Die Autoren bedanken sich bei Dr. Jean-Michel Ané in der Abteilung für Pflanzenbau an der UW-Madison für die Bereitstellung von Medicago truncatula Proben bestätigen. Diese Arbeit wurde zum Teil aus Mitteln der National Science Foundation (NSF) unterstützt Zuschuss CHE-0957784, der Universität von Wisconsin Graduate School und der Wisconsin Alumni Research Foundation (WARF) und Romnes Fakultät Research Fellowship-Programm (LL). EG quittiert eine NSF Graduate Research Fellowship (DGE-1256259).

1. Instrumentierung <ol><li> MALDI-TOF/TOF MSI. Verwenden Sie ein Massenspektrometer mit einer MALDI-Quelle für die Analyse von kleinen Molekülen ausgestattet (siehe Tabelle der Materialien / Geräte). Führen Akquisitionen im positiven oder negativen Ionen-Modus in Abhängigkeit von den Analyten von Interesse. Geben Sie einen Massenbereich von Interesse und sammeln Sie 500 Laserschüsse / Spot bei 50 Intervallen um sowohl in der x-und y-Richtung über die Oberfläche der Probe auf Ionen-Bilder zu erzeugen. Die Rasterweite und die Anzahl der Laserschüsse eingestellt werden, um eine höhere räumliche Auflösung und maximalen Signalintensität bzw. zu erhalten. Verwenden DHB Matrix Peaks oder der Folie oder direkt auf das Gewebe aufgebracht, um die Massenspektren kalibrieren internen Standards. </li><li> Hohe Auflösung LC-MS. (Siehe Tabelle der Materialien / Geräte) Führen Probenextrakten mit LC-MS entweder mit Reversed-Phase (RP) LC mit einer C-18-Säule oder Normalphase (NP) mit einem HILIC Säule in Abhängigkeit von den Analyten von Interesse. Verwenden Sie mobile Phasen undGradienten für das entsprechende speziellen Probentyp. Führen Akquisitionen in positive oder negative Ionen-Modi, je nach Probentyp. </li></ol> 2. Gewebepräparation <ol><li> Schneiden Sie die Wurzelknöllchen aus der Pflanze, so dass 3-4 mm der Wurzel zum Knoten befestigt. </li><li> Unmittelbar nach der Sektion, Zange verwenden, um das Gewebe in einem Kryostaten Tasse legen und decken mit Gelatine (100 mg / ml in VE-Wasser). Es ist für das Gewebe an der Unterseite der Schale ohne Luftblasen aufgeklebt werden. </li><li> Blitzeis das Gewebe, indem Sie den Becher in einem Trockeneis / Ethanol-Bad, bis die Gelatine erstarrt und wird undurchsichtig. Proben bei -80 ° C bis zur Verwendung. </li><li> Proben entfernen aus dem -80 ° C Gefrierschrank, schneiden Sie den Kunststoffbecher und-Kryostaten wegschneiden überschüssige Gelatine. Montieren Sie den eingebetteten Gewebe mit dem Kryostaten Spannfutter mit einer Dime-Größe Menge der optimale Schnitttemperatur (OCT) Medien, die zwar nicht gerade der Oktober berühren das Gewebe. Legen Sie in KryostatenBox, bis die Oktober erstarrt. </li><li> Damit das Spannfutter und Gelatine in den Kryostaten Feld (auf -20 oder -25 ° C) für etwa 15 min äquilibrieren. </li><li> Verwenden Sie den Kryostaten (siehe Tabelle der Materialien / Geräte), um Gewebeschnitt etwa die Dicke einer Zelle (8-20 um je nach Gewebetyp) und Tauwetter montieren jede Scheibe auf die ITO-beschichtetes Glas durch Erwärmen der Rückseite (nicht-ITO beschichtete Seite) einer ITO-beschichtete Glasträger auf der Rückseite der Hand. Legen Sie die ITO-beschichtete Seite der Folie erwärmt in der Nähe des eingefrorenen Gewebeschnitt und damit die Scheibe, um auf der Folie haften. Platzieren Sie die Abschnitte nahe beieinander auf der Folie wird die bessere Ausrichtung bei MSI bieten. </li></ol> 3. Matrix-Anwendung <ol><li> Airbrush Anwendung der MALDI-Matrix <ol><li> Alle Airbrush-Verfahren sollten in einem Abzug durchgeführt werden. </li><li> Die Airbrush-Lösung Behälter und Düse (siehe Tabelle der Materialien / Geräte) mit Methanol gründlich reinigen undFüllen der Lösungsbehälter mit DHB-Matrix-Lösung (150 mg / ml in 50% methanol/0.1% TFA v / v). </li><li> Halten der Spritzpistole etwa 35 cm von der Probe und anzuwenden 10-15 Schichten Matrix auf der Oberfläche des Objektträgers mit einer Dauer von 10 Sek. und 30 Sek. Spritztrockenzeit zwischen jeder Beschichtung. </li><li> Gründlich die Airbrush wieder sauber, wenn Sie fertig mit Methanol, um zu vermeiden Verstopfung von der Matrix-Lösung. </li></ol></li><li> Automatische Sprayer Anwendung der MALDI-Matrix <ol><li> Folgen Sie den Start-up-Anleitungen der Hersteller von automatischen Spritzgerät System. </li><li> Für MSI von Metaboliten in Wurzelknöllchen mit 40 mg / ml (in 50% methanol/0.1% TFA v / v) DHB als Matrix, die Temperatur auf ~ 80 ° C, Geschwindigkeit bis 1250 mm / min, Durchflussrate auf 50 ul / min, und die Anzahl der Durchgänge 24. Für beste Leistung wird empfohlen, um die Düse 90 und / oder versetzt die Düse von 1,5 mm zwischen jedem Durchlauf drehen. Starten Sprayer-Methode. Als side Note, insbesondere die Spritzensystem verwendet hier heizt die Düse zur schnelleren Verdampfung des Lösungsmittels. Wenn das Lösungsmittel verdampft, wobei die Konzentration des Matrix schnell erhöht. Die mit der Airbrush und dem Spritzautomaten auf die Probe aufgebracht Matrix vergleichbare Konzentrationen. </li><li> Folgen Sie den Anweisungen Abschaltung der Hersteller von automatischen Spritzgerät System. </li></ol></li><li> Sublimation Anwendung der MALDI-Matrix <ol><li> Wiegen Sie 300 mg DHB in den Boden des Sublimationskammer (siehe Tabelle der Materialien / Geräte). </li><li> Kleben Sie den Glasobjektträger zu der kalten Finger (obere Teil des Sublimationskammer) mit den Gewebeschnitten nach unten mit einem doppelseitigen, leitfähiges Band. Decken Sie die gesamte Rückseite der Folie mit dem doppelseitigen Klebeband selbst für Leitfähigkeit, wodurch auch Matrix-Abscheidung. </li><li> Klemmen Sie die oberen und unteren Hälften der Sublimation Kammer zusammen mit der C-Klemme. Verbinden Sie den Vakuum-und Ad-d Eis und kaltes Wasser an die Spitze Reservoir. </li><li> Platzieren Sublimationskammer in einem Heizmantel bei Raumtemperatur. </li><li> Einschalten der Vakuumpumpe. Warten Sie 15 min und die Heizung andrehen Mantel. Der Heizmantel sollte 120 ° C im Verlauf von 10 min zu erreichen. </li><li> Nach 10 min, schalten Sie die Hitze, in der Nähe der Vakuumventil (so das Innere der Kammer bleibt unter Vakuum), und schalten Sie die Vakuumpumpe. </li><li> Lassen Sie die Kammer auf Raumtemperatur zu kommen, öffnen Sie das Ventil das Vakuum Druck und entfernen Sie die Probe. Die Größe der Kammer Sublimation wird die Höhe der Matrix zu dem Glasobjektträger sublimiert bestimmen. Die größeren Sublimation Kammern (die Größe einer 400 ml-Becherglas) werden ca. 300 mg HTB während die kleineren Kammern (die Größe einer 150 ml-Becherglas) werden ca. 100 mg HTB und erfordert Schneiden der Glasplatte, so dass es passt in die Kammer. </li></ol></li></ol> 4. Image Acquisition <ol> &lt;li&gt; Mark a + Muster auf jeder Ecke der Probe mit einem WiteOut Korrekturflüssigkeit Stift als &quot;lehren Punkte&quot; verwendet werden. Setzen Sie den Glasobjektträger in die MALDI Dia-Adapterplatte und nehmen Sie ein optisches Bild der Probe mit Hilfe eines Scanners. </li><li> Einrichten einer Bildaufnahme-Datei unter Verwendung der von der Firma Instrument mit einer Rasterschrittweite von 50 um und einer Laserdurchmesser gleich oder kleiner als die Rasterschrittweite vorgesehen Software. An diesem Instrument, der minimale Lasereinstellung gibt einen Laserdurchmesser von etwa 10 um und kleinen Lasereinstellung hat einen Durchmesser von 40 bis 50 um. </li><li> Laden des optischen Bildes in die Software und Ausrichten der Platte mit dem optischen Bild. </li><li> Kalibrieren Sie das Gerät vor Beginn der gemeinsamen Akquisition mit Matrix-Clusterionen, interne Standards oder eine Kalibrierung Mix. </li><li> Geben die Bereiche des Gewebes mit MSI analysiert werden, einschließlich einer Stelle der reinen Matrix auf der Folie als &quot;blank&quot; verwendet werden. </li><li> Beginnen acErwerb. </li></ol> 5. Bildgenerierung <ol><li> Öffnen Sie die Bilddatei in der handelsüblichen Software, die vom Hersteller bereitgestellt und extrahieren Sie die Ionen-Bilder. Andere Open-Source-Software ist für MSI 19 Datenverarbeitung zur Verfügung. </li></ol> 6. Identifizierung von Metaboliten <ol><li> Wählen Sie einen bestimmten m / z von Interesse aus dem Massenspektrum mit der herstellerspezifischen Software (siehe Tabelle der Materialien / Geräte). Ein Analyt kann aus einem Matrix-Ionen unterschieden werden, wenn ein Analyt ausgewählt ist aus Peak im Massenspektrum und Ionen Bilder erzeugt werden spezifisch an den Gewebeabschnitt zu lokalisieren. </li><li> Erstellen Sie eine Liste von Analyten von Interesse und führen Sie MS / MS-Experimente. Siehe Tabelle 1 und Tabelle 2 in Repräsentative Ergebnisse für die Probenlisten von Analyten. </li><li> Führen Sie gezielt LC-MS-Analyse auf einem hochauflösenden Massenspektrometer (oder hoher Auflösung MALDI-MS falls vorhanden) genau zu erhaltenMassenmessungen der Analyten von Interesse und führen auch LC-MS/MS der Ziel Analyten charakteristischen Fragmentierungsmuster zu erhalten. </li><li> Führen Datenbank suchen, um vermeintliche Identifikationen für die Ziel Analyten zu bestimmen. Beispiele für Stoffwechsel Datenbanken enthalten: METLIN, ChemSpider, PubChem, KEGG und HMDB. </li><li> Um die vermeintlichen Identifikationen von genauen Massendatenbanksuche bestätigen, passen Sie die MS / MS von den gezielten Analyten MS / MS-Spektren von Standards, Literatur und / oder Splitter Vorhersage-Software. </li></ol>

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Chem. 76, 5630-5640 (1021).</li><li>Stemmler, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-mass-resolution+direct-tissue+MALDI-FTMS+reveals+broad+conservation+of+three+neuropeptides+(APSGFLGMRamide,+GYRKPPFNGSIFamide+and+pQDLDHVFLRFamide)+across+members+of+seven+decapod+crustaean+infraorders.">High-mass-resolution direct-tissue MALDI-FTMS reveals broad conservation of three neuropeptides (APSGFLGMRamide, GYRKPPFNGSIFamide and pQDLDHVFLRFamide) across members of seven decapod crustaean infraorders.</a> Peptides. 28, 2104-2115 (2007).</li><li>Rubakhin, S. S., Churchill, J. D., Greenough, W. T., Sweedler, J. 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Chem. 84, 2048-2054 (2012).</li><li>Chen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2,3,4,5-Tetrakis(3',4'-dihydroxylphenyl)thiophene:+a+new+matrix+for+the+selective+analysis+of+low+molecular+weight+amines+and+direct+determination+of+creatinine+in+urine+by+MALDI-TOF+MS.">2,3,4,5-Tetrakis(3',4'-dihydroxylphenyl)thiophene: a new matrix for the selective analysis of low molecular weight amines and direct determination of creatinine in urine by MALDI-TOF MS.</a> Anal. Chem. 84, 10291-10297 (2012).</li><li>Shroff, R., Rulisek, L., Doubsky, J., Svatos, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acid-base-driven+matrix-assisted+mass+spectrometry+for+targeted+metabolomics.">Acid-base-driven matrix-assisted mass spectrometry for targeted metabolomics.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 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Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.

Wie oben diskutiert, ist die Probenvorbereitung der wichtigste Schritt in der MSI Workflow. Die Einbettung des Gewebes verursachen ungleichmäßig Schneiden schwierig oder in einigen Fällen nicht möglich zu sein. Der Abschnitt Größe und angemessene Ausgleichszeit sind entscheidend für die Aufrechterhaltung der Gewebeintegrität und Vermeidung von Falten und Tränen. Auswahl der Matrix-und Applikationstechnik eine Rolle bei der Bestimmung der Arten von Analyten zu erfassen ist, die räumliche Auflösung und Reproduz...

Die wachsenden Bereich der Metabolomics hat viele wichtige biologische Anwendungen, einschließlich der Entdeckung von Biomarkern, die Entschlüsselung Stoffwechselwege in Pflanzen und anderen biologischen Systemen und Toxikologie Profilierung 4,6-10. Eine große technische Herausforderung bei der Untersuchung biologischer Systeme ist es, Wege metabolomic sie ohne Unterbrechung 11 studieren. MALDI-MSI ermöglicht die direkte Analyse von intaktem Gewebe, die sensitive Detektion von Analyten in einzelnen Organen und sogar 12,13 14,15 Einzelzellen ermöglicht. Probenvorbereitung ist ein entscheidender Schritt in der Herstellung reproduzierbare und zuverlässige Massenspektren Bilder. Die Qualität der Bilder hängt stark von Faktoren wie Gewebeeinbettungsmedium, Schichtdicke, MALDI-Matrix und Matrix-Anwendungstechnik. Bei bildgebenden Anwendungen ist ideal Schnittdicke die Breite einer Zelle (8-20 um je nach Probentyp). MALDI erfordert Abscheidung einer organischen, Crystalline Matrixverbindung, typischerweise eine schwache Säure, auf die Probe, um einen Analyten-Ablation und Ionisierung zu unterstützen. 16 verschiedene Matrizen bieten unterschiedliche Signalintensitäten, störenden Ionen und Ionisierungseffizienz von verschiedenen Klassen von Verbindungen. Die Matrix Applikationstechnik spielt auch eine Rolle, in der Qualität der Massenspektren Bilder und verschiedene Techniken für die verschiedenen Klassen von Analyten geeignet sind. Drei Matrix Anwendungsmethoden werden in diesem Protokoll vorgestellt: Airbrush, Spritzautomaten und Sublimation. Airbrush-Matrix-Anwendung wurde vielfach in der MALDI-Bildgebung verwendet. Der Vorteil der Airbrush-Matrix-Anwendung ist, dass es relativ schnell und einfach ist. Allerdings ist die Qualität der Airbrush Matrix Anwendung hängt stark von der Geschicklichkeit des Benutzers und neigt weniger reproduzierbar und führen Diffusion von Analyten, insbesondere kleine Moleküle 17. Automatische Spritze Systeme haben ähnliche Mechanik Matrix Anwendung Airbrush, aber have entwickelt worden, um die Variabilität mit manueller Airbrush-Anwendung gesehen zu entfernen, so dass das Spray mehr reproduzierbar. Diese Methode kann manchmal mehr Zeit in Anspruch als herkömmliche Airbrush-Matrix-Anwendung sein. Sowohl manuelle Airbrush und Spritzautomaten Systeme sind lösemittelbasierten Matrix Anwendungsmethoden. Sublimation ist eine trockene Matrix Applikationstechnik, die immer mehr und mehr populär für die Massenspektrale Bildgebung von Metaboliten und kleinen Molekülen, weil es Analytdiffusion reduziert, aber es fehlt die notwendige Lösungsmittel zu extrahieren und zu beobachten, höhere Massen 18 Verbindungen. Zuversichtlich Identifizierung von Metaboliten erfordert in der Regel präzise Massenmessungen an vermeintlichen Identifikationen gefolgt von Tandem-Massenspektrometrie (MS / MS) Experimente zur Validierung, mit MS / MS-Spektren, die verglichen werden, um Standards, Literatur oder theoretischen Spektren zu erhalten. In diesem Protokoll hoher Auflösung (Massenauflösungsvermögen von 60.000 bei m / z 400), Flüssigchromatographie (LC)-MS ist mit MALDI-MSI gekoppelt, die die Rauminformationen und zuversichtlich Identifikationen von endogenen Metaboliten zu erhalten, mit Medicago truncatula Wurzeln und Wurzelknollen als das biologische System. MS / MS-Experimente können direkt auf das Gewebe mit MALDI-MSI-oder Gewebeextrakten mit LC-MS durchgeführt und für die Validierung der Metabolit Identifikationen verwendet werden. Dieses Protokoll bietet eine einfache Methode, um endogene Metaboliten in M. Karte truncatula, die angepasst und MSI von kleinen Molekülen in verschiedenen Gewebetypen und biologische Systeme angewandt werden kann.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1270">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Gelatin</td>
			<td style="width:181px;">Difco</td>
			<td style="width:163px;"><a href="http://catalog.bd.com/bdCat/viewProduct.doCustomer?productNumber=214340">214340</a></td>
			<td style="width:611px;">heat to dissolve</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cryostat- HM 550</td>
			<td style="width:181px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:163px;">956564A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">indium tin oxide (ITO)-coated glass slides&#160;</td>
			<td>Delta Technologies</td>
			<td>CB-90IN-S107</td>
			<td>25-75-0.8 mm (width-length-thickness)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2,5-Dihydroxybenzoic acid (DHB) matrix&#160;</td>
			<td>ICN Biomedicals</td>
			<td><a href="http://www.labsource.com/Catalog/Item.aspx?ItemID=1787195">PI90033</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Airbrush</td>
			<td>Paasche Airbrush Company</td>
			<td>TG-100D</td>
			<td>coupled with 75 ml steel container</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;">Automatic matrix sprayer system- TM-Sprayer</td>
			<td>HTX Technologies, LLC</td>
			<td style="width:163px;">HTX.TMSP.H021-U</td>
			<td>Specific start-up and shut-down instructions will be given when the instrument is installed</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sublimation apparatus&#160;</td>
			<td>Chemglass Life Science</td>
			<td style="width:163px;"><a href="http://www.chemglass.com/product_view.asp?pnr=CG-3038">CG-3038-01</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Vaccum pump- Alcatel 2008 A</td>
			<td>Ideal Vacuum Products</td>
			<td>P10976</td>
			<td>Ultimate Pressure = 1x10-4 Torr</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ultrafleXtreme MALDI-TOF/TOF</td>
			<td style="width:181px;">Bruker Daltonics</td>
			<td style="width:163px;">276601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">FlexImaging</td>
			<td style="width:181px;">Bruker Daltonics</td>
			<td>269841</td>
			<td>One example of &#34;vender specific software&#34;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">MALDI LTQ Orbitrap</td>
			<td style="width:181px;">Thermo Scientific</td>
			<td>IQLAAEGAAPFADBMASZ</td>
			<td>High resolution MALDI instrument for accurate mass measurements</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Q Exactive</td>
			<td style="width:181px;">Thermo Scientific</td>
			<td>IQLAAEGAAPFALGMAZR</td>
			<td>High resolution LC-MS instrument for accurate mass measurements</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

maldi-mass spectrometric imaging for the investigation of metabolites in medicago truncatula root nodules

Die meisten Techniken verwendet, um kleine Moleküle, wie Medikamente oder endogene Metaboliten studieren, verwenden Gewebeextrakten, die die Homogenisierung des Gewebes von Interesse, die möglicherweise Änderungen in der Stoffwechselwege untersucht 1 verursachen könnte erfordern. Bildgebenden Massenspektrometrie (MSI) ist ein leistungsstarkes Analyse-Tool, das in intakten Scheiben von biologischen Gewebeproben 1-5 räumliche Informationen von Analyten zur Verfügung stellen kann. Diese Technik wurde ausgiebig verwendet, um verschiedene Arten von Verbindungen, einschließlich Proteine, Peptide, Lipide, kleine Moleküle wie Metaboliten endogenen studieren. Mit Matrix-unterstützte Laserdesorption / Ionisation (MALDI)-MSI können räumliche Verteilungen mehrerer Metaboliten gleichzeitig detektiert werden. Hierbei wird eine speziell für die Durchführung von Metabolomics ungezielte MSI Experimente an Leguminosen Wurzeln und Wurzelknöllchen entwickelte Methode vorgestellt, das Einblicke in die biologischen Prozesse, die sich offenbaren konnte. Diehier vorgestellte Methode zeigt eine typische MSI Workflow, von der Probenvorbereitung bis zur Bildaufnahme, und konzentriert sich auf die Matrix-Anwendung Schritt und zeigt mehrere Matrix Anwendungstechniken, die nützlich für die Erkennung kleiner Moleküle sind. Sobald die MS Bilder erzeugt, wird die Analyse und Identifizierung von Metaboliten von Interesse diskutiert und gezeigt. Die hier vorgestellten Standard-Workflow kann leicht für verschiedene Gewebearten, Molekülarten, und Instrumentierung geändert werden.

Ein Überblick über experimentelle MSI ist in Fig. 1 gezeigt. Am Anfang des Experiments ist die Probenvorbereitung ein kritischer Schritt. Knöllchen aus der Pflanzenwurzel geschnitten und in Gelatine eingebettet. Das Gewebe muss flach gegen den Kryostaten Tasse gedrückt werden, ohne Blasen, während es eingefroren wird, das wird einfacher und die richtige Ausrichtung des Gewebes zu gewährleisten, während es geschnitten ist. Wenn das Gewebe in Scheiben geschnitten wird, ist es wichtig, das Gewebe be...

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MALDI-Mass Spectrometric Imaging for the Investigation of Metabolites in Medicago truncatula Root Nodules

Bildgebenden Massenspektrometrie (MSI) ist ein leistungsfähiges Werkzeug, das benutzt werden kann, um in intakten Geweben entdecken und identifizieren verschiedene chemische Spezies, die Erhaltung der Verbindungen in ihrer natürlichen Umgebung, die neue Einblicke in die biologischen Prozesse zur Verfügung stellen kann. Hierin eine für die Analyse von kleinen Molekülen entwickelt MSI Verfahren beschrieben.

MALDI-Imaging-Massenspektrometrie zur Untersuchung von Metaboliten in<em&gt; Medicago truncatula</em&gt; Wurzelknöllchen

Most techniques used to study small molecules, such as pharmaceutical drugs or endogenous metabolites, employ tissue extracts which require the ...

maldi-mass-spectrometric-imaging-for-investigation-metabolites

Research

JoVE Journal

Biology

MALDI-Mass Spectrometric Imaging for the Investigation of Metabolites in Medicago truncatula Root Nodules

18.8K Aufrufe.  University of Wisconsin- Madison.  Bildgebenden Massenspektrometrie (MSI) ist ein leistungsfähiges Werkzeug, das benutzt werden kann, um in intakten Geweben entdecken und identifizieren verschiedene chemische Spezies, die Erhaltung der Verbindungen in ihrer natürlichen Umgebung, die neue Einblicke in die biologischen Prozesse zur Verfügung stellen kann. Hierin eine für die Analyse von kleinen Molekülen entwickelt MSI Verfahren beschrieben. 

Serie: MALDI-Mass Spectrometric Imaging for the Investigation of Metabolites in Medicago truncatula Root Nodules

Generation of Composite Plants in Medicago truncatula used for Nodulation Assays

Similar to Agrobacterium tumerfaciens, Agrobacterium rhizogenes can transfer foreign DNAs into plant cells based on the autonomous root-inducing (Ri) plasmid. A. rhizogenes can cause hairy root formation on plant tissues and form composite plants after transformation. On these composite plants, some of the regenerated roots are transgenic, carrying the wild type T-DNA and the engineered binary vector; while the shoots are still non-transgenic, serving to provide energy and growth support. These hairy root composite plants will not produce transgenic seeds, but there are a number of important features that make these composite plants very useful in plant research. First, with a broad host range,A. rhizogenes can transform many plant species, especially dicots, allowing genetic engineering in a variety of species. Second, A. rhizogenes infect tissues and explants directly; no tissue cultures prior to transformation is necessary to obtain composite plants, making them ideal for transforming recalcitrant plant species. Moreover, transgenic root tissues can be generated in a matter of weeks. For Medicago truncatula, we can obtain transgenic roots in as short as three weeks, faster than normal floral dip Arabidopsis transformation. Overall, the hairy root composite plant technology is a versatile and useful tool to study gene functions and root related-phenotypes. Here we demonstrate how hairy root composite plants can be used to study plant-rhizobium interactions and nodulation in the difficult-to-transform species M. truncatula.

Generation of Composite Plants in Medicago truncatula used for Nodulation Assays

We demonstrate how hairy root composite plants can be used to study plant-rhizobium interactions and nodulation in the difficult-to-transform species Medicago truncatula.

Generierung von Composite-Anlagen in Medicago truncatula Für Nodulation Assays verwendet

Similar to Agrobacterium tumerfaciens, Agrobacterium rhizogenes can transfer foreign DNAs into plant cells based on the autonomous root-inducing (Ri) ...

Forschung

Biologie

The ex vivo Isolated Skeletal Microvessel Preparation for Investigation of Vascular Reactivity

The isolated microvessel preparation is an ex vivo preparation that allows for examination of the different contributions of factors that control vessel diameter, and thus, perfusion resistance1-5. This is a classic experimental preparation that was, in large measure, initially described by Uchida et al.15 several decades ago. This initial description provided the basis for the techniques that was extensively modified and enhanced, primarily in the laboratory of Dr. Brian Duling at the University of Virginia6-8, and we present a current approach in the following pages. This preparation will specifically refer to the gracilis arteriole in a rat as the microvessel of choice, but the basic preparation can readily be applied to vessels isolated from nearly any other tissue or organ across species9-13. Mechanical (i.e., dimensional) changes in the isolated microvessels can easily be evaluated in response to a broad array of physiological (e.g., hypoxia, intravascular pressure, or shear) or pharmacological challenges, and can provide insight into mechanistic elements comprising integrated responses in an intact, although ex vivo, tissue. The significance of this method is that it allows for facile manipulation of the influences on the integrated regulation of microvessel diameter, while also allowing for the control of many of the contributions from other sources, including intravascular pressure (myogenic), autonomic innervation, hemodynamic (e.g., shear stress), endothelial dependent or independent stimuli, hormonal, and parenchymal influences, to provide a partial list. Under appropriate experimental conditions and with appropriate goals, this can serve as an advantage over in vivo or in situ tissue/organ preparations, which do not readily allow for the facile control of broader systemic variables. 
The major limitation of this preparation is essentially the consequence of its strengths. By definition, the behavior of these vessels is being studied under conditions where many of the most significant contributors to the regulation of vascular resistance have been removed, including neural, humoral, metabolic, etc. As such, the investigator is cautioned to avoid over-interpretation and extrapolation of the data that are collected utilizing this preparation. The other significant area of concern with regard to this preparation is that it can be very easy to damage cellular components such as the endothelial lining or the vascular smooth muscle, such that variable source of error can be introduced. It is strongly recommended that the individual investigator utilize appropriate measurements to ensure the quality of the preparation, both at the initiation of the experiment and periodically throughout the course of a protocol.

The ex vivo Isolated Skeletal Microvessel Preparation for Investigation of Vascular Reactivity

An ex vivo preparation is described for isolation of the largest gracilis muscle resistance arterioles for interrogation of both vascular responses to vasoactive stimuli and the assessment of basic structural properties via passive wall mechanics.

Die Ex vivo Isoliert Skeletal Mikrogefäßdichte Vorbereitung für Untersuchung der vaskulären Reaktivität

The isolated  microvessel preparation is an ex vivo preparation that allows for examination of the different contributions of  factors that control vessel ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

The proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal development in all metazoan organisms. Apoptotic cell clearance is a highly dynamic process intimately associated with cell death; unengulfed apoptotic cells are barely seen in vivo under normal conditions. In order to understand the different steps of apoptotic cell clearance and to compare 'professional' phagocytes - macrophages and dendritic cells to 'non-professional' - tissue-resident neighboring cells, in vivo live imaging of the process is extremely valuable. Here we describe a protocol for studying apoptotic cell clearance in live Drosophila embryos. To follow the dynamics of different steps in phagocytosis we use specific markers for apoptotic cells and phagocytes. In addition, we can monitor two phagocyte systems in parallel: 'professional' macrophages and 'semi-professional' glia in the developing central nervous system (CNS). The method described here employs the Drosophila embryo as an excellent model for real time studies of apoptotic cell clearance.

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Here we describe an effective method for studying dynamics of apoptotic cell clearance in vivo. This method employs live Drosophila embryos as a powerful model for monitoring phagocytosis of apoptotic cells using specific labeling of apoptotic cells and phagocytes.

Live-Imaging von apoptotischen Ausverkauf während<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryogenese

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Purification of Transcripts and Metabolites from Drosophila Heads

For the last decade, we have tried to understand the molecular and cellular mechanisms of neuronal degeneration using Drosophila as a model organism. Although fruit flies provide obvious experimental advantages, research on neurodegenerative diseases has mostly relied on traditional techniques, including genetic interaction, histology, immunofluorescence, and protein biochemistry. These techniques are effective for mechanistic, hypothesis-driven studies, which lead to a detailed understanding of the role of single genes in well-defined biological problems. However, neurodegenerative diseases are highly complex and affect multiple cellular organelles and processes over time. The advent of new technologies and the omics age provides a unique opportunity to understand the global cellular perturbations underlying complex diseases. Flexible model organisms such as Drosophila are ideal for adapting these new technologies because of their strong annotation and high tractability. One challenge with these small animals, though, is the purification of enough informational molecules (DNA, mRNA, protein, metabolites) from highly relevant tissues such as fly brains. Other challenges consist of collecting large numbers of flies for experimental replicates (critical for statistical robustness) and developing consistent procedures for the purification of high-quality biological material. Here, we describe the procedures for collecting thousands of fly heads and the extraction of transcripts and metabolites to understand how global changes in gene expression and metabolism contribute to neurodegenerative diseases. These procedures are easily scalable and can be applied to the study of proteomic and epigenomic contributions to disease.

Purification of Transcripts and Metabolites from Drosophila Heads

We describe here the procedures for the extraction and purification of mRNA and metabolites from Drosophila heads. We are applying these techniques to better understand the cellular perturbations underlying neuronal degeneration. These methodologies can be easily scaled and adapted for other "omic" projects.

Reinigung von Transcripts und Metaboliten aus<em&gt; Drosophila</em&gt; Köpfe

For the last decade, we have tried to understand the molecular and cellular mechanisms of neuronal degeneration using Drosophila as a model organism. ...

In vitro Investigation of the MexAB Efflux Pump From Pseudomonas aeruginosa

There is an emerging scientific need for reliable tools for monitoring membrane protein transport. We present a methodology leading to the reconstitution of efflux pumps from the Gram-negative bacteria Pseudomonas aeruginosa in a biomimetic environment that allows for an accurate investigation of their activity of transport. Three prerequisites are fulfilled: compartmentation in a lipidic environment, use of a relevant index for transport, and generation of a proton gradient. The membrane protein transporter is reconstituted into liposomes together with bacteriorhodopsin, a light-activated proton pump that generates a proton gradient that is robust as well as reversible and tunable. The activity of the protein is deduced from the pH variations occurring within the liposome, using pyranin, a pH-dependent fluorescent probe. We describe a step-by-step procedure where membrane protein purification, liposome formation, protein reconstitution, and transport analysis are addressed. Although they were specifically designed for an RND transporter, the described methods could potentially be adapted for use with any other membrane protein transporter energized by a proton gradient.

In vitro Investigation of the MexAB Efflux Pump From Pseudomonas aeruginosa

We present a protocol for the in vitro investigation of efflux pumps from Pseudomonas aeruginosa. This protocol allows for the generation of a robust, reversible, and tunable proton gradient within the liposome membrane and hence should be adaptable to any membrane protein energized by the protomotive force.

In-vitro-Untersuchung der MexAB Effluxpumpe Von Pseudomonas aeruginosa

There is an emerging scientific need for reliable tools for monitoring membrane protein transport. We present a methodology leading to the reconstitution ...

Synchronization of Caulobacter Crescentus for Investigation of the Bacterial Cell Cycle

The cell cycle is important for growth, genome replication, and development in all cells. In bacteria, studies of the cell cycle have focused largely on unsynchronized cells making it difficult to order the temporal events required for cell cycle progression, genome replication, and division. Caulobacter crescentus provides an excellent model system for the bacterial cell cycle whereby cells can be rapidly synchronized in a G0 state by density centrifugation. Cell cycle synchronization experiments have been used to establish the molecular events governing chromosome replication and segregation, to map a genetic regulatory network controlling cell cycle progression, and to identify the establishment of polar signaling complexes required for asymmetric cell division. Here we provide a detailed protocol for the rapid synchronization of Caulobacter NA1000 cells. Synchronization can be performed in a large-scale format for gene expression profiling and western blot assays, as well as a small-scale format for microscopy or FACS assays. The rapid synchronizability and high cell yields of Caulobacter make this organism a powerful model system for studies of the bacterial cell cycle.

Synchronization of Caulobacter Crescentus for Investigation of the Bacterial Cell Cycle

Synchronization of bacterial cells is essential for studies of the bacterial cell cycle and development. Caulobacter crescentus is synchronizable through density centrifugation allowing a rapid and powerful tool for studies of the bacterial cell cycle. Here we provide a detailed protocol for the synchronization of Caulobacter cells.

Synchronisation<em&gt; Caulobacter crescentus</em&gt; Für die Untersuchung der Bakterienzellzyklus

The cell cycle is important for growth, genome replication, and development in all cells.  In bacteria, studies of the cell cycle have focused largely on ...

Contractility Measurements on Isolated Papillary Muscles for the Investigation of Cardiac Inotropy in Mice

Papillary muscle isolated from adult mouse hearts can be used to study cardiac contractility during different physiological/pathological conditions. The contractile characteristics can be evaluated independently of external influences such as vascular tonus or neurohumoral status. It depicts a scientific approach between single cell measurements with isolated cardiac myocytes and in vivo studies like echocardiography. Thus, papillary muscle preparations serve as an excellent model to study cardiac physiology/pathophysiology and can be used for investigations like the modulation by pharmacological agents or the exploration of transgenic animal models. Here, we describe a method of isolating the murine left anterior papillary muscle to investigate cardiac contractility in an organ bath setup. In contrast to a muscle strip preparation isolated from the ventricular wall, the papillary muscle can be prepared in toto without damaging the muscle tissue severely. The organ bath setup consists of several temperature-controlled, gassed and electrode-equipped organ bath chambers. The isolated papillary muscle is fixed in the organ bath chamber and electrically stimulated. The evoked twitch force is recorded using a pressure transducer and parameters such as twitch force amplitude and twitch kinetics are analyzed. Different experimental protocols can be performed to investigate the calcium- and frequency-dependent contractility as well as dose-response curves of contractile agents such as catecholamines or other pharmaceuticals. Additionally, pathologic conditions like acute ischemia can be simulated.

Murine left ventricular papillary muscle can be used to investigate cardiac contractility in vitro. This article describes in detail the isolation and experimental protocols to study cardiac contractile characteristics.

Kontraktilität Messungen auf isolierte Papillarmuskeln für die Untersuchung von Herz Inotropie bei Mäusen

Papillary muscle isolated from adult mouse hearts can be used to study cardiac contractility during different physiological/pathological conditions. The ...

MRM Microcoil Performance Calibration and Usage Demonstrated on Medicago truncatula Roots at 22 T

This protocol describes a signal-to-noise ratio (SNR) calibration and sample preparation method for solenoidal microcoils combined with biological samples, designed for high-resolution magnetic resonance imaging (MRI), also referred to as MR microscopy (MRM). It may be used at pre-clinical MRI spectrometers, demonstrated on Medicago truncatula root samples. Microcoils increase sensitivity by matching the size of the RF resonator to the size of the sample of interest, thereby enabling higher image resolutions in a given data acquisition time. Due to the relatively simple design, solenoidal microcoils are straightforward and cheap to construct and can be easily adapted to the sample requirements. Systematically, we explain how to calibrate new or home-built microcoils, using a reference solution. The calibration steps include: pulse power determination using a nutation curve; estimation of RF-field homogeneity; and calculating a volume-normalized signal-to-noise ratio (SNR) using standard pulse sequences. Important steps in sample preparation for small biological samples are discussed, as well as possible mitigating factors such as magnetic susceptibility differences. The applications of an optimized solenoid coil are demonstrated by high-resolution (13 x 13 x 13 &#956;m3, 2.2 pL) 3D imaging of a root sample.

MRM Microcoil Performance Calibration and Usage Demonstrated on Medicago truncatula Roots at 22 T

A protocol to study biological tissue at high spatial resolution using ultra-high field magnetic resonance microscopy (MRM) using microcoils is presented. Step-by-step instructions are provided for characterizing the microcoils. Finally, optimization of imaging is demonstrated on plant roots.

MRM Microcoil Performance Calibration and Usage demonstriert auf Medicago-Truncatula-Wurzeln bei 22 T

This protocol describes a signal-to-noise ratio (SNR) calibration and sample preparation method for solenoidal microcoils combined with biological ...

Sample Preparation for Metabolic Profiling using MALDI Mass Spectrometry Imaging

Metabolomics, the study to identify and quantify small molecules and metabolites present in an experimental sample, has emerged as an important tool to investigate the biological activities during development and diseases. Metabolomics approaches&#160;are widely employed in the study of cancer, nutrition/diet, diabetes, and other physiological and pathological conditions involving metabolic processes. An advantageous tool that aids in metabolomic profiling advocated in this paper is matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry imaging (MALDI MSI). Its ability to detect metabolites in situ without labeling, structural modifications, or other specialized reagents, such as those used in immunostaining, makes MALDI MSI a unique tool in advancing methodologies relevant in the field of metabolomics. An appropriate sample preparation process is critical to yield optimal results and will be the focus of this paper.

The goal of this protocol is to provide detailed guidance on the sample preparation when planning for experiments using MALDI MSI to maximize metabolic and molecular detection in biological samples.

Probenvorbereitung für metabolisches Profiling mittels MALDI-Massenspektrometrie-Bildgebung

Metabolomics, the study to identify and quantify small molecules and metabolites present in an experimental sample, has emerged as an important tool to ...

Divergence of Root Microbiota in Different Habitats based on Weighted Correlation Networks

The root microbiome plays an important role in plant growth and environmental adaptation. Network analysis is an important tool for studying communities, which can effectively explore the interaction relationship or co-occurrence model of different microbial species in different environments. The purpose of this manuscript is to provide details on how to use the weighted correlation network algorithm to analyze different co-occurrence networks that may occur in microbial communities due to different ecological environments. All analysis of the experiment is performed in the WGCNA package. WGCNA is an R package for weighted correlation network analysis. The experimental data used to demonstrate these methods were microbial community data from the NCBI (National Center for Biotechnology Information) database for three niches of the rice (Oryza sativa) root system. We used the weighted correlation network algorithm to construct co-abundance networks of microbial community in each of the three niches. Then, differential co-abundance networks among endosphere, rhizoplane and rhizosphere soil were identified. In addition, the core genera in network were obtained by the "WGCNA" package, which plays an important regulated role in network functions. These methods enable researchers to analyze the response of microbial network to environmental disturbance and verify different microbial ecological response theories. The results of these methods show that the significant differential microbial networks identified in the endosphere, rhizoplane and rhizosphere soil of rice.

Network analysis was applied to evaluate the association of various ecological microbial communities, such as soil, water and rhizosphere. Presented here is a protocol on how to use the WGCNA algorithm to analyze different co-occurrence networks that may occur in the microbial communities due to different ecological environments.

Divergenz von Wurzelmikrobiota in verschiedenen Lebensräumen basierend auf gewichteten Korrelationsnetzwerken

The root microbiome plays an important role in plant growth and environmental adaptation. Network analysis is an important tool for studying communities, ...