Der Hauptbeitrag unseres Papiers ist, dass wir eine präzise und feine Landschaft der Amyloid-Betapathologie des Alzheimer-Gehirns mit der bildgebenden Technologie der MALDI-Bildgebungs-Massenspektrometrie erforscht haben. Wir haben technologische Fortschritte erzielt, indem wir ein spezielles Protokoll mit Ameisensäurevorbehandlung der Geweberutschen erzeugt haben. Nach MALDI-IMS werden Segmentierungskarten erstellt und Berechnungen durchgeführt, um neuartige Markerproteine oder Peptide zu entdecken, die mit Plaque und Subarachnoidervaskulatur kolokalisiert sind.
Besorgen Sie menschliche kortikale Proben für IMS von Gehirnen, die innerhalb von acht Stunden nach dem Tod bei minus 80 Grad Celsius entfernt, verarbeitet und gelagert wurden. Nehmen Sie die Hirnprobe aus dem okzipitalen Kortex von AD-Patienten und altersgerechten Kontrollen. Um die Gewebeabschnitte auf einem Kryostat zu schneiden, schieben sich zunächst leitfähiges Indiumzinnoxid oder ITO-beschichtetes Mikroskopglas in den Kryostat.
Erwärmen Sie die Autopsie Gehirn Probe von minus 80 Grad Celsius auf minus 22 Grad Celsius im Kryostat. Befestigen Sie für jedes Experiment eine neue Einwegklinge am Kryostat. Versuchen Sie immer, einen sauberen Teil der Klinge zu verwenden.
Setzen Sie die gefrorenen Autopsie Gehirne auf der Bühne zusammen mit einer kleinen Menge an optimalen Schneidtemperatur-Verbindung. Für IMS und Immunhistochemie fünf bis sechs Abschnitte aus jeder Gewebeprobe schneiden. Wenn die Klinge gerade erst damit beginnt, das Gewebe zu schneiden, drehen Sie das Rad und stellen Sie sich dem Block, bis das gesamte Gewebe freigelegt ist.
Wenn es einen kleinen Streifen oder Riss über den Abschnitt gibt, warten Sie im Kryostat, bis die Temperatureinstellung ihn automatisch fixiert. Zählen Sie ein paar Sekunden vor dem Öffnen der Anti-Rolle mit einem Gewebe darunter. Legen Sie die Gewebescheibe sofort auf die ITO-beschichtete Seite des Glasschlittens.
Tauen Sie die Gewebescheibe, indem Sie einen Finger unter die Folie auf der nicht-ITO-beschichteten Seite. Das Gewebe klebt an der Rutsche. Stellen Sie sicher, dass das Gewebe so flach wie möglich und ohne Falten ist.
Um die Gewebeabschnitte zu spülen, tauchen Sie die Proben in 40 bis 100 Milliliter 70% Ethanol in ein Glas-Färbeglasglas 30 Sekunden, um endogene Lipide und anorganische Salze zu entfernen. Waschen Sie die Proben mit der im Textprotokoll aufgeführten Waschsequenz. Dann trocknen Sie die Proben in einem Vakuum für 30 Minuten.
Behandeln Sie nun die Gewebeabschnitte mit einem Ameisensäuredampf für eine bessere Ionisierung der Amyloid-Betaproteine aus Autopsie-Gehirngewebe. Dazu bereiten Sie den Ofen bei 60 Grad Celsius und eine Inkubationsglasschale mit fünf Millilitern 100%Ameisensäure zu. Halten Sie die Luftfeuchtigkeit in der Inkubationsglasschale auf Sättigungsniveau.
Legen Sie die Gewebeglyse in die Inkubationsglasschale, während Sie das Eintauchen in die Ameisensäure vermeiden und sechs Minuten lang behandeln. Nehmen Sie ein optisches Bild der Proben mit einem Filmscanner, einem Gelscanner oder einem digitalen Mikroskop auf. Führen Sie diesen Schritt bei Raumtemperatur aus.
Die Ausrichtung des optischen Bildes der Proben ist notwendig, wenn das Probenziel im Gerät platziert wird. Normalerweise ist es nicht möglich, den Gewebeabschnitt unter der Matrixschicht zu erkennen. Um die optischen Bilder mit den Samples zu korrelieren, erstellen Sie Führungszeichen, die sowohl im optischen Bild als auch unterhalb der Matrixschicht in der Kameraoptik sichtbar sind.
Der einfachste Weg ist, mindestens drei Korrekturflüssigkeitsmarkierungen um die Probe herum zu erkennen, bevor das optische Bild genommen wird. Um die Matrix mit einem Ultraschallsprüher zu besprühen, entfernen Sie das zu sprühende Gewebe aus dem Trockenhaus und legen Sie es in die Kammer. Stellen Sie sicher, dass das Gewebe das Sensorfenster nicht bedeckt.
Starten Sie die Vorbereitung, indem Sie die Starttaste drücken. In der Regel beträgt die Vorbereitungszeit etwa 90 Minuten. Die Aufbereitung wird automatisch über die Überwachung der Matrixschichtdicke und Nässe geregelt.
Alternativ können Sie die Matrixlösung mit einem automatischen Sprühgerät auf die Gewebeoberfläche sprühen, um die Matrixlösung mit einem Lösemittelpumpensystem von 10 psi und 0,15 Milliliter pro Minute zu besprühen. Ein konstanter Fluss von beheiztem Mantelgas wird zusammen mit dem Matrixlösungsspray geliefert. Führen Sie Bildgebungsexperimente mit hohem Durchsatz und hoher räumlicher Auflösung mit MALDI-IMS durch.
Definieren Sie für die Messung der Massenspektrometrie die Gewebebereiche mit der Steuerungssoftware MALDI und der Datenanalysesoftware. Erfassen Sie Spektren in einem positiven linearen Modus mit einem Massen-Ladeverhältnis-Bereich von 2 000 bis 20.000 und einer räumlichen Auflösung von 20 und 100 Mikrometern. Um den Kalibrierstandard zu machen, lösen Sie den Peptidkalibrierungsstandard und den Proteinkalibrierungsstandard im Verhältnis eins zu vier mit CHCA- und TA30-Lösung auf und verdünnen Sie ihn dann 10-mal.
Platzieren Sie einen Mikroliter Kalibrierstandard an vier verschiedenen Stellen auf dem Dia. Mit molekularer Histologie-Software, überlagern mehrere Signalbilder, um die räumliche Korrelation von verschiedenen Signalen wie verschiedene Amyloid-Beta-Peptide kolokalisieren in senilen Plaques und arteriellen Wänden zu finden. Die zerebrale Amyloid-Angiopathie oder CAA-Phänotypen von Patient Nummer drei waren in dieser Studie am prominentesten.
MALDI-IMS des Gehirngewebes dieses Patienten hat deutlich visualisiert, dass Amyloid beta 1-42 und Amyloid beta 1-43 bevorzugt als senile Plaques im zerebralen Parenchym abgelegt wurden. Im Gegensatz dazu wurden kürzere Amyloid-Betas wie Amyloid beta 1-36 bis 1-41 bevorzugt auf die leptomeningealen Gefäßbereiche abgelagert. Es gab keine signifikanten Signale in der nicht-pathologischen Kontrolle.
Die Verteilungen von Amyloid beta 1-40 und Amyloid beta 1-42 wurden mit der Immunhistochemie unter Verwendung benachbarter gefrorener Gewebeabschnitte weiter validiert. Die Anti-Amyloid beta 1-40 Antikörper mit der Bezeichnung CAA und zeigte Amyloid beta 1-40 wird bevorzugt in leptomeningealen Blutgefäßen abgelagert, was ein klarer Kontrast zur Verteilung von Amyloid beta 1-42 im Zerebralparesch als senilen Plaques ist. Hier ist eine Segmentierungskarte zu sehen, die mit einer bisecting k-means-Analyse erhalten wurde, die auf denselben Abschnitt aus Patient Nummer 3 angewendet wird.
Diese Clustering-Methode identifizierte erfolgreich plaqueartige Strukturen in den Parenchymen- und Gefäßstrukturen im Subarachnoidenraum. Es ist interessant, einen kleinen kreisförmigen Bereich im Parenchym zu finden, der nur um eine kleine Arteriole im Parenchym sowie im Subarachnoidenraum nachgewiesen wird. Dies wird durch einzelne Ionenbilder dieser einzelnen Amyloid-Beta-Peptide bestätigt.
Es gibt eine Grenze, um eine breite Palette von Amyloid Betas gleichzeitig zu verfolgen, auch wenn die spezifischen Antikörper zu verwenden. Hier zeigen wir die Verteilung von Amyloid-Beta im menschlichen Gehirn mit der hochmodernen MALDI-Bild-Massenspektrometrie-Methode. Wir glauben, dass dieser Beitrag einen Durchbruch in der Alzheimer-Krankheitsforschung schafft, weil dieser Bericht die Charakterisierung des gesamten Satzes von Amyloid-Beta-Proteinen in menschlichen autopsied Gehirnen bietet.
Die eindrucksvollste Erkenntnis ist, dass nur eine einzige Aminosäureveränderung am C-Terminal des Amyloid-Beta-Proteins eine drastische Veränderung in ihrer Verteilung bewirken. Die Schritte zur Gewebevorbereitung sind entscheidend, um eine effektive Ionisierung von aggregierten Proteinen im menschlichen Gehirngewebe zu erhalten. Homogene Kokristallisation des Analyten mit Matrixen, die für hohe Empfindlichkeit und artefaktfreie Bildgebung entscheidend sind.
