The authors thank Gr&#225;inne Tierney and Silvia Bellissimo for their editorial assistance.

O protocolo segue as orientações do Comitê de Ética em Pesquisa com Seres Humanos IRST. NOTA: Neste protocolo, isolado DNA a partir de amostras de urina para realizar uma análise de integridade do DNA UCF. LNCaP e células MRC linhas foram utilizados para construir padrões. Técnicas tais como a extracção de ADN, a quantificação de ADN (espectrofotómetro e PCR em tempo real para o gene de controlo, STOX1), e PCR em tempo real para oncogenes específicos foram realizados (Figura 1). 1. Recolha de urina e Processamento <ol><li> Obter uma de urina limpa primeira manhã amostra de urina em um copo limpo e seco, de plástico. Recolher pelo menos 50 ml da amostra de urina. </li><li> Manter a urina, a 4 ° C durante um máximo de 3 h e enviá-lo para o laboratório, à mesma temperatura. </li><li> Misture cada amostra invertendo-lo duas vezes imediatamente após a chegada no laboratório e transferência em dois tubos de polipropileno de fundo cónico de 50 ml. </li><li> Centrifugar os tubosa 850 xg durante 10 min a 4 ° C ou à temperatura ambiente. </li><li> transferir cuidadosamente 10 ml de a parte superior do sobrenadante de urina em dois tubos de 5 mL, deixando, pelo menos, 2 ml do sobrenadante acima da pelete de células. NOTA: Transferir a parte superior do sobrenadante reduz o risco de contaminação por células ou detritos celulares. Não há nenhuma clara delimitação entre as partes superior e inferior. </li><li> Desprezar o pelete e congelar imediatamente o sobrenadante a -80 ° C até à sua utilização. </li></ol> 2. Isolamento de ADN a partir do sobrenadante de urina e linhas celulares NOTA: Isolar o ADN a partir de uma linha celular (por exemplo, LNCaP de cancro da próstata ou cancro da bexiga para MRC) usando um estojo comercial e seguindo as instruções do fabricante. Isolamento de ADN a partir do sobrenadante de urina deve ser realizado utilizando o protocolo comercial, modificado como se segue: <ol><li> Descongelar uma alíquota do sobrenadante de urina, à temperatura ambiente. &lt;/ Li&gt; <li> Vortex e misturar a amostra de urina e transferir 1 ml de sobrenadante a urina para um tubo de 5 mL claro. Congelar a urina residual à temperatura de -80 ° C. </li><li> Adicionar 100 ul de proteinase K directamente para a amostra. </li><li> Adicionar 1 mL de tampão AL à amostra e misturar bem por pipetagem. </li><li> Feche os tubos e incubar as amostras a 56 ° C durante 15 min. </li><li> Durante a incubação, preparar uma coluna para cada amostra e preparação dos tampões de lavagem, e AW1 AW2, conforme instruções do fabricante (adicionar a quantidade indicada de 100% de etanol). </li><li> Trazer as amostras de volta à temperatura ambiente e adicionar 1 ml de etanol absoluto. Misturar completamente por pipetagem. </li><li> Adicionar 650 ul da mistura obtida no passo 2.7 para a coluna e centrifugar-lo a 6,000 xg durante 1 min. </li><li> Descartar o tubo contendo o fluxo de passagem e colocar a coluna em um tubo de recolha de novo, limpo. Repita os passos 2.8 e 2.9 até que toda a mistura de amostra foi usado (5 vezes). </li><li> Adicionar 500 &amp;# 181; ul de tampão AW1 sem molhar a borda da coluna. Centrifugar-lo a 6,000 xg durante 1 min. </li><li> Descartar o tubo contendo o fluxo de passagem e substituí-lo por um novo tubo de recolha, limpo. </li><li> Adicionar 500 ul de tampão de AW2 sem molhar a borda da coluna. Centrifugar-lo à velocidade máxima (20000 x g) durante 3 min. </li><li> Descartar o tubo contendo o fluxo de passagem e substituí-lo por um novo tubo de recolha, limpo. </li><li> Repita o passo 2.12 para remover qualquer tampão de lavagem residual. </li><li> Colocar a coluna para um tubo limpo de 1,5 mL. Adicionar 50 ul de tampão de eluição AE e esperar 7 min para assegurar que os molha tampão da coluna. </li><li> Centrifugar a 8.000 xg lo durante 1 min. </li><li> Pipetar o eluente do passo 2.15 para o mini-coluna e centrifugar-lo à velocidade máxima durante 1 min para assegurar a máxima recuperação do DNA. </li></ol> 3. DNA Quantificação e Diluição <ol><li> Usando um espectrofotómetro, realizar a quantificação do ADN de both, a linha de células e as amostras de urina sobrenadante. Use 2 ul de amostra num espectrómetro de bancada, de acordo com as instruções do fabricante. </li><li> Diluir as amostras de DNA de UCF para obter uma concentração de 1 ng / mL e armazenar o ADN à temperatura de -20 ° C até que a análise da integridade do ADN. NOTA: Se a quantidade de ADN não é suficiente para prosseguir com PCR em tempo real (pelo menos 100 ng), realizar um novo processo de isolamento de DNA. </li><li> Dilui-se o ADN a partir de amostras de linha de células para obter seis padrões com diferentes concentrações: 0,001, 0,01, 0,1, 1, 0,5 e 2 ng / mL, cada uma com um volume de 100 uL (ST1, ST2, ST3, sT4, ST5, e ST6). Armazenar os padrões de ADN da linha de células à temperatura de -20 ° C até que a análise da integridade do ADN. </li></ol> 4. DNA Integrity Test - PCR <ol><li> Descongelar os iniciadores (a concentração depende do tipo de ensaio), Supermix verde, padrões de ADN da linha de células, e amostras de DNA UCF diluídos em gelo. </li><li> Prepare tubos tira na placa de fou o disco do rotor 72 poços. Alíquota de 10 uL em duplicado para cada padrão e amostra diluída e 10 uL de água isenta de RNase para o controlo negativo. </li><li> Prepara-se uma mistura de 1 mL de cada iniciador (as concentrações são indicadas na Tabela 1), 12,5 uL de Supermix verde, e 6,5 mL de água isenta de RNase para cada amostra. Ao preparar a mistura, utilize o seguinte número de amostras: 6 padrões para 2 repetições, número de amostras por 2 repetições, controle negativo para 2 repetições, e 2 amostras extras. </li><li> Aliquota de 15 uL da mistura em cada cavidade. Não pipeta ou girar os tubos. </li><li> Inicie o protocolo com as condições de PCR indicados na Tabela 1. NOTA: Para obter o valor DNA UCF, 29 amostras de DNA foram processados ​​para cada experimento em tempo real usando o disco do rotor 72 poços: 29 x 2 amostras + 6 x 2 padrões + control x 2 = 72 (valor de DNA UCF) negativo. NOTA: O protocolo para a análise da integridade do ADN também pode ser UCFrealizada utilizando um outro instrumento de PCR em tempo real (quando se utiliza um outro dispositivo, ROX corante pode precisar de ser adicionado). </li></ol> 5. DNA Integrity Test - Análise de Dados e Interpretação NOTA: O valor de ADN UCF para cada amostra foi obtida por um software de sistema de detecção de instrumento em tempo real, utilizando uma construção curva padrão para cada avaliação individual do gene por PCR e utilizando interpolação curva padrão, tal como anteriormente descrito 7-9 (Figura 2). <ol><li> Avaliar as repetições; amostra replica com uma diferença ≥1 Ct deve ser descartado e re-avaliado em um segundo experimento. </li><li> Calcule o Ct mediana para cada amostra e considerar amostras com um valor de Ct ≤ 36. </li><li> Avaliar a especificidade dos produtos de PCR por meio de análise de fusão. </li><li> Avaliar a concentração de cada fragmento amplificado por interpolação com a curva padrão; obter um valor de concentração (ng / mL) para cada fragmento amplificado.</li>
</ol>

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The authors declare no competing financial interests.

UCF análise da integridade do ADN é um método novo, não invasivo para avaliar a integridade do ADN na urina. Recentemente, foi proposto para o diagnóstico precoce da bexiga e próstata 9 7,8. Um certo número de vantagens e desvantagens do teste de integridade do DNA UCF são discutidos aqui, juntamente com perspectivas futuras. A principal vantagem do método é que ele oferece um método barato, não-invasivo e um protocolo simples para estudar urina como uma fon...

ADN livre de células pode ser detectado no sangue e na urina devido a morte celular por mecanismos apoptóticos ou necróticos. DNA livre de células no sangue tem sido amplamente estudada para fins de diagnóstico e prognóstico em várias doenças, especialmente câncer 1. No entanto, pouco se sabe sobre o papel do DNA urinário livre de células (UCF). DNA UCF podem ser originários de passagem de sangue através do sistema de filtração glomerular ou a partir de células que entram em contacto directo com este corpo fluido 2 (por exemplo, células uroteliais ou células prostáticas). A utilização de ADN UCF como uma fonte de biomarcadores tem sido principalmente investigado para o diagnóstico precoce de doença renal, da bexiga, e cancro da próstata, devido à elevada percentagem de ADN UCF vindo directamente a partir de células do tracto urinário 3,4. Pouco se sabe sobre DNA UCF e os melhores métodos para isolar e caracterizar-lo. Tendo em conta a hipótese de que as células tumorais libertar fragmentos de ADN mais longos do que as células normais, a avaliaçãoda integridade do ADN isento de células foi estudada na tentativa de elucidar a origem de ADN na circulação sanguínea 5. Alguns estudos demonstraram que a integridade do ADN isento de células no sangue representa um bom teste de diagnóstico para muitos tipos de cancro 6, e a mesma hipótese tem sido proposta em relação à urina 7-9. Este artigo descreve um novo método para a análise de integridade do DNA UCF com um potencial de aplicação para detecção de bexiga e câncer de próstata. Em particular, a integridade do ADN UCF fragmentos superiores a 250 pb foi testado em 4 regiões conhecidas por terem um aumento do número de cópias de ADN em tumores sólidos, incluindo o da próstata e cancro da bexiga: c-myc (8q24.21), HER2 (17q12.1 ), BCAS1 (20q13.2) e AR (Xq12) 10-14. oncogenes específicos, em vez de seqüências aleatórias, foram escolhidos para aumentar a probabilidade de encontrá-los na fração livre de células de pacientes com câncer. Uma das principais vantagens deeste método é que é flexível e que outras regiões podem também ser seleccionada com base no tipo de tumor e características.

<table><tbody><tr><td>QIAamp DNA Mini Kit&lt;br/&gt; &amp;nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>51304</td><td></td></tr><tr><td>iQ SYBR&amp;nbsp;Green Supermix, 100 x 50 &amp;micro;L rxns, 2.5 mL (2 x 1.25 mL)</td><td>Biorad</td><td>1708880</td><td></td></tr><tr><td>IDT custom DNA oligos&amp;nbsp;</td><td>IDT&amp;nbsp;</td><td></td><td>HPLC purification, 100nMole DNA oligo</td></tr><tr><td>NanoDrop 1000 Spectrophotometer</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>Other spectrophotometric methods could also be used to quantify DNA</td></tr><tr><td>Rotor-Gene 6000</td><td>Corbett</td><td></td><td>Another Real Time PCR instrument could also be used</td></tr><tr><td>microcentrifuge</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>one centrifuge for 50 mL tubes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>incubator</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>-80 &amp;deg;C freezer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>-20 &amp;deg;C freezer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 &amp;#956;L pipette</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>20 &amp;#956;L pipette</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>200 &amp;#956;L pipette</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1,000 &amp;#956;L pipette</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pipette tips (10; 20; 200; 1,000)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL tubes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 mL tubes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 mL tubes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rotor-Disc 72 Rotor</td><td>Corbett</td><td>9018899</td><td></td></tr><tr><td>Strip Tubes and Caps, 0.1 mL (250)</td><td>Qiagen</td><td>981103</td><td></td></tr><tr><td>Collection Tubes (2 mL)</td><td>Qiagen</td><td>19201</td><td></td></tr><tr><td>Buffer AL (264 mL)</td><td>Qiagen</td><td>19075</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K (10 mL)</td><td>Qiagen</td><td>19133</td><td></td></tr></tbody></table>

cell-free dna integrity analysis in urine samples

Embora a presença de ADN de circulação livre de células no plasma ou soro tem sido amplamente demonstrado ser uma fonte adequada de biomarcadores para muitos tipos de cancro, poucos estudos têm-se centrado na utilização potencial de ADN isento de células de urina (UCF). A partir das hipóteses de que as células em apoptose normais produzem DNA altamente fragmentado e que as células cancerosas liberam mais DNA, o papel potencial da integridade do DNA UCF foi avaliada como um marcador diagnóstico precoce capaz de distinguir entre os pacientes com câncer de próstata ou câncer de bexiga e indivíduos saudáveis. Uma análise da integridade do ADN UCF é proposta com base em quatro reacções de PCR quantitativo em tempo real de quatro sequências mais longas do que 250 pb: c-myc, BCAS1, HER2, e AR. As sequências que têm frequentemente um aumento do número de cópias de ADN na bexiga e cancros da próstata foram escolhidos para análise, mas o método é flexível, e estes genes podem ser substituídos por outros genes de intedescansar. A utilidade potencial de DNA UCF como fonte de biomarcadores já foi demonstrado para neoplasias urológicas, abrindo assim o caminho para novos estudos sobre a caracterização DNA UCF. O teste de integridade do DNA UCF tem a vantagem de ser não-invasivo, rápido, e fácil de executar, com apenas alguns mililitros de urina necessários para levar a cabo a análise.

A concentração total de ADN livre foi quantificado por espectrofotometria para todas as amostras analisadas, mostrando uma gama de entre 1,51 e 138 ng / mL. Cinco amostras de controlo foram utilizados para a reprodutibilidade dos dados: duas experiências independentes em tempo real foram realizados para c-myc, HER2, BCAS1, AR, e STOX1. Os coeficientes de variação (CV) foram então calculados para cada gene (Tabela 2), com...

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Cell-Free DNA Integrity Analysis in Urine Samples

A method for analyzing DNA integrity in the cell-free supernatant fraction of urine samples is proposed. The method is suitable for early detection of urological malignancies and has proven accurate for the early diagnosis of bladder cancer.

Análise integridade do DNA de células-Free em amostras de urina

Although the presence of circulating cell-free DNA in plasma or serum has been widely shown to be a suitable source of biomarkers for many types of ...

cell-free-dna-integrity-analysis-in-urine-samples

Research

JoVE Journal

Cancer Research

13.7K visualizações.  Istituto Scientifico Romagnolo per lo Studio e la Cura dei Tumori (IRST) IRCCS. A method for analyzing DNA integrity in the cell-free supernatant fraction of urine samples is proposed. The method is suitable for early detection of urological malignancies and has proven accurate for the early diagnosis of bladder cancer.

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Single Droplet Digital Polymerase Chain Reaction for Comprehensive and Simultaneous Detection of Mutations in Hotspot Regions

Droplet digital polymerase chain reaction (ddPCR) is a highly sensitive quantitative polymerase chain reaction (PCR) method based on sample fractionation into thousands of nano-sized water-in-oil individual reactions. Recently, ddPCR has become one of the most accurate and sensitive tools for circulating tumor DNA (ctDNA) detection. One of the major limitations of the standard ddPCR technique is the restricted number of mutations that can be screened per reaction, as specific hydrolysis probes recognizing each possible allelic version are required. An alternative methodology, the drop-off ddPCR, increases throughput, since it requires only a single pair of probes to detect and quantify potentially all genetic alterations in the targeted region. Drop-off ddPCR displays comparable sensitivity to conventional ddPCR assays with the advantage of detecting a greater number of mutations in a single reaction. It is cost-effective, conserves precious sample material, and can also be used as a discovery tool when mutations are not known a priori.

Here, we present a protocol to accurately quantify multiple genetic alterations of a target region in a single reaction using drop-off ddPCR and a unique pair of hydrolysis probes.

Reação em Cadeia da Polimerase Digital de Gota Única para Detecção Abrangente e Simultânea de Mutações em Regiões de Hotspot

Droplet digital polymerase chain reaction (ddPCR) is a highly sensitive quantitative polymerase chain reaction (PCR) method based on sample fractionation ...

Genética

Evaluation of Colorectal Cancer Risk and Prevalence by Stool DNA Integrity Detection

Nowadays, stool DNA can be isolated and analyzed by several methods. The long fragments of DNA in stool can be detected by a qPCR assay, which provides a reliable probability of the presence of pre-neoplastic or neoplastic colorectal lesions. This method, called fluorescence long DNA (FL-DNA), is a fast, non-invasive procedure that is an improvement upon the primary prevention system. This method is based on evaluation of fecal DNA integrity by quantitative amplification of specific targets of genomic DNA. In particular, the evaluation of DNA fragments longer than 200 bp allows for detection of patients with colorectal lesions with very high specificity. However, this system and all currently available stool DNA tests present some general issues that need to be addressed (e.g., the frequency at which tests should be carried out and optimal number of stool samples collected at each timepoint for each individual). However, the main advantage of FL-DNA is the possibility to use it in association with a test currently used in the CRC screening program, known as the immunochemical-based fecal occult blood test (iFOBT). Indeed, both tests can be performed on the same sample, reducing costs and achieving a better prediction of the eventual presence of colorectal lesions.

The presented diagnostic FL-DNA kit is a time-saving and user-friendly method to determine the reliable probability of the presence of colorectal cancer lesions.

Avaliação do Risco e Prevalência de Câncer Colorretal por Detecção de Integridade do DNA das fezes

Nowadays, stool DNA can be isolated and analyzed by several methods. The long fragments of DNA in stool can be detected by a qPCR assay, which provides a ...

Pesquisa do câncer

Detection and Monitoring of Tumor Associated Circulating DNA in Patient Biofluids

Complications associated with upfront and repeat surgical tissue sampling present the need for minimally invasive platforms capable of molecular sub-classification and temporal monitoring of tumor response to therapy. Here, we describe our dPCR-based method for the detection of tumor somatic mutations in cell free DNA (cfDNA), readily available in&#160;patient biofluids. Although limited in the number of mutations that can be tested for in each assay, this method provides a high level of sensitivity and specificity. Monitoring of mutation abundance, as calculated by MAF, allows for the evaluation of tumor response to therapy, thereby providing a much-needed supplement to radiographic imaging.

Here, we present a protocol to detect tumor somatic mutations in circulating DNA present in patient biological fluids (biofluids). Our droplet digital polymerase chain reaction (dPCR)-based method enables quantification of the tumor mutation allelic frequency (MAF), facilitating a minimally invasive complement to diagnosis and temporal monitoring of tumor response.

Deteção e monitoração do ADN de circulação associado do tumor em Biofluids pacientes

Complications associated with upfront and repeat surgical tissue sampling present the need for minimally invasive platforms capable of molecular ...

Detection of Cell-Free DNA in Blood Plasma Samples of Cancer Patients

Identifying mutations in tumors of cancer patients is a very important step in disease management. These mutations serve as biomarkers for tumor diagnosis as well as for the treatment selection and its response in cancer patients. The current gold standard method for detecting tumor mutations involves a genetic test of tumor DNA by means of tumor biopsies. However, this invasive method is difficult to be performed repeatedly as a follow-up test of the tumor mutational repertoire. Liquid biopsy is a new and emerging technique for detecting tumor mutations as an easy-to-use and non-invasive biopsy approach.
Cancer cells multiply rapidly. In parallel, numerous cancer cells undergo apoptosis. Debris from these cells are released into a patient&#8217;s circulatory system, together with finely fragmented DNA pieces, called cell-free DNA (cfDNA) fragments, which carry tumor DNA mutations. Therefore, for identifying cfDNA based biomarkers using liquid biopsy technique, blood samples are collected from the cancer patients, followed by the separation of plasma and buffy coat. Next, plasma is processed for the isolation of cfDNA, and the respective buffy coat is processed for the isolation of a patient&#39;s genomic DNA. Both nucleic acid samples are then checked for their quantity and quality; and analyzed for mutations using next-generation sequencing (NGS) techniques.
In this manuscript, we present a detailed protocol for liquid biopsy, including blood collection, plasma, and buffy coat separation, cfDNA and germline DNA extraction, quantification of cfDNA or germline DNA, and cfDNA fragment enrichment analysis.

In this paper we present a detailed protocol for non-invasive liquid biopsy technique, including blood collection, plasma and buffy coat separation, cfDNA and germline DNA extraction, quantification of cfDNA or germline DNA, and cfDNA fragment enrichment analysis.

Detecção de DNA livre de células em amostras de plasma de sangue de pacientes com câncer

Identifying mutations in tumors of cancer patients is a very important step in disease management. These mutations serve as biomarkers for tumor diagnosis ...

A Standardized Liquid Biopsy Preanalytical Protocol for Downstream Circulating-Free DNA Applications

The term liquid biopsy (LB) refers to molecules such as proteins, DNA, RNA, cells, or extracellular vesicles in blood and other bodily fluids that originate from the primary and/or metastatic tumor. LB has emerged as a mainstay in translational research and has started to become part of clinical oncology practice, providing a minimally invasive alternative to solid biopsy. The LB allows real-time monitoring of a tumor via a minimally invasive sample extraction, such as blood. The applications include early cancer detection, patient follow-up for the detection of disease progression, assessment of minimal residual disease, and potential identification of molecular progression and mechanism of resistance. In order to achieve a reliable analysis of these samples that can be reported in the clinic, the preanalytical procedures should be carefully considered and strictly followed. Sample collection, quality, and storage are crucial steps that determine their usefulness in downstream applications. Here, we present standardized protocols from our liquid biopsy working module for collecting, processing, and storing plasma and serum samples for downstream liquid biopsy analysis based on circulating-free DNA. The protocols presented here require standard equipment and are sufficiently flexible to be applied in most laboratories focused on biological procedures.

The liquid biopsy has revolutionized our approach to oncology translational studies, with sample collection, quality, and storage being crucial steps for its successful clinical application. Here we describe a standardized and validated protocol for downstream circulating-free DNA applications that can be applied in most translational research laboratories.

Um protocolo pré-analítico de biópsia líquida padronizada para aplicações de DNA sem circulação a jusante

The term liquid biopsy (LB) refers to molecules such as proteins, DNA, RNA, cells, or extracellular vesicles in blood and other bodily fluids that ...

Uracil-DNA Glycosylase Assay by Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-flight Mass Spectrometry Analysis

Uracil-DNA glycosylase (UDG) is a key component in the base excision repair pathway for the correction of uracil formed from hydrolytic deamination of cytosine. Thus, it is crucial for genome integrity maintenance. A highly specific, non-labeled, non-radio-isotopic method was developed to measure UDG activity. A synthetic DNA duplex containing a site-specific uracil was cleaved by UDG and then subjected to Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) analysis. A protocol was established to preserve the apurinic/apyrimidinic site (AP) product in DNA without strand break. The change in the m/z value from the substrate to the product was used to evaluate uracil hydrolysis by UDG. A G:U substrate was used for UDG kinetic analysis yielding the Km = 50 nM, Vmax = 0.98 nM/s, and Kcat = 9.31 s-1. Application of this method to a uracil glycosylase inhibitor (UGI) assay yielded an IC50 value of 7.6 pM. The UDG specificity using uracil at various positions within single-stranded and double-stranded DNA substrates demonstrated different cleavage efficiencies. Thus, this simple, rapid, and versatile MALDI-TOF MS method could be an excellent reference method for various monofunctional DNA glycosylases. It also has the potential as a tool for DNA glycosylase inhibitor screening.

A non-labeled, non-radio-isotopic method to assay uracil-DNA glycosylase activity was developed using MALDI-TOF mass spectrometry for direct apurinic/apyrimidinic site-containing product analysis. The assay proved to be quite simple, specific, rapid, and easy to use for DNA glycosylase measurement.

Ensaio de Glicosylase Uracil-DNA por Desorção a Laser Assistida por Matriz/Análise de Espectrometria de Massa

Uracil-DNA glycosylase (UDG) is a key component in the base excision repair pathway for the correction of uracil formed from hydrolytic deamination of ...

Bioquímica

Quantification of three DNA Lesions by Mass Spectrometry and Assessment of Their Levels in Tissues of Mice Exposed to Ambient Fine Particulate Matter

DNA adducts and oxidized DNA bases are examples of DNA lesions that are useful biomarkers for the toxicity assessment of substances that are electrophilic, generate reactive electrophiles upon biotransformation, or induce oxidative stress. Among the oxidized nucleobases, the most studied one is 8-oxo-7,8-dihydroguanine (8-oxoGua) or 8-oxo-7,8-dihydro-2&#39;-deoxyguanosine (8-oxodGuo), a biomarker of oxidatively induced base damage in DNA. Aldehydes and epoxyaldehydes resulting from the lipid peroxidation process are electrophilic molecules able to form mutagenic exocyclic DNA adducts, such as the etheno adducts 1,N2-etheno-2&#39;-deoxyguanosine (1,N2-&#949;dGuo) and 1,N6-etheno-2&#39;-deoxyadenosine (1,N6-&#949;dAdo), which have been suggested as potential biomarkers in the pathophysiology of inflammation. Selective and sensitive methods for their quantification in DNA are necessary for the development of preventive strategies to slow down cell mutation rates and chronic disease development (e.g., cancer, neurodegenerative diseases). Among the sensitive methods available for their detection (high performance liquid chromatography coupled to electrochemical or tandem mass spectrometry detectors, comet assay, immunoassays, 32P-postlabeling), the most selective are those based on high performance liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry (HPLC-ESI-MS/MS). Selectivity is an essential advantage when analyzing complex biological samples and HPLC-ESI-MS/MS evolved as the gold standard for quantification of modified nucleosides in biological matrices, such as DNA, urine, plasma and saliva. The use of isotopically labeled internal standards adds the advantage of corrections for molecule losses during the DNA hydrolysis and analyte enrichment steps, as well as for differences of the analyte ionization between samples. It also aids in the identification of the correct chromatographic peak when more than one peak is present.
We present here validated sensitive, accurate and precise HPLC-ESI-MS/MS methods that were successfully applied for the quantification of 8-oxodGuo, 1,N6-dAdo and 1,N2-dGuo in lung, liver and kidney DNA of A/J mice for the assessment of the effects of ambient PM2.5 exposure.

We describe here methods for sensitive and accurate quantification of the lesions 8-oxo-7,8-dihydro-2&#39;-deoxyguanosine (8-oxodGuo), 1,N6-etheno-2&#39;-deoxyadenosine (1,N6-dAdo) and 1,N2-etheno-2&#39;-deoxyguanosine (1,N2-dGuo) in DNA. The methods were applied to the assessment of the effects of ambient fine particulate matter (PM2.5) in tissues (lung, liver and kidney) of exposed A/J mice.

Quantificação de três lesões de DNA por espectrometria de massas e avaliação de seus níveis em tecidos de camundongos expostos a material particulado fino ambiente

DNA adducts and oxidized DNA bases are examples of DNA lesions that are useful biomarkers for the toxicity assessment of substances that are ...

Imunologia e Infecção

Teste de biomarcador de urina sintética CRISPR-Cas para diagnóstico de câncer

CRISPR-Cas-mediated Multianalyte Synthetic Urine Biomarker Test for Portable Diagnostics

Creating synthetic biomarkers for the development of precision diagnostics has enabled detection of disease through pathways beyond those used for traditional biofluid measurements. Synthetic biomarkers generally make use of reporters that provide readable signals in the biofluid to reflect the biochemical alterations in the local disease microenvironment during disease incidence and progression. The pharmacokinetic concentration of the reporters and biochemical amplification of the disease signal are paramount to achieving high sensitivity and specificity in a diagnostic test. Here, a cancer diagnostic platform is built using one format of synthetic biomarkers: activity-based nanosensors carrying chemically stabilized DNA reporters that can be liberated by aberrant proteolytic signatures in the tumor microenvironment. Synthetic DNA as a disease reporter affords multiplexing capability through its use as a barcode, allowing for the readout of multiple proteolytic signatures at once. DNA reporters released into the urine are detected using CRISPR nucleases via hybridization with CRISPR RNAs, which in turn produce a fluorescent or colorimetric signal upon enzyme activation. In this protocol, DNA-barcoded, activity-based nanosensors are constructed and their application is exemplified in a preclinical mouse model of metastatic colorectal cancer. This system is highly modifiable according to disease biology and generates multiple disease signals simultaneously, affording a comprehensive understanding of the disease characteristics through a minimally invasive process requiring only nanosensor administration, urine collection, and a paper test which enables point-of-care diagnostics.

Autor em destaque: Ferramentas moleculares de engenharia para detecção e imagem de doenças

This protocol describes a CRISPR-Cas-mediated, multianalyte synthetic urine biomarker test that enables point-of-care cancer diagnostics through the ex vivo analysis of tumor-associated protease activities.

Análise integridade do DNA de células-Free em amostras de urina

Resumo

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Capítulos neste vídeo

Reação em Cadeia da Polimerase Digital de Gota Única para Detecção Abrangente e Simultânea de Mutações em Regiões de Hotspot

Avaliação do Risco e Prevalência de Câncer Colorretal por Detecção de Integridade do DNA das fezes

Deteção e monitoração do ADN de circulação associado do tumor em Biofluids pacientes

Detecção de DNA livre de células em amostras de plasma de sangue de pacientes com câncer

Um protocolo pré-analítico de biópsia líquida padronizada para aplicações de DNA sem circulação a jusante

Ensaio de Glicosylase Uracil-DNA por Desorção a Laser Assistida por Matriz/Análise de Espectrometria de Massa

Quantificação de três lesões de DNA por espectrometria de massas e avaliação de seus níveis em tecidos de camundongos expostos a material particulado fino ambiente

Teste de Biomarcador Sintético de Urina Multianalito Mediado por CRISPR-Cas para Diagnóstico Portátil

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Teste de Biomarcador Sintético de Urina Multianalito Mediado por CRISPR-Cas para Diagnóstico Portátil