Der endolymphatische Sack ist für die normale Entwicklung des Innenohrs erforderlich. Da es in situ für strukturelle, physiologische und molekulare Studien nicht zugänglich ist, ist seine Zerlegung aus Tiermodellen, insbesondere Mausmodellen, unerlässlich. Die Dissektion und Präparation des endolymphatischen Sacks ist aufgrund seiner dünnen, zarten Epithelstruktur und seiner Nähe und Adhärenz an benachbarten Geweben äußerst schwierig.
Unser Ansatz erleichtert die Visualisierung und Identifizierung eines Sacks und seine Trennung von angrenzenden Geweben. Krankheiten und Störungen, die die normale Funktion des endolymphatischen Sacks beeinträchtigen, können zum Verlust des Gehörs und des Gleichgewichts führen. Unsere Technik ist unerlässlich, um die zellulären, molekularen und physiologischen Prozesse aufzuklären, die den Funktionen des endolymphatischen Sacks zugrunde liegen.
Das Verfahren wird von Hyun Jae Lee, einer Postdoktorandin aus meinem Labor, demonstriert. Beginnen Sie mit dem Anordnen der Innenohrpräparation in einer 35 Millimeter großen Gewebekulturschale, die PBS enthält, mit der Wurzel des achten Hirnnervs nach oben. Halten Sie das Gewebe mit einer Pinzette Nr. 4 an der Cochlea und identifizieren Sie das vestibuläre Aquädukt, die vorderen und hinteren Bogengänge, den Crus communis und den Sinus sigmoidus.
Verwenden Sie dann eine 27-Gauge-Nadel, die auf einer Ein-Milliliter-Spritze montiert ist, um die Dura mater und das vestibuläre Aquädukt sowie das darunter liegende Bindegewebe, das den endolymphatischen Sack umgibt, zu schneiden. Nachdem Sie einen Schnitt in das Bindegewebe lateral des endolymphatischen Sacks gemacht haben, verwenden Sie eine Pinzette, um das Bindegewebe zu halten und es zu schälen, indem Sie es vom Schläfenbein wegziehen. Entfernen Sie vorsichtig alle verbleibenden Ablagerungen und trennen Sie das Epithel des endolymphatischen Sacks vom umgebenden Gewebe.
Für die Dissektion des geöffneten endolymphatischen Sacks halten Sie den Stielteil des Präparats, um den Querschnitt des Lumens zu beobachten. Führen Sie dann eine 27-Gauge-Nadel in das Lumen ein und bewegen Sie sie, um den endolymphatischen Sack in zwei Blätter zu schneiden. Halten Sie den Rand jedes blattartigen Gewebes mit einer Pinzette fest und trennen Sie sie voneinander.
In der repräsentativen Analyse wurde ein mittelsagittaler Schnitt des Schädels dieser Mäuse vor und nach der halben Hirnentfernung mit tdTomato-Fluoreszenz sichtbar gemacht. Der endolymphatische Sack war auch ohne Dissektion gut sichtbar. Es wurden Innenohren von Mäusen am embryonalen Tag 16.6 sowie am postnatalen Tag 5 und 30 isoliert.
Die endolymphatischen Säcke wurden unter höherer Vergrößerung beobachtet. Bei P30-Mäusen ist der endolymphatische Gang aufgrund seiner Verkapselung im Knochen schwer zu isolieren. Die Immunhistochemie intakter endolymphatischer Säcke aus E16.5 und P5 wurde mit Anti-SLC26A4-Antikörper- und Phalloidin-Markierung untersucht.
Phalloidin wurde verwendet, um den endolymphatischen Sack und das ihn umgebende Bindegewebe hervorzuheben. Bilder mit hoher Vergrößerung des geöffneten endolymphatischen Sackepithels bei P5 zeigen, dass das grün markierte SLC26A4 in der apikalen Region einer Untergruppe von Zellen lokalisiert ist. Das Wichtigste, woran Sie denken sollten, wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist, sehr sanft zu sein, um eine Beschädigung des endolymphatischen Sacks zu vermeiden.
Ein fixiertes endolymphatisches Sackgewebe, das mit diesem Ansatz isoliert wurde, kann für die In-situ-Hybridisierung, den RNA-Scope und die Immunhistochemie verwendet werden. Lebendes Gewebe kann verwendet werden, um RNA für die Transkriptomanalyse und für die Physiologie vorzubereiten. Dieser Ansatz wurde verwendet, um das Transkriptom des endolymphatischen Sacks zu untersuchen, entweder als Ganzes oder in Einzelzell-RNA-Seq-Analysen, um zur Charakterisierung seiner verschiedenen Zelltypen beizutragen.
