Diese Arbeit wurde uns freundlicherweise vom Wellcome Trust, der Biotechnologie und Biologische Wissenschaften Research Council und der Irwin Joffe Memorial Fellowship finanziert.

Ethik Aussage: Alle Tier Arbeit mit der Lizenz und Genehmigung des Vereinigten Königreichs Home Office durchgeführt wurde. Menschliche Teilnahme an dieser Forschung wurde von der Gemeinsamen UCL / UCLH Ausschüsse für die Ethik der Human Research genehmigt. Alle Teilnehmer zur Verfügung gestellt informierte Zustimmung. 1. Herstellung von C. albicans <ol><li> Wachsen Sie einen Candida - Disc (siehe Materialliste) auf einer YPD - Agar - Platte gemäß der Anweisungen des Herstellers. Wählen Sie eine Kolonie, und fügen Sie 15 ml YPD-Brühe. Inkubieren es in einem Schüttelinkubator bei 30 ° C und 200 Umdrehungen pro Minute , bis die Brühe trüb ist ( in der Regel ca. 2 Tage, oder bis zu einer Konzentration von etwa mehr als 1 x 10 9 / ml). </li><li> Drehte das Candida Medium nach unten und Resuspendieren in 50 ml phosphatgepufferter Salzlösung (PBS). Zentrifuge bei 3.000 xg für 10 min. Zweimal wiederholen Sie diesen Schritt. </li><li> Das Röhrchen 50 ml PBS / Candida - Medium in einem Wasserbad enthält , vorerwärmt auf 60 ° C , so dass das gesamte Rohr s istfür 1 h ubmerged. <ol><li> Um zu bestätigen , dass die Candida sind durch Hitze abgetötete, Streifen eine Probe auf eine YPD - Agar - Platte und Inkubation über Nacht bei 30 ° C. Stellen Sie die Hitze abgetöteten (HK) Candida - Konzentration auf 5-9 x 10 8 / ml, in Abhängigkeit von Candida - Wachstum, und es in 1 ml Aliquots in einem -20 ° C - Gefrierschrank. HINWEIS: Alle Zellzahlen in diesem Protokoll wurden unter Verwendung eines automatisierten Zellzähler ausgeführt. </li></ol></li></ol> 2. S-1 Kopplung an Hitze abgetötete (HK) Candida <ol><li> Bereiten eines Aliquots carboxy-S-1-succinimidylester (50 ug), indem sie in 100 &amp; mgr; l von hochwertigen Dimethylsulfoxid (DMSO) verdünnt. Vortex gut zu mischen. </li><li> Herstellung von 1 ml 1 x 10 8 HK Candida in 0,1 M Natriumbicarbonat (pH 8,3) in einem 15 ml Röhrchen. </li><li> Füge 100 &amp; mgr; l carboxy-S-1 ein Tropfen zu einer Zeit , zu der HK Candida , während bei etwa 2000 Umdrehungen pro Minute auf einem Vortex - Mischen (mittlere bis hohen Drehzahl). Wickeln Sie Aluminium foil um das Rohr und sie auf einer Walze bei Raumtemperatur für 1 h. </li><li> Waschen Sie die HK Candida- S-1 (HKC-S-1) dreimal durch Zentrifugation bei 2.250 xg für 10 min jeweils. Für die ersten zwei Waschungen, das Pellet in 15 ml 0,1 M Natriumbicarbonat (pH 8,3). Nach dem dritten Waschen, Resuspendieren in 1 ml balancierter Salzlösung (BSS) -Puffer (siehe Tabelle 1). </li><li> Übertragen der HKC-S-1-Suspension in Röhrchen in 100 ul Aliquots und lagern Sie sie bei -20 ° C. HINWEIS: Die Verwendung Rohre mit geringem Oberflächenmaterial zu binden, wenn möglich, als HKC-S-1-Partikel an die Wand des normalen Zentrifugenröhrchens kleben können. </li><li> Opsonisieren HKC-S-1 <ol><li> Für menschliche Neutrophile, 100 &amp; mgr; l Human-IgG-Serum zu 100 ul aufgetauten HKC-S-1. </li><li> Maus für Neutrophile, werden 50 ul normalem Mausserum und 50 &amp; mgr; l Maus - Candida - Immunserum (erzeugt aus C57B6 - Mäusen mit HK Candida injiziert) 5 bis 100 &amp; mgr; lder HKC-S-1. </li><li> Mischen Sie es auf einem hitzeSchüttler bei 37 ° C und 1100 rpm für 60-90 min, und dann auf einer 4 &amp; deg; C für 2 h Walze. </li><li> Wasche dreimal in BSS-Puffer durch Zentrifugation bei 17.200 xg für jeweils 1 min. Resuspendieren in 100 ul Puffer BSS. </li></ol></li></ol> 3. Isolierung von Neutrophilen <ol><li> Für menschliche Neutrophilen des peripheren Bluts, nehmen 15 ml Blut durch Venenpunktur von einem gesunden Spender und legen sie in eine 20 ml Spritze 90 ul von 1.000 IU / ml Heparin-Natrium-Lösung (60 ul Heparin / 10 ml Blut) enthält. </li><li> Mit Hilfe einer Pipettenspitze, injizieren 1,5 ml 10% Dextran-Lösung in die Spritze. Kehren Sie es sanft 3-mal und lassen Sie es aufrecht auf der Bank stehen. </li><li> 30-60 min warten, bis das Blut grob in zwei Hälften geteilt ist, mit einer oberen buffy coat-Schicht, die strohfarbene und eine untere Schicht enthält, Erythrozyten. </li><li> Vorsichtig schiebt die oberste Schicht durch eine Nadel oder es mit einer Pipettenspitze entfernen. Legen Sie es ina 15 ml-Röhrchen. Vermeiden Sie die rote Schicht herausnehmen. Unter Verwendung einer 5 ml-Pipette, fügen 3-4 ml Dichtegradientenmedium (siehe Materialliste) an den Boden des Röhrchens unter der buffy coat-Schicht zwei verschiedene Schichten zu erhalten. Zentrifuge bei 913 × g für 10 min. HINWEIS: Bei Verwendung von Neutrophilen - Maus (Referenz 17 für Maus Neutrophilen Isolation sehen), verwendet , um die Zellsuspension , die anstatt aus dem Knochenmark ausgespült wurde. </li><li> Gießen Sie den Überstand ab, hinter einem roten Pellet zu verlassen. Sanft Wirbel um das Pellet zu stören. 7 ml destilliertes, autoklaviert H 2 O zu dem Pellet und Invertzucker für 20 s um das Pellet zu resuspendieren. In 7 ml 2x Kochsalzlösung und mehrmals umschwenken zu mischen, um die verbleibenden roten Blutkörperchen lysieren. </li><li> Zentrifuge bei 300 × g für 5 min. Gießen Sie den Überstand und das Pellet in BSS - Puffer auf etwa 4 x 10 6 / ml ab. HINWEIS: Für eine optimale Mikroskopie der Zellen, halten die Zellsuspensionskonzentration zwischen 1,5-6 x 10 6 </sup&gt; / mL. </li></ol> 4. Herstellung von Folien <ol><li> ein 8-Well-Platte-Mikroskopie (siehe Materialliste) mit 200 &amp; mgr; l Poly-L-Lysin (0,01% ige Lösung) in jeder Vertiefung für 40-60 min bei Raumtemperatur vorge behandeln. </li><li> Entfernen des Poly-L-Lysin (kann wiederverwendet werden) und wäscht die Vertiefungen zweimal mit 200 ul destilliertem H 2 O. </li><li> In 200 ul Zellsuspension, hergestellt in Schritt 3.6 in jeder Vertiefung. Inkubieren bei Raumtemperatur für 30-60 min. </li><li> Bereiten einen Aliquots von 5- (und-6) -Carboxy S-1 Acetoxymethyl (S-1-AM) ester (50 &amp; mgr; g) durch Zugabe von 100 &amp; mgr; l von hochwertigen DMSO zu einem Röhrchen. Vortex zu mischen. Wenn nicht in Gebrauch, bei -20 ° C. </li><li> In einem Röhrchen, fügen Sie 1,7 ml BSS-Puffer und 20 ul S-1-AM. Vortex zu mischen. </li><li> Waschen Sie die Vertiefungen zweimal mit 200 &amp; mgr; l BSS-Puffer, und dann den Puffer mit der S-1-AM-Lösung ersetzen. Achten Sie darauf, um die Monoschicht von Zellen nicht stört zum Boden des Bohrlochs angebracht durch vorsichtiges Pipettierendie Mauern der Mulden. Inkubieren bei Raumtemperatur mindestens 25 min. </li><li> Waschen Sie die Vertiefungen zweimal mit 200 &amp; mgr; l BSS-Puffer. einen „Master-Mix“ des entsprechenden Medikaments in BSS-Puffer, um einen Inhibitor zu testen, bilden. Waschen Sie die Vertiefungen zweimal in der Inhibitorlösung. HINWEIS: Stellen Sie sicher , dass die gleiche Menge an Arzneimittel Fahrzeug (zB DMSO oder Ethanol) in der Steuerung zu verwenden und wurde für den Inhibitor verwendet. Wenn die Wirkung von Zinkchlorid zu testen, verwendet BSS - Puffer fehlt KH 2 PO 4 (die HEPES - Lösung kann die Puffer allein), wie Zink mit Phosphat ausfällt. </li><li> Beschallen die opsonisierten HKC-S-1 (Abschnitt 6.2) für etwa 3 s bei 5 &amp; mgr; m Amplitude. In 10 &amp; mgr; l zu jeder Vertiefung. Inkubiere die Platte bei 37 ° C für 15-20 min Phagozytose zu ermöglichen, die Zellen bereit, was für Schnappschüsse von Phagozytose abgebildet werden soll. </li></ol> 5. konfokale Mikroskopie <ol><li> ein konfokales Mikroskop, Einstellen der Laserwellenlänge so than den Zellen angeregt bei 555 nm und die Emission von zwei Kanälen festgestellt wird, oder Detektoren: 560-600 nm und über 600 nm. HINWEIS: Spezielle Mikroskopparameter für jedes Mikroskop unterscheiden und müssen vom Forscher optimiert werden. </li><li> Sehen Sie sich die Zellen ein 63X-Objektiv mit Öl. Verwenden Sie eine Kachel-Scan-Bild auf die kontinuierliche Einstellung der Mitte Kachel anzuzeigen. Mit Hilfe der Fluoreszenzintensität und der Verstärkung der Detektorkanäle, stellen den Fokus und die Intensität des Lasers und die Verstärkung der beiden Kanäle um das Bild zu optimieren. </li><li> Teilen Sie die Bild der Einstellungen unter Verwendung beiden Kanäle zu sehen; überprüfen, dass es keine Sättigung der Fluoreszenzintensität im Zytoplasma oder Vakuolen ist. Sättigung erscheint als rote Punkte. Reduzieren Sie die Laserintensität so, dass es eine minimale Anzahl von roten Punkten, aber die Zellen und phagosomes sind hell genug, um klar zu sehen. </li><li> Wenn Sie zufrieden sind, klicken Sie auf „Experiment starten.“ A 9-tile Abtastbild erzeugt. Speichern Sie das Bild als eine komplexe Datei empfohlen vondie Software, die ein zusammengesetztes Bild der beiden Kanäle (nicht JPEG- oder TIFF) enthält. </li></ol> 6. Kalibrierung Experimente <ol><li> Konstruieren Sie die pH - Standardkurve mit Candida allein. <ol><li> Bereiten Sie die Puffer von pH 3,0 bis 13,0, gemäß Tabelle 1. </li><li> Nehmen Sie eine Teilmenge (100 &amp; mgr; l) von HKC-S-1. Spin es für 1 min bei 17.200 x g nach unten. Resuspendieren in 500 &amp; mgr; l der zugeordneten Puffer. </li><li> Ausgehend von dem niedrigsten pH-Bereich, fügen die Suspension auf eine vorbehandelte gut (aus Schritt 4.2). Platzieren der Schieber auf dem konfokalen Mikroskop auf einem Heiztisch auf 37 ° C. </li><li> Notieren Sie sich die Fluoreszenz jedes min für 10 min. Wiederholen Sie dies für jeden Puffer. </li></ol></li><li> Saponin Standardkurve. <ol><li> Isolieren 1 x 10 7 humane Neutrophilen 5 und resuspendieren sie in 1 ml des niedrigsten pH - Puffers. </li><li> Folgen Sie die in Abschnitt 4 beschriebenen Verfahren zur Messung phagosomal pH-Wert in Neutrophilen. </li><li> Nach der Inkubation mit der Suspension Candida für 20 min, Zugabe von 0,3% Saponin (15 &amp; mgr; l von 10% Stamm einen vorbehandelte gut (aus Schritt 4.2)) an die Schale, und dann 20 min bei 37 ° C inkubieren. Nehmen Sie ein Bild jede Minute für 10 Minuten. Wiederholen Sie dies für jeden Puffer. </li></ol></li><li> Cytosolischen pH Standardkurven der hohen K + / Nigericin - Technik unter Verwendung von 5, 18, 19. <ol><li> Bilden Sie die beschriebenen Puffer in Tabelle 1 von pH 4,0 bis 13,0. </li><li> Führen Sie die Schritte 4,1-4,7, nur Neutrophile in den vorbehandelten Vertiefungen verlassen - jede Vertiefung einen anderen Puffer enthalten. Fügen Sie die Folie in die 37 ° C erhitzt, Phase und erfassen die Fluoreszenz jedes min für 10 min. </li><li> Anmerkung: Es kann einige Zeit dauern, bis der cytosolischen pH mit der externen Lösung zu stabilisieren, aber nach diesem Punkt ist der S-1-Verhältnis Wert wirdKonstante. Messung der extrazellulären HKC-S-1 in jedem Experiment kann als Kontrolle dienen, um zu überprüfen, dass alle hinzugefügt Inhibitoren interferieren nicht mit der S-1 emittierte Fluoreszenz oder den Puffer des pH beeinflussen. </li></ol></li></ol> 7. Bildanalyse HINWEIS: Hier Anweisungen für die Bildanalyse (Quantifizierung der Fluoreszenz) mit der ImageJ freien Software zur Verfügung gestellt wird. Die Verwendung von ImageJ wird empfohlen. <ol><li> Herunterladen und Installieren von ImageJ Version&gt; 1.46r gemäß der Entwickler-Anweisungen (https://imagej.nih.gov/ij/). Installieren Sie die Zusatz-Code-Datei mit diesem Protokoll beigefügt namens „phagosomalen Messung.“ </li><li> Bild öffnen J und laden Sie die Bilddatei für die Analyse auf der Symbolleiste ausgewählt. Um die beiden Kanäle zu kombinieren, verwenden Sie Bild&gt; Farbe&gt; Composite-Machen. </li><li> Rechtsklick auf eine Datei auszuwählen, in dem Ergebnis zu speichern. </li><li> Klicken Sie auf das Zeilenwerkzeug in der Werkzeugleiste und doppelklicken Sie auf die Breite erhöhen # &amp;34; 2 „ist. </li><li> Zeichnen Sie eine Linie über die Breite eines phagosome, und dann mit der rechten Maustaste auf „Maß pH“. Die mittlere Intensität der zwei Kanäle erfasst wird, und ihr Verhältnis wird automatisch durch die Codedatei in ImageJ berechnet. </li><li> Nach den Messungen Fertigstellung der rechten Maustaste wählen „Datei speichern“. </li><li> Um den phagosome Bereich zu messen, verwenden Sie das vierte Symbol entlang der Werkzeugleiste freihändig um den Bereich zu ziehen. Rechtsklick auf die Option „Messfeld.“ HINWEIS: Die Ergebnisse werden gespeichert und eine Protokolldatei im Verzeichnis ausgewählt erzeugt. Die Ergebnisse können unter Verwendung von Tabellenkalkulationsprogramm, R oder eine gleichwertige Software verarbeitet. Die Beziehung zwischen dem Fluoreszenzverhältnis auf pH beträgt ca. sigmoidal, und die Verhältniswerte von der ImageJ Analyse erzeugt wird, können eine verallgemeinerte logistische oder Sigmoidfunktion oder durch lineare oder kubische Spline-Interpolation auf pH umgewandelt werden. </li><li> Um Zytoplasma zu messen, eine Linie über das Zytoplasma ziehen und die rechte Maustaste auf „Maß pH“. </li></ol>

<ol>
	<li>Segal, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NADPH+oxidases+as+electrochemical+generators+to+produce+ion+fluxes+and+turgor+in+fungi,+plants+and+humans.">NADPH oxidases as electrochemical generators to produce ion fluxes and turgor in fungi, plants and humans.</a> Open Biol. 6 (5), 515-517 (2016).</li><li>Segal, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+neutrophils+kill+microbes.">How neutrophils kill microbes.</a> Annu Rev Immunol. 23, 197-223 (2005).</li><li>Cross, A. R., Segal, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+NADPH+oxidase+of+professional+phagocytes+-+Prototype+of+the+NOX+electron+transport+chain+systems.">The NADPH oxidase of professional phagocytes - Prototype of the NOX electron transport chain systems.</a> BBA Bioenergetics. 1657 (1), 1-22 (2004).</li><li>Demaurex, N., El Chemaly, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+roles+of+voltage-gated+proton+channels+in+leukocytes.">Physiological roles of voltage-gated proton channels in leukocytes.</a> J Physiol. 588 (23), 4659-4665 (2010).</li><li>Levine, A. P., Duchen, M. R., de Villiers, S., Rich, P. R., Segal, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alkalinity+of+neutrophil+phagocytic+vacuoles+is+modulated+by+HVCN1+and+has+consequences+for+myeloperoxidase+activity.">Alkalinity of neutrophil phagocytic vacuoles is modulated by HVCN1 and has consequences for myeloperoxidase activity.</a> PLoS One. 10 (4), 0125906 (2015).</li><li>Reeves, E. P., Lu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Killing+activity+of+neutrophils+is+mediated+through+activation+of+proteases+by+K++flux.">Killing activity of neutrophils is mediated through activation of proteases by K+ flux.</a> Nature. 416 (6878), 291-297 (2002).</li><li>Menegazzi, R., Busetto, S., Dri, P., Cramer, R., Patriarca, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chloride+ion+efflux+regulates+adherence,+spreading,+and+respiratory+burst+of+neutrophils+stimulated+by+tumor+necrosis+factor-alpha+(TNF)+on+biologic+surfaces.">Chloride ion efflux regulates adherence, spreading, and respiratory burst of neutrophils stimulated by tumor necrosis factor-alpha (TNF) on biologic surfaces.</a> J Cell Biol. 135 (2), 511-522 (1996).</li><li>Ohkuma, S., Poole, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+probe+measurement+of+the+intralysosomal+pH+in+living+cells+and+the+perturbation+of+pH+by+various+agents.">Fluorescence probe measurement of the intralysosomal pH in living cells and the perturbation of pH by various agents.</a> Cell Biol. 75 (7), 3327-3331 (1978).</li><li>Jankowski, A., Scott, C. C., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determinants+of+the+phagosomal+pH+in+neutrophils.">Determinants of the phagosomal pH in neutrophils.</a> J Biol Chem. 277 (8), 6059-6066 (2002).</li><li>Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+Indicators+of+Ion+Concentrations.">Fluorescent Indicators of Ion Concentrations.</a> Methods in Cell Biol. 30, 127-156 (1989).</li><li>Lavis, L. D., Rutkoski, T. J., Raines, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tuning+the+pK+a+of+Fluorescein+to+Optimize+Binding+Assays.">Tuning the pK a of Fluorescein to Optimize Binding Assays.</a> Anal Chem. 79 (17), 6775-6782 (2007).</li><li>Hurst, J. K., Albrich, J. M., Green, T. R., Rosen, H., Klebanoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myeloperoxidase-dependent+fluorescein+chlorination+by+stimulated+neutrophils.">Myeloperoxidase-dependent fluorescein chlorination by stimulated neutrophils.</a> J Biol Chem. 259 (8), 4812-4821 (1984).</li><li>Nunes, P., Guido, D., Demaurex, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+Phagosome+pH+by+Ratiometric+Fluorescence+Microscopy.">Measuring Phagosome pH by Ratiometric Fluorescence Microscopy.</a> J Vis Exp. (106), e53402 (2015).</li><li>Canton, J., Khezri, R., Glogauer, M., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contrasting+phagosome+pH+regulation+and+maturation+in+human+M1+and+M2+macrophages.">Contrasting phagosome pH regulation and maturation in human M1 and M2 macrophages.</a> Mol Biol Cell. 25 (21), 3330-3341 (2014).</li><li>Schlafer, S., Dige, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ratiometric+Imaging+of+Extracellular+pH+in+Dental+Biofilms.">Ratiometric Imaging of Extracellular pH in Dental Biofilms.</a> J Vis Exp. (109), e53622 (2016).</li><li>Buckler, K. J., Vaughan-Jones, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+a+new+pH-sensitive+fluoroprobe+(carboxy-SNARF-1)+for+intracellular+pH+measurement+in+small,+isolated+cells.">Application of a new pH-sensitive fluoroprobe (carboxy-SNARF-1) for intracellular pH measurement in small, isolated cells.</a> Pfl &#252;gers Archiv EJP. 417 (2), 234-239 (1990).</li><li>El Chemaly, A., Nunes, P., Jimaja, W., Castelbou, C., Demaurex, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hv1+proton+channels+differentially+regulate+the+pH+of+neutrophil+and+macrophage+phagosomes+by+sustaining+the+production+of+phagosomal+ROS+that+inhibit+the+delivery+of+vacuolar+ATPases.">Hv1 proton channels differentially regulate the pH of neutrophil and macrophage phagosomes by sustaining the production of phagosomal ROS that inhibit the delivery of vacuolar ATPases.</a> J Leuko Biol. 95 (5), 827-839 (2014).</li><li>Morgan, D., Capasso, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Voltage-gated+proton+channels+maintain+pH+in+human+neutrophils+during+phagocytosis.">Voltage-gated proton channels maintain pH in human neutrophils during phagocytosis.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 106 (42), 18022-18027 (2009).</li><li>Thomas, J. A., Buchsbaum, R. N., Zimniak, A., Racker, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+pH+measurements+in+Ehrlich+ascites+tumor+cells+utilizing+spectroscopic+probes+generated+in+situ.">Intracellular pH measurements in Ehrlich ascites tumor cells utilizing spectroscopic probes generated in situ.</a> Biochemistry. 18 (11), 2210-2218 (1979).</li><li>Levine, A. P., Segal, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+NADPH+Oxidase+and+Microbial+Killing+by+Neutrophils,+With+a+Particular+Emphasis+on+the+Proposed+Antimicrobial+Role+of+Myeloperoxidase+within+the+Phagocytic+Vacuole.">The NADPH Oxidase and Microbial Killing by Neutrophils, With a Particular Emphasis on the Proposed Antimicrobial Role of Myeloperoxidase within the Phagocytic Vacuole.</a> Microbiol Spectr. 4 (4), (2016).</li><li>Segal, A. W., Geisow, M., Garcia, R., Harper, A., Miller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+respiratory+burst+of+phagocytic+cells+is+associated+with+a+rise+in+vacuolar+pH.">The respiratory burst of phagocytic cells is associated with a rise in vacuolar pH.</a> Nature. 290 (5805), 406-409 (1981).</li><li>Hunter, R. C., Beveridge, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+a+pH-sensitive+fluoroprobe+(C-SNARF-4)+for+pH+microenvironment+analysis+in+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms.">Application of a pH-sensitive fluoroprobe (C-SNARF-4) for pH microenvironment analysis in Pseudomonas aeruginosa biofilms.</a> Appl Environ Microbiol. 71 (5), 2501-2510 (2005).</li><li>Van Erp, P. E. J., Jansen, M. J. J. M., De Jongh, G. J., Boezeman, J. B. M., Schalkwijk, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ratiometric+measurement+of+intracellular+pH+in+cultured+human+keratinocytes+using+carboxy-SNARF-1+and+flow+cytometry.">Ratiometric measurement of intracellular pH in cultured human keratinocytes using carboxy-SNARF-1 and flow cytometry.</a> Cytometry. 12 (2), 127-132 (1991).</li><li>Minamikawa, T., Takamatsu, T., Kashima, S., Fushiki, S., Fujita, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+calcium+imaging+with+ultraviolet+laser-+scanning+microscopy+and+indo-1.">Confocal calcium imaging with ultraviolet laser- scanning microscopy and indo-1.</a> Micron. 24 (6), 551-556 (1993).</li><li>Takahashi, A., Camacho, P., Lechleiter, J. D., Herman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+Intracellular+Calcium.">Measurement of Intracellular Calcium.</a> Physiol Rev. 79 (4), (1999).</li><li>Hillson, E. J., Dewitt, S., Hallett, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+methods+for+the+measurement+and+manipulation+of+cytosolic+free+calcium+in+neutrophils.">Optical methods for the measurement and manipulation of cytosolic free calcium in neutrophils.</a> Methods Mol Biol. 412, 125-137 (2007).</li><li>Bernardo, J., Long, H. J., Simons, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initial+cytoplasmic+and+phagosomal+consequences+of+human+neutrophil+exposure+to+Staphylococcus+epidermidis.">Initial cytoplasmic and phagosomal consequences of human neutrophil exposure to Staphylococcus epidermidis.</a> Cytometry Part A. 77 (3), 243-252 (2010).</li><li>Riazanski, V., Gabdoulkhakova, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRPC6+channel+translocation+into+phagosomal+membrane+augments+phagosomal+function.">TRPC6 channel translocation into phagosomal membrane augments phagosomal function.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 112 (47), 6486-6495 (2015).</li><li>Mart&#237;nez-Zaguil&#225;n, R., Mart&#237;nez, G. M., Lattanzio, F., Gillies, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+measurement+of+intracellular+pH+and+Ca2++using+the+fluorescence+of+SNARF-1+and+fura-2.">Simultaneous measurement of intracellular pH and Ca2+ using the fluorescence of SNARF-1 and fura-2.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 260 (2), (1991).</li></ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.

Sobald die entsprechenden Reagenzien, Mikroskop-Einstellungen und Kalibrierungsexperimente aufgebaut werden, ist dieses Verfahren relativ einfach durchzuführen. Die kritischen Schritte umfassen: Markieren des Candida mit S-1 , um sicherzustellen , dass es keine Überlastung des Farbstoffs ist, Kalibrieren, und das Bild wird analysiert. S-1 ist ein Reagenz , um mehr alkalischen pH - Umgebungen geeignet, die für Neutrophile 21 besonders wichtig ist , sondern beschränkt seine Verwendung in bestimmten Zelltypen. Weitere sauren Umgebungen, wie beispielsweise Makrophagen Phagosomen, SNARF-4 oder S-4, ist besser geeignet wegen seiner niedrigeren pKa 22. Darüber hinaus wird für genauere Ablesungen zytoplasmatische, ist es besser zu nutzen S-4, wie die Standardkurve für S-1 zeigt , dass die Fluoreszenz - Verhältnisse Plateau unterhalb pH 6 (Figur 3) beginnen. Andere Farbstoffe, wie beispielsweise 2&#39; , 7&#39;-Bis- (2-Carboxyethyl) -5- (und-6) -carboxyfluorescein (BCECF) oder pHrodo Red auch geeignet in einem cont sein kannext, die sauer sein soll. Doch die Zytoplasmafärbung ist immer noch notwendig für die korrekte Identifizierung der phagosomes enthält Candida. Ein wichtiges Merkmal eines phagosomalen pH-Indikator ist, dass es nicht irreversibel durch die reaktive phagosomalen Umgebung verändert wird. S-1 scheint die Neutrophilen Milieu resistent. Dies wird von Levine et al. 5 (siehe Ergänzungs Video 4 von Referenz 5) , welche die Phagozytose und nachfolgende Freisetzung eines S-1-markierter Candida Teilchen durch eine Hvcn1 demonstrieren - / - Neutrophilen. Wenn phagozytiert, schaltet sich das Teilchen von gelb / orange bis rot (neutralen bis alkalischen pH-Wert), jedoch, wenn das Teilchen durch die Neutrophilen freigesetzt wird, kehrt er in seine ursprüngliche Farbe. Es ist wichtig, einige der Einschränkungen bei der Verwendung von S-1 verbunden zu erwähnen. Die Tatsache, daß dieser Farbstoff beiden Emissionsspektren ermöglicht ratiometrisch meas haturement ist ein Vorteil, aber eine spezielle Ausrüstung benötigt wird, um Bilder zu erfassen; das Mikroskop für die Experimente verwendet wird, muß zwei Bilder gleichzeitig aufnehmen kann, oder mit einer unwesentlichen Zeitverzögerung. Die Autoren gehen davon aus, dass die Forscher dieses Protokoll versucht haben Erfahrung konfokale Mikroskopie, oder haben Zugriff auf eine ausgebildete Fachkraft. Wir können nicht alle spezifischen Mikroskop Parameter auflisten, wie sie für jedes Mikroskop unterscheiden und müssen vom Forscher optimiert werden. Der Acetoxymethylester konjugiert an S-1, dass der Farbstoff in das Zytoplasma diffundieren können durch unspezifische Esterasen im Zytoplasma der Zelle abgebaut das fluoreszierende Molekül zu bilden. Esterasen, wie alkalische Phosphatase, ist in Humanserum und fötales Rinderserum, die verwendet werden, um Zellkulturmedien zu ergänzen. Dementsprechend, in dem das Medium die Zellen, die mit S-1-AM (Abschnitt 4.5) enthalten darf nicht Serum geladen werden. Dies kann eine Herausforderung sein, wenn Zellen verwendet, die eine nährstoff ric erfordernh Medium zu erhalten, sie als die ausgeglichene Salzlösung in diesem Protokoll verwendet. Ähnlich können andere fluoreszierende Mediumkomponenten, wie Phenolrot, kann mit S-1-Messungen stören. Die Fehlerbalken in Figur 3 zeigen , dass es bei jedem pH gewissen Variation im Verhältnis von Messungen ist. Eine geeignete Anzahl von Wiederholungen jeden Experiment (mindestens n = 3) und so viele Einzelmessungen in jedem einzelnen Experiment werden die Inter-vakuolären Variation zu überwinden benötigt. Es ist daher ratsam , den pH - Wert von mindestens 100 Phagosomen für jede Bedingung und ebenso viele phagosomalen Bereichen zu messen , die nur eine Candida zu enthalten scheinen. Die Phagosomen zur Quantifizierung zu mess sollten diejenigen sein , die eine Candida Teilchen vollständig verschlungen haben (dh jene , vollständig von Zytoplasma umgeben). Zur Milderung gegen unbeabsichtigte Verzerrungen bei der Auswahl von Zellen / phagosomes zur Quantifizierung sollten alle Analysen werden durchgeführt, währendblind für die experimentellen Bedingungen. Hier beschreiben wir die Isolierung von Neutrophilen durch Dextransedimentation von Vollblut, gefolgt von einer Zentrifugation der Plasmaschicht durch eine Dichtegradienten. Wir verwenden diese Technik, da sie schnell und effizient eine reine (&gt; 95%) Population von Neutrophilen produziert, obwohl es auch anderen Methoden zur Verfügung, wie zum Beispiel Vollblut Zentrifugation durch andere Dichtegradienten Formeln oder negative Selektion von Neutrophilen mit einem speziellen Kits mit Antikörpern oder magnetischen Perlen. Jedoch kann diese für die meisten Gruppen unerschwinglich teuer sein, die Neutrophilen routinemäßig zu isolieren. Außerdem verwenden wir das Antikoagulans Heparin in dem Blutsammelröhrchen, während andere Forscher mehr daran gewöhnt sein können Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) oder Säure-Citrat-Natrium (ACD) zu verwenden. Da es viele verschiedene Methoden zur Auswahl, ist es auf die persönliche Präferenz des Forschers auf. Außerdem,bei der Isolierung und Manipulation von Neutrophilen sie sollten mit Vorsicht behandelt werden, um übermäßige Aktivierung zu vermeiden. Vorsorgliche Schritte umfassen: nur Plastikgeschirr verwendet wird, kein Glas; Filter-Sterilisieren alle Puffer jegliche verunreinigende Endotoxin zu entfernen; beim Spinnen Neutrophilen sicherstellen, dass die Zentrifuge gut ausgewogen ist übermäßige Vibrationen zu vermeiden; so weit wie möglich begrenzt die Zeit Neutrophilen bleiben in einem Pellet nach Zentrifugation; Neutrophile nicht in Lösung von mehr als 5 x 10 6 / ml beizubehalten; und führt das Experiment so bald wie möglich nach der Isolierung. Dieses Verfahren kann angepasst werden, um Veränderungen im pH-Wert und phagosomalen Bereich über die Zeit zu messen, indem ein beheiztes Bühnenbild bis 37 ° C auf dem Mikroskop und Schnappschüsse einmal all 30-60 s von der gleichen Position einnehmen, da für die Kalibrierungsschritte beschrieben. Es könnte theoretisch auch für höhere Durchsatzexperimente angepasst werden, wie zum Beispiel in 96-Well-Platten und für die Durchflusszytometrie Experimente, in denen S-1 kannals pH - Indikator 23 verwendet werden. Bei diesen Einstellungen wird die Betonung der individuellen Zellaktivität durch eine globale Wirkung auf die Zellpopulation ersetzt. Dieses Verfahren zielt darauf ab, einen relativ einfachen Versuchsaufbau zur Verfügung zu stellen, auf denen einzelne Forscher anpassen können ihr Interessengebiet gerecht zu werden. Forscher wollen können Neutrophilen phagosomalen pH und Umgebung zu erkunden, während auch die Bewegung der anderen Ionen zu messen, beispielsweise die intrazelluläre Calciumkonzentration. Es gibt mehrere fluoreszierende Indikatoren Ca 2+ leicht zugänglich für die konfokale Mikroskopie, wie beispielsweise Indo-1, die auch Doppelemissionsspektren bei 400 und 475 nm 24 hat. Diese Emissionswellenlängen nicht überlappen, mit S-1-Emissionsspektren, aber die Anregungswellenlänge ist im ultravioletten (UV) Ende des Spektrums, die Zellen schädlich sein kann, und ein UV-Laser ist auf allen Mikroskopen nicht alltäglich. Eine umfassende Überprüfung der verschiedenen Indikatoren zuMessung der intrazellulären Kalziumfluss wird von Takahashi et al abgedeckt. 25 und Hillson et al. 26. Schließlich gibt es noch andere Methoden zur Verfügung phagosomalen pH unter Verwendung verschiedene Fluoreszenzfarbstoffe wie Nunes et al zu messen. 27, 28 haben 13 sowie andere Gruppen demonstriert. Andere Forscher haben ebenfalls verwendet S-1 cytosolischen pH 29 oder pH 14 phagosomalen zu messen. Jedoch ist dieses Protokoll einzigartiges gleichzeitig den pH - Wertes von sowohl Cytosol und phagosome bei der Messung, die die Möglichkeit bietet , Änderungen in phagosomalen Querschnittsfläche zu beobachten , und zwischen Wildtyp- und Hvcn1 zu unterscheiden - / - Maus Neutrophilen und menschliche Neutrophilen mit und ohne eine Arbeits NADPH-Oxidase.

Die Neutrophilen sind die häufigste angeborenen Immunzellen im Körper. Seine Hauptfunktion besteht darin , den Blutstrom patrouillieren und Verschlingen und die Fremdpartikel verdauen , dass es in einem Verfahren , wie Phagozytose 1, 2 bekannt , die auftreten können. Die Partikel werden in einem intrazellulären Kompartiment Phagosom genannt abgebaut. Die Aktivierung der neutrophilen NADPH-Oxidase, die Isoform NOX2, initiiert eine Kaskade biochemischer Reaktionen, die in dem Tod des Pathogens gipfelt. NOX2 Proteinuntereinheiten fortfahren in der phagosomalen Membran 3 eine Elektronentransportkette Komplex zu bilden. Einmal aktiviert, es transportiert Elektronen von NADPH durch die Membran zu molekularem Sauerstoff im Innern des phagosome, Superoxidanionen Herstellung und weiteren reaktive Sauerstoffspezies. Dies wird als respiratory burst bekannt, und es wird angenommen , dass für eine effiziente mikrobielle Tötung und Verdauung 2 wesentlich zu sein </sup&gt;. Allerdings ist diese exklusive Bewegung der negativen Ladung durch die Membran würde bald NOX2 inaktivieren, wenn es nicht durch positive Ladung kompensiert bewegen sich in und / oder negative Ladung aus dem phagosome bewegen. Es wurde bekannt, dass die Mehrheit der Ladungsausgleich in den Neutrophilen wird HVCN1 4 durch den Protonenkanal durchgeführt wird , 5. Dieser Kanal ermöglicht die passive Bewegung von Protonen nach unten ihren elektrochemischen Gradienten aus dem Cytosol in die phagosome. Protonenkonzentration wird durch pH reflektiert, so dass für ein gegebenes Niveau der Oxidase-Aktivität kann der pH-Wert im phagosome Messung liefern Informationen über die relative Beteiligung von protonischen und nicht-protonischen Wege in den Ladungsausgleich. Die humanen neutrophilen phagosome hat einen alkalischen pH - Wert von etwa 8,5 für 20 bis 30 Minuten nach der Phagozytose 5. Dies impliziert die Existenz von zusätzlichen Nicht-Protonen-Ionenkanälen in NOXLadungskompensation 2-induzierten, als Fusion und Freisetzung des Inhalts der sauren Granulat und alleinige Kompensation durch HVCN1 würde ein saures Milieu, im Gegensatz zu dem beobachteten aufrechtzuerhalten. Die Bewegung von Ionen Dieser negative Ladung zu kompensieren, kann auch Änderungen in phagosome Größe über Osmose ausüben. Diese können Ionen anwesend seine in den Neutrophilen bei hohen physiologischen Konzentrationen: Kaliumionen wurden in die phagosome 6 gezeigt zu bewegen, und Chlorid - Ionen - Bewegung ist ein weiterer Kandidat für die Neutrophilen - Funktion wichtig 7. Die Regulierung des pH - Wertes in dem phagosome ist lebenswichtig für die antimikrobielle Protease - Aktivität 5. Myeloperoxidase (MPO) erscheint bei pH 6 optimale Aktivität zu haben, während für Kathepsin G und Elastase, die optimalen Niveaus sind pH 7-9 und pH 8-10 bzw. 5. Daher kann vorübergehende Veränderung in phagosomalen pH-Aktivitäts Nischen sorgen für verschiedene Enzyme Spaßction. Zu verstehen, wie pH-Wert in Neutrophilen mikrobiellen Tötung beteiligt ist nützliche Informationen für das Design neuer Neutrophilen-Vermehrung mikrobielle Mittel bereitstellen. Die Neutrophilen phagosome ist ein hochreaktives Umgebung. Dies macht es schwierig, pH-Wert genau zu beurteilen, weil Farbstoffe können leicht oxidiert werden, um technische Artefakte führt. Historisch hat Fluoresceinisothiocyanat (FITC) der Farbstoff der Wahl 8 intrazellulären pH zu messen, 9. Es gibt jedoch einige Nachteile für die Verwendung bei der Messung von Neutrophilen phagosomalen pH-Wert. Es hat einen pKa von 6,4 10, was bedeutet , dass es nur genau verwendet werden kann , um pH - Werte von 5 bis 7,5 8 beurteilen zu können , wie es bei pH &lt;8 11 sättigt. Da die Neutrophilen phagosomalen pH viel mehr alkalisch 5 werden kann, kann FITC nicht das gesamte Spektrum möglicher pH - Änderungen erfassen. Eine weitere signifikippe Problem mit FITC im Rahmen von Neutrophilen ist , dass es angenommen wird , von MPO 12 wurde gebleicht. Die MPO - Inhibitor, Natriumazid, verwendet werden , 13 zu begrenzen , Photobleich, aber es hat sich gezeigt , dass Natriumazid direkt die phagosomalen pH in einem MPO-unabhängigen Weise senkt und ist somit ungeeignet für die Verwendung in solchen Assays 5. Im Vergleich zu anderen intrazellulären Farbstoffen S-1 hat einen relativ hohen pKa - Wert von 7,5 10. In sauren Bedingungen ist das Molekül protonierten und erzeugt ein Emissionssignal zwischen 560 und 600 nm, wenn sie bei 488 nm oder darüber angeregt werden. Wenn das Molekül in stärker alkalischen Bedingungen deprotoniert wird, ist die Emissionswellenlänge über 600 nm. Ein Verhältnis der Fluoreszenzintensitäten bei den beiden Wellenlängen zeigt die Emissionsschicht, die mehr ist zuverlässiger als einzelne Fluoreszenzmessungen ist, wie es von Fluorophor-Konzentration und Zellstruktur nicht betroffen ist. S-1 kann an antigenem Material konjugiert werden, wie beispielsweise Zymosan 14, obwohl Hitze abgetöteten (HK) Candida albicans ist bevorzugt, da die größere Oberfläche eines konsistentere Fluoreszenzmesswert ergibt. Wir haben auch verwendet , eine Modifikation dieses Verfahren zeitliche Veränderungen in pH (Abbildung 3) 5 zu studieren. Dieses Verfahren zur Messung des cytosolischen pH - Wertes kann leicht auf andere Zelltypen angewandt werden, wie an anderer Stelle beschrieben 15, 16, und Zellen , die mit alkalischen Phagosomen 14.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="851">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:275px;">Candida albicans ATCC 10231 Vitroids&#160; 80 CFU</td>
			<td style="width:99px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">RQC14003-10EA</td>
			<td style="width:360px;">Place directly on a spread agar plate according to the manufacturer&#39;s instructions</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:275px;">YPD broth</td>
			<td style="width:99px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">Y1375</td>
			<td style="width:360px;">Follow manufacturer&#39;s instructions, various providers exist</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:275px;">Dextran Clinical grade MW = 200,000-300,000</td>
			<td style="width:99px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:119px;">2101514</td>
			<td style="width:360px;">Use gloves&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:275px;">Heparin Sodium solution for infusion (preservative free), 1,000IU/ml&#160;</td>
			<td style="width:99px;">Fannin, Wockhardt UK Ltd</td>
			<td style="width:119px;">FP1077</td>
			<td style="width:360px;">We purchased from UCH inpatient pharmacy</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:275px;">SNARF-1 Carboxylic Acid, Acetate, Succinimidyl Ester - Special Packaging</td>
			<td style="width:99px;">Thermo Scientific/Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">SS22801</td>
			<td style="width:360px;">Use gloves</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:275px;">5-(and-6)-Carboxy SNARF-1, Acetoxymethyl Ester, Acetate</td>
			<td style="width:99px;">Thermo Scientific/Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">C1272</td>
			<td style="width:360px;">Use gloves</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:275px;">Vivaglobin human IgG&#160; 160mg/ml solution</td>
			<td style="width:99px;">CSL Behring</td>
			<td style="width:119px;">received as a gift</td>
			<td style="width:360px;">Various providers exist</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">Normal mouse serum</td>
			<td style="width:99px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab7486</td>
			<td style="width:360px;">Various providers exist</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:275px;">Lymphoprep (density gradient medium)</td>
			<td style="width:99px;">Alere Ltd</td>
			<td style="width:119px;">1114547</td>
			<td style="width:360px;">Keep sterile and away from direct sunlight, can be substituted by Ficoll-Paque</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">Nigericin</td>
			<td style="width:99px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">N7143</td>
			<td style="width:360px;">Toxic, use gloves, various providers exist</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">Saponin</td>
			<td style="width:99px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">47036</td>
			<td style="width:360px;">Toxic, use gloves, various providers exist</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">Dimethyl sulphoxide (DMSO)</td>
			<td style="width:99px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D8418</td>
			<td style="width:360px;">Toxic, use gloves, various providers exist</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:275px;">4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid (HEPES)</td>
			<td style="width:99px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">H3375</td>
			<td style="width:360px;">Various providers exist</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:275px;">Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris)</td>
			<td style="width:99px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T1503&#160;</td>
			<td style="width:360px;">Various providers exist</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">Potassium chloride (KCl)</td>
			<td style="width:99px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P9333</td>
			<td style="width:360px;">Various providers exist</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td style="width:99px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S7653</td>
			<td style="width:360px;">Various providers exist</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">Magnesium chloride (MgCl2)</td>
			<td style="width:99px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">M8266</td>
			<td style="width:360px;">Various providers exist</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">Magnesium sulphate (MgSO4)</td>
			<td style="width:99px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">M7506</td>
			<td style="width:360px;">Various providers exist</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:275px;">Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4)</td>
			<td style="width:99px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P9791</td>
			<td style="width:360px;">Various providers exist</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">Calcium chloride (CaCl2)</td>
			<td style="width:99px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C1016</td>
			<td style="width:360px;">Various providers exist</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">Glucose</td>
			<td style="width:99px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D9434</td>
			<td style="width:360px;">Various providers exist</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">Absolute Ethanol&#160;</td>
			<td style="width:99px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">2860</td>
			<td style="width:360px;">Various providers exist</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">Diphenylene iodonium (DPI)</td>
			<td style="width:99px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D2926</td>
			<td style="width:360px;">Various providers exist</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:275px;">Zinc chloride</td>
			<td style="width:99px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">208086</td>
			<td style="width:360px;">Various providers exist, do not dilute in phosphate based buffers as it will precipitate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">Poly L lysine</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P4707</td>
			<td style="width:360px;">Various providers exist</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:275px;">Laser scanning confocal microscope (Zeiss LSM 700)</td>
			<td style="width:99px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:360px;">The microscope must be able to excite at 555nm and measure emission at two channels simultaneously (560-600nm, &#62;610nm)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:275px;">Ibidi &#181; slide 8 well ibiTreat</td>
			<td style="width:99px;">Thistle Scientific</td>
			<td style="width:119px;">IB-80826</td>
			<td style="width:360px;">Other appropriate imaging dishes can be substituted</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:275px;">Fluorodish Cell Culture Dish-35mm, 23mm well</td>
			<td style="width:99px;">World Precision Instruments&#160;</td>
			<td style="width:119px;">FD35-100</td>
			<td style="width:360px;">Other appropriate imaging dishes can be substituted, different sizes are available</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">Soniprep 150</td>
			<td style="width:99px;">MSE</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:360px;">Any appropriate sonicator will suffice</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">TC20 Automated Cell Counter</td>
			<td style="width:99px;">BioRad</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:360px;">Various providers exist</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:275px;">1.5ml Protein LoBind Tubes</td>
			<td style="width:99px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">Z666505-100EA</td>
			<td style="width:360px;">Specially used as Candida can stick to normal eppendorfs</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging the neutrophil phagosome and cytoplasm using a ratiometric ph indicator

Neutrophile sind entscheidend angeborene Verteidigung zu hosten und damit auch ein wichtiger Bestandteil der medizinischen Forschung. Phagosom, die intrazelluläre Kompartimente, in denen die Tötung und Verdauung von verschlungen Teilchen stattfinden, ist die Haupt Arena für die Neutrophilen Pathogen Abtötung, die strenge Regulierung erfordert. Phagosomalen pH ist ein Aspekt, sorgfältig gesteuert wird, die wiederum Regulierung antimikrobielle Protease-Aktivität. Viele fluoreszierende pH-sensitive Farbstoffe wurden verwendet, um die phagosomalen Umgebung sichtbar zu machen. S-1 hat mehrere Vorteile gegenüber anderen pH-empfindliche Farbstoffe, einschließlich seiner Doppelemissionsspektren, die Beständigkeit gegen Photobleiche, und seine hohe pKa. Mit dieser Methode haben wir gezeigt, dass die neutrophilen phagosome im Vergleich zu anderen Phagozyten ungewöhnlich alkalisch ist. Durch die Verwendung verschiedene biochemische Konjugationen des Farbstoffes können die phagosome aus dem Cytoplasma abgegrenzt werden, so dass Änderungen in der Größe und Form des phagosome beurteilt werden können. Dies ermöglicht es foder eine weitere Überwachung der Ionenbewegung.

Abbildung 1 zeigt Schnappschüsse von Neutrophilen verschiedener Herkunft unterschiedlicher phagosomalen Umgebungen zu demonstrieren. Zur quantitativen Analyse zu erleichtern, ist es wichtig, die Vertiefungen mit einer entsprechenden Anzahl von Zellen zu impfen: zu viele werden die Zellen dazu führen, dass über jede andere Schicht, was es schwierig macht eingeschlossen phagosomes zu sehen genau; zu wenig Willen, natürlich, weniger Ergebnisse liefern, zumal nicht jeder neutrophile Phagozytose wird. 2 ist ein Bild , das über tigten ist; Dies kann durch Aufteilen des Bildes zwischen seinen beiden Kanälen (unter Verwendung der Mikroskop-Software in der Materialliste oder einem äquivalenten empfohlen) bewertet werden - rote Punkte zeigen, wo maximale Fluoreszenz detektiert wurde. Dies kann durch eine Verringerung der Intensität des Lasers begegnet werden. Kalibrierungskurven , die verschiedene Puffersysteme verwenden , sind in Abbildung 3, von Levine et al angepasst dargestellt. 5 &lt;/ Sup&gt;. Die Fehlerbalken zeigen, dass es eine gewisse Variation in der Fluoreszenz zwischen den Messungen. Abbildung 4 zeigt ein Beispiel dafür , wie die Daten für phagosomalen pH - Wert und Bereich könnten vorgelegt werden. Dieser Ansatz ermöglicht es jede einzelne Messung mit einer überlegenden boxplot angezeigt werden. Allerdings könnten die Daten auch in einem Histogramm-Balkendiagramm angezeigt werden. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/55107/55107fig1.jpg" /> Abbildung 1: Geeignete Snapshot - Bilder von Neutrophilen von Menschen und Mäusen. Um ganz rechts ist ein qualitativer visueller Schlüssel der ungefähren Farbe der S-1-gefärbte phagosomes auf den pH-Wert entspricht. Die gelbe Farbe zeigt mehr Säure, während Rot mehr Alkalität zeigt. (A) zeigt Hvcn1 - / - Maus - Knochenmark - Neutrophile 20 min nach der Phagozytose. Die phagosomes erscheinen sehr rot, alkalisch und geschwollen. Der rote Pfeil in der rechten unteren Teil desBildpunkte auf einer intrazellulären Candida, während der Pfeil in der linken oberen Punkte an eine extrazelluläre Partikel. (B) zeigt Wildtyp- Knochenmark der Maus , die Neutrophile Candida eingenommen haben; sie sind viel weniger alkalisch als Hvcn1 - / - Zellen. (C) zeigt menschliche peripheres Blut Neutrophilen am gleichen Punkt nach der Phagozytose. Sie erscheinen leicht alkalischer als die Maus Wildtypzellen, aber die phagosomes sind noch nicht so groß und rot wie die Hcvn1 - / - Zellen. (D) zeigen menschliche Neutrophilen , die 5 uM Diphenylen iodonium (DPI) phagozytiert Candida in Gegenwart haben. Alle phagosomes sind sehr sauer, mit einem pH-Wert von 6 oder weniger; das Medikament hemmt die NADPH-Oxidase, so gibt es keine Ausgleichsionenbewegung. Die Protonen aus dem sauren Granulat freigesetzt, die zur Sicherung verursachen phagosome sauren pH 20, und eine erhöhte Rekrutierung der V-ATPase the phagosomalen Membran bei Behandlung mit DPI 9. Das Zytoplasma erscheint auch mehr alkalisch im Vergleich zu den Zellen von den anderen Bedingungen. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55107/55107fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55107/55107fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/55107/55107fig2.jpg" /> Abbildung 2: Übersättigung von Hvcn1 - / - Maus Knochenmark Neutrophilen. Es ist wichtig, aus den Analysebilder ausschließen, in denen die Fluoreszenzdaten über gesättigt sind. Wie in Abschnitt 5.3 beschrieben, wird das zusammengesetzte Bild in zwei Bilder aufgeteilt (oben links, roter Pfeil) mit sowohl einzeln dargestellt Kanälen. In dieser Software wird geprüft Bereichsanzeige auf (links unten, roter Pfeil), werden alle Pixel, die über gesättigt sind leuchtend rot. Es ist eine Übersättigung, die in beiden Kanälen (1 und 2). Ein magnification einiger Zellen und extrazelluläre Candida wird unten rechts dargestellt, mit Pfeilen auf die betroffenen Stellen zeigen. diese Punkte zu analysieren zu einer falschen Quotientenmeßschaltung führen würde. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55107/55107fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55107/55107fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/55107/55107fig3.jpg" /> Abbildung 3: Standardkalibrierungskurven für die Umwandlung von S-1 - Fluoreszenz - Verhältnissen auf pH - Messungen. Die Standardkurven für Candida allein in den verschiedenen Puffern (markiert als „Tris“) , und wenn die Zellen mit Saponin ( „Saponin“) permeabilisiert werden , sind sehr ähnlich, was zeigt , dass die S-1 das Lesen innerhalb und außerhalb der Zelle (phagosome und extrazellulärem mittel) sind vergleichbar. Die Fehlerbalken stellen den Mittelwert ± SD. Die S-1-Verhältnis / pH-Kurve verkürzt wird, wenn i getestetn das Zytoplasma ( „Cytoplasma“), die unter Berücksichtigung der in der Bildanalyse genommen werden sollte. Diese Zahl wurde von Levine et al modifiziert. 5. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55107/55107fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55107/55107fig3large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/55107/55107fig4.jpg" /> Abbildung 4: Quantifizierung der phagosomalen pH und Fläche. Diese Abbildung zeigt ein Beispiel für die Datenpräsentation. Die Diagramme wurden unter Verwendung der Programmiersoftware erzeugt R. A: phagosomalen Verhältnis und entsprechende pH - Wert für A zeigt (Hvcn1 - / - Maus - Knochenmark - Neutrophile), B: Wildtyp- Maus - Knochenmark Neutrophilen, C: humane periphere Blut Neutrophile und D: menschliche Neutrophilen mit 5 uM DPI n = 3/300. Einzelmessungen sind als kleine Quadrate dargestellt, mit einem mit medi Übereinander boxplotein und Quartilabstand. Ein roter Balken stellt den Mittelwert. Wie in den Bildern in Abbildung 1 zu sehen ist , Hvcn1 - / - Zellen haben sehr alkalisch phagosomes im Vergleich zu Wildtyp - Maus und humanen Neutrophilen. Sie haben auch einen größeren phagosomalen Bereich (4B, n = 3/300). Humane neutrophilen phagosomes ist etwas alkalisch und größer als Wildtyp-Maus Neutrophile, während menschliche Neutrophilen mit DPI inkubiert haben sehr sauer und kleine phagosomes. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55107/55107fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55107/55107fig4large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <table><tbody><tr><td colspan="4"> Balancierter Salzlösung (BSS) Puffer </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 156 mM </td><td></td><td></td></tr><tr><td> KCl </td><td> 3 mM </td><td></td><td></td></tr><tr><td> MgSO 4 </td><td> 2 mM </td><td></td><td></td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> 1,25 mM </td><td></td><td></td></tr><tr><td> CaCI2 </td><td> 2 mM </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Glucose </td><td> 10 mM </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Hepes </td><td> 10 mM </td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> pH 7,4 mit NaOH oder HCl </td></tr><tr><td colspan="4"> YPD - Brühe </td></tr><tr><td> YPD-Brühe </td><td> 50 g </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Destilliertes Wasser </td><td> L 1 </td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> Autoklaven bei 121 ° C für 15 min </td></tr><tr><td colspan="4"> Für YPD-Agar: Vor dem Autoklavieren 15 g / l Agar hinzufügen </td></tr><tr><td colspan="4"> 10% Dextranlösung </td></tr><tr><td> Dextran klinischer Güte </td><td></td><td> 50 g </td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td> &lt;td&gt; </td><td> 4,5 g </td><td></td></tr><tr><td> Destilliertes Wasser </td><td></td><td> 500 ml </td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> In der Glasflasche und Autoklaven bei 121 ° C für 15 min </td></tr><tr><td colspan="4"> 2x Kochsalzlösung </td></tr><tr><td> NaCl </td><td></td><td> 18 g </td><td></td></tr><tr><td> Destilliertes Wasser </td><td></td><td> L 1 </td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> In der Glasflasche und Autoklaven bei 121 ° C für 15 min </td></tr><tr><td colspan="4"> 10% Saponin Lager </td></tr><tr><td> BSS-Puffer </td><td></td><td> 50 ml </td><td></td></tr><tr><td> Saponin </td><td></td><td> 5 g </td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> Wärme BSS-Puffer auf 37 ° C abgekühlt, Saponin und mischen. </td></tr><tr><td colspan="4"> Hinzufügen 0,1% Natriumazid als Konservierungsmittel, Lager Mischung bei 4 ° C. </td> &lt;/ Tr&gt; <tr><td colspan="4"> Kalibrierpuffer </td></tr><tr><td colspan="4"> Candida Standardkurve </td></tr><tr><td colspan="4"> bildet erster 0,15 M Lager jeden Puffer </td></tr><tr><td colspan="4"> Make-up 0,15 M NaCl-Lösung </td></tr><tr><td colspan="4"> 15 ml Endvolumen: 5 ml 0,15 M der gewünschten Pufferlösung + 10 ml 0,15 M NaCl-Lösung </td></tr><tr><td> pH 3 </td><td> 100 mM NaCl </td><td> 50 mM Glycin </td><td></td></tr><tr><td> pH 4 </td><td> 100 mM NaCl </td><td> 50 mM Acetat </td><td></td></tr><tr><td> pH 5 </td><td> 100 mM NaCl </td><td> 50 mM Acetat </td><td></td></tr><tr><td> pH 6 </td><td> 100 mM NaCl </td><td> 50 mM Acetat </td><td></td></tr><tr><td> pH 7 </td><td> 100 mM NaCl </td><td> 50 mM Tris </td><td></td></tr><tr><td> pH 8 </td><td> 100 mM NaCl </td><td> 50 mM Tris </td><td></td></tr><tr><td> pH 9 </td><td> 100 mM NaCl </td><td> 50 mM Tris </td><td></td></tr><tr><td> pH 10 </td><td> 100 mM NaCl </td><td> 50 mM Glycin </td><td></td></tr><tr><td> pH 11 </td><td> 100 mM NaCl </td><td> 50 mM Phosphat </td><td></td></tr><tr><td> pH 12 </td><td> 100 mM NaCl </td><td> 50 mM Phosphat </td><td></td></tr><tr><td> pH 13 </td><td> 100 mM NaCl </td><td> 50 mM Phosphat </td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> Cytosolic Standardkurve </td></tr><tr><td colspan="4"> Verwendung Bisher 0,15 M Stammpufferlösungen hergestellt </td></tr><tr><td colspan="4"> Make-up 0,15 M KCl-Lösung </td></tr><tr><td colspan="4"> 15 ml Endvolumen: 5 ml 0,15 M erwünschten Puffer + 10 ml 0,15 M KCl-Lösung </td></tr><tr><td colspan="4"> 10 mM Stammlösung von Nigericin in Ethanol, fügt 15 &amp; mgr; l zu jeder Endvolumens Lösung </td></tr><tr><td> pH 3 </td><td> 100 mM KCl </td&gt; <td> 50 mM Glycin </td><td> 10 &amp; mgr; M Nigericin </td></tr><tr><td> pH 4 </td><td> 100 mM KCl </td><td> 50 mM Acetat </td><td> 10 &amp; mgr; M Nigericin </td></tr><tr><td> pH 5 </td><td> 100 mM KCl </td><td> 50 mM Acetat </td><td> 10 &amp; mgr; M Nigericin </td></tr><tr><td> pH 6 </td><td> 100 mM KCl </td><td> 50 mM Acetat </td><td> 10 &amp; mgr; M Nigericin </td></tr><tr><td> pH 7 </td><td> 100 mM KCl </td><td> 50 mM Tris </td><td> 10 &amp; mgr; M Nigericin </td></tr><tr><td> pH 8 </td><td> 100 mM KCl </td><td> 50 mM Tris </td><td> 10 &amp; mgr; M Nigericin </td></tr><tr><td> pH 9 </td><td> 100 mM KCl </td><td> 50 mM Tris </td><td> 10 &amp; mgr; M Nigericin </td></tr><tr><td> pH 10 </td><td> 100 mM KCl </td><td> 50 mM Glycin </td><td> 10 &amp; mgr; M Nigericin </td></tr><tr><td> pH 11 </td><td> 100 mM KCl </td><td> 50 mM Phosphat </td><td> 10 &amp; mgr; M Nigericin </td></tr><tr><td> pH 12 </td&gt; <td> 100 mM KCl </td><td> 50 mM Phosphat </td><td> 10 &amp; mgr; M Nigericin </td></tr><tr><td> pH 13 </td><td> 100 mM KCl </td><td> 50 mM Phosphat </td><td> 10 &amp; mgr; M Nigericin </td></tr><tr><td colspan="4"> pH alle Kalibrierlösungen mit entweder HCl oder NaOH </td></tr></tbody></table> Tabelle 1: Zusammensetzung von Puffern. Diese Tabelle beschreibt die entsprechenden Zusammensetzungen der verschiedenen Puffer in dem Protokoll verwendet. Zusatz - Code - Datei. Diese Datei enthält eine Reihe von Makros, geschrieben von AP Levine, die für die Bildanalyse notwendig sind. Die Autoren würden uns freuen, um zu versuchen, alle Fragen bei der Verwendung dieser Code zugeordnet zu adressieren. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/55107/Phagosomal_measurement.txt" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/55107/Phagosomal_measurement.txt" target="_blank">diese Datei herunterzuladen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Imaging the Neutrophil Phagosome and Cytoplasm Using a Ratiometric pH Indicator at JoVE.com

Imaging the Neutrophil Phagosome and Cytoplasm Using a Ratiometric pH Indicator

Diese Handschrift beschreibt eine einfache Methode, um die phagosomalen und pH-Bereich sowie die cytoplasmatische pH von menschlichen und Maus-Neutrophilen unter Verwendung des ratiometrischen Indikatoren seminaphthorhodafluor (SNARF) -1, oder S-1 zu messen. Dies wird in lebenden Zellen konfokale Fluoreszenzmikroskopie und Bildanalyse erreicht werden.

Abbilden der Neutrophilen Phagosomen und Zytoplasma Mit einem Ratiometrisch pH-Indikator

Neutrophils are crucial to host innate defense and, consequently, constitute an important area of medical research. The phagosome, the intracellular ...

imaging-neutrophil-phagosome-cytoplasm-using-ratiometric-ph

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

10.0K Aufrufe.  University College London.  Diese Handschrift beschreibt eine einfache Methode, um die phagosomalen und pH-Bereich sowie die cytoplasmatische pH von menschlichen und Maus-Neutrophilen unter Verwendung des ratiometrischen Indikatoren seminaphthorhodafluor (SNARF) -1, oder S-1 zu messen. Dies wird in lebenden Zellen konfokale Fluoreszenzmikroskopie und Bildanalyse erreicht werden. 

Serie: Imaging the Neutrophil Phagosome and Cytoplasm Using a Ratiometric pH Indicator

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of infection with influenza virus alone. Instead, most individuals are thought to have succumbed to a secondary bacterial infection, predominately caused by the bacterium Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus). The synergistic relationship between infections caused by influenza virus and the pneumococcus has subsequently been observed during the 1957 Asian influenza virus pandemic, as well as during seasonal outbreaks of the virus (reviewed in 1, 2). Here, we describe a protocol used to investigate the mechanism(s) that may be involved in increased morbidity as a result of concurrent influenza A virus and S. pneumoniae infection. We have developed an infant murine model to reliably and reproducibly demonstrate the effects of influenza virus infection of mice colonised with S. pneumoniae. Using this protocol, we have provided the first insight into the kinetics of pneumococcal transmission between co-housed, neonatal mice using in vivo imaging 3.

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

A concurrent infection with influenza A virus is one of the factors implicated in the induction of invasive pneumococcal disease during asymptomatic Streptococcus pneumoniae carriage. Here we describe a mixed infection method using infant mice to investigate the synergism between these two respiratory pathogens.

Mit Bioluminescent Imaging, um Synergie von Untersuchen Streptococcus pneumoniae Und Influenza A Virus in Infant Mäuse

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Non-invasive Optical Imaging of the Lymphatic Vasculature of a Mouse

The lymphatic vascular system is an important component of the circulatory system that maintains fluid homeostasis, provides immune surveillance, and mediates fat absorption in the gut. Yet despite its critical function, there is comparatively little understanding of how the lymphatic system adapts to serve these functions in health and disease1. Recently, we have demonstrated the ability to dynamically image lymphatic architecture and lymph "pumping" action in normal human subjects as well as in persons suffering lymphatic dysfunction using trace administration of a near-infrared fluorescent (NIRF) dye and a custom, Gen III-intensified imaging system2-4. NIRF imaging showed dramatic changes in lymphatic architecture and function with human disease. It remains unclear how these changes occur and new animal models are being developed to elucidate their genetic and molecular basis. In this protocol, we present NIRF lymphatic, small animal imaging5,6 using indocyanine green (ICG), a dye that has been used for 50 years in humans7, and a NIRF dye-labeled cyclic albumin binding domain (cABD-IRDye800) peptide that preferentially binds mouse and human albumin8. Approximately 5.5 times brighter than ICG, cABD-IRDye800 has a similar lymphatic clearance profile and can be injected in smaller doses than ICG to achieve sufficient NIRF signals for imaging8. Because both cABD-IRDye800 and ICG bind to albumin in the interstitial space8, they both may depict active protein transport into and within the lymphatics. Intradermal (ID) injections (5-50 &mu;l) of ICG (645 &mu;M) or cABD-IRDye800 (200 &mu;M) in saline are administered to the dorsal aspect of each hind paw and/or the left and right side of the base of the tail of an isoflurane-anesthetized mouse. The resulting dye concentration in the animal is 83-1,250 &mu;g/kg for ICG or 113-1,700 &mu;g/kg for cABD-IRDye800. Immediately following injections, functional lymphatic imaging is conducted for up to 1 hr using a customized, small animal NIRF imaging system. Whole animal spatial resolution can depict fluorescent lymphatic vessels of 100 microns or less, and images of structures up to 3 cm in depth can be acquired9. Images are acquired using V++ software and analyzed using ImageJ or MATLAB software. During analysis, consecutive regions of interest (ROIs) encompassing the entire vessel diameter are drawn along a given lymph vessel. The dimensions for each ROI are kept constant for a given vessel and NIRF intensity is measured for each ROI to quantitatively assess "packets" of lymph moving through vessels.

Recently developed imaging techniques using near-infrared fluorescence (NIRF) may help elucidate the role the lymphatic system plays in cancer metastasis, immune response, wound repair, and other lymphatic-associated diseases.

Nicht-invasive optische Abbildung des lymphatischen Gefäßsystem eines Maus

The lymphatic  vascular system is an important component of the circulatory system that  maintains fluid homeostasis, provides immune surveillance, and ...

Monitoring Dendritic Cell Migration using 19F / 1H Magnetic Resonance Imaging

Continuous advancements in noninvasive imaging modalities such as magnetic resonance imaging (MRI) have greatly improved our ability to study physiological or pathological processes in living organisms. MRI is also proving to be a valuable tool for capturing transplanted cells in vivo. Initial cell labeling strategies for MRI made use of contrast agents that influence the MR relaxation times (T1, T2, T2*) and lead to an enhancement (T1) or depletion (T2*) of signal where labeled cells are present. T2* enhancement agents such as ultrasmall iron oxide agents (USPIO) have been employed to study cell migration and some have also been approved by the FDA for clinical application. A drawback of T2* agents is the difficulty to distinguish the signal extinction created by the labeled cells from other artifacts such as blood clots, micro bleeds or air bubbles. In this article, we describe an emerging technique for tracking cells in vivo that is based on labeling the cells with fluorine (19F)-rich particles. These particles are prepared by emulsifying perfluorocarbon (PFC) compounds and then used to label cells, which subsequently can be imaged by 19F MRI. Important advantages of PFCs for cell tracking in vivo include (i) the absence of carbon-bound 19F in vivo, which then yields background-free images and complete cell selectivityand(ii) the possibility to quantify the cell signal by 19F MR spectroscopy.

Monitoring Dendritic Cell Migration using 19F / 1H Magnetic Resonance Imaging

Tracking of cells using MRI has gained remarkable attention in the past years. This protocol describes the labeling of dendritic cells with fluorine (19F)-rich particles, the in vivo application of these cells, and monitoring the extent of their migration to the draining lymph node with 19F/1H MRI and 19F MRS.

Überwachung dendritische Zellen mit Migration<sup&gt; 19</sup&gt; F /<sup&gt; 1</sup&gt; H Magnetic Resonance Imaging

Continuous  advancements in noninvasive imaging modalities such as magnetic resonance  imaging (MRI) have greatly improved our ability to study ...

Study of Phagolysosome Biogenesis in Live Macrophages

Phagocytic cells play a major role in the innate immune system by removing and eliminating invading microorganisms in their phagosomes. Phagosome maturation is the complex and tightly regulated process during which a nascent phagosome undergoes drastic transformation through well-orchestrated interactions with various cellular organelles and compartments in the cytoplasm. This process, which is essential for the physiological function of phagocytic cells by endowing phagosomes with their lytic and bactericidal properties, culminates in fusion of phagosomes with lysosomes and biogenesis of phagolysosomes which is considered to be the last and critical stage of maturation for phagosomes. In this report, we describe a live cell imaging based method for qualitative and quantitative analysis of the dynamic process of lysosome to phagosome content delivery, which is a hallmark of phagolysosome biogenesis. This approach uses IgG-coated microbeads as a model for phagocytosis and fluorophore-conjugated dextran molecules as a luminal lysosomal cargo probe, in order to follow the dynamic delivery of lysosmal content to the phagosomes in real time in live macrophages using time-lapse imaging and confocal laser scanning microscopy. Here we describe in detail the background, the preparation steps and the step-by-step experimental setup to enable easy and precise deployment of this method in other labs. Our described method is simple, robust, and most importantly, can be easily adapted to study phagosomal interactions and maturation in different systems and under various experimental settings such as use of various phagocytic cells types, loss-of-function experiments, different probes, and phagocytic particles.

Studium der Biogenese Phagolysosom im Live-Makrophagen

Phagocytic cells play a major role in the innate immune system by removing and eliminating invading microorganisms in their phagosomes. Phagosome ...

Measuring Phagosome pH by Ratiometric Fluorescence Microscopy

Phagocytosis is a fundamental process through which innate immune cells engulf bacteria, apoptotic cells or other foreign particles in order to kill or neutralize the ingested material, or to present it as antigens and initiate adaptive immune responses. The pH of phagosomes is a critical parameter regulating fission or fusion with endomembranes and activation of proteolytic enzymes, events that allow the phagocytic vacuole to mature into a degradative organelle. In addition, translocation of H+ is required for the production of high levels of reactive oxygen species (ROS), which are essential for efficient killing and signaling to other host tissues. Many intracellular pathogens subvert phagocytic killing by limiting phagosomal acidification, highlighting the importance of pH in phagosome biology. Here we describe a ratiometric method for measuring phagosomal pH in neutrophils using fluorescein isothiocyanate (FITC)-labeled zymosan as phagocytic targets, and live-cell imaging. The assay is based on the fluorescence properties of FITC, which is quenched by acidic pH when excited at 490 nm but not when excited at 440 nm, allowing quantification of a pH-dependent ratio, rather than absolute fluorescence, of a single dye. A detailed protocol for performing in situ dye calibration and conversion of ratio to real pH values is also provided. Single-dye ratiometric methods are generally considered superior to single wavelength or dual-dye pseudo-ratiometric protocols, as they are less sensitive to perturbations such as bleaching, focus changes, laser variations, and uneven labeling, which distort the measured signal. This method can be easily modified to measure pH in other phagocytic cell types, and zymosan can be replaced by any other amine-containing particle, from inert beads to living microorganisms. Finally, this method can be adapted to make use of other fluorescent probes sensitive to different pH ranges or other phagosomal activities, making it a generalized protocol for the functional imaging of phagosomes.

Phagosomal pH influences phagosome maturation, oxidant production, phagosomal killing as well as antigen presentation. Here we describe a ratiometric method for measuring time-course and endpoint pH changes in individual phagosomes in living phagocytes using fluorescence microscopy.

Mess Phagosomen pH durch ratiometrische Fluoreszenzmikroskopie

Phagocytosis is a fundamental process through which innate immune cells engulf bacteria, apoptotic cells or other foreign particles in order to kill or ...

Ratiometric Imaging of Extracellular pH in Dental Biofilms

The pH in bacterial biofilms on teeth is of central importance for dental caries, a disease with a high worldwide prevalence. Nutrients and metabolites are not distributed evenly in dental biofilms. A complex interplay of sorption to and reaction with organic matter in the biofilm reduces the diffusion paths of solutes and creates steep gradients of reactive molecules, including organic acids, across the biofilm. Quantitative fluorescent microscopic methods, such as fluorescence life time imaging or pH ratiometry, can be employed to visualize pH in different microenvironments of dental biofilms. pH ratiometry exploits a pH-dependent shift in the fluorescent emission of pH-sensitive dyes. Calculation of the emission ratio at two different wavelengths allows determining local pH in microscopic images, irrespective of the concentration of the dye. Contrary to microelectrodes the technique allows monitoring both vertical and horizontal pH gradients in real-time without mechanically disturbing the biofilm. However, care must be taken to differentiate accurately between extra- and intracellular compartments of the biofilm. Here, the ratiometric dye, seminaphthorhodafluor-4F 5-(and-6) carboxylic acid (C-SNARF-4) is employed to monitor extracellular pH in in vivo grown dental biofilms of unknown species composition. Upon exposure to glucose the dye is up-concentrated inside all bacterial cells in the biofilms; it is thus used both as a universal bacterial stain and as a marker of extracellular pH. After confocal microscopic image acquisition, the bacterial biomass is removed from all pictures using digital image analysis software, which permits to exclusively calculate extracellular pH. pH ratiometry with the ratiometric dye is well-suited to study extracellular pH in thin biofilms of up to 75 &#181;m thickness, but is limited to the pH range between 4.5 and 7.0.

A pH-sensitive ratiometric dye is used in combination with confocal laser scanning microscopy and digital image analysis to monitor extracellular pH in dental biofilms in real-time.

Ratiometrisch Imaging von extrazellulären pH in Dental Biofilme

The pH in bacterial biofilms on teeth is of central importance for dental caries, a disease with a high worldwide prevalence. Nutrients and metabolites ...

Intravital Imaging of Neutrophil Priming Using IL-1&#946; Promoter-driven DsRed Reporter Mice

Neutrophils are the most abundant leukocytes in human blood circulation and are quickly recruited to inflammatory sites. Priming is a critical event that enhances the phagocytic functionality of neutrophils. Although extensive studies have unveiled the existence and importance of neutrophil priming during infection and injury, means of visualizing this process in vivo have been unavailable. The protocol provided enables monitoring of the dynamic process of neutrophil priming in living animals by combining three methodologies: 1) DsRed reporter signal &#8212; used as a measure of priming 2) in vivo neutrophil labeling &#8212; achieved by injection of fluorescence-conjugated anti-lymphocyte antigen 6G (Ly6G) monoclonal antibody (mAb) and 3) intravital confocal imaging. Several critical steps are involved in this protocol: oxazolone-induced mouse ear skin inflammation, appropriate sedation of animals, repeated injections of anti-Ly6G mAb, and prevention of focus drift during imaging. Although a few limitations have been observed, such as the limit of continuous imaging time (~ 8 hr) in one mouse and the leakage of fluorescein isothiocyanate-dextran from blood vessels in the inflammatory state, this protocol provides a fundamental framework for intravital imaging of primed neutrophil behavior and function, which can easily be expanded to examination of other immune cells in mouse inflammation models.

This current protocol employs fluorescent reporters, in vivo labeling, and intravital imaging techniques to enable monitoring of the dynamic process of neutrophil priming in living animals.

Intravital Imaging von Neutrophilen Priming Mit IL-1β Promoter-driven DsRed Reporter Mäuse

Neutrophils are the most abundant leukocytes in human blood circulation and are quickly recruited to inflammatory sites. Priming is a critical event that ...

"Phagosome Closure Assay" to Visualize Phagosome Formation in Three Dimensions Using Total Internal Reflection Fluorescent Microscopy (TIRFM)

Phagocytosis is a mechanism used by specialized cells to internalize and eliminate microorganisms or cellular debris. It relies on profound rearrangements of the actin cytoskeleton that is the driving force for plasma membrane extension around the particle. In addition, efficient engulfment of large material relies on focal exocytosis of intracellular compartments. This process is highly dynamic and numerous molecular players have been described to have a role during phagocytic cup formation. The precise regulation in time and space of all of these molecules, however, remains elusive. In addition, the last step of phagosome closure has been very difficult to observe because inhibition by RNA interference or dominant negative mutants often results in stalled phagocytic cup formation. 
We have set up a dedicated experimental approach using total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM) combined with epifluorescence to monitor step by step the extension of pseudopods and their tips in a phagosome growing around a particle loosely bound to a coverslip. This method allows us to observe, with high resolution the very tips of the pseudopods and their fusion during closure of the phagosome in living cells for two different fluorescently tagged proteins at the same time.

"Phagosome Closure Assay" to Visualize Phagosome Formation in Three Dimensions Using Total Internal Reflection Fluorescent Microscopy TIRFM

We describe an experimental setup to visualize with unprecedented high resolution phagosome formation and closure in three dimensions in living macrophages, using total internal reflection fluorescence microscopy. It allows monitoring of the base of the phagocytic cup, the extending pseudopods, as well as the precise site of phagosome scission.

&quot;Phagosomen Closure Assay&quot; zu visualisieren Phagosomen Formation in drei Dimensionen Mit Total Internal Reflection Fluoreszenz-Mikroskopie (TIRFM)

Phagocytosis is a mechanism used by specialized cells to internalize and eliminate microorganisms or cellular debris. It relies on profound rearrangements ...

Development and Identification of a Novel Subpopulation of Human Neutrophil-derived Giant Phagocytes In Vitro

Neutrophils (PMN) are best known for their phagocytic functions against invading pathogens and microorganisms. They have the shortest half-life amongst leukocytes and in their non-activated state are constitutively committed to apoptosis. When recruited to inflammatory sites to resolve inflammation, they produce an array of cytotoxic molecules with potent antimicrobial killing. Yet, when these powerful cytotoxic molecules are released in an uncontrolled manner they can damage surrounding tissues. In recent years however, neutrophil versatility is increasingly evidenced, by demonstrating plasticity and immunoregulatory functions. We have recently identified a new neutrophil-derived subpopulation, which develops spontaneously in standard culture conditions without the addition of cytokines/growth factors such as granulocyte colony-stimulating factor (GM-CSF)/interleukin (IL)-4. Their phagocytic abilities of neutrophil remnants largely contribute to increase their size immensely; therefore they were termed giant phagocytes (G&#981;). Unlike neutrophils, G&#981; are long lived in culture. They express the cluster of differentiation (CD) neutrophil markers CD66b/CD63/CD15/CD11b/myeloperoxidase (MPO)/neutrophil elastase (NE), and are devoid of the monocytic lineage markers CD14/CD16/CD163 and the dendritic CD1c/CD141 markers. They also take-up latex and zymosan, and respond by oxidative burst to stimulation with opsonized-zymosan and PMA. G&#981; also express the scavenger receptors CD68/CD36, and unlike neutrophils, internalize oxidized-low density lipoprotein (oxLDL). Moreover, unlike fresh neutrophils, or cultured monocytes, they respond to oxLDL uptake by increased reactive oxygen species (ROS) production. Additionally, these phagocytes contain microtubule-associated protein-1 light chain 3B (LC3B) coated vacuoles, indicating the activation of autophagy. Using specific inhibitors it is evident that both phagocytosis and autophagy are prerequisites for their development and likely NADPH oxidase dependent ROS. We describe here a method for the preparation of this new subpopulation of long-lived, neutrophil-derived phagocytic cells in culture, their identification and their currently known characteristics. This protocol is essential for obtaining and characterizing G&#981; in order to further investigate their significance and functions.

Development and Identification of a Novel Subpopulation of Human Neutrophil-derived Giant Phagocytes In Vitro

We describe here a method for obtaining and identifying a newly characterized subpopulation of neutrophil-derived giant phagocytes. These cells develop in culture from fresh human blood neutrophils, and are characterized by phagocytosis, autophagy, immensely large size, and extended lifespan. This method is essential to further investigate this unique neutrophil-derived subpopulation.

Entwicklung und Identifizierung eines neuen Subpopulation von humanen neutrophilen abgeleiteten Riesen Phagozyten<em&gt; In Vitro</em

Neutrophils (PMN) are best known for their phagocytic functions against invading pathogens and microorganisms. They have the shortest half-life amongst ...

Monitoring Extracellular pH in Cross-Kingdom Biofilms using Confocal Microscopy

Cross-kingdom biofilms consisting of both fungal and bacterial cells are involved in a variety of oral diseases, such as endodontic infections, periodontitis, mucosal infections and, most notably, early childhood caries. In all of these conditions, the pH in the biofilm matrix impacts microbe-host interactions and thus the disease progression. The present protocol describes a confocal microscopy-based method to monitor pH dynamics inside cross-kingdom biofilms comprising Candida albicans and Streptococcus mutans. The pH-dependent dual-emission spectrum and the staining properties of the ratiometric probe C-SNARF-4 are exploited to determine drops in pH in extracellular areas of the biofilms. Use of pH ratiometry with the probe requires a meticulous choice of imaging parameters, a thorough calibration of the dye, and careful, threshold-based post-processing of the image data. When used correctly, the technique allows for the rapid assessment of extracellular pH in different areas of a biofilm and thus the monitoring of both horizontal and vertical pH gradients over time. While the use of confocal microscopy limits Z-profiling to thin biofilms of 75 &#181;m or less, the use of pH ratiometry is ideally suited for the noninvasive study of an important virulence factor in cross-kingdom biofilms.

The protocol describes the cultivation of cross-kingdom biofilms consisting of Candida albicans and Streptococcus mutans and presents a confocal microscopy-based method for the monitoring of extracellular pH inside these biofilms.