Dieses Protokoll ermöglicht die Echtzeitbewertung verschiedener Prozesse und biochemischer Parameter innerhalb des Lumens einzelner Makropinosomen. Diese Methoden können zur Wirkstoffforschung in der Zellbiologie der Makropinozytose eingesetzt werden. Dieses Protokoll bietet den Vorteil, Heterogenität sowohl auf zellulärer als auch auf Organellenebene aufzudecken.
Einen Tag vor dem Assay samen Raw264,7 Zellen mit einer Dichte von fünf mal 10 hoch der Kraft der Zellen in 100 Mikrolitern pro Vertiefung, in einer Glasboden-96-Well-Platte mit schwarzen Seiten. Überprüfen Sie am Tag des Assays, ob die Bohrungen zu mindestens 70% konfluent sind. Dann waschen Sie alle Brunnen mit 100 Mikrolitern HBSS, vorgewarmt bei 37 Grad Celsius.
Als nächstes fügen Sie 100 Mikroliter HBSS hinzu, die 0,025 Milligramm pro Milliliter TMR mit 70 Kilodalton Dextran und 0,025 Milligramm pro Milliliter Fluoreszein mit 70 Kilodalton Dextran in jeder Vertiefung enthalten, und inkubieren Sie die Zellen dann bei 37 Grad Celsius für 15 Minuten. Nachdem die Inkubation abgeschlossen ist, entfernen Sie die Platte aus dem Inkubator und waschen Sie die Zellen sechsmal mit 100 Mikrolitern HBSS. Nach der letzten Wäsche 100 Mikroliter vorgewarmtes HBSS in die Zellen geben und die Platte dann auf ein Mikroskop mit einem beheizten Tisch und einer Kammer legen.
Nachdem Sie die Anregungs- und Emissionsparameter für TMR und Fluorescein nach Bedarf angepasst haben, erhalten Sie ein Bild von jeder Vertiefung, die zwischen den beiden Fluorophoren zwischen jeder Vertiefung wechselt. Überprüfen Sie nach der ersten Aufnahme, ob alle Bohrungen über die gesamte Platte im Fokus geblieben sind, und erfassen Sie dann Bilder von jeder Bohrung in Abständen von einem bis 15 Minuten für die gewünschte Zeitspange. Passen Sie während der Bildaufnahme den pH-Wert eines 50-Milliliter-Aliquots einer kaliumreichen Lösung, die mit 25 Millimolar-HEPES gepuffert ist, je nach Bedarf mit 10 molarer Salzsäure oder 10 molaren Kaliumhydroxiden auf 7,5 an.
Stellen Sie dann den pH-Wert von 350 Milliliter Aliquoten der kaliumreichen Lösung, die mit 25 Millimolar MES gepuffert ist, auf pH 6,5, pH 5,5 und pH 5,0 ein. Sobald die Bildaufnahme abgeschlossen ist, entfernen Sie das HBSS von der 96-Well-Platte, die die Zellen enthält, und fügen Sie die kaliumreiche Lösung bei pH 7,5 hinzu. Dann fügen Sie Nigericin in einer Endkonzentration von 10 Mikrogramm pro Milliliter hinzu.
Legen Sie die Platte wieder auf das Mikroskop und erfassen Sie Bilder von jeder Vertiefung mit den gleichen Aufnahmeeinstellungen wie zuvor gezeigt. Um oxidative Ereignisse in Makropinosomen zu messen, säen Sie RAW264,7-Zellen einen Tag vor dem Assay in einer 96-Well-Platte aus, wie zuvor gezeigt. Dann am Tag des Assays alle Brunnen mit 100 Mikrolitern HBSS vorgewarmt auf 37 Grad Celsius waschen.
Als nächstes fügen Sie 100 Mikroliter HBSS mit 0,025 Milligramm pro Milliliter TMR mit 70 Kilodalton Dextran und 0,025 Milligramm pro Milliliter H2DCFDA mit 70 Kilodalton Dextran zu jeder Vertiefung hinzu und inkubieren Sie die Zellen dann bei 37 Grad Celsius für 15 Minuten. Nach dem Entfernen der Platte aus dem Inkubator waschen Sie die Zellen sechsmal mit 100 Mikrolitern HBSS. Nach der letzten Wäsche 100 Mikroliter HBSS in jede Vertiefung geben und die Platte auf das Mikroskop legen.
Nachdem Sie die Anregungs- und Emissionsparameter für TMR und H2DCFDA nach Bedarf angepasst haben, erfassen Sie Bilder von jeder Bohrung in Abständen von einem bis 15 Minuten, wie zuvor gezeigt. Um die Proteinverdauung in Makropinosomen zu messen, säen Sie RAW264,7-Zellen einen Tag vor dem Assay, wie zuvor gezeigt. Am Tag des Assays waschen Sie dann alle Brunnen mit 100 Mikrolitern HBSS, die bei 37 Grad Celsius vorgewärmt sind.
Als nächstes fügen Sie 100 Mikroliter HBSS mit 0,025 Milligramm pro Milliliter TMR-markiertem 70 Kilodalton Dextran in 0,2 Milligramm pro Milliliter BODIPY markiertem Ovalbumin zu jeder Vertiefung hinzu. Anschließend die Platte bei 37 Grad Celsius für 15 Minuten inkubieren. Nachdem Sie die Zellen aus dem Inkubator entfernt haben, waschen Sie sie sechsmal mit 100 Mikrolitern HBSS.
Nach der letzten Wäsche 100 Mikroliter HBSS in jede Vertiefung geben und dann die Platte auf das Mikroskop legen. Nachdem Sie die Anregungs- und Emissionsparameter für TMR und BODIPY nach Bedarf angepasst haben, erfassen Sie Bilder von jeder Bohrung in Abständen von einem bis 15 Minuten, wie zuvor gezeigt. Bei der Messung des pH-Werts, oxidativer Ereignisse oder des Proteinabbaus in Makropinosomen kann die Dynamik der Versauerung nicht für einen bestimmten Zeitraum gemessen werden, der der Dextran-Ladephase entspricht, die je nach verwendetem Zelltyp variiert.
Bei der Messung des Makropinosom-pH-Werts wird das Fluorescein-TMR-Verhältnis zunehmend kleiner und stagniert innerhalb von 15 Minuten nach der Erfassung. Dieses Plateau entspricht einem pH-Wert von etwa fünf, der in etwa dem pH-Wert von Lysosomen entspricht. Am Ende jeder Akquisition wird eine In-situ-Kalibrierung durchgeführt.
Das Fluorescein-TMR-Verhältnis sollte innerhalb des Kalibrierpuffers bei pH 7,5 am größten sein und zunehmend kleiner werden, wenn die Kalibrierpuffer saurer werden. Dies ermöglicht die Erstellung einer Kalibrierkurve. Bei der Messung oxidativer Ereignisse in Makropinosomen wird das Verhältnis von H2DCFDA zu TMR zunehmend größer und wird wahrscheinlich innerhalb der ersten 20 bis 30 Minuten in einer aktivierten RAW264.7-Zellen ein Plateau erreichen.
Bei der Messung der makropinosomalen Proteinverdauung wird ein progressiv starkes Fluoreszeinsignal freigesetzt, wenn das Ovalbumin verdaut wird. In RAW264.7-Zellen wird die Zunahme der Fluoreszenz, die aus dem verdauten BODIPY-markierten Ovalbumin freigesetzt wird, innerhalb der ersten 30 Minuten ein Plateau erreichen. Mit dieser aufstrebenden Rolle in der Homöostase und ihrer neu entdeckten Relevanz für die Krebspathologie ist derzeit eine Renaissance-Makropinozytoseforschung im Gange.
Diese Methoden wurden einem Werkzeugkasten zur Verfügung gestellt, um den Beitrag der Makropinozytose zu diesen Studienbereichen zu untersuchen.
