We would like to acknowledge the technical assistance of Kristina Jurcic in the University of Western Ontario MALDI MS facility, as well as the National Sciences and Engineering Council (NSERC) for funding this work. The authors would also like to acknowledge the Caprioli group (Vanderbilt University, TN) and Chaurand group (Universit&#233; de Montreal, QC) for their advice in optimizing the sublimation technique presented in this manuscript.

Alle Tier Verfahren für den Umgang unten, um sich an der University of Western Ontario Tierpflege Komitee (2016-014) beschrieben. 1. Gewebepräparation und Sectioning <ol><li> Extrahieren Hirngewebe von Ratten durch einen Prozess bekannt als &quot;frisch gefroren Extraction&quot; (FFE). <ol><li> Euthanize die Ratte mit einer Überdosis Pentobarbital-Natrium und überwachen Reflexe in den Gliedern. Sobald alle Reflexe aufgehört haben, trennen den Kopf der Ratte eine Guillotine mit. </li><li> Trennen Sie vorsichtig die Muskeln und andere Gewebe aus dem Schädel mit einem Skalpell. Verwenden Knochenschneidezangen den Schädel zu brechen, das Gehirn zu belichten, von der Basis des Schädels (Foramen magnum) mit dem vorderen Teil beginnen. </li><li> Sobald das Gehirn ausgesetzt ist, es vorsichtig mit einem Spatel chirurgischen aushöhlen und sofort für Flash Einfrieren auf zerstoßenem Trockeneis statt. HINWEIS: Das Gehirn wird sehr formbar sein. Daher extreme Vorsicht walten, wenn das Gehirn Platzierung aufTrockeneis. Wenn das Gehirn zerdrückt oder gegen eine Oberfläche gedrückt wird, wird er seine Form ändert und in dieser Position fixieren. </li></ol></li><li> Entfernen Sie frische gefrorene Gewebe (nicht mit Formaldehyd durchbluteten oder in OCT eingebettet) von - 80 ° C Gefrierschrank und auf Trockeneis. </li><li> Legen Sie einige Tropfen Wasser auf einem Kryostat Halter und auf entweder Trockeneis oder Kryostaten freeze bar. Drücken Sie Gewebe leicht auf Kryostaten Halter, wie es beginnt, bis das Wasser gefriert um die Basis des Gewebes und verankert sie an Ort und Stelle zu frieren und zu halten. Fügen Sie zusätzliches Wasser weiter in das Gewebe an der Halterung zu sichern, falls erforderlich. HINWEIS: Das Wasser wird zur Montage Gewebe, um anstelle der OCT Medien verwendet, um eine Kontamination des Gewebes mit den Verbindungen zu vermeiden, die die Erfassung des gewünschten Signals beeinflussen können. </li><li> Position Gewebe in Kryostaten. § Gewebe bis zur gewünschten anatomischen Lage. Stellen Sie sicher, dass die Schnittstärke zwischen 8 - 12 &amp; mgr; m. HINWEIS: Wenn Gewebe in kommunalen Kryostaten sectioningGeräte, ist es zwingend notwendig, dass getrennte Materialien wie Messer, Bürsten, Stabis und Halter, um eine Kontamination mit Vergussmassen zu vermeiden, verwendet werden. Das Innere des Kryostaten sollte auch gründlich mit Ethanol vor der Verwendung gereinigt werden. </li><li> Unter Verwendung des Kryostaten Stabilisator, abgeflachte langsam Abschnitt Gewebeschnitten. Löcher oder Markierungen auf dem Gewebe kann auftreten, wenn der Überrollbügel Platzierung ist falsch oder Klinge ist stumpf. Bewegen Sie das Gewebe in die Mitte des Schneidens Plattform sauber Pinseln verwenden. </li><li> Montage <ol><li> Frieren leitfähigen Folien oder Metallplatten, die durch sie in den Kryostaten platziert, während das Schneiden. Wenn der Schlitten vollständig gefroren, vorsichtig das geschnittene Gewebe auf die leitfähige Oberfläche des sauberen Pinseln mit Folie zu gelangen. Sobald alle Gewebeschnitte korrekt auf der Folie positioniert sind, legen Sie einen Finger unter der Folie, gegenüber dem Gewebe, und drücken Sie, bis der Abschnitt auftaut. HINWEIS: Abschnitte während des Auftauprozeß falten oder rollen kann, wennVerwendung dieses Montageverfahren. Dies kann durch Halten der Folie in dem Kryostaten verringert werden, wenn das Gewebe aufgetaut. Wenn diese Fragen problematisch werden, eine Alternative ist warm Einhängemethode unten aufgeführt. </li><li> Alternativ nehmen Sie ein Raumtemperatur Indiumzinnoxid (ITO) Schieber (oder Metallplatte) und leicht auf gefrorenen Gewebeschnitt nach unten auf das Aufschneiden Plattformoberfläche, leitfähige Seite nach unten drücken. Dies wird zu dem Gewebeschnitt Auftauen führen gleichmäßig auf die Oberfläche der Folie mit wenig Kräuseln oder Falten des Gewebes. HINWEIS: Die Kondensation unter dem Abschnitt auftreten können bei der Montage mit dieser Methode, die zum Verlust bestimmter Proteine ​​und Lipide führen kann. </li></ol></li><li> Die Objektträger mit dem Gewebe in einem Exsikkator während 5 - 10 min. </li></ol> 2. Sublimatorschiffchen Gerät Set-up HINWEIS: Führen Sie diese Schritte in einem Abzug. <ol><li> Legen Sie ein Sandbad in einem Aluminiumbehälter auf einer heißen Platte, mit der heißen Platte auf einem Metall-Scherenbühnegeeigneter Oberfläche (dh größer als die Kochplatte). Schalten Sie auf der heißen Platte und die Temperatur auf 140 ° C. HINWEIS: Der Schmelzpunkt für DAN-Matrix ist zwischen 187 bis 190 ° C. Verpassen Sie nicht diese Temperatur auf der Heizplatte nicht überschreiten. <ol><li> Wenn die heiße Platte mit einer Temperatur-Feedback-Sonde ausgestattet ist, verwenden Sie es Sandtemperatur während des Experiments zu überwachen und Temperaturkonstanz zu gewährleisten. Diese Funktion kann über verschiedene Sublimation Experimente mit dem Experiment Reproduzierbarkeit unterstützen. HINWEIS: Das Sandbad sollte in einem Aluminiumbehälter als Glasbehälter enthalten sein können, bei hohen Temperaturen zerbrechen. </li></ol></li><li> Platzieren 300 mg von DAN-Matrix auf der Bodenfläche des -Sublimationsapparatur. Legen Sie die Matrix in der Mitte der Vorrichtung und verteilt in einer gleichmäßigen Schicht in der ungefähren Breite und Länge des Schlittens sublimiert werden. VORSICHT: DAN-Matrix ist giftig. Daher ist es wichtig, Handschuhe tragen, Masken und SicherheitSchutzbrille zu allen Zeiten, wenn das pulverförmige Matrix Handhabung. DAN sollte im Dunkeln gelagert werden, da sie lichtempfindlich ist. </li><li> Band, das eine Metallplatte, auf die innere Oberfläche der Vorrichtung mit der Platte über die gesamte Oberfläche des Objektträgers während der Sublimation Kühl direkten Kontakt mit dem Boden des Kondensators, um sicherzustellen, gleichmäßige Verteilung der Temperatur zu machen. Alternativ Sand der Boden des Kondensators um eine flache Oberfläche zu gewährleisten. <ol><li> Legen Sie das Band entlang der äußeren Kanten der Platte und sich an den Seiten des inneren Glaswaren. Wenn das Band unter der Platte angeordnet ist, und haftet an dem Boden der inneren Glasoberfläche kann die Temperaturverteilung nicht gleichmäßig sein und in ungleichmäßigen Matrix Verteilung über die Oberfläche des Objektträgers führen könnte. </li><li> Kleben Sie ein Leerzeichen (Test) gleiten diagonal über die Oberfläche der Metallplatte mit dem Band wieder an den äußeren Rändern des Schlittens platziert. </li></ol></li><li> Verbinden Sie die oberen und unteren Abschnitte der Vorrichtung, wit einem Gummi-O-Ring in der Mitte eine vollständige Abdichtung zu gewährleisten. </li><li> Legen Sie ein Metall U-Gelenk um die Mitte des Gerätes und ziehen Laster, bis die obere und die untere Hälfte der Vorrichtung sind eng miteinander versiegelt. Legen Sie in den Metall-O-Ring über dem Sandbad. </li><li> Nehmen Sie eine Hand voll zerstoßenes Eis und legen Sie es in den Kondensator. Füllen Kondensator ¼ mit kaltem Wasser auf ½ Eisbrei zu schaffen. Die Eisbrei wird die Metallplatte auf der Innenseite der Vorrichtung kühlen und anschließend den Schieber daran haften. Warten mindestens 5 min für die Temperatur einen stabilen Zustand zu erreichen. </li><li> Gießen Sie 300 ml Ethanol in der Kühlfalle Behälter und legen Sie das Glas in den Behälter. Drop 2 bis 3 kleine Stücke Trockeneis in das Ethanol in der Unterseite des Kühlfalle Behälter. Die Kühlfalle Eingang hat ein Glasrohr mit dem Boden des Zylinders ausgeführt wird, während das Ausgangssignal nicht. </li><li> Schließen Sie die Vakuumpumpe an den Kühlfalle Ausgang Gummischlauch mit. Verwenden Sie ein anderes Stück GummiSchlauch der Kühlfalle Eingang mit dem -Sublimationsapparatur zu verbinden. Stellen Sie sicher, dass der Schlauch fest Metallklammern verwenden, wenn verfügbar gesichert ist. </li><li> Verwenden Sie die Vakuumpumpe ein Vakuum von 30 zu liefern - 50 mT. Die Pumpe für mindestens 5 min für Druckausgleich auszuführen. Schraubstöcke auf U-Ring der Sublimation Vorrichtung kann wieder festgezogen werden müssen, sobald die Vakuumpumpe aufgrund von vermindertem Druck in die Vorrichtung eingeschaltet wird. HINWEIS: Es wird dringend empfohlen, dass ein Vakuum-Messgerät an der Pumpe angebracht werden, um den Druck des Vakuums während des Experiments zu überwachen und auf undichte Stellen in Druck zu testen, um die höchstmögliche Reproduzierbarkeit zwischen den Experimenten zu erreichen. Allerdings sind die meisten Pumpen einen konstanten Druck aufrecht zu erhalten, damit der Sensor möglicherweise nicht für erfahrene Anwender wesentlich sein. Außerdem können Vakuumdichtung Fett verwendet werden, um Vakuumdruck helfen halten. </li></ol> 3. Sublimation <ol><li> Stellen Sie sicher, dass das Sandbad Temperatur stabilized bei 140 ° C und daß die Vorrichtung in dem Metall-O-Ring über dem Sandbad mit allen Schlauch verbunden gesichert ist und das Vakuum eingeschaltet. </li><li> Zeitschaltuhr für 7 min, aber nicht Timer starten. Langsam heben auf die -Sublimationsapparatur die Scherenbühne und Sandbad, bis die U-Gelenk des Sublimatorschiffchen deutlich über dem O-Ring-Metall ist. Dieser zusätzliche Platz kann für die Einstellung der Vorrichtung auf dem Sand. <ol><li> drücken Sie schnell die Sublimatorschiffchen sanft auf der Sandoberfläche, um sicherzustellen, dass die Vorrichtung gleichmäßig auf dem Sand sitzt, und dann sofort den Timer zu starten. </li></ol></li><li> Wenn der Timer ertönt, schalten Sie die Vakuumpumpe und vorsichtig absenken die Scherenbühne, bis der Sublimatorschiffchen ausgeschaltet ist nicht mehr das Sandbad zu berühren und sicher in der Metall-O-Ring sitzt. <ol><li> Langsam die Mikro-Entlüftungs lösen Ventildruck in der Vorrichtung zu lösen. Lösen Sie die Metallschelle um den Gummischlauch der -Sublimationsapparatur und beginnen langsam das Rohr zu lösen. Sobald die rubber Rohr leicht biegen, um die Röhre zu einer Seite zu ermöglichen, Restdruck entweichen gelockert wurde. </li><li> Bei Umgebungsdruck zurückkehrt, vorsichtig den Gummischlauch von der -Sublimationsapparatur entfernen. </li></ol></li><li> Lösen Sie die Laster auf der U-Verbindung des Gerätes und zu entfernen. Trennen Sie vorsichtig die beiden Hälften der -Sublimationsapparatur und ziehen Sie die Folie von der Oberseite des inneren Glaswaren aus. Untersuchen Folie zu bestätigen auch Matrix-Verteilung. HINWEIS: Wenn Matrix uneben ist, kann die pulverförmige Matrix in dem Boden des Sublimators neu positioniert werden, oder der Sublimator Vorrichtung kann für die nächste Folie in den Sand neu positioniert werden. Die Sublimation Vorgang mehrmals wiederholt werden, können die gleiche Matrix, jedoch wird die Matrix wird schließlich dunkler aus wiederholten Wärmebelastung und der Menge an Pulver, verringert sich, dass die Sublimation der Zeit geringfügig angepasst werden müssen kompensiert werden. Aus diesem Grund ist es wichtig, die Menge von Matrix bei überwachenng sublimierte nach jedem Experiment Konsistenz in Matrixablagerung zwischen den Folien, um sicherzustellen, </li><li> Wenn die Verteilung und Menge der Matrix sublimiert ausreichend ist, kleben Sie eine neue Folie mit Gewebe auf der Innenseite des Sublimatorschiffchen und wiederholen Sie Abschnitt 3. HINWEIS: Für die Qualitätskontrolle (QC) Zwecke kann die Menge der Matrix sublimierte nach jedem Experiment gemessen werden , indem die Folie vor und nach der Sublimation Wiege- und das Gewicht der sublimierten Matrix mit der Oberfläche des Schiebers Dividieren 2 sollte beachtet werden , dass aufgrund der mangelnden Präzision der meisten Skalen über vier Dezimalstellen und Variabilität zwischen den Skalen sollten diese Messungen nur einen Leitfaden für die optimale Matrix Ablagerung auf eine voll quantifizierbare Mittel der QC im Gegensatz verwendet werden, sofern nicht ein hoher Präzisionswaage (siehe Abbildung verwendet wird , 3). </li></ol> 4. Tissue Storage / Rehydrierung <ol><li> Nach Sublimation, Dias lagern in einem verschlossenen Behälter oder kleine Cassette in verschlossenen Plastikbeutel. </li><li> Inkubieren Dias in -20 ° C Gefrierschrank für 2 Stunden oder über Nacht. HINWEIS: Das Ziel des Gefriervorgangs ist als Rehydratisierungsschritt für die Desorption von Gewebematerialien in die Matrix zu wirken. Der Gefriervorgang ist auch gezeigt worden für bis zu 1 Woche Abbau von Lipidsignalen zu verhindern , wenn bei -80 ° C 12 gespeichert. Aus diesem Grund wird der Zeit die Menge der Proben in der Tiefkühltruhe aufbewahrt werden kann bis zu einem gewissen Grad variiert werden, um die Bedürfnisse des Experimentators zu entsprechen, ohne Signalerfassungs signifikant zu verändern (wie in unserem Labor beobachtet). Wir haben jedoch eine gewisse Verfärbung der Matrix bemerkt, wenn Proben länger als 24 h bei -20 ° C eingefroren. Daher empfehlen wir die Abbildung der sublimierten Gewebe vor dieser Zeit oder Gewebe bei -80 ° C für längere Inkubationszeiten zu speichern. </li><li> Objektträger aus der Gefriertruhe (und Behälter) und in einem Exsikkator 5 - 10 min. </li></ol> 5. Imaging und Analyse <ol><li> Die Objektträger aus Exsikkator und gelten Instrument Standards Massengenauigkeit von MALDI Instrument während der Bildgebung zu gewährleisten. Die Art der Standards werden in Abhängigkeit von Instrumentierungs variieren. Standards sind in der Regel gleichmäßig über den gesamten Objektträger, das umgebende Gewebe abgebildet werden (3D) angewendet. </li><li> Legen Sie Abgleiten in MALDI Instrument und folgen Sie den Anweisungen des Herstellers für die Bildgebung Experimente (Instrumentenverfahren für eine 1000 optimiert werden soll - 2000 Massenbereich). Repräsentative Ergebnis (Abbildung 4) wurde in Reflectron Negativ - Modus mit einer 70 &amp; mgr; m - Raster und 20 Schüsse / Spektrum (Erfassungszeit ~ 2 h) erworben. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Diese Arbeit Details eines standardisierten Protokolls von Matrix Sublimation auf das Gewebe für die Detektion von negativ geladenen Lipiden, wie Ganglioside, in MALDI IMS Experimenten. Probenvorbereitung für MALDI IMS ist sehr variabel und muss angepasst werden, um die einzigartigen Eigenschaften des Analyten von Interesse zu passen. Die Anwendung der Matrix auf die Gewebeprobenoberfläche ist ein wichtiger Aspekt des Probenherstellungsverfahrens im Hinblick auf die Qualität der Ergebnisse in IMS. Besondere Vorsicht...

Matrix-unterstützte Laser-Desorptions / Ionisations (MALDI) Imaging-Massenspektrometrie (IMS) entwickelt sich zu einem sehr begehrt Technik zur Visualisierung der räumlichen Verteilung von Lipiden, Peptiden und Proteinen in intakten Probenoberflächen. MALDI IMS wurde zuvor als analytische Technik für die vorgereinigten Analyten bekannt, aber in den letzten Jahren hat es sich in vielen anderen Disziplinen wegen der Fähigkeit, die Genauigkeit der Massenspektrometrie zu kombinieren mit einer hohen Auflösung optisch / anatomischer Referenzpunkte ohne das die Aufmerksamkeit müssen für jede externe Kennzeichnung. Da die wissenschaftliche Pool von Forschern diese Technik verwendet wird, weiter zu wachsen ist Bedarf an standardisierten, einfach zu folgen Protokolle erhöht in der Entwicklung und Optimierung von IMS Experimente zu unterstützen. Ganglioside, eine Gruppe von Membranlipiden sehr reichlich vorhanden in dem Zentralnervensystem, sind ideal für MALDI IMS Experimente wie ihre Lage in der Membran eingebettet ist, stellt sicher, speziES unmöglich mit konventionellen Immuno-Kennzeichnung zu erkennen. Darüber hinaus haben wir gezeigt, MALDI IMS verwenden, dass diese Lipide, die als Modulatoren von Zellsignalen funktionieren, unter anderem einzigartige anatomische Verteilungsmuster im gesunden Gehirn von Nagetieren, die 3 nach einer Hirnschädigung verändert, 4, 5. Ganglioside werden mit einer höheren Massenbereich im Vergleich zu den meisten Lipidspezies, und sind daher am meisten geeignet für die MALDI Bildgebungs Plattform befinden. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/55254/55254fig1.jpg" /> Abbildung 1: Workflow von MALDI IMS Experiment. Schematische Darstellung des allgemeinen Arbeitsablauf eines MALDI IMS Experiment unter Verwendung von Sublimation. Gewebe bei -80 ° C eingefroren ist in einem Kryostaten geschnitten und 10 &amp; mgr; m Abschnitte sind thaw auf leitfähigen ITO Objektträger aufgebracht. Der Objektträger wird dann in einem Exsikkator bis zur Sublimation platziert. slides in die Sublimation Vorrichtung eingeführt und eine gleichmäßige Schicht der Matrix ist auf der Gewebeprobenoberfläche aufgetragen. Die Proben werden über Nacht in einem -20 ° C Gefrierschrank eingefroren dann in einem Exsikkator für 10 Minuten gestellt. Sobald Normen angewandt wurden, werden die Proben in das MALDI Instrument eingeführt, wo ein Laser über das Gewebe gerichtet ist, verursacht desorbierten Moleküle in der Matrix zu ionisieren. Die Ionen wandern ein Flugrohr nach unten und getrennt auf der Grundlage ihrer Masse (time-of-flight / TOF), bis sie den Detektor erreichen. Die Informationen über die Ionenfluss von Analyten in einem vorbestimmten Masse-zu-Ladung (m / z) -Bereich wird sowohl als Molekularbild und Massenspektrum angezeigt. Diese Daten können verwendet werden, um sowohl zu visualisieren und die Ionenfluss des Analyten von Interesse innerhalb des abgebildeten Gewebes zu quantifizieren. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55254/55254fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55254/55254fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> Probenvorbereitungfür MALDI IMS ist sehr variabel, da jeder Schritt des Verfahrens an den Analyten von Interesse angepasst werden müssen. Das bestimmende Merkmal der MALDI-basierten Experimenten ist die Verwendung einer Matrix-Beschichtung auf die Probenoberfläche vor der Analyse abgeschieden. Zusätzlich zu der Rolle zu absorbieren und Strahlungsenergie von dem Laser während des Ablationsprozesses zu übertragen, dient die Matrix auch verschiedene Analyten aus der Probe zu isolieren, wodurch die Analyse der Verbindungen von Interesse zu erleichtern 6, 7. Homogenes Aufbringen der Matrix auf die Probenoberfläche ist der wichtigste Schritt bei der Probenvorbereitung. Eine falsche Matrix Abscheidung kann zu großen heterogenen Matrix Kristallformationen führen und die Entwicklung von Artefakten, niedrige Ionensignal und schlechte Reproduzierbarkeit 7. Aufgrund der Affinität bestimmter Matrices spezifischen Analyten zu isolieren, kann die Art der Matrix für ein Experiment ausgewähltdeutlich das Ergebnis zu verändern. Die Matrizen verwendet für die Bildgebung von Proteinen und Peptiden unterscheiden sich oft von denen, für die Bildgebung verwendeten Lipide und das Verfahren wird weiter durch die Notwendigkeit für zusätzliche Verfahren, wie Waschen und Rehydratation Schritte, um kompliziert erfolgreich Signale von Gewebe erkennen. Obwohl Waschschritte zur Verbesserung der Lipidsignale existieren 8, sind sie keine Voraussetzung für die Detektion der meisten Lipidspezies. Wenn eine Matrix für eine Lipidbildgebungsexperiment auswählt, ist es wichtig, dass die Polarität des Lipids von Interesse, da dies zu prüfen, wird der Bereich von geeigneten Matrizen renzen. Enthalten beispielsweise Ganglioside Sialinsäurereste, die sie insgesamt eine negative Polarität geben. Es gibt eine Reihe von Matrizen, die effektiv zu desorbieren und zu ionisieren Ganglioside aus Gewebe; jedoch Faktoren wie Matrix abgeleiteten Peaks im Spektrum und Stabilität der Matrix unter Vakuum muß in Betracht gezogen werden. 1,5-Diaminonaphthalin (DAN) Matrix ist ausreichend stabil , um unter Vakuumbedingungen Instrument für die meisten Abbildungsanwendungen und hat einen hohen Grad an Empfindlichkeit für Lipid Desorption gezeigt und kann sowohl in 2 positive und negative Ionenarten für die Analyse von Lipiden verwendet werden. DAN Matrix, wenn im Vergleich zu anderen negativen Lipid Affinitätsmatrizen wie Dihydroxybenzoesäure (DHB), 9-Aminoacridin (9-AA) und 5-Chloro-2-Mercaptobenzothiazol (CMBT), konnte am effizientesten Gangliosiden aus Rattenhirn desorbieren Gewebe im negativen Ionenmodus (Manuskript in Vorbereitung). die entsprechende Methode der Matrixablagerung Auswahl von gleicher Bedeutung ist selbst die Matrix zu wählen. Nassmatrixabscheidungsverfahren, wobei die feste Matrix in einem organischen Lösungsmittel gelöst wird, und durch pneumatische oder automatisierten Sprüher oder spotters abgeschieden sind besonders wirksam für die Desorption von Proteinen und Peptiden als die Flüssigkeit die Probe für zusätzliche zuzulassen permeiertction von Verbindungen und Co-Kristallisation mit der Matrix. Obwohl diese Techniken auch für die Lipid - Anwendungen verwendet werden kann, Analyt Delokalisierung und ungleichmäßige Matrix Kristallformationen sind häufige Vorkommen aufgrund der hohen Menge und Löslichkeit von Lipiden in Lösungsmitteln, insbesondere in Gewebe 2, 9. Weil Lipiden leicht aus Gewebe ionisiert werden, trockene Matrix Abscheidungstechniken, wie Sublimation, bieten eine einfache, kostengünstige Alternative zu Sprüher während viele der Nachteil dieser Techniken zu umgehen. Der Erfolg der Sublimierung in MALDI IMS Experimente auf Merkmale wie mikrokristalline Matrix Morphologie zugeschrieben , die für Matrix-Analyt - Bindung, erhöhte Matrix Reinheit der Oberfläche erhöht, und homogene Matrix Ablagerung zu einer erhöhten Reproduzierbarkeit im Vergleich zu nassen Matrixtechniken , 1, 10. Sublimation invoLves eine pulverisierte Matrix unter Vakuum unmittelbar unterhalb einer gekühlten Probenoberfläche Heizgas-Phasenübergang des pulverförmigen Matrix, gefolgt von der Abscheidung auf die Gewebeprobenoberfläche in Feststoff zu ergeben. Während der Sublimation, können Matrixablagerung durch Variieren Faktoren wie Zeit, Temperatur und Druck zu liefern hoch reproduzierbare Ergebnisse gesteuert werden. Ein einzelnes Sublimation Experiment kann überall nehmen von 5 bis 20 min in Abhängigkeit von der Art der Matrix ausgewählt wird, die mehrmals vor der Entsorgung wieder eingesetzt werden können. Die Vorrichtung kann zu einem Bruchteil des Preises von automatischen Sprüher im Handel erworben werden und ist leicht auseinander zur Reinigung und Wartung entnommen. Die niedrigen Kosten und die relative Einfachheit dieser Matrix-Abscheidungstechnik machen es für die Forscher ideale Beginn oder die Erweiterung auf Lipid-Imaging-Anwendungen in MALDI IMS. Auch wenn die Informations Protokolle für die Sublimation von Geweben für IMS haben Detaillierung 11 berichtet worden, einige standardisierte Protokolle existieren which konzentrieren sich auf die Basis-Workflow beteiligt mit einer Sublimation Experiment Durchführung für die Bildgebung mit hoher Masse Lipide im Negativ-Ionen-Modus, so dass es schwierig ist, die Technik ohne aufwendige Versuch und Irrtum zu etablieren. Im Folgenden ist ein experimentelles Protokoll, diese Lücke für die Sublimation von DAN Matrix auf Rattenhirnschnitten für hochauflösende Bildgebung und Detektion von Gangliosiden zu füllen Ziel. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/55254/55254fig2.jpg" /> Abbildung 2: -Sublimationsapparatur. Fotografie (A) und schematische Darstellung (B) der -Sublimationsapparatur. Die Vakuumpumpe wird durch Gummischlauch in eine Kühlfalle, gefüllt mit 300 ml Ethanol verbunden. Die Kühlfalle wird dann durch Gummischlauch zur Sublimation Vorrichtung verbunden. Die Vorrichtung besteht aus zwei separaten Teilen von Glaswaren, die zusammen mit einem Metall-U-joint abgedichtet sind. Die obere Hälfte des Sublimatorschiffchenenthält den Kondensator, der mit Eisbrei gefüllt ist. Die Probenplatte wird auf den Boden des Kondensators abgeklebt, im Inneren des abgedichteten Glasapparatur. Die untere Hälfte der -Sublimationsapparatur enthält die DAN-Matrix gleichmäßig verteilt die Probenplatte gegenüber. Während der Sublimation wird die Glasapparatur auf einem Sandbad mit einer heißen Platte erhitzt auf 140 ° C gebracht direkt darunter. Der Temperaturfühler trägt, durch Rückkopplung des Sandbad Temperatur im Vergleich zu der voreingestellten Temperatur für das Experiment eine stabile Temperatur während der Sublimation Experiments aufrechtzuerhalten. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55254/55254fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55254/55254fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sublimator</td>
			<td>Chemglass Life Sciences</td>
			<td>CG3038-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,5- Diaminonapthalene (DAN) matrix</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D21200&#160;</td>
			<td>100 G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>CryoStar NX50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot plate with temperature feedback</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td>HP88857290</td>
			<td>Isotemp ADVD 7x7 HP 100-120v</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless Steel Jack</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td>2216479</td>
			<td>10x10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cold Trap</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Custom built on site</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Pump</td>
			<td>Franklin Electric</td>
			<td>1102180403</td>
			<td>Savant VP100 Two Stage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Indium-tin-oxide (ITO) Slides</td>
			<td>Hudson Surface Technology</td>
			<td>PSI 1111000</td>
			<td>type II, 1.1mm/25 each</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MALDI TOF/TOF 5800 Instrument</td>
			<td>AB Sciex</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desiccator</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2797</td>
			<td>tabletop desiccator</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sublimation of dan matrix for the detection and visualization of gangliosides in rat brain tissue for maldi imaging mass spectrometry

Probenvorbereitung ist der Schlüssel für eine optimale Detektion und Visualisierung von Analyten in Matrix-unterstützte Laser-Desorption / Ionisation (MALDI) Imaging-Massenspektrometrie (IMS) Experimenten. Bestimmen des geeigneten Protokolls während der Probenvorbereitungsprozess folgen kann schwierig sein, da jede Stufe optimiert werden, müssen mit den einzigartigen Eigenschaften der Analyten von Interesse entsprechen. Dieser Prozess beinhaltet nicht nur eine kompatible Matrix zu finden, die die Moleküle von Interesse effizient desorbieren und ionisieren kann, sondern auch die entsprechende Matrix Abscheidungstechnik ausgewählt wird. Beispielsweise eine nasse Matrix Abscheidungstechnik, die eine Matrix in einem Lösungsmittel aufgelöst ist, beinhaltet, superior zur Desorption der meisten Proteine ​​und Peptide, während trockene Matrix Abscheidungstechniken besonders wirksam sind für die Ionisation von Lipiden. Sublimation hat sich als hocheffizientes Verfahren zur Trockenmatrixablagerung zum Nachweis von Lipiden in Gewebe durch MALDI IMS aufgrund der homogenei berichtetty der Matrix Kristallablagerung und minimale Analyten Delokalisierung im Vergleich zu vielen Nassabscheidungsverfahren 1, 2. Im weitesten Sinne handelt es mit den Proben gegen eine kalte Oberfläche gepresst in einer vakuumdichten Kammer, die eine Probe und pulverisierten Matrix platzieren. Die Vorrichtung wird dann in ein erwärmtes Bad (Sand oder Öl) gesenkt, was zu Sublimation des pulverförmigen Matrix auf der Probenoberfläche gekühlt Gewebe. Hier beschreiben wir ein Sublimations-Protokoll 1,5-Diaminonaphthalin (DAN) -Matrix für die Detektion und Darstellung von Gangliosiden in dem Rattenhirn unter Verwendung von MALDI IMS.

Nach Beendigung der Sublimation Experiment wurden die beiden Hälften der Glasapparatur sind in der Abzugshaube und dem Schieber getrennt ist , zu dem Kondensator abgeklebt, kann (3A) entfernt werden. An dieser Stelle sollte der Schieber für unebene Matrix Verteilung und die Zeit, die Temperatur oder die Platzierung der Vorrichtung in dem Sandbad untersucht werden kann für die nächste Folie angepasst werden. Eine erfolgreiche DAN Sublimation Experiment in eine gleichm...

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Sublimation of DAN Matrix for the Detection and Visualization of Gangliosides in Rat Brain Tissue for MALDI Imaging Mass Spectrometry

A protocol for the sublimation of DAN matrix onto rat brain tissue for the detection of gangliosides using MALDI Imaging Mass Spectrometry is presented.

Sublimation von DAN Matrix für die Erkennung und Visualisierung von Gangliosiden in Rattenhirngewebe für die MALDI-Imaging-Massenspektrometrie

Sample preparation is key for optimal detection and visualization of analytes in Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization (MALDI) Imaging Mass ...

sublimation-dan-matrix-for-detection-visualization-gangliosides-rat

Research

JoVE Journal

Neuroscience

10.7K Aufrufe.  The University of Western Ontario. A protocol for the sublimation of DAN matrix onto rat brain tissue for the detection of gangliosides using MALDI Imaging Mass Spectrometry is presented.

Serie: Sublimation of DAN Matrix for the Detection and Visualization of Gangliosides in Rat Brain Tissue for MALDI Imaging Mass Spectrometry

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other insects proprioception is provided by specialized sensory organs termed chordotonal organs (ChOs) 2. Like many other organs in Drosophila, ChOs develop twice during the life cycle of the fly. First, the larval ChOs develop during embryogenesis. Then, the adult ChOs start to develop in the larval imaginal discs and continue to differentiate during metamorphosis.
The development of larval ChOs during embryogenesis has been studied extensively 10,11,13,15,16. The centerpiece of each ChO is a sensory unit composed of a neuron and a scolopale cell. The sensory unit is stretched between two types of accessory cells that attach to the cuticle via specialized epidermal attachment cells 1,9,14. When a fly larva moves, the relative displacement of the epidermal attachment cells leads to stretching of the sensory unit and consequent opening of specific transient receptor potential vanilloid (TRPV) channels at the outer segment of the dendrite 8,12. The elicited signal is then transferred to the locomotor central pattern generator circuit in the central nervous system.
Multiple ChOs have been described in the adult fly 7. These are located near the joints of the adult fly appendages (legs, wings and halters) and in the thorax and abdomen. In addition, several hundreds of ChOs collectively form the Johnston's organ in the adult antenna that transduce acoustic to mechanical energy 3,5,17,4.
In contrast to the extensive knowledge about the development of ChOs in embryonic stages, very little is known about the morphology of these organs during larval stages. Moreover, with the exception of femoral ChOs 18 and Johnston's organ, our knowledge about the development and structure of ChOs in the adult fly is very fragmentary.
Here we describe a method for staining and visualizing ChOs in third instar larvae and pupae. This method can be applied together with genetic tools to better characterize the morphology and understand the development of the various ChOs in the fly.

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

A method to immunostain and visualize chordotonal organs in larvae and pupae of Drosophila melanogaster is described.

Visualisierung von Propriozeptoren in<em&gt; Drosophila</em&gt; Larven und Puppen

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other ...

Forschung

Neurowissenschaften

Stereotaxic Surgery for Excitotoxic Lesion of Specific Brain Areas in the Adult Rat

Many behavioral functions in mammals, including rodents and humans, are mediated principally by discrete brain regions. A common method for discerning the function of various brain regions for behavior or other experimental outcomes is to implement a localized ablation of function. In humans, patient populations with localized brain lesions are often studied for deficits, in hopes of revealing the underlying function of the damaged area. In rodents, one can experimentally induce lesions of specific brain regions.
Lesion can be accomplished in several ways. Electrolytic lesions can cause localized damage but will damage a variety of cell types as well as traversing fibers from other brain regions that happen to be near the lesion site. Inducible genetic techniques using cell-type specific promoters may also enable site-specific targeting. These techniques are complex and not always practical depending on the target brain area. Excitotoxic lesion using stereotaxic surgery, by contrast, is one of the most reliable and practical methods of lesioning excitatory neurons without damaging local glial cells or traversing fibers.
Here, we present a protocol for stereotaxic infusion of the excitotoxin, N-methyl-D-aspartate (NMDA), into the basolateral amygdala complex. Using anatomical indications, we apply stereotaxic coordinates to determine the location of our target brain region and lower an injection needle in place just above the target. We then infuse our excitotoxin into the brain, resulting in excitotoxic death of nearby neurons. While our experimental subject of choice is a rat, the same methods can be applied to other mammals, with the appropriate adjustments in equipment and coordinates.
This method can be used on a variety of brain regions, including the basolateral amygdala1-6, other amygdala nuclei6, 7, hippocampus8, entorhinal cortex9 and prefrontal cortex10. It can also be used to infuse biological compounds such as viral vectors1, 11. The basic stereotaxic technique could also be adapted for implantation of more permanent osmotic pumps, allowing more prolonged exposure to a compound of interest.

Targeted ablation of specific brain region(s) by infusion of an excitotoxin using stereotaxic coordinates is described. This technique could also be adapted for infusion of other chemicals into the rat brain.

Stereotaktischen Chirurgie für Exzitotoxische Läsion Spezifische Hirnareale in der erwachsenen Ratte

Many behavioral functions in mammals, including rodents and humans, are mediated principally by discrete brain regions. A common method for discerning the ...

Fiber-optic Implantation for Chronic Optogenetic Stimulation of Brain Tissue

Elucidating patterns of neuronal connectivity has been a challenge for both clinical and basic neuroscience. Electrophysiology has been the gold standard for analyzing patterns of synaptic connectivity, but paired electrophysiological recordings can be both cumbersome and experimentally limiting. The development of optogenetics has introduced an elegant method to stimulate neurons and circuits, both in vitro1 and in vivo2,3. By exploiting cell-type specific promoter activity to drive opsin expression in discrete neuronal populations, one can precisely stimulate genetically defined neuronal subtypes in distinct circuits4-6. Well described methods to stimulate neurons, including electrical stimulation and/or pharmacological manipulations, are often cell-type indiscriminate, invasive, and can damage surrounding tissues. These limitations could alter normal synaptic function and/or circuit behavior. In addition, due to the nature of the manipulation, the current methods are often acute and terminal. Optogenetics affords the ability to stimulate neurons in a relatively innocuous manner, and in genetically targeted neurons. The majority of studies involving in vivo optogenetics currently use a optical fiber guided through an implanted cannula6,7; however, limitations of this method include damaged brain tissue with repeated insertion of an optical fiber, and potential breakage of the fiber inside the cannula. Given the burgeoning field of optogenetics, a more reliable method of chronic stimulation is necessary to facilitate long-term studies with minimal collateral tissue damage. Here we provide our modified protocol as a video article to complement the method effectively and elegantly described in Sparta et al.8 for the fabrication of a fiber optic implant and its permanent fixation onto the cranium of anesthetized mice, as well as the assembly of the fiber optic coupler connecting the implant to a light source. The implant, connected with optical fibers to a solid-state laser, allows for an efficient method to chronically photostimulate functional neuronal circuitry with less tissue damage9 using small, detachable, tethers. Permanent fixation of the fiber optic implants provides consistent, long-term in vivo optogenetic studies of neuronal circuits in awake, behaving mice10 with minimal tissue damage.

The development of optogenetics now provides the means to precisely stimulate genetically defined neurons and circuits, both in vitro and in vivo. Here we describe the assembly and implantation of a fiber optic for chronic photostimulation of brain tissue.

LWL-Implantation für chronische optogenetische Stimulation des Hirngewebes

Elucidating patterns of neuronal connectivity has been a challenge for both clinical and basic neuroscience. Electrophysiology has been the gold standard ...

Immunohistochemical Analysis in the Rat Central Nervous System and Peripheral Lymph Node Tissue Sections

Immunohistochemistry (IHC) provides highly specific, reliable and attractive protein visualization. Correct performance and interpretation of an IHC-based multicolor labeling is challenging, especially when utilized for assessing interrelations between target proteins in the tissue with a high fat content such as the central nervous system (CNS).
Our protocol represents a refinement of the standard immunolabeling technique particularly adjusted for detection of both structural and soluble proteins in the rat CNS and peripheral lymph nodes (LN) affected by neuroinflammation. Nonetheless, with or without further modifications, our protocol could likely be used for detection of other related protein targets, even in other organs and species than here presented.

We here present an optimized, detailed protocol for double immunostaining in formalin-fixed, paraffin-embedded rat central nervous system (CNS) and peripheral lymph node (LN) tissue sections.

Immunhistochemische Analyse im Rat des Zentralnervensystems und peripheren Lymphknoten Gewebeschnitte

Immunohistochemistry (IHC) provides highly specific, reliable and attractive protein visualization. Correct performance and interpretation of an IHC-based ...

A Dual Tracer PET-MRI Protocol for the Quantitative Measure of Regional Brain Energy Substrates Uptake in the Rat

We present a method for comparing the uptake of the brain&#39;s two key energy substrates: glucose and ketones (acetoacetate [AcAc] in this case) in the rat. The developed method is a small-animal positron emission tomography (PET) protocol, in which&#160;11C-AcAc and 18F-fluorodeoxyglucose (18F-FDG) are injected sequentially in each animal. This dual tracer PET acquisition is possible because of the short half-life of 11C (20.4 min). The rats also undergo a magnetic resonance imaging (MRI) acquisition seven days before the PET protocol. Prior to image analysis, PET and MRI images are coregistered to allow the measurement of regional cerebral uptake (cortex, hippocampus, striatum, and cerebellum). A quantitative measure of 11C-AcAc and 18F-FDG brain uptake (cerebral metabolic rate; &#956;mol/100 g/min) is determined by kinetic modeling using the image-derived input function (IDIF) method. Our new dual tracer PET protocol is robust and flexible; the two tracers used can be replaced by different radiotracers to evaluate other processes in the brain. Moreover, our protocol is applicable to the study of brain fuel supply in multiple conditions such as normal aging and neurodegenerative pathologies such as Alzheimer&#39;s and Parkinson&#39;s diseases.

Small-animal positron emission tomography enables the assessment of the brain&#39;s two main energy substrates:&#160;glucose and ketones. In the present method, 11C-acetoacetate and 18F-fluorodeoxyglucose are injected sequentially in each animal, and their uptake is measured quantitatively in specific brain regions determined from the magnetic resonance images.

We present a method for comparing the uptake of the brain&#39;s two key energy substrates: glucose and ketones (acetoacetate [AcAc] in this case) in the ...

Live Imaging of Mitosis in the Developing Mouse Embryonic Cortex

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the developing cerebral cortex, abnormal mitosis of neural progenitors can cause defects in brain size and function. Hence, there is a critical need for tools to understand the mechanisms of neural progenitor mitosis. Cortical development in rodents is an outstanding model for studying this process. Neural progenitor mitosis is commonly examined in fixed brain sections. This protocol will describe in detail an approach for live imaging of mitosis in ex vivo embryonic brain slices. We will describe the critical steps for this procedure, which include: brain extraction, brain embedding, vibratome sectioning of brain slices, staining and culturing of slices, and time-lapse imaging. We will then demonstrate and describe in detail how to perform post-acquisition analysis of mitosis. We include representative results from this assay using the vital dye Syto11, transgenic mice (histone H2B-EGFP and centrin-EGFP), and in utero electroporation (mCherry-&#945;-tubulin). We will discuss how this procedure can be best optimized and how it can be modified for study of genetic regulation of mitosis. Live imaging of mitosis in brain slices is a flexible approach to assess the impact of age, anatomy, and genetic perturbation in a controlled environment, and to generate a large amount of data with high temporal and spatial resolution. Hence this protocol will complement existing tools for analysis of neural progenitor mitosis.

Neural progenitor mitosis is a critical parameter of neurogenesis. Much of our understanding of neural progenitor mitosis is based on analysis of fixed tissue. Live imaging in embryonic brain slices is a versatile technique to assess mitosis with high temporal and spatial resolution in a controlled environment.

Live-Imaging der Mitose in der Entwicklung von embryonalen Maus-Cortex

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the ...

Non-invasive Parenchymal, Vascular and Metabolic High-frequency Ultrasound and Photoacoustic Rat Deep Brain Imaging

Photoacoustics and high frequency ultrasound stands out as powerful tools for neurobiological applications enabling high-resolution imaging on the central nervous system of small animals. However, transdermal and transcranial neuroimaging is frequently affected by low sensitivity, image aberrations and loss of space resolution, requiring scalp or even skull removal before imaging. To overcome this challenge, a new protocol is presented to gain significant insights in brain hemodynamics by photoacoustic and high-frequency ultrasounds imaging with the animal skin and skull intact. The procedure relies on the passage of ultrasound (US) waves and laser directly through the fissures that are naturally present on the animal cranium. By juxtaposing the imaging transducer device exactly in correspondence to these selected areas where the skull has a reduced thickness or is totally absent, one can acquire high quality deep images and explore internal brain regions that are usually difficult to anatomically or functionally describe without an invasive approach. By applying this experimental procedure, significant data can be collected in both sonic and optoacoustic modalities, enabling to image the parenchymal and the vascular anatomy far below the head surface. Deep brain features such as parenchymal convolutions and fissures separating the lobes were clearly visible. Moreover, the configuration of large and small blood vessels was imaged at several millimeters of depth, and precise information were collected about blood fluxes, vascular stream velocities and the hemoglobin chemical state. This repertoire of data could be crucial in several research contests, ranging from brain vascular disease studies to experimental techniques involving the systemic administration of exogenous chemicals or other objects endowed with imaging contrast enhancement properties. In conclusion, thanks to the presented protocol, the US and PA techniques become an attractive noninvasive performance-competitive means for cortical and internal brain imaging, retaining a significant potential in many neurologic fields.

The present work describes a new protocol to perform non-invasive high-frequency ultrasound and photoacoustic based imaging on rat brain, to efficiently visualize deep subcortical regions and their vascular patterns by directing signals on skull foramina naturally present on animal cranium.

Nicht-invasive Parenchymale, Gefäß- und Stoffwechselhochfrequenz-Ultraschall und Photoakustische Rat Deep Brain Imaging

Photoacoustics and high frequency ultrasound stands out as powerful tools for neurobiological applications enabling high-resolution imaging on the central ...

Visualization of Amyloid &#946; Deposits in the Human Brain with Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Imaging Mass Spectrometry

The neuropathology of Alzheimer&#39;s disease (AD) is characterized by the accumulation and aggregation of amyloid &#946; (A&#946;) peptides into extracellular plaques of the brain. The A&#946; peptides, composed of 40 amino acids, are generated from amyloid precursor proteins (APP) by &#946;- and &#947;-secretases. A&#946; is deposited not only in cerebral parenchyma but also in leptomeningeal and cerebral vessel walls, known as cerebral amyloid angiopathy (CAA). While a variety of A&#946; peptides were identified, the detailed production and distribution of individual A&#946; peptides in pathological tissues of AD and CAA have not been fully addressed. Here, we develop a protocol of matrix-assisted laser desorption/ionization-based imaging mass spectrometry (MALDI-IMS) on human autopsy brain tissues to obtain comprehensive protein mapping. For this purpose, human cortical specimens were obtained from the Brain Bank at the Tokyo Metropolitan Institute of Gerontology. Frozen cryosections are cut and transferred to indium-tin-oxide (ITO)-coated glass slides. Spectra are acquired using the MALDI system with a spatial resolution up to 20 &#181;m. Sinapinic acid (SA) is uniformly deposited on the slide using either an automatic or a manual sprayer. With the current technical advantages of MALDI-IMS, a typical data set of various A&#946; species within the same sections of human autopsied brains can be obtained without specific probes. Furthermore, high-resolution (20 &#181;m) imaging of an AD brain and severe CAA sample clearly shows that A&#946;1-36 to A&#946;1-41 were deposited into leptomeningeal vessels, while A&#946;1-42 and A&#946;1-43 were deposited in cerebral parenchyma as senile plaque (SP). It is feasible to adopt MALDI-IMS as a standard approach in combination with clinical, genetic, and pathological observations in understanding the pathology of AD, CAA, and other neurological diseases based on the current strategy.

Molecular imaging with matrix-assisted laser desorption/ionization-based imaging mass spectrometry (MALDI-IMS) allows the simultaneous mapping of multiple analytes in biological samples. Here, we present a protocol for the detection and visualization of amyloid &#946; protein on brain tissues of Alzheimer&#39;s disease and cerebral amyloid angiopathy samples using MALDI-IMS.

Visualisierung von Amyloid-β-Einlagen in das menschliche Gehirn mit Matrix-unterstützte Laser Desorption/Ionisierung bildgebende Massenspektrometrie

The neuropathology of Alzheimer&#39;s disease (AD) is characterized by the accumulation and aggregation of amyloid &#946; (A&#946;) peptides into ...

Light-Induced Molecular Adsorption of Proteins Using the PRIMO System for Micro-Patterning to Study Cell Responses to Extracellular Matrix Proteins

Cells sense a variety of extracellular cues, including the composition and geometry of the extracellular matrix, which is synthesized and remodeled by the cells themselves. Here, we present the method of Light-Induced Molecular Adsorption of Proteins (LIMAP) using the PRIMO system as a patterning technique to produce micro-patterned extracellular matrix (ECM) substrates using a single or combination of proteins. The method enables printing of ECM patterns in micron resolution with excellent reproducibility. We provide a step-by-step protocol and demonstrate how this can be applied to study the processes of neuronal pathfinding. LIMAP has significant advantages over existing micro-printing methods in terms of the ease of patterning more than one component and the ability to generate a pattern with any geometry or gradient. The protocol can easily be adapted to study the contribution of almost any chemical component towards cell fate and cell behavior. Finally, we discuss common issues that can arise and how these can be avoided.

Our overall aim is to understand how cells sense extracellular cues that lead to directed axonal growth. Here, we describe the methodology of Light-Induced Molecular Adsorption of Proteins, used to produce defined micro-patterns of extracellular matrix components in order to study specific events that govern axon outgrowth and pathfinding.

Lichtinduzierte molekulare Adsorption von Proteinen mit dem PRIMO-System für Mikro-Patterning zur Untersuchung von Zellreaktionen auf extrazelluläre Matrixproteine

Cells sense a variety of extracellular cues, including the composition and geometry of the extracellular matrix, which is synthesized and remodeled by the ...

Labeling and Imaging of Amyloid Plaques in Brain Tissue Using the Natural Polyphenol Curcumin

Deposition of amyloid beta protein (A&#946;) in extra- and intracellular spaces is one of the hallmark pathologies of Alzheimer&#39;s disease (AD). Therefore, detection of the presence of A&#946; in AD brain tissue is a valuable tool for developing new treatments to prevent the progression of AD. Several classical amyloid binding dyes, fluorochrome, imaging probes, and A&#946;-specific antibodies have been used to detect A&#946; histochemically in AD brain tissue. Use of these compounds for A&#946; detection is costly and time consuming. However, because of its intense fluorescent activity, high-affinity, and specificity for A&#946;, as well as structural similarities with traditional amyloid binding dyes, curcumin (Cur) is a promising candidate for labeling and imaging of A&#946; plaques in postmortem brain tissue. It is a natural polyphenol from the herb Curcuma longa. In the present study, Cur was used to histochemically label A&#946; plaques from both a genetic mouse model of 5x familial Alzheimer&#39;s disease (5xFAD) and from human AD tissue within a minute. The labeling capability of Cur was compared to conventional amyloid binding dyes, such as thioflavin-S (Thio-S), Congo red (CR), and Fluoro-jade C (FJC), as well as A&#946;-specific antibodies (6E10 and A11). We observed that Cur is the most inexpensive and quickest way to label and image A&#946; plaques when compared to these conventional dyes and is comparable to A&#946;-specific antibodies. In addition, Cur binds with most A&#946; species, such as oligomers and fibrils. Therefore, Cur could be used as the most cost-effective, simple, and quick fluorochrome detection agent for A&#946; plaques.

Curcumin is an ideal fluorophore for labeling and imaging of amyloid beta protein plaques in brain tissue due to its preferential binding to amyloid beta protein as well as its structural similarities with other traditional amyloid binding dyes. It can be used to label and image amyloid beta protein plaques more efficiently and inexpensively than traditional methods.

Etikettierung und Bildgebung von Amyloid-Plaques im Gehirngewebe mit dem natürlichen Polyphenol Curcumin

Deposition of amyloid beta protein (A&#946;) in extra- and intracellular spaces is one of the hallmark pathologies of Alzheimer&#39;s disease (AD). ...