Die Autoren danken den Mitgliedern des Laboratory of Cancer Genomics and Biocomputing of Complex Diseases für ihre scharfen Beobachtungsbeiträge und ihre Teilnahme an mehreren Diskussionen in verschiedenen Phasen dieses Projekts. Die Unterstützung umfasst die Israel Cancer Association (ICA-Zuschuss für M.F-M 2017-2019) und kamin Grant der Israel Innovation Authority (für M.F-M.).

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Die Entnahme des Blutes eines Patienten in einer Röhre, der Versand und die Lagerung sind entscheidende erste Schritte in der flüssigen Biopsie. Unsachgemäße Handhabung kann die Qualität des Plasmas beeinträchtigen und daher die Ergebnisse der flüssigen Biopsiestören 47. Wenn eine Blutprobe in einem EDTA-Blutröhrchen entnommen wird, muss das Plasma innerhalb von zwei Stunden nach der Blutentnahme getrennt werden, um eine Lyse von WBCs und die Freisetzung seiner genomischen DNA in das Plas...

Technologische Fortschritte haben zur Sequenzierung von Hunderten von Krebsgenomen und Transkriptomen1geführt. Dies hat dazu beigetragen, Landschaften molekularer Veränderungen über verschiedene Krebsarten hinweg zu verstehen2. Weitere Studien zu diesen Landschaften haben dazu beigetragen, die sequenziellen somatischen Veränderungen und Gen-Gen-Fusionen3 zu charakterisieren, die an Krebs oder Tumorprogression beteiligt sind, indem sie die Apoptosewege seriell stören4. Daher können somatische Mutationen und Gen-Gen-Fusionen Informationen über Tumore liefern, indem sie als Biomarker bei einzelnen Patienten für einen bestimmten Tumortyp5dienen, bestehende Primärtumoren-Prognose6identifizieren, sekundäre Tumoren auf der Grundlage molekularer Veränderungen kategorisieren7, und medikamentöse Tumorzieleidentifizieren 8. Solche Informationen können bei der Auswahl einer personalisierten Behandlung für Krebspatienten und bei der Bestimmung positiver und negativer Behandlungsreaktionenerleichtern 9. Die Gewinnung von Tumormaterial zur Identifizierung der genomischen Profilierung von Tumorgewebe ist jedoch ein invasives Verfahren10. Darüber hinaus umfasst eine Tumorbiopsie nur einen kleinen Teil eines heterogenen Tumors; und darf daher nicht repräsentativ für das molekulare Profil des gesamten Tumors11sein. Serielle Überwachung und Tumor-Genotypisierung erfordern eine wiederholte Sammlung von Tumorgeweben, was in der Regel aufgrund der Invasivität des Tumorbiopsieverfahrens und der Sicherheitsprobleme, die sich aus solchen Verfahren ergeben, nicht machbar ist12.
Die flüssige Biopsie-Technik hingegen hat in den letzten zehn Jahren enorme Aufmerksamkeit in der Präzisions-Onkologie erlangt13,14. Es ist vor allem aufgrund der Nicht-Invasivität dieser Technik, und die Möglichkeit, dass es an mehreren Zeitpunkten wiederholt werden, wodurch eine einfach zu bedienende und sichere Überwachungstechnik für die Krankheitskurse15,16ermöglicht wird. Die Flüssigbiopsie basiert auf einem Phänomen, dass sich Tumorzellen schnell vermehren und gleichzeitig viele von ihnen apoptosis und nekrose leiden. Dies führt zur Freisetzung von apoptotischen Zellablagerungen in das Blut der Patienten, zusammen mit den DNA-Fragmenten, die bei Apoptose17in präzisen Größen geschnitten werden. Die Apoptose von nicht-kanzerösen Zellen führt auch zur Freisetzung ihrer zellulären Ablagerungen in das Blut, jedoch ist die Apoptoserate in diesen Zellen relativ viel niedriger als die tumorzellen18. Der Grund der flüssigen Biopsietechnik besteht darin, tumorassoziierte Moleküle wie DNA, RNA, Proteine und Tumorzellen14,19 zu erfassen, die kontinuierlich im Blut zirkulieren. Für die Analyse dieser Moleküle können verschiedene Techniken20 verwendet werden, darunter Next-Generation Sequencing (NGS), digitale Tröpfchenpolymerase-Kettenreaktion (ddPCR), Echtzeit-PCR und enzymgebundener Immunsorbent-Assay (ELISA). Die Flüssigbiopsietechnik ermöglicht die Identifizierung von Biomarkern, die Merkmale von Tumorzellen sind. Diese Biomarkermoleküle werden nicht nur aus bestimmten Teilen eines Tumors freigesetzt, sondern aus allen Teilen des Tumors21. Daher stellen marker, die in der flüssigen Biopsie identifiziert werden, die molekulare Profilierung eines gesamten heterogenen Tumors dar, zusätzlich zu anderen Tumoren im Körper, also Vorteile gegenüber der Gewebebiopsie-basierten Technik22.
Die cfDNA hat eine kurze Halbwertszeit im zirkulierenden Blut von wenigen Minuten bis 1-2 Stunden23. Die kurze Halbwertszeit von cfDNA ermöglicht jedoch Echtzeitanalysen durch die Bewertung der Behandlungsreaktionen und dynamischen Tumorbewertungen. Die tumorabgeleiteten cfDNA-Spiegel zeigen eine Prognose des Tumorstadiums/der Tumorgröße, die durch mehrere Studien belegt wurde, die einen Zusammenhang zwischen cfDNA-Spiegeln und den Überlebensergebnissen24zeigten. Darüber hinaus haben Studien gezeigt, dass die cfDNA eine bessere Vorhersagekapazität als bestehende Tumormarkerhat 25. Die Prognose von cfDNA ist nach der Krebsbehandlung noch ausgeprägter, höhere cfDNA-Konzentrationen nach der Behandlung korrelieren gut mit einer reduzierten Überlebensrate und Resistenz gegen die Behandlung. Während niedrigere cfDNA-Werte nach der Therapie im Allgemeinen mit einem positiven Behandlungsverhalten korrespondiert. Darüber hinaus erleichtert die cfDNA die Früherkennung des Behandlungsreaktionens als die herkömmlichen Nachweismethoden.
Die cfDNA erhöht die Möglichkeit der Früherkennung von krebsassoziierten Mutationen: während der Frühstadium-Krankheit15, das Auftreten der Symptome26 und vor der Krebsdiagnose bis zu 2 Jahre27. Da cfDNA aus mehreren Tumorregionen oder Brennpunkten freigesetzt wird, bietet seine Analyse einen umfassenden Überblick über das Tumorgenom, das28darstellt. Daher ermöglicht die cfDNA, somatische Mutationen zu erkennen, die in den Gewebeproben übersehen worden sein könnten29. Da intratumorliche Heterogenität und subklonale Mutationen durch tiefe Sequenzierung genomischer Regionen, die sich über Tausende von Basen erstrecken, nachgewiesen werden können, ermöglicht die Analyse der cfDNA die Aufdeckung spezifischer molekularer Subtypen mit deutlichen genomischen Signaturen13. Um ein ähnliches Maß an Informationen durch Gewebeproben zu erhalten, wären viele feste Biopsien erforderlich gewesen.
Darüber hinaus erwiesen sich die cfDNA-Spiegel bei Patienten mit einer lokalisierten Erkrankung wie Dickdarm-, Eierstock- und Lungenkrebs nach einer chirurgischen Behandlung und/oder Chemotherapie als ein starker prognostischer Marker für das Wiederauftreten von Krebs und die Behandlungsergebnisse20. Darüber hinaus konnten bei Patienten mit Dickdarm-, Brust- und Lungenkrebs Analysen der cfDNA aus dem Blut die tumorspezifischen Veränderungen erfolgreich erkennen, was zur genauen Vorhersage eines Rezidivs mehrere Monate im Voraus13führte. Darüber hinaus sind die Behandlungsresistenzmarker, wie KRAS-Mutationen bei Patienten mit CRC, die eine Anti-EGFR-Therapieerhalten, 30; VAFs für Gene wie PIK3CA, MED1 oder EGFR bei Patientinnen mit Brustkrebs nach der Behandlung mit verschiedenen Therapien31; und EGFR T790M Resistenzmutation bei Lungenkrebspatienten, die mit EGFR-gezielten TKIs32 behandelt wurden, können auch durch cfDNA-Analyse identifiziert werden.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die cfDNA-Analyse verwendet werden kann, um präzise Biomarker im Bereich der Onkologie13,33zu identifizieren. In diesem Protokoll wurden Blutproben von 3 Gliom-Patienten und 3 gesunde Kontrollen verarbeitet, um genomische DNA aus WBCs und cfDNA aus dem Plasma zu erhalten. Bei Gliomkrebs dienen Mutationen bei IDH, TERT, ATRX, EGFR und TP53 als diagnostische sowie prognostische Marker, die bei der Frühdiagnose von Gliomtumoren helfen können, verschiedene Arten von Gliomtumoren zu klassifizieren, die genaue Behandlung für den einzelnen Patienten zu leiten und das Behandlungsverhalten zu verstehen34,35. Der Mutationsstatus dieser Gene kann mit blutabgeleiteter cfDNA identifiziert werden. In diesem Manuskript stellen wir ein detailliertes Protokoll der plasmaabgeleiteten cfDNA vor, das zur Untersuchung von Mutationsveränderungen bei Gliomkrebs verwendet wurde12. Ein solches cfDNA-basiertes Flüssigbiopsieprotokoll, das in diesem Artikel erläutert wird, kann zur Untersuchung von Mutationsveränderungen bei vielen anderen Krebsarten verwendet werden. Darüber hinaus hat eine aktuelle Studie gezeigt, dass cfDNA-basierte Flüssigbiopsie 50 verschiedene Krebsarten erkennen kann36.
Die Entnahme, Lagerung und Verbringung von Blutproben sind entscheidende Schritte in diesem Protokoll, da die unkontrollierte Temperatur während dieser Schritte eine Lyse von WBCs verursacht, die zur Freisetzung genomischer DNA aus dem WBC in das Plasma führt und eine Kontamination der cfDNA-Probe verursacht, die den Rest des Verfahrens betrifft37. Hämolyse aufgrund unkontrollierter Temperatur kann nachgeschaltete Probenvorbereitungsprozesse von cfDNA beeinträchtigen, wie z. B. die PCR-Schritte38. Das Serum enthält einen hohen Anteil an Keimbahn cfDNA anstelle von Plasma, obwohl es ein großes Hintergrundrauschen für tumorassoziierte cfDNA39darstellt. Daher ist Plasma zur Isolierung tumorassoziierter cfDNA eine geeignete Probe39. Blut, das in einem mit Blutentnahmeröhrchen haltigen Antikoagulans entnommen wird, sollte sofort oder innerhalb von bis zu zwei Stunden zentrifugiert werden, um das Plasma zu trennen und eine cfDNA-Kontamination zu vermeiden. In diesem Protokoll werden spezielle kommerzielle cfDNA-Konservierungsblutentnahmeröhrchen verwendet (siehe Tabelle der Materialien), die eine Alternative zu gerinnungshemmenden Blutentnahmeröhrchen darstellen. Diese speziellen Blutentnahmeröhrchen bewahren cfDNA und cfRNA und verhindern eine Lyse von WBCs für bis zu 30 Tage bei Umgebungstemperatur und bis zu 8 Tage bei 37 °C. Dies erleichtert die Aufrechterhaltung der entsprechenden Temperatur während einer Blutprobensendung und bis plasma- und WBC-Trennung40.
Derzeit gibt es drei Arten von cfDNA-Extraktionsmethoden: Phasenisolierung, Siliziummembran-basierte Spin-Säule und magnetische Perlen-basierte Isolierung41. Das Siliziummembran-basierte Spinsäulenverfahren lieferte eine hohe Menge an cfDNA mit hoher Integrität im Vergleich zu anderen cfDNA-Extraktionsmethoden42.
Die quantitative Auswertung von DNA ist eine grundlegende Anforderung in der flüssigen Biopsie, es besteht die Notwendigkeit, ein einfaches, erschwingliches und standardisiertes Verfahren für ihre einfache Umsetzung und breite Nutzung zu entwickeln. Drei häufig verwendete Methoden zur cfDNA-Quantifizierung sind spektrophotometrische, fluorimetrische und qPCR. Die fluorimetrische Methode ist besser als die anderen Methoden in Bezug auf die Genauigkeit, Kosten und Leichtigkeit der Leitung43.
Die Integrität und Reinheit der cfDNA kann entweder durch Agaroseelektrophorese oder Kapillarelektrophorese geschätzt werden. Die Agarose-Elektrophorese zeigt weder eine Empfindlichkeit bei geringer CfDNA-Konzentration noch hat sie eine hohe Auflösung, um eine genaue Fragmentgröße von cfDNA zu zeigen. Andererseits hat die Kapillarelektrophorese einen Vorteil gegenüber der Agaroseelektrophorese, indem sie die damit verbundenen Herausforderungen überwindet und daher von den Forschern für die cfDNA-Fragmentgrößenanalyse weit verbreitet ist. In diesem Protokoll wurde die Fragmentgrößenverteilung isolierter cfDNA mit einem automatisierten Kapillarelektrophorese-Instrument geschätzt (siehe Tabelle der Materialien).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2100 Bioanalyzer Instrument</td>
			<td>Agilent Technologies, Inc.</td>
			<td>G2939BA</td>
			<td>The 2100 Bioanalyzer system is an established automated electrophoresis tool for the sample quality control of biomolecules.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adjustable Clip for Priming Station</td>
			<td>Agilent Technologies, Inc.</td>
			<td>5042-1398</td>
			<td>Used in combination with syringe to apply defined pressure for chip priming.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent High Sensitivity DNA Kit</td>
			<td>Agilent Technologies, Inc.</td>
			<td>5067-4626</td>
			<td>The High Sensitivity DNA assays are often used for sample quality control for next-generation sequencing libraries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cf-DNA/cf-RNA Preservative Tubes</td>
			<td>Norgen Biotek Corp.</td>
			<td>63950</td>
			<td>Norgen&#39;s cf-DNA/cf-RNA Preservative Tubes are closed, evacuated plastic tubes for the collection and the preservation of cf-DNA, circulating tumor DNA, cf-RNA and circulating tumor cells in human whole blood samples during storage and shipping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chip Priming Station</td>
			<td>Agilent Technologies, Inc.</td>
			<td>5065-4401</td>
			<td>Used to load gel matrix into a chip with a syringe provided with each assay kit&#8212; used for RNA, DNA, and protein assays. Includes priming station, stop watch, and 1 syringe clip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode Cleaner Kit</td>
			<td>Agilent Technologies, Inc.</td>
			<td>5065-9951</td>
			<td>Prevents cross-contamination. Removes bacterial or protein contaminants from electrodes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filters for Gel Matrix</td>
			<td>Agilent Technologies, Inc.</td>
			<td>185-5990</td>
			<td>Used for proper mixing of DNA dye concentrate and DNA gel matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IKA Basic Chip Vortex</td>
			<td>IKA-Werke GmbH &#38; Co. KG</td>
			<td>MS-3-S36</td>
			<td>Used for proper mixing of DNA ladder and DNA sample on Bioanalyzer assay chips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoSpin Tissue kit</td>
			<td>MACHEREY-NAGEL</td>
			<td>740952.5</td>
			<td>With the NucleoSpin Tissue kit, genomic DNA can be prepared from tissue, cells 
			(e.g., bacteria), and many other sources.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAamp circulating nucleic acid kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>55114</td>
			<td>The QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit enables efficient purification of these circulating nucleic acids from human plasma or serum and other cell-free body fluids.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAvac 24 Plus vacuum manifold</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19413</td>
			<td>The QIAvac 24 Plus vacuum manifold is designed for vacuum processing of QIAGEN columns in parallel.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAvac Connecting System</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19419</td>
			<td>In combination with the QIAvac Connecting System, the QIAvac 24 Plus vacuum manifold can be used as a flow-through system. The sample flow-through, containing possibly infectious material, is collected in a separate waste bottle.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 2.0 fluorometer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q32866</td>
			<td>The Qubit 2.0 Fluorometer is an easy-to-use, analytical instrument designed to work with the Qubit assays for DNA, RNA, and protein quantitation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit assay tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Q32856</td>
			<td>Qubit assay tubes are 500 &#181;L thin-walled polypropylene tubes for use with the Qubit Fluorometer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Q32851</td>
			<td>The Qubit dsDNA HS (High Sensitivity) Assay Kit is designed specifically for use with the Qubit Fluorometer. The assay is highly selective for double-stranded DNA (dsDNA) over RNA and is designed to be accurate for initial sample concentrations from 10 pg/&#181;L to 100 ng/&#181;L.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Pump</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>84010</td>
			<td>used for vacuum processing of QIAGEN columns</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miscellaneous</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml centrifuge tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crushed ice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (96&#8211;100%)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating block or similar at 56 &#176;C (capable of holding 2 ml collection tubes)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol (100%)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes (adjustable)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile pipette tips (pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross-contamination)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath or heating block capable of holding 50 mL centrifuge tubes at 60 &#176;C</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of cell-free dna in blood plasma samples of cancer patients

Die Identifizierung von Mutationen in Tumoren von Krebspatienten ist ein sehr wichtiger Schritt im Krankheitsmanagement. Diese Mutationen dienen als Biomarker für die Tumordiagnose sowie für die Behandlungsauswahl und deren Reaktion bei Krebspatienten. Die aktuelle Goldstandardmethode zum Nachweis von Tumormutationen beinhaltet einen genetischen Test der Tumor-DNA mittels Tumorbiopsien. Diese invasive Methode ist jedoch nur schwer wiederholt als Folgetest des Tumormutationsrepertoires durchzuführen. Flüssigbiopsie ist eine neue und aufkommende Technik, um Tumormutationen als einfach zu bedienenden und nicht-invasiven Biopsieansatz zu erkennen.
Krebszellen vermehren sich schnell. Parallel dazu erkranken zahlreiche Krebszellen einer Apoptose. Trümmer dieser Zellen werden in das Kreislaufsystem eines Patienten freigesetzt, zusammen mit fein fragmentierten DNA-Stücken, sogenannten zellfreien DNA-Fragmenten (cfDNA), die Tumor-DNA-Mutationen tragen. Daher werden zur Identifizierung von cfDNA-basierten Biomarkern mit flüssiger Biopsietechnik Blutproben von den Krebspatienten entnommen, gefolgt von der Trennung von Plasma und buffy Coat. Als nächstes wird Plasma zur Isolierung von cfDNA und das jeweilige Buffy-Mantel zur Isolierung der genomischen DNA eines Patienten verarbeitet. Beide Nukleinsäureproben werden dann auf ihre Menge und Qualität überprüft; und auf Mutationen mit NGS-Techniken der nächsten Generation analysiert.
In diesem Manuskript stellen wir ein detailliertes Protokoll für die flüssige Biopsie vor, einschließlich Blutentnahme, Plasma- und Buffy-Coat-Trennung, cfDNA- und Keimbahn-DNA-Extraktion, Quantifizierung von cfDNA- oder Keimbahn-DNA und cfDNA-Fragmentanreicherungsanalyse.

Plasma-Trennung 8,5-9 ml Blut, das in cfDNA- oder cfRNA-Konservierungsröhrchen gesammelt wird, ergibt ein Volumen von ca. 4 ml Plasma. Das Volumen des Plasmas, das von blutgebundenen Blutinues in EDTA-Röhren getrennt ist, kann je nach Temperatur variieren. Die Exposition von EDTA-Röhren, die Blut bei einer Temperatur von mehr als 37 °C enthalten, führt zu einer verringerten Plasmavolumenausbeute44.
Fluorometer-Assay-Ergebnisse<b...

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Detection of Cell-Free DNA in Blood Plasma Samples of Cancer Patients

In diesem Beitrag stellen wir ein detailliertes Protokoll für die nichtinvasive flüssige Biopsietechnik vor, einschließlich Blutentnahme, Plasma- und Buffy-Coat-Trennung, cfDNA- und Keimbahn-DNA-Extraktion, Quantifizierung von cfDNA- oder Keimbahn-DNA und cfDNA-Fragmentanreicherungsanalyse.

Nachweis zellfreier DNA in Blutplasmaproben von Krebspatienten

Identifying mutations in tumors of cancer patients is a very important step in disease management. These mutations serve as biomarkers for tumor diagnosis ...

detection-of-cell-free-dna-in-blood-plasma-samples-of-cancer-patients

Research

JoVE Journal

Cancer Research

10.8K Aufrufe.  Bar-Ilan University. In diesem Beitrag stellen wir ein detailliertes Protokoll für die nichtinvasive flüssige Biopsietechnik vor, einschließlich Blutentnahme, Plasma- und Buffy-Coat-Trennung, cfDNA- und Keimbahn-DNA-Extraktion, Quantifizierung von cfDNA- oder Keimbahn-DNA und cfDNA-Fragmentanreicherungsanalyse.

Serie: Detection of Cell-Free DNA in Blood Plasma Samples of Cancer Patients

Cell-Free DNA Integrity Analysis in Urine Samples

Although the presence of circulating cell-free DNA in plasma or serum has been widely shown to be a suitable source of biomarkers for many types of cancer, few studies have focused on the potential use of urine cell-free (UCF) DNA. Starting from the hypotheses that normal apoptotic cells produce highly fragmented DNA and that cancer cells release longer DNA, the potential role of UCF DNA integrity was evaluated as an early diagnostic marker capable of distinguishing between patients with prostate or bladder cancer and healthy individuals.
A UCF DNA integrity analysis is proposed on the basis of four quantitative real-time PCRs of four sequences longer than 250 bp: c-MYC, BCAS1, HER2, and AR. Sequences that frequently have an increased DNA copy number in bladder and prostate cancers were chosen for the analysis, but the method is flexible, and these genes could be substituted with other genes of interest. The potential utility of UCF DNA as a source of biomarkers has already been demonstrated for urologic malignancies, thus paving the way for further studies on UCF DNA characterization. The UCF DNA integrity test has the advantage of being non-invasive, rapid, and easy to perform, with only a few milliliters of urine needed to carry out the analysis.

A method for analyzing DNA integrity in the cell-free supernatant fraction of urine samples is proposed. The method is suitable for early detection of urological malignancies and has proven accurate for the early diagnosis of bladder cancer.

Zellfreie DNA-Integritätsanalyse in Urinproben

Although the presence of circulating cell-free DNA in plasma or serum has been widely shown to be a suitable source of biomarkers for many types of ...

Forschung

Krebsforschung

Serum and Plasma Copy Number Detection Using Real-time PCR

Serum and plasma cell free DNA (cfDNA) has been shown as an informative, non-invasive source of biomarkers for cancer diagnosis, prognosis, monitoring, and prediction of treatment resistance. Starting from the hypothesis that androgen receptor (AR) gene copy number (CN) gain is a frequent event in metastatic castration resistance prostate cancer (mCRPC), we propose to analyze this event in cfDNA as a potential predictive biomarker.
We evaluated AR CN in cfDNA using 2 different real-time PCR assays and 2 reference genes (RNaseP and AGO1). DNA amount of 60 ng was used for each assay combination. AR CN gain was confirmed using Digital PCR as a more accurate method. CN variation analysis has already been demonstrated to be informative for the prediction of treatment resistance in the setting of mCRPC, but it could be useful also for other purposes in different patient settings. CN analysis on cfDNA has several advantages: it is non-invasive, rapid and easy to perform, and it starts from a small volume of serum or plasma material.

This manuscript describes the copy number variation analysis performed in serum or plasma DNA using real-time PCR approach. This method is suitable for the prediction of drug resistance in castration resistant prostate cancer patients, but it could be informative also for other diseases.

Serum und Plasma Kopie Nummer Erkennung mittels Real-Time PCR

Serum and plasma cell free DNA (cfDNA) has been shown as an informative, non-invasive source of biomarkers for cancer diagnosis, prognosis, monitoring, ...

Using 22C3 Anti-PD-L1 Antibody Concentrate on Biopsy and Cytology Samples from Non-small Cell Lung Cancer Patients

Pembrolizumab monotherapy has been approved for the first- and second-line treatment of patients with PD-L1-expressing advanced non-small cell lung cancer (NSCLC). Testing for PD-L1 expression with the PD-L1 immunohistochemistry (IHC) 22C3 companion diagnostic assay, which gives a tumor proportion score (TPS), has been validated on tumor tissue. We developed an optimized laboratory-developed test (LDT) that uses the 22C3 antibody (Ab) concentrate on a widely available IHC autostainer for biopsy and cytology specimens. The PD-L1 TPS was evaluated with 120 paired whole-tumor tissue sections and biopsy samples and with 70 paired biopsy and cytology samples (bronchial washes, n = 40; pleural effusions, n = 30). The 22C3 Ab concentrate-based LDT showed a high concordance rate between biopsy (~100%) and cytology (~95%) specimens when compared to PD-L1 IHC expression determined using the PD-L1 IHC 22C3 companion assay at both TPS cut points (&#8805;1%, &#8805;50%). The optimized LDT presented here, using the 22C3 Ab concentrate to determine the PD-L1 expression in both tumor tissue and in cytology specimens, will expand the ability of laboratories worldwide to assess the eligibility of patients with NSCLC for treatment with pembrolizumab monotherapy in a reliable and reproducible manner.

To expand the ability of laboratories worldwide to assess the eligibility of patients with lung cancer for treatment with pembrolizumab, in a reliable and reproducible manner, we developed an assay that uses the 22C3 antibody concentrate on a widely available immunohistochemical autostainer, for both biopsy and cytology specimens.

Mit 22 3 Anti-PD-L1-Antikörper konzentrieren sich auf Biopsie und Zytologie Proben von Patienten mit nicht-kleinzelligem Lungenkrebs

Pembrolizumab monotherapy has been approved for the first- and second-line treatment of patients with PD-L1-expressing advanced non-small cell lung cancer ...

Methods for Evaluating the Role of c-Fos and Dusp1 in Oncogene Dependence

The demonstration of tyrosine kinase inhibitors (TKIs) in treating chronic myeloid leukemia (CML) has heralded a new era in cancer therapeutics. However, a small population of cells does not respond to TKI treatment, resulting in minimal residual disease (MRD); even the most potent TKIs fail to eradicate these cells. These MRD cells serve as a reservoir to develop resistance to therapy. Why TKI treatment is ineffective against MRD cells is not known. Growth factor signaling is implicated in supporting the survival of MRD cells during TKI treatment, but a mechanistic understanding is lacking. Recent studies demonstrated that an elevated c-Fos and Dusp1 expression as a result of convergent oncogenic and growth factor signaling in MRD cells mediate TKI resistance. The genetic and chemical inhibition of c-Fos and Dusp1 renders CML exquisitely sensitive to TKIs and cures CML in both genetic and humanized mouse models. We identified these target genes using multiple microarrays from TKI-sensitive and -resistant cells. Here, we provide methods for target validation using in vitro and in vivo mouse models. These methods can easily be applied to any target for genetic validation and therapeutic development.

Here, we describe protocols for the genetic and chemical validation of c-Fos and Dusp1 as a drug target in leukemia using in vitro and in vivo genetic and humanized mouse models. This method can be applied to any target for genetic validation and therapeutic development.

Methoden zur Bewertung der Rolle von c-Fos und Dusp1 in Abhängigkeit der Onkogen

The demonstration of tyrosine kinase inhibitors (TKIs) in treating chronic myeloid leukemia (CML) has heralded a new era in cancer therapeutics. However, ...

Detection of a Circulating MicroRNA Custom Panel in Patients with Metastatic Colorectal Cancer

There is increasing interest in liquid biopsy for cancer diagnosis, prognosis and therapeutic monitoring, creating the need for reliable and useful biomarkers for clinical practice. Here, we present a protocol to extract, reverse transcribe and evaluate the expression levels of circulating miRNAs from plasma samples of patients with colorectal cancer (CRC). microRNAs (miRNAs) are a class of non-coding RNAs of 18-25 nucleotides in length that regulate the expression of target genes at the translational level and play an important role, including that of pro- and anti-angiogenic function, in the physiopathology of various organs. miRNAs are stable in biological fluids such as serum and plasma, which renders them ideal circulating biomarkers for cancer diagnosis, prognosis and treatment decision-making and monitoring. Circulating miRNA extraction was performed using a rapid and effective method that involves both organic and column-based methodologies. For miRNA retrotranscription, we used a multi-step procedure that considers polyadenylation at 3&#39; and the ligation of an adapter at 5&#39; of the mature miRNAs, followed by random miRNA pre-amplification. We selected a 24-miRNA custom panel to be tested by quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR) and spotted the miRNA probes on array custom plates. We performed qRT-PCR plate runs on a real-time PCR System. Housekeeping miRNAs for normalization were selected using GeNorm software (v. 3.2). Data were analyzed using Expression suite software (v 1.1) and statistical analyses were performed. The method proved to be reliable and technically robust and could be useful to evaluate biomarker levels in liquid samples such as plasma and/or serum.

We present a protocol to evaluate the expression levels of circulating microRNA (miRNAs) in plasma samples from cancer patients. In particular, we used a commercially available kit for circulating miRNA extraction and reverse transcription. Finally, we analyzed a panel of 24 selected miRNAs using real-time pre-spotted probe custom plates.

Erkennung eines zirkulierenden MicroRNA Custom Panels bei Patienten mit metastasiertem kolorektalen Karzinom

There is increasing interest in liquid biopsy for cancer diagnosis, prognosis and therapeutic monitoring, creating the need for reliable and useful ...

Evaluation of Colorectal Cancer Risk and Prevalence by Stool DNA Integrity Detection

Nowadays, stool DNA can be isolated and analyzed by several methods. The long fragments of DNA in stool can be detected by a qPCR assay, which provides a reliable probability of the presence of pre-neoplastic or neoplastic colorectal lesions. This method, called fluorescence long DNA (FL-DNA), is a fast, non-invasive procedure that is an improvement upon the primary prevention system. This method is based on evaluation of fecal DNA integrity by quantitative amplification of specific targets of genomic DNA. In particular, the evaluation of DNA fragments longer than 200 bp allows for detection of patients with colorectal lesions with very high specificity. However, this system and all currently available stool DNA tests present some general issues that need to be addressed (e.g., the frequency at which tests should be carried out and optimal number of stool samples collected at each timepoint for each individual). However, the main advantage of FL-DNA is the possibility to use it in association with a test currently used in the CRC screening program, known as the immunochemical-based fecal occult blood test (iFOBT). Indeed, both tests can be performed on the same sample, reducing costs and achieving a better prediction of the eventual presence of colorectal lesions.

The presented diagnostic FL-DNA kit is a time-saving and user-friendly method to determine the reliable probability of the presence of colorectal cancer lesions.

Bewertung des Darmkrebsrisikos und der Prävalenz durch Stuhl-DNA-Integritätsnachweis

Nowadays, stool DNA can be isolated and analyzed by several methods. The long fragments of DNA in stool can be detected by a qPCR assay, which provides a ...

Flow Cytometric Analysis of Mitochondrial Reactive Oxygen Species in Murine Hematopoietic Stem and Progenitor Cells and MLL-AF9 Driven Leukemia

We present a flow cytometric approach for analyzing mitochondrial ROS in various live bone marrow (BM)-derived stem and progenitor cell populations from healthy mice as well as mice with AML driven by MLL-AF9. Specifically, we describe a two-step cell staining process, whereby healthy or leukemia BM cells are first stained with a fluorogenic dye that detects mitochondrial superoxides, followed by staining with fluorochrome-linked monoclonal antibodies that are used to distinguish various healthy and malignant hematopoietic progenitor populations. We also provide a strategy for acquiring and analyzing the samples by flow cytometry. The entire protocol can be carried out in a timeframe as short as 3-4 h. We also highlight the key variables to consider as well as the advantages and limitations of monitoring ROS production in the mitochondrial compartment of live hematopoietic and leukemia stem and progenitor subpopulations using fluorogenic dyes by flow cytometry. Furthermore, we present data that mitochondrial ROS abundance varies among distinct healthy HSPC sub-populations and leukemia progenitors and discuss the possible applications of this technique in hematologic research.

We describe a method for using multiparameter flow cytometry to detect mitochondrial reactive oxygen species (ROS) in murine healthy hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and leukemia cells from a mouse model of acute myeloid leukemia (AML) driven by MLL-AF9.

We present a flow cytometric approach for analyzing mitochondrial ROS in various live bone marrow (BM)-derived stem and progenitor cell populations from ...

Detection and Monitoring of Tumor Associated Circulating DNA in Patient Biofluids

Complications associated with upfront and repeat surgical tissue sampling present the need for minimally invasive platforms capable of molecular sub-classification and temporal monitoring of tumor response to therapy. Here, we describe our dPCR-based method for the detection of tumor somatic mutations in cell free DNA (cfDNA), readily available in&#160;patient biofluids. Although limited in the number of mutations that can be tested for in each assay, this method provides a high level of sensitivity and specificity. Monitoring of mutation abundance, as calculated by MAF, allows for the evaluation of tumor response to therapy, thereby providing a much-needed supplement to radiographic imaging.

Here, we present a protocol to detect tumor somatic mutations in circulating DNA present in patient biological fluids (biofluids). Our droplet digital polymerase chain reaction (dPCR)-based method enables quantification of the tumor mutation allelic frequency (MAF), facilitating a minimally invasive complement to diagnosis and temporal monitoring of tumor response.

Nachweis und Überwachung von tumorassoziierter zirkulierender DNA in Biofluiden von Patienten

Complications associated with upfront and repeat surgical tissue sampling present the need for minimally invasive platforms capable of molecular ...

Simple and Fast Rolling Circle Amplification-Based Detection of Topoisomerase 1 Activity in Crude Biological Samples

Isothermal amplification-based techniques such as the rolling circle amplification have been successfully employed for the detection of nucleic acids, protein amounts, or other relevant molecules. These methods have shown to be substantial alternatives to PCR or ELISA for clinical and research applications. Moreover, the detection of protein amount (by Western blot or immunohistochemistry) is often insufficient to provide information for cancer diagnosis, whereas the measurement of enzyme activity represents a valuable biomarker. Measurement of enzyme activity also allows for the diagnosis and potential treatment of pathogen-borne diseases. In all eukaryotes, topoisomerases are the key DNA-binding enzymes involved in the control of the DNA topological state during important cellular processes and are among the important biomarkers for cancer prognosis and treatment.
Over the years, topoisomerases have been substantially investigated as a potential target of antiparasitic and anticancer drugs with libraries of natural and synthetic small-molecule compounds that are investigated every year. Here, the rolling circle amplification method, termed rolling circle enhanced enzyme activity detection (REEAD) assay that allows for the quantitative measurement of topoisomerase 1 (TOP1) activity in a simple, fast, and gel-free manner is presented.By cleaving and ligating a specially designed DNA substrate, TOP1 converts a DNA oligonucleotide into a closed circle, which becomes the template for rolling circle amplification, yielding ~103 tandem repeat rolling circle products. Depending on the nucleotide incorporation during the amplification, there is the possibility of different readout methods, from fluorescence to chemiluminescence to colorimetric. As each TOP1-mediated cleavage-ligation generates one closed DNA circle, the assay is highly sensitive and directly quantitative.

A protocol for the sensitive and quantitative detection of topoisomerase 1 activity using the rolling circle enhanced enzyme activity detection assay is described. The method allows detection of topoisomerase 1 activity from purified components or cell/tissue extracts. This protocol has wide-ranging applications in any field involving detection of enzymatic activity.

Einfache und schnelle Rolling Circle Amplification-basierte Detektion der Topoisomerase 1-Aktivität in rohen biologischen Proben

Isothermal amplification-based techniques such as the rolling circle amplification have been successfully employed for the detection of nucleic acids, ...

Diagnose des vitreoretinalen Lymphoms mit zellfreier DNA

Cell-Free DNA Extraction of Vitreous and Aqueous Humor Specimens for Diagnosis and Monitoring of Vitreoretinal Lymphoma

Vitreoretinal lymphoma (VRL) represents an aggressive lymphoma, often categorized as primary central nervous system diffuse large B-cell lymphoma. To diagnose VRL, specimens such as vitreous humor and, more recently, aqueous humor are collected. Diagnostic testing for VRL on these specimens includes cytology, flow cytometry, and molecular testing. However, both cytopathology and flow cytometry, along with molecular testing using cellular DNA, necessitate intact whole cells. The challenge lies in the fact that vitreous and aqueous humor typically have low cellularity, and many cells get destroyed during collection, storage, and processing. Moreover, these specimens pose additional difficulties for molecular testing due to the high viscosity of vitreous humor and the low volume of both vitreous and aqueous humor. This study proposes a method for extracting cell-free DNA from vitreous and aqueous specimens. This approach complements the extraction of cellular DNA or allows the cellular component of these specimens to be utilized for other diagnostic methods, including cytology and flow cytometry.

Autor im Rampenlicht: Weiterentwicklung der VRL-Diagnose durch zellfreie DNA-Extraktion aus Glaskörper 

A procedure to extract cell-free DNA from vitreous and aqueous humor to perform molecular studies for diagnosing vitreoretinal lymphoma is established here. The method offers the ability to concurrently extract DNA from the cellular component of the sample or to reserve it for ancillary testing.

Zellfreie DNA-Extraktion von Glaskörper- und Kammerwasserproben zur Diagnose und Überwachung des vitreoretinalen Lymphoms

Vitreoretinal lymphoma (VRL) represents an aggressive lymphoma, often categorized as primary central nervous system diffuse large B-cell lymphoma. To ...