assessment of Their Levels in Tissues of Mice Exposed to Ambient Fine Particulate Matter

DNA adducts and oxidized DNA bases are examples of DNA lesions that are useful biomarkers for the toxicity assessment of substances that are electrophilic, generate reactive electrophiles upon biotransformation, or induce oxidative stress. Among the oxidized nucleobases, the most studied one is 8-oxo-7,8-dihydroguanine (8-oxoGua) or 8-oxo-7,8-dihydro-2&#39;-deoxyguanosine (8-oxodGuo), a biomarker of oxidatively induced base damage in DNA. Aldehydes and epoxyaldehydes resulting from the lipid peroxidation process are electrophilic molecules able to form mutagenic exocyclic DNA adducts, such as the etheno adducts 1,N2-etheno-2&#39;-deoxyguanosine (1,N2-&#949;dGuo) and 1,N6-etheno-2&#39;-deoxyadenosine (1,N6-&#949;dAdo), which have been suggested as potential biomarkers in the pathophysiology of inflammation. Selective and sensitive methods for their quantification in DNA are necessary for the development of preventive strategies to slow down cell mutation rates and chronic disease development (e.g., cancer, neurodegenerative diseases). Among the sensitive methods available for their detection (high performance liquid chromatography coupled to electrochemical or tandem mass spectrometry detectors, comet assay, immunoassays, 32P-postlabeling), the most selective are those based on high performance liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry (HPLC-ESI-MS/MS). Selectivity is an essential advantage when analyzing complex biological samples and HPLC-ESI-MS/MS evolved as the gold standard for quantification of modified nucleosides in biological matrices, such as DNA, urine, plasma and saliva. The use of isotopically labeled internal standards adds the advantage of corrections for molecule losses during the DNA hydrolysis and analyte enrichment steps, as well as for differences of the analyte ionization between samples. It also aids in the identification of the correct chromatographic peak when more than one peak is present.
We present here validated sensitive, accurate and precise HPLC-ESI-MS/MS methods that were successfully applied for the quantification of 8-oxodGuo, 1,N6-dAdo and 1,N2-dGuo in lung, liver and kidney DNA of A/J mice for the assessment of the effects of ambient PM2.5 exposure.

We describe here methods for sensitive and accurate quantification of the lesions 8-oxo-7,8-dihydro-2&#39;-deoxyguanosine (8-oxodGuo), 1,N6-etheno-2&#39;-deoxyadenosine (1,N6-dAdo) and 1,N2-etheno-2&#39;-deoxyguanosine (1,N2-dGuo) in DNA. The methods were applied to the assessment of the effects of ambient fine particulate matter (PM2.5) in tissues (lung, liver and kidney) of exposed A/J mice.

Quantifizierung von drei DNA-Mäsionen durch Massenspektrometrie und Bewertung ihrer Niveaus in den Themen von Mäusen, die der zämatten Feinstaub ausgesetzt sind

DNA adducts and oxidized DNA bases are examples of DNA lesions that are useful biomarkers for the toxicity assessment of substances that are ...

Immunologie und Infektion

CRISPR-Cas Synthetischer Urin-Biomarker-Test für die Krebsdiagnostik

CRISPR-Cas-mediated Multianalyte Synthetic Urine Biomarker Test for Portable Diagnostics

Creating synthetic biomarkers for the development of precision diagnostics has enabled detection of disease through pathways beyond those used for traditional biofluid measurements. Synthetic biomarkers generally make use of reporters that provide readable signals in the biofluid to reflect the biochemical alterations in the local disease microenvironment during disease incidence and progression. The pharmacokinetic concentration of the reporters and biochemical amplification of the disease signal are paramount to achieving high sensitivity and specificity in a diagnostic test. Here, a cancer diagnostic platform is built using one format of synthetic biomarkers: activity-based nanosensors carrying chemically stabilized DNA reporters that can be liberated by aberrant proteolytic signatures in the tumor microenvironment. Synthetic DNA as a disease reporter affords multiplexing capability through its use as a barcode, allowing for the readout of multiple proteolytic signatures at once. DNA reporters released into the urine are detected using CRISPR nucleases via hybridization with CRISPR RNAs, which in turn produce a fluorescent or colorimetric signal upon enzyme activation. In this protocol, DNA-barcoded, activity-based nanosensors are constructed and their application is exemplified in a preclinical mouse model of metastatic colorectal cancer. This system is highly modifiable according to disease biology and generates multiple disease signals simultaneously, affording a comprehensive understanding of the disease characteristics through a minimally invasive process requiring only nanosensor administration, urine collection, and a paper test which enables point-of-care diagnostics.

Autor im Rampenlicht: Entwicklung molekularer Werkzeuge für die Erkennung und Bildgebung von Krankheiten

This protocol describes a CRISPR-Cas-mediated, multianalyte synthetic urine biomarker test that enables point-of-care cancer diagnostics through the ex vivo analysis of tumor-associated protease activities.

Zellfreie DNA-Integritätsanalyse in Urinproben

Zusammenfassung

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Kapitel in diesem Video

Einzelne Tropfen digitale Polymerase-Kettenreaktion für umfassende und gleichzeitigen Nachweis von Mutationen im Hotspot-Regionen

Bewertung des Darmkrebsrisikos und der Prävalenz durch Stuhl-DNA-Integritätsnachweis

Nachweis und Überwachung von tumorassoziierter zirkulierender DNA in Biofluiden von Patienten

Nachweis zellfreier DNA in Blutplasmaproben von Krebspatienten

Ein standardisiertes präanalytisches Flüssigbiopsieprotokoll für nachgeschaltete zirkulatorfreie DNA-Anwendungen

Uracil-DNA-Glykosylase-Assay durch matrixgestützte Laserdesorption/Ionisations-Time-of-Flight-Massenspektrometrie-Analyse

Quantifizierung von drei DNA-Mäsionen durch Massenspektrometrie und Bewertung ihrer Niveaus in den Themen von Mäusen, die der zämatten Feinstaub ausgesetzt sind

CRISPR-Cas-vermittelter synthetischer Multianalyt-Urin-Biomarker-Test für tragbare Diagnostik

CRISPR-Cas-vermittelter synthetischer Multianalyt-Urin-Biomarker-Test für tragbare Diagnostik

CRISPR-Cas-vermittelter synthetischer Multianalyt-Urin-Biomarker-Test für tragbare Diagnostik