Diese Arbeit wurde von einem NSERC Postdoktorandenstipendium (DWDW), einem ARCS Foundation Stipendium (AL) und einem UC Davis College of Biological Sciences Grant (KB) unterstützt.

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Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Das vorliegende Manuskript beschreibt ein Modell des Bandgewebes, das eine nützliche experimentelle Plattform für Forscher mit einem breiten Spektrum von Forschungsthemen ist, von der Gewebeentwicklung bis hin zu translationalen / klinischen Fragen. Das hier beschriebene Konstruktionsband basiert auf einem vielseitigen Protokoll, das an verschiedenen Stellen während des gesamten Workflows angepasst werden kann ( Abbildung 1 und Diskussionsteil ). Weiterhin kann die inhärent reduktionistische Natur der in vitro Umgebung dem physiologischen Bereich durch Ergänzung von Futtermittelmedien mit konditioniertem menschlichem oder tierischem Serum näher gebracht werden. Konstrukte können mit Fibroblasten aus einer Vielzahl von Quellen gebildet werden Während die hier gezeigten Methodik- und Repräsentativresultate auf der Verwendung von primären ACL-Fibroblasten basieren, kann das Zellisolationsprotokoll angepasst werden, um andere Arten von primären Fibroblasten zu sammeln. Wie beschriebenIn Fig. 4 zeigen die mit den primären Zellen, die von jungen menschlichen Spendern isoliert wurden, gebildeten Liganden eine niedrige Donorvariabilität. Primärzellen sind durch anfängliche Isolations- und Durchgangsbeschränkung begrenzt; Die Verwendung von Zelllinien kann die Reproduzierbarkeit von Experimenten verbessern. Die Verwendung anderer Zelltypen kann Modifikationen in Zellkulturmedien und Fibringelformulierungen erfordern. Zum Beispiel haben wir beobachtet, dass menschliche mesenchymale Stammzellen (MSCs) nicht in der Lage sind, lineare Gewebe zwischen den Brushit-Zement-Anker im Laufe von 2 Wochen zu bilden, während equine überlegene digitale Flexor Sehnenfibroblasten, pferdeartige Knochenmark-Stromazellen, Küken embryonale Sehnenfibroblasten , Und murine C3H10T1 / 2 MSCs schnell zusammenziehen und verdauen das Fibrin Gel zu einem linearen Gewebe (unveröffentlichte Beobachtungen) zu bilden. Dieser Kontrast kann eine Folge von Unterschieden in der Zellkontraktilität, Proliferation und fibrinolytischen Enzymproduktion sein. Anwendung von ChemikalienUnd mechanische Stimulation Bei dem hier beschriebenen Verfahren bildet sich Fibrin-basiertes Gewebe um Brushit-Zement-Anker herum, was die Anwendung der mechanischen Stimulation über einen Streck-Bioreaktor 11 sowie für die Endpunkt-Zugversuche ermöglicht. Die Anwesenheit von Brushit-Zement-Weichgewebe-Grenzfläche (Enthesis) bietet auch eine Gelegenheit für weitere Untersuchungen und Verbesserungen 22 , 26 (siehe Abschnitt Klinische Anwendungen unten). In diesem in vitro- Umfeld kann der Beitrag der chemischen und mechanischen Faktoren leichter identifiziert werden; Ein Beispiel dafür ist in Fig. 5 gezeigt , wobei die Wirkung der Nach-Übungs-Serumumgebung von den mechanischen Stimuli der Übung getrennt wurde. Pilotstudien können erforderlich sein, um den Zeitrahmen der experimentellen Interventionen, die Zusammensetzung der Behandlungen und die entsprechenden Endpunkte zu bestimmen, um eine beobachtbare Veränderung zu erwarten. FoR Beispiel, in der Nach-Übungs-Serum-Studie 1 , wurde die Länge der experimentellen Behandlung durch die Bereitstellung von Serum zur Ergänzung von Medien, von denen Konstrukte wurden jeden zweiten Tag gezwungen wurde eingeschränkt. Weiterhin wurde während der zweiten Kulturwoche Kulturmedien mit Rest- oder Nachübungsserum mit Ascorbinsäure und L-Prolin ergänzt, während TGF-β1 entfernt wurde. TGF-β1 ist ein bekannter pro-fibrotischer Wachstumsfaktor, der nach dem Training 27 im Serum zunimmt. Um diese TGF-β1-bezogenen Effekte des Nach-Übungs-Serums zu verdecken, wurde dieses Cytokin daher nicht in den Kulturmedien aufrechterhalten. Dieses konstruierte Ligamentmodell kann auch verwendet werden, um den Effekt der mechanischen Dehnung zu testen. Durch die Konstruktion von umgekehrt modellierten Griffen, um die Brushit-Zement-Ankerenden zu halten (ähnlich dem in Fig. 1 dargestellten uniaxialen Zugprüfgerät), können Streckbioreaktoren entworfen werden, um eng aufzunehmen<html> Ineered bänder Unser Labor hat dieses Modell bisher verwendet, um die molekulare Signalisierungsreaktion von konstruierten Bändern auf eine uniaxiale Zugdehnung in einem maßgeschneiderten Bioreaktor 11 zu untersuchen, der ein besseres Verständnis für die rationale Gestaltung eines in vitro -Streckparadigmas oder sogar potentiell in vivo bietet Stretch / Aktivität / therapeutische Anwendungen. Bewertung von konstruierten Bändern Wie bei der traditionellen Monolayer-Kultur können 3D-Konstrukte für die Gen / Protein-Expression untersucht werden. Darüber hinaus bietet ihre 3D-Morphologie auch die Möglichkeit, funktionale und morphologische Veränderungen zu beurteilen und Konstrukte können in Kultur für Langzeitstudien gehalten werden (Abbildung 3 ). Während konstruierte Bänder nicht gleichbedeutend mit einheimischen, reifen Bändern sind, haben sie Ähnlichkeit mit der Entwicklung von Sehnen / Bändern und verhalten sich ähnlich wie natives Gewebe als Reaktion auf Nährstoffe&quot;&gt; 26, Wachstumsfaktoren 10 , Hormone 25 und Übung 11 , 28. Während die Vorsicht vor einer breiten Verallgemeinerung aus jedem in vitro- Modell gerechtfertigt ist, können die Ergebnisse der Ligamentenkonstruktionstests einen bestimmten physiologischen Mechanismus aufdecken oder informieren, der sonst sein könnte Unmöglich in vivo zu untersuchen . Ergänzen Sie Feedmedien mit konditioniertem Serum für ein flexibles und dynamisches Modell mit breiten Anwendungen Das menschliche Serummetabolom ist ein Milieu von ~ 4.500 Verbindungen, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Glykoproteine, Lipoproteine, Lipidderivate, Energiesubstrate, Metabolite, Vitamine, Enzyme, Hormone, Neurotransmitter und eine Fülle von Bausteinen / Zwischenprodukten. 29 Eine weitere Inspektion des menschlichen Serummetaboloms nach den Compoundklassen 29 zeigt,Vorteile der Integration von experimentellem Serum in in vitro Experimente. Das heißt, die Mehrheit der ~ 4500-Verbindungen im Serum ist hydrophob oder lipid-abgeleitet und unterstreicht die Bedeutung der Bindung von Proteinen für den Transport / die Solubilisierung. Daraus folgt, dass die experimentelle Rekapitulation der endogenen Verbundtransportdynamik und damit der Bioverfügbarkeit und der Compound-Ziel-Wechselwirkungen nahezu unmöglich wäre. So ist das experimentelle Serum besonders wirksam für die Untersuchung von Verbindungen, von denen bekannt ist, dass sie von den Zusatzmolekülen für die Solubilisierung, den Transport, die Zielbindung und den Wirkmechanismus abhängen. Unser Labor hat ein langjähriges Interesse an den gesundheitlichen Vorteilen der Übung. Übung verbessert die Zell- und Organfunktion in einer Vielzahl von Geweben im ganzen Körper 12 , was auf eine Vielzahl von Faktoren zurückzuführen ist (z. B. IL-6 13 , IL-15 14 , Meteorin-like 15 ,Exosomen 16 , 17 ), die in den systemischen Kreislauf freigesetzt werden. Das biochemische Milieu nach der Übung spiegelt die Faktoren wider, die sowohl von der Verabreichung von Skelettmuskel-Übungsempfindlichen Hormonen als auch von Faktoren, die als Ergebnis der sympathischen Nervensystemstimulation von Sekretionsdrüsen freigesetzt werden ( z. B. Cortisol und Katecholamine aus der Nebenniere 18 und Wachstum, freigesetzt werden Hormon aus der anterioren Hypophyse 19 ). Wir haben vor kurzem ein Modell des Pre- und Post-Trainings-Serums verwendet, um die Effekte des ausübung-induzierten biochemischen Milieus auf Gewebe zu untersuchen. 1 Während zahlreiche wichtige Übungsfragen bestehen bleiben, ist das Modell auf diese Weise keineswegs eingeschränkt. Beispielsweise könnte das Serum entweder aus tierischen oder menschlichen Quellen nach diätetischen oder pharmakologischen Interventionen oder aus verschiedenen Altersgruppen oder klinischen Populationen gewonnen werdenS 30 Auf diese Weise werden exogene oder endogene Verbindungen von Interesse in den Serum- und Behandlungsmedien in bioverfügbaren Mengen vorhanden sein und mit dem Zielgewebe zusammen mit dem endogenen Milieu ( dh in einem physiologischeren Kontext) interagieren. Dieser Ansatz ist dynamisch, da es höchstwahrscheinlich ist, dass eine gegebene Intervention einen Multiorgan (und Multi-Compound) -Effekt ausübt und somit das physiologische Milieu co-modifiziert wird. Während dieser Ansatz gewisse Herausforderungen stellt, da mehrere systemische biochemische Variablen gleichzeitig verändert werden, ist es ein Ansatz, der dazu beitragen kann, Nachteile einer rein reduktionistischen experimentellen Methodik zu überwinden 31 , 32 . Zusammenfassend kann die Implementierung von konditioniertem Serum zusammen mit einem gewebetechnischen ( in vitro biomimetischen ) Gewebe als Werkzeug für Physiologie, Ernährung und klinische Forschungsfragen verwendet werden. <stronG&gt; Klinische Anwendungen sind zahlreich Das hier vorgestellte Tissue Engineering-Modell kann verwendet werden, um anatomische und klinische Forschungsfragen zu untersuchen, die traditionelle In-vitro- Modelle nicht können. Ein Ligament oder Sehne in vivo enthält eine weiche bis harte Gewebeübergangsregion, die die Enthesis genannt wird. Die auf die mechanische Belastungsverletzung 33 anfällige Enthesis kann im Querschnitt über histochemische und Elektronenmikroskopietechniken 22 , 26 untersucht werden . Diese einzigartige Schnittstelle ist für diejenigen mit geringer oder eingeschränkter Beweglichkeit doppelt wichtig, da die physikalische Inaktivität die Fähigkeit des Bindegewebes beeinträchtigt, die Belastung in Regionen mit niedriger bis hoher Compliance 34 zu übertragen, was letztlich zu einer Gesamtabnahme der Gewebe-Compliance und einem erhöhten Verletzungsrisiko führt. Unser Labor hat vor kurzem dieses Tissue Engineering Modell 25 verwendet/ Sup&gt;, um eine andere Population zu modellieren, weibliche Athleten, die für Bindegewebsverletzungen gefährdet sind: Die Inzidenz von ACL-Verletzungen ist etwa fünfmal größer als ihre männlichen Pendants 35 . Potenzielle Mechanismen, die diese sexbasierte Disparität bei der Verletzung untermauern, wurden untersucht, indem sie Ligamentenkonstrukte mit physiologischen Konzentrationen des weiblichen Sexualhormons, Östrogen, in Konzentrationen behandelt wurden, die die Stadien des Menstruationszyklus nachahmen. Interessanterweise hemmten hohe Östrogenkonzentrationen die Genexpression und -aktivität der Lysoloxidase, das primäre Enzym, das für die Bildung von Lysin-Lysin-Quervernetzungen in der Kollagenmatrix von Bändern und Sehnen verantwortlich ist. Wichtig ist, dass 48 h des hohen Östrogens (um die Follikelphase zu simulieren) die Ligamentenkonstruktionssteifigkeit verringert, ohne die Kollagendichte der Konstrukte zu verändern. Aus physiologischer Perspektive deutet dies darauf hin, dass die Zunahme der Ligament-Laxheit bei Frauen zumindest teilweise zurückgehen kannVernetzungsbildung. Aus einer experimentellen Perspektive heben diese Erkenntnisse 25 den Nutzen des 3D-Konstruktmodells hervor, das eine funktionale Vernetzungsaktivität untersucht hat. Aus klinischer Perspektive kann dieses Modell nun verwendet werden, um schnell Interventionen zu screenen, die die negativen Effekte von Östrogen der Ligamentfunktion verhindern können. Schlußbemerkungen Hier haben wir eine detaillierte Methodik für die Bildung von konstruierten Bändern und deren Nutzen als 3D- In-vitro- Gewebemodell vorgestellt. Das Modell ist sehr anpassungsfähig für eine breite Palette von Zielen, die Flexibilität in der Zell-Typ, Interventionen und Ergebnis Maßnahmen von Interesse. Die Ergänzung von Futtermedien mit konditioniertem Serum fügt einen physiologischen Kontext hinzu, der in einer traditionellen in vitro Umgebung nicht erreicht werden kann, wodurch die Modellierung der in vivo Physiologie verbessert wird. Kurz gesagt, wir glauben, dass dies ein breit anwendbarer Modus istL mit spannenden Implikationen für die Förderung der Bereiche Physiologie und Tissue Engineering.

Sehnen- und Bandverletzungen sind häufig und können schwächende Konsequenzen für die normale Mobilität und Lebensqualität haben. Chirurgische Eingriffe sind oft notwendig, können aber einen begrenzten und vielfältigen Erfolg haben 4 , 5 . Das gegenwärtige Verständnis davon, wie sich Sehnen und Bänder entwickeln, reifen und auf Verletzungen reagieren, ist unvollständig, und so sind wirksame Forschungsmodelle erforderlich, um einen Einblick in die Entwicklung effektiverer Behandlungen zu geben. Um diese Wissenslücke zu bewältigen, können Tiermodelle verwendet werden, aber in vivo Studien sind inhärent komplex mit Schwierigkeiten bei der Kontrolle der Umwelt und direkt auf Interventionen auf das beabsichtigte Gewebe. Im Gegensatz dazu kann die experimentelle Umgebung in vitro mit der traditionellen Monolayerzellkultur leicht kontrolliert und überwacht werden . Diese Technik kann jedoch die chemische und mechanische Umgebung übertreffen und kann daher nicht rekapitulierenSpät das in vivo Verhalten der Zellen. Tissue Engineering ist in der Lage, die Vorteile der komplexen in vivo Umgebung in Tiermodellen mit der Kontrolle der in vitro Umwelt zu heiraten und bietet ein zusätzliches Werkzeug, um Physiologie zu studieren. Darüber hinaus, bewaffnet mit einem besseren Verständnis der Ligament-Entwicklung, Tissue Engineering kann auch eine Quelle von Transplantat Gewebe, wenn chirurgische Rekonstruktion erforderlich ist 6 . Somit validiert das hier beschriebene Verfahren ein in vitro 3D-konstruiertes Gewebe, das verwendet werden kann, um die Bandfunktion und die Morphologie zu untersuchen. Fibrin-basierte Sehnen- oder Ligamentenkonstrukte wurden als In-vitro- Modell verwendet, um physiologische Prozesse einschließlich Kollagenfibrillogenese 7 und Sehnenentwicklung 8 sowie Translationsanwendungen zu untersuchen, bei denen ihre Nützlichkeit als Pfropfgewebe in einem Schafmodell von anterior cru ausgewertet wurdeLigament (ACL) Rekonstruktion 9 . Unser Labor hat zuvor ein 3D-konstruiertes Ligamentmodell mit zwei Brushit, einem Calciumphosphat-Knochenersatzmaterial, Zementankern, hergestellt. Dieses Modell kann durch einfache Ergänzung des Kulturmediums mit biologischen Faktoren 10 oder durch Anwendung mechanischer Stimulation 11 verschiedenen experimentellen Bedingungen unterworfen werden. Wichtig ist, dass dieses Knochen-zu-Knochen-Ligament-Modell die eingehende Analyse der Enthesis, der Schnittstelle zwischen Boney- und Sehnenelementen, ermöglicht, die anfällig für Verletzungen ist. In der Studie, die hier gezeigt wurde, um diese Methodik zu präsentieren, interessierten wir uns für die Wirkung von trainationsbedingten Veränderungen im biochemischen Milieu auf die Bandfunktion. Übung verbessert die Zell- und Organfunktion in einer Vielzahl von Geweben im ganzen Körper 2 , 3 , </suP&gt; 12 , ein Effekt, der auf die Freisetzung verschiedener bekannter (z. B. IL-6 13 , IL-15 14 , Meteorin-artiger 15 , Exosomen 16 , 17 ) und anderer unbekannter biochemischer Faktoren zurückzuführen ist, die in den systemischen Kreislauf freigesetzt werden . Darüber hinaus ist das biochemische Nachjoch-Milieu mit übung reaktionsfähigen Hormonen angereichert, deren Freisetzung durch sympathische Nervensystemstimulation von Sekretionsdrüsen stimuliert wird ( zB Cortisol und Katecholamine aus der Nebenniere 18 und Wachstumshormon aus der anterioren Hypophyse) ). Allerdings ist es unmöglich, die Auswirkungen des mechanischen Stimulus der Übung von ausübung-induzierten biochemischen Veränderungen zu unterscheiden. Während einige Studien den erwarteten Anstieg von bestimmten zirkulierenden Hormonen und Zytokinen als Reaktion auf Übungen charakterisiert habenE wie oben erwähnt, gibt es zu viele Faktoren, sowohl bekannt als auch unbekannt, um in vitro genau zu rekapitulieren . Das heißt, die Isolierung einiger Faktoren für eine In-vitro- Studie adressiert die Komplexität der biochemischen Antwort unzureichend. In dieser Studie haben wir untersucht, wie sich Veränderungen im serumbiochemischen Milieu, angetrieben durch Übung, auf die entwickelte Ligamentfunktion auswirken. Um die Effekte der biochemischen Veränderungen zu isolieren, erhielten wir Serum von menschlichen Teilnehmern vor und nach einem Kampf der Resistenz-Übung und verwendeten es behandeln 3D-konstruierte Bänder, die mit menschlichen vorderen Kreuzbandlibament (ACL) Fibroblasten gebildet wurden. Mit diesem Modell können wir funktionale Daten erhalten, einschließlich Auswirkungen auf die mechanischen Eigenschaften und den Kollagengehalt sowie die quantitativen Effekte auf die molekulare Signalisierung.

<table><tbody><tr><td>Austerlitz Insect pins, minutien stainless steel, size 0.20</td><td>Entomoravia</td><td>N/A</td><td>For brushite cement anchors</td></tr><tr><td>&amp;beta;-tricalcium phosphate</td><td>Plasma Biotal Ltd (Derbyshire, UK)</td><td>N/A</td><td>For brushite cement anchors</td></tr><tr><td>o-phosphoric acid, 85% (w/w)</td><td>EMD Millipore</td><td>PX0995</td><td>For brushite cement anchors</td></tr><tr><td>Citric acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>251275-500g</td><td>For brushite cement anchors</td></tr><tr><td>Falcon 35 mm tissue culture dishes</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772A</td><td>For silicone-coated plates</td></tr><tr><td>Sylgard 184 silicone elastomer kit</td><td>Ellsworth Adhesives</td><td>4019862</td><td>For silicone-coated plates</td></tr><tr><td>1x Phosphate-buffered saline (PBS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3002802</td><td>For cell isolation and expansion</td></tr><tr><td>100x antibiotic/antimycotic solution</td><td>VWR</td><td>45000-616</td><td>For cell isolation</td></tr><tr><td>Type II collagenase</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17101015</td><td>For cell isolation</td></tr><tr><td>100x penicillin/streptomycin solution</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td>For cell isolation</td></tr><tr><td>Steriflip-GP, 0.22&amp;nbsp;&amp;micro;m pore, polyethersulfone, gamma irradiated</td><td>EMD Millipore</td><td>SCGP00525</td><td>For reagent sterilization</td></tr><tr><td>DMEM high glucose with sodium pyruvate and L-glutamine</td><td>VWR</td><td>10-013-CV</td><td>For cell and tissue culture</td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>BioSera</td><td>FBS2000</td><td>Component of tissue digestion media and growth media</td></tr><tr><td>Penicillin G Potassium Salt</td><td>MP Biomedicals</td><td>0219453680 - 100 MU</td><td>Component of growth media. Dissolve in water to 100,000 U/mL, filter sterilize, aliquot, and store at -20&amp;deg;C.</td></tr><tr><td>CELLSTAR polystyrene tissue culture dishes (145 mm x 20 mm)</td><td>VWR</td><td>82050-598</td><td>For cell culture</td></tr><tr><td>Trypan blue</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>T10282</td><td>For cell isolation</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0.25%)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25200056</td><td>For cell culture. Dilute to 0.05% in PBS</td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>472301</td><td>For cell freezing media</td></tr><tr><td>Nalgene Mr. Frosty Cryogenic Freezing Container</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>5100-0001</td><td>For cell freezing</td></tr><tr><td>BD Vacutainer Red Plastic 10 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>367820</td><td>For human serum collection</td></tr><tr><td>Bound Tree Insyte Autoguard IV Catheters, 22 G x 1 inch Needle</td><td>Fisher Scientific</td><td>354221</td><td>For human serum collection</td></tr><tr><td>Thrombin, bovine origin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4648-1KU</td><td>For engineered ligament formation. Dissolve at 200 U/mL in DMEM high glucose media. Filter at 0.22 &amp;mu;m, aliquot, and store at -20 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Fibrinogen, bovine origin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8630-5G</td><td>For engineered ligament formation. Dissolve at 20 mg/mL in DMEM high glucose media. Filter at 0.22 &amp;mu;m, aliquot, and store at -20 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Aprotinin from bovine lung</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3428</td><td>For engineered ligament formation. Dissolve at 10 mg/mL in water. Filter at 0.22 &amp;mu;m, aliquot, and store at -20 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>6-Aminohexanoic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>07260-100g</td><td>For engineered ligament formation. Dissolve at 0.1g/mL in water. Filter at 0.22 &amp;mu;m, aliquot, and store at 4 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>L-Ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8960-5G</td><td>Component of feed media. Dissolve in DMEM high glucose media at a concentration of 50 mM. Filter at 0.22 &amp;mu;m and store at 4 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>L-proline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5607-25G</td><td>Component of feed media. Dissolve in PBS at a concentration of 50 mM. Filter at 0.22 &amp;mu;m and store at 4 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Transforming growth factor-&amp;beta;1</td><td>Peprotech</td><td>100-21</td><td>Component of feed media. Reconsistute according to manufacturer&#039;s instructions at a concentration of 10 &amp;mu;g/mL. Aliquot and store at -20 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Stericup-GP, 0.22&amp;nbsp;&amp;micro;m, polyethersulfone, 250&amp;nbsp;mL, radio-sterilized</td><td>EMD Millipore</td><td>SCGPU02RE</td><td>For reagent sterilization</td></tr><tr><td>Hydrochloric acid</td><td>Fisher Scientific</td><td>A144-212</td><td>Dilute in water to 6 M</td></tr><tr><td>4-Dimethylaminobenzaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>39070-50g</td><td>For hydroxyproline assay</td></tr><tr><td>Chloramine-T trihydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>402869-100g</td><td>For hydroxyproline assay</td></tr><tr><td>trans-4-Hydroxy-L-proline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H54409-100g</td><td>For hydroxyproline assay</td></tr><tr><td>1-propanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>279544-1L</td><td>For hydroxyproline assay</td></tr><tr><td>Perchloric acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>311421-250ml</td><td>For hydroxyproline assay</td></tr><tr><td>Acetic acid, glacial</td><td>EMD Millipore</td><td>AX0073-9</td><td>For hydroxyproline assay</td></tr><tr><td>Sodium hydroxide</td><td>Fisher Scientific</td><td>S318-500</td><td>For hydroxyproline assay</td></tr><tr><td>Toluene, anhydrous</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>244511-1L</td><td>For hydroxyproline assay</td></tr><tr><td>Corning Costar Clear Polystyrene 96-Well Plates</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-656</td><td>For hydroxyproline assay</td></tr></tbody></table>

treatment of ligament constructs with exercise-conditioned serum: a translational tissue engineering model

In-vitro- Experimente sind essentiell, um biologische Mechanismen zu verstehen; Allerdings ist die Kluft zwischen der monolayer Gewebekultur und der menschlichen Physiologie groß, und die Übersetzung der Befunde ist oft schlecht. So gibt es genügend Gelegenheit für alternative experimentelle Ansätze. Hier stellen wir einen Ansatz vor, in dem menschliche Zellen aus menschlichen vorderen Kreuzband-Geweberesten isoliert, in Kultur erweitert und zur Bildung von konstruierten Bändern verwendet werden. Übung ändert das biochemische Milieu im Blut, so dass die Funktion vieler Gewebe, Organe und Körperprozesse verbessert wird. In diesem Experiment wurde das Ligamentenkonstruktionskulturmedium mit experimentellem Humanserum ergänzt, das durch Übung &quot;konditioniert&quot; wurde. Somit ist die Intervention biologisch relevanter, da ein experimentelles Gewebe dem vollen endogenen biochemischen Milieu ausgesetzt ist, einschließlich bindender Proteine ​​und ergänzender Verbindungen, die im Zusammenhang mit der Aktivität von a verändert werden könnenUnbekannter Agent von Interesse. Nach der Behandlung können konstruierte Bänder für mechanische Funktion, Kollagengehalt, Morphologie und zelluläre Biochemie analysiert werden. Insgesamt gibt es vier große Vorteile gegenüber herkömmlichen Monolayer-Kultur- und Tiermodellen, dem hier vorgestellten physiologischen Modell des Bandgewebes. Zuerst sind die Ligamentenkonstrukte dreidimensional, so dass mechanische Eigenschaften ( dh Funktion), wie z. B. Zugspannung, maximale Zugbelastung und Modul, quantifiziert werden können. Zweitens kann die Enthesis, die Schnittstelle zwischen boney und sinew elements, im Detail und im funktionalen Kontext untersucht werden. Drittens ermöglicht die Vorbereitung von Medien mit Post-Übungs-Serum die Auswirkungen des ausübung-induzierten biochemischen Milieus, das für das breite Spektrum der gesundheitlichen Vorteile der Übung verantwortlich ist, in einer unvoreingenommenen Weise zu untersuchen. Schließlich schreitet dieses experimentelle Modell die wissenschaftliche Forschung auf eine humane und ethische Weise vor, indem sie die Verwendung vonTiere, ein Kernmandat der National Institutes of Health, das Center for Disease Control und die Food and Drug Administration.

Übersicht über die entwickelte Ligamentbildung und experimentelle Intervention Abbildung 1 zeigt einen Überblick über die Bildung von Konstruktionsbändern. Brushit-Zement wird ein Knochenersatzmaterial 22 durch Kombination einer Orthophosphorsäure / Zitronensäurelösung mit β-Tricalciumphosphat in zylindrischen Vertiefungen hergestellt. Alternativ können, wenn nicht direkt mechanische Funktion der Gewebe gemessen werden, 3-0 Seidennähte als Anker bei der Bildung eines Gewebes verwendet werden. Diese werden in silikonbeschichteten 35-mm-Schalen 12 mm auseinander gehalten und durch Einweichen in 70% Ethanol sterilisiert. Fibroblasten werden aus den vorderen Kreuzbandresten isoliert, die während der ACL-Rekonstruktionsoperation erhalten wurden. Nach der Expansion werden 2,5 x 10 &amp; sup5; Zellen in einem Fibrin-Gel eingekapselt, das in der Brushit-Zement-Anker-gepinnten Schale gebildet wird. Nach der bildung, ligament constrKönnen auf Veränderungen der mechanischen Eigenschaften, des Kollagengehalts, der Zellproliferation, der Genexpression, der Proteinspiegel und der Gewebemorphologie untersucht werden. Während der Kultur kontrahieren die Zellen das Fibringel und bilden ein lineares Gewebe zwischen den beiden Anker (Abbildung 2A ). Nach 1-2 Tagen in Kultur haben sich die Zellen an das Fibringel gebunden, verlängerte Zellprozesse und begannen, Zugkräfte auszuüben (Abbildung 2B ). Da das Fibringel durch Zugkräfte kontrahiert und durch zelluläre Enzyme zerlegt wird, wird zwischen den beiden Ankerpunkten eine Spannung erzeugt und unsere Zellen parallel zu dieser Achse ausgerichtet ( Abb. 2B ) und beginnen Kollagen zu deponieren. Nach 4-5 Tagen haben sich die Konstrukte um die Anker, die ein lineares zylindrisches Gewebe bilden, zusammengezogen ( Fig. 2A , an diesem Punkt können externe Reize auf das System angewendet werden (IntervEntion zu diesem Zeitpunkt vermeidet die Störung des linearen Gewebebildungsprozesses). Interventionen können die Ergänzung der Kulturmedien mit menschlichem oder tierischem Serum nach einer gegebenen Intervention, exogenen Zytokinen und Wachstumsfaktoren, die mechanische Stimulation oder die Veränderung anderer Umweltfaktoren wie Sauerstoffspannung, umfassen. Unter Verwendung von Wachstumsmedien (DMEM mit 10% FBS und 100 U / ml Penicillin), ergänzt mit 200 &amp; mgr; M Ascorbinsäure, 50 &amp; mgr; M L-Prolin und 5 ng / ml TGF-β1, haben wir festgestellt, dass die Zellproliferation während einer 2-wöchigen Kultur fortgesetzt wird ( Abb. 2C ) und in der Tat zeigt die Lichtmikroskopie ein dichtes Gewebe, das hochgradig ausgerichtete Zellen an 14 Tagen Kultur enthält (Abbildung 2B ). Bewertung von konstruierten Bändern Am Ende der Kulturperiode können konstruierte Bänder in einer Varietät beurteilt werdenY von Weisen Ein wesentlicher Vorteil dieses Systems ist die Fähigkeit, funktionelle Veränderungen des Gewebes durch mechanische Tests zu bestimmen, eine wichtige Beurteilung angesichts der mechanischen Rolle des nativen Bandes. Uniaxiale Zugversuche können verwendet werden, um die mechanischen Eigenschaften einschließlich der Last zum Ausfall, der Zugfestigkeit und des Elastizitätsmoduls zu messen. Viskoelastische Eigenschaften können auch mit Spannungsrelaxation und Kriechversuchen gemessen werden. Fig. 3A zeigt ein konstruiertes Ligament, das in umgekehrt geformten Griffen in einem kundenspezifischen uniaxialen Zugprüfgerät gehalten wird. Der rechte Griff ist an einem Kraftaufnehmer angebracht, um die Last über dem Band zu messen, wenn das Gewebe zum Versagen belastet wird. Fig. 3B zeigt eine repräsentative Spannungs-Dehnungs-Kurve für einen Test zum Versagen Nach einer mechanischen Prüfung können dieselben Konstrukte getrocknet und für einen Hydroxyprolin-Assay 23 verarbeitet werden, um den gesamten Kollagengehalt sowie andere Biochs zu beurteilenMische Assays Mit einer ausreichenden Anzahl von zusätzlichen Proben pro Bedingung kann eine gründliche Untersuchung eines experimentellen Eingriffs durchgeführt werden, einschließlich seiner Auswirkungen auf die Zellproliferation, die Gen- und Proteinexpression und die histologische Morphologie. Während 14 Tage ein typischer Endpunkt für unsere Studien sind, verbessern die konstruierten Bänder ihre mechanischen Eigenschaften und ihren Kollagengehalt durch 28 Tage Kultur, wie in Abbildung 3C gezeigt, und kann für mindestens 3 Monate in Kultur 24 überleben. Spendervariabilität ist ein wichtiger Aspekt für die experimentelle Wiederholbarkeit. Fig. 4 zeigt ein repräsentatives Experiment, das von Lee et al. 25 Vergleich von 7 verschiedenen ACL-Donoren (n = 3 männlich und n = 4 weiblich), die typische Zugeigenschaften und Kollagengehalt nach einer 2-wöchigen Kultur in der zuvor beschriebenen zeigen<html> Ergänzte Wachstumsmedien. Mit Hilfe von Zellen aus ähnlichen ACL-Sammlungen, Alter des Spenders, Zeit nach Verletzung, Geschlecht usw. zeigen die entwickelten Bänder eine geringe Variabilität zwischen Spendern und ähnlichen Eigenschaften zwischen männlichen und weiblichen Spendern mit Ausnahme des Unterschieds in der Kollagenfraktion. In der oben erwähnten Studie wurden konstruierte Bänder als In-vitro- Modell verwendet, um zu untersuchen, warum Frauen ein signifikant größeres Risiko für ACL-Verletzungen haben als Männer und zeigten, dass ACL-Fibroblasten, die von weiblichen Spendern isoliert wurden, nicht inhärent schwächere und weniger kollagene konstruierte Bänder bilden. Die Auswirkung des Nach-Übungs-Serum-Milieus auf die In-vitro- Ligamentfunktion Wir haben bisher die Fähigkeit von konstruierten Bändern gezeigt, um physiologische Prozesse 1 ,Ss = &quot;xref&quot;&gt; 25 In dem folgenden repräsentativen Experiment, wie von West et al. 1 , haben wir die biochemischen Effekte der Übung auf die Bandfunktion bestimmt und die Methodik und die Ergebnisse hier hervorgehoben. Wir bildeten konstruierte Bänder mit menschlichen ACL-Zellen und wandten eine Intervention an Tag 7 der Kultur, bestehend aus Kulturmedien, die mit menschlichem Serum konditioniert wurden, vor und nach der Übung. Kurz gesagt, wir rekrutierten gesunde junge männliche Teilnehmer und sammelten Blutproben vor und nach einem akuten Kampf der Resistenz-Übung, die zirkulierende Hormone und Zytokine einschließlich menschliches Wachstumshormon (GH) erhöht. Das menschliche Serum wurde aus Vor- und Nach-Übung-Blutproben isoliert und anstelle von fötalem Rinderserum in den Kulturmedien für die zweite Woche der konstruierten Ligamentenkultur verwendet (Abbildung 5A ). Vor- und Nach-Übungs-Serumproben wurden unter Verwendung von ELISA für Änderungen in GH und insulinähnlichem Wachstumsfaktor 1 (IGF-1) analysiertDeren Konzentration durch Übung verändert werden kann (Abbildung 5B ). Diese Information wurde verwendet, um Serum-Effekte auf die konstruierten Bänder mit Veränderungen im Serum als Reaktion auf Übung zu korrelieren. Nach einer 14-tägigen Kulturperiode wurden die Ligamentenkonstrukte unter Verwendung eines mechanischen Tests und einer Hydroxyprolin-Bestimmung des Kollagengehalts bewertet und zeigten eine signifikante Zunahme sowohl der maximalen Zugbelastung als auch des Kollagengehalts in Reaktion auf das Nachübungsserum. Um zu beurteilen, ob dieser Effekt mit Übungs-induzierten Freisetzungen von GH oder IGF-1 zusammenhängt, wurden in einem separaten Experiment konstruierte Bänder gebildet und mit einer Dosisantwort von entweder humanem rekombinantem GH oder IGF-1 behandelt. Interessanterweise erhöhte die fortschreitende rekombinante GH-Konzentration im Kulturmedium, während das Serum GH im Blut zunahm (Abbildung 5B- i), den Kollagengehalt (Abbildung 5D- i) oder mechanisch nichtEigenschaften (Daten nicht gezeigt) in konstruierten Bändern. Im Gegensatz dazu zeigten die Serum-IGF-1-Spiegel nach dem Training nicht, aber ein Dosis-Wirkungs-Experiment zeigte, dass die Erhöhung der Konzentrationen in den Kulturmedien den Kollagengehalt von Ligamentenkonstrukten verbesserte (Abbildung 4D- ii). Während also die Ausübung zu einer robusten Zunahme des Nachbehandlungs-GH führte, erweckt das Dosis-Response-Experiment mit rhGH Zweifel daran, ob GH direkt für die phänotypische Verstärkung der konstruierten Bänder verantwortlich ist (zumindest die 22 kDa-Isoform allein nicht Scheinen verantwortlich zu sein). Umgekehrt, während Serum IGF-1 nicht bei 15 min nach der Übung verändert wurde, zeigte das RHIGF-1 über ein breites Spektrum von Konzentrationen, dass IGF-1 in der Lage ist, den Kollagengehalt zu verbessern; Es sollte jedoch beachtet werden, dass die Erhöhung der rhIGF-1-Konzentrationen durch einen Bereich, der die physiologischen Konzentrationen schätzte, den Kollagengehalt nicht signifikant erhöhte. So ist das einzigartige Post-Trainings-Serum enviroWar wichtig für die Verbesserung der Mechanik und des Kollagens von konstruierten Bändern. In der hier betrachteten Studie war das Volumen des experimentellen Serums aufgrund ethischer Erwägungen begrenzt; So wurden kurzfristige 2D-Bioassays, die niedrigere Serumanforderungen hatten, verwendet, um die molekularen Mechanismen, die für die beobachtete Zunahme des Kollagens verantwortlich waren, weiter zu untersuchen. ACL-Fibroblasten wurden bis zur Konfluenz in 6-Well-Platten kultiviert und für 1 Stunde mit Ruhe- oder Nachübungsserum behandelt und mit Dosisreaktionen von rekombinantem GH, IGF-1, TGF-β1 und der Aktivierung von Targets im PI3K / mTORC1 verglichen , ERK1 / 2 und Smad-Signalwege bestimmt. In Gegenwart von Post-Trainings-Serum zeigte der PI3K / mTORC1- und ERK1 / 2-Weg eine stärkere Aktivierung, wie durch Phosphorylierung von S6K (Abbildung 5D- i) bzw. ERK1 / 2 (Abbildung 5D- ii) beurteilt.Im Vergleich zu den Hormon- und Zytokin-Dosisreaktionen, während GH einen kleinen positiven Effekt auf die mTOR-Signalisierung hatte (Abbildung 5D- i) und IGF-1 zeigten eine positive Wirkung bei der niedrigsten Dosis, die drei Behandlungen von GH, IGF-1 und TGF -β1 nicht für den Anstieg der PI3K / mTORC1- und ERK1 / 2-Signalisierung verantwortlich war. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass unser 3D-konstruiertes Ligamentmodell und 2D-Bioassay-Daten darauf hindeuten, dass die Post-Trainings-Serum-Umgebung durch die Aktivierung der PI3K / mTORC1- und ERK1 / 2-Wege in der Lage ist, die Ligamentfunktion und den Kollagengehalt zu verbessern. Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass man ein konstruktives Ligamentmodell mit ausübungsbedingtem Serum kombiniert hat. Wir konnten die Wirkung der Post-Trainings-Serumumgebung auf die konstruierte Ligamentfunktion und das Kollagen untersuchen, ii) die Veränderungen des Ligament-Phänotyps mit Veränderungen der Serum-Hormon-Konzentration korrelieren, Mit dem Ziel zu bestimmen, welche Veränderungen im Serum zu chang geführt habenEs in konstruierten Bändern und iii) weiter den Umfang der Arbeit unter Verwendung von 2D-Bioassays, um molekulare Ziele des serumbiochemischen Milieus zu untersuchen, um molekulare Mechanismen zu bestimmen, die durch Nachübungsserum aktiviert werden, die zu Verbesserungen der Ligamentfunktion führen. <img alt="Abbildung 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55339/55339fig1.jpg" /> Abbildung 1: Überblick über die Entstehung und Verwendung von konstruierten Bändern. Brushit-Zementanker werden in silikonbeschichtete Platten gefertigt und fixiert. Primäre Fibroblasten werden isoliert und aus ACL-Resten erweitert. Konstruktive Bänder werden durch Einkapselung von Fibroblasten in einem Fibringel um zwei Brushit-Zementanker gebildet. Konstruktive Bänder werden kultiviert und mit jeglichem spezifischen chemischen oder mechanischen ( zB über einen Bioreaktor) stimuliert. Am gewünschten Endpunkt können konstruierte Bänder gesammelt und für Mechanica beurteilt werdenL Eigenschaften, Genexpression, Kollagengehalt, Proteinexpression und Histologie. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55339/55339fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55339/55339fig2.jpg" /> Abbildung 2. Primäre Ligamentfibroblasten bilden ein Fibrin-basiertes Knochen-zu-Knochen-konstruiertes Band, das zwei Brushit-Zement-Anker umfasst. ( A ) Im Laufe der Zeit verteilen die Fibroblasten das Fibringel um die Brushit-Zement-Anker, die ein lineares Gewebe bilden. ( B ) In den ersten drei Tagen hängen die Zellen an das Fibringel an und üben Zugkräfte aus, wobei die Zellen mit der langen Achse des Konstruktes ausgerichtet werden. Über 14 Tage bilden die Zellen ein hoch ausgerichtetes Gewebe. Maßstab = 160 μm. ( C ) Der DNA-Gehalt der konstruierten Bänder nimmt weiter zu oVer 14 Tage in der Kultur, während sich die Zellen vermehren. Die Daten werden als Mittelwert ± SD mit n = 3-4 Konstrukten pro Gruppe dargestellt. Gruppen <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55339/55339fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55339/55339fig3.jpg" /> Abbildung 3: Mechanische Eigenschaften des gewogenen Bands und der Kollagengehalt verbessern sich im Laufe der Zeit. ( A ) Ligamentenkonstrukte sind uniaxial spannungsgeprüft, um die Wirkung eines gegebenen Eingriffs auf die Ligamentfunktion zu bestimmen. Wie gezeigt, halten zwei umgekehrt geformte, 3D-bedruckte Griffe wechselseitig geformte Anker, die von der konstruierten Sünde überbrückt werden. Anker sind mit einem Schrittmotor und einem Kraftaufnehmer gekoppelt, um Spannungs- / Dehnungskurven des getesteten Gewebes zu erzeugen, wodurch mechanische Eigenschaften bestimmt werden können. ( B &lt;/ Strong&gt;) Repräsentative Spannungs-Dehnungs-Kurve von einem konstruierten Band, das zum Versagen gespannt ist. Im Laufe von 28 Tagen, ( C ) Endzugfestigkeit (UTS), ( D ) maximale Zugbelastung (MTL), ( E ) Elastizitätsmodul und ( F ) Kollagenfraktion weiter zu verbessern. Die Daten werden als Mittelwert ± SD mit n = 5 Konstrukten pro Gruppe dargestellt. * Zeigt signifikanten Unterschied zu allen anderen Gruppen. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55339/55339fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55339/55339fig4.jpg" /> Abbildung 4: Konstruktive Bänder können auf Funktionalität und biochemischen Inhalt beurteilt werden und zeigen eine niedrige Donorvariabilität. Ausgearbeitete Bänder wurden 7 verschiedene Spender gebildet (n = 3 männlich, n = 4 weiblich). Nach 2 Wochen o( C ) Elastizitätsmodul, ( D ) Querschnittsfläche (CSA), ( E ) Gesamtkollagengehalt pro, Konstruieren und ( F ) Kollagen als Bruchteil der trockenen Masse. Die Daten werden als Mittelwert ± SD dargestellt und die statistische Signifikanz wurde mit dem t-Test von Student * Zeigt einen signifikanten Unterschied zu anderen Gruppen (p &lt;0,05). Abbildung von Lee et al. 25 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55339/55339fig4large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55339/55339fig5.jpg" /> Abbildung 5. Konstruktive Bänder zeigen mechanische und biochemische Veränderungen in Reaktion auf BioloGrafische Interventionen. ( A ) Serum wurde aus Blutspuren isoliert, die von den Probanden vor- (RestTx) und nach der Übung (ExTx) gesammelt wurden und zur Behandlung von Konstruktionsbändern während der zweiten Kulturwoche verwendet wurden. ( B ) (i) Das menschliche Wachstumshormon (GH) und (ii) Insulin-ähnliche Wachstumsfaktor (IGF) -1-Spiegel im Rest- und Übungsserum wurden durch ELISA quantifiziert. ( C ) Konstruierte Bänder, die mit ExTx behandelt wurden, zeigten einen verbesserten (i) Kollagengehalt und (ii) maximale Zugbelastung. Die statistische Signifikanz der gepaarten Vergleiche (RestTx und ExTx) wurde durch einen t-Test mit einem auf p &lt;0,05 eingestellten Signifikanzniveau analysiert. ( D ) Eine Dosis-Antwort von (i) GH und (ii) IGF-1 wurde verwendet, um mögliche Beiträge dieser Faktoren auf die Veränderungen des Kollagengehalts durch ExTx zu bestimmen. E) 2D-Bioassays wurden verwendet, um die Effekte von zunehmenden Dosen von GH, RestTx und ExTx auf molekulare Signalisierungsziele wie die Phosphorylierung von (i) S6K Thr38 zu vergleichen9 und (ii) ERK1 / 2 Thr202 / Tyr204 . Der statistische Vergleich von mehr als zwei experimentellen Gruppen erfolgte mit ANOVA und Tukey&#39;s HSD. Die Daten werden als Mittelwert ± SD dargestellt. * Zeigt einen signifikanten Unterschied zur Kontrolle an (p &lt;0,05) und § zeigt einen signifikanten Unterschied von 150 ng / mL und 300 ng / mL IGF-1 an. Abbildung von West et al. 1 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55339/55339fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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Behandlung von Bandkonstrukten mit belastungskonditioniertem Serum: Ein translatorisches Tissue-Engineering-Modell | Bioingenieurwesen | Video

Treatment of Ligament Constructs with Exercise-conditioned Serum: A Translational Tissue Engineering Model

Wir präsentieren ein Modell des Bandgewebes, in dem dreidimensionale Konstrukte mit dem menschlichen Übungskonditionierten Serum behandelt und auf Kollagengehalt, Funktion und Zellbiochemie analysiert werden.

Behandlung von Ligamentenkonstrukten mit ausüberschüssigem Serum: Ein Translations-Gewebe-Engineering-Modell

In vitro experiments are essential to understand biological mechanisms; however, the gap between monolayer tissue culture and human physiology is large, ...

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13.5K Aufrufe.  University of California, Davis.  Wir präsentieren ein Modell des Bandgewebes, in dem dreidimensionale Konstrukte mit dem menschlichen Übungskonditionierten Serum behandelt und auf Kollagengehalt, Funktion und Zellbiochemie analysiert werden. 

Serie: Treatment of Ligament Constructs with Exercise-conditioned Serum: A Translational Tissue Engineering Model

Engineering Fibrin-based Tissue Constructs from Myofibroblasts and Application of Constraints and Strain to Induce Cell and Collagen Reorganization

Collagen content and organization in developing collagenous tissues can be influenced by local tissue strains and tissue constraint. Tissue engineers aim to use these principles to create tissues with predefined collagen architectures. A full understanding of the exact underlying processes of collagen remodeling to control the final tissue architecture, however, is lacking. In particular, little is known about the (re)orientation of collagen fibers in response to changes in tissue mechanical loading conditions. We developed an in&#160;vitro model system, consisting of biaxially-constrained myofibroblast-seeded fibrin constructs, to further elucidate collagen (re)orientation in response to i) reverting biaxial to uniaxial static loading conditions and ii) cyclic uniaxial loading of the biaxially-constrained constructs before and after a change in loading direction, with use of the Flexcell FX4000T loading device. Time-lapse confocal imaging is used to visualize collagen (re)orientation in a nondestructive manner.
Cell and collagen organization in the constructs can be visualized in real-time, and an internal reference system allows us to relocate cells and collagen structures for time-lapse analysis. Various aspects of the model system can be adjusted, like cell source or use of healthy and diseased cells. Additives can be used to further elucidate mechanisms underlying collagen remodeling, by for example adding MMPs or blocking integrins. Shape and size of the construct can be easily adapted to specific needs, resulting in a highly tunable model system to study cell and collagen (re)organization.

This model system starts from a myofibroblast-populated fibrin gel that can be used to study endogenous collagen (re)organization real-time in a nondestructive manner. The model system is very tunable, as it can be used with different cell sources, medium additives, and can be adapted easily to specific needs.

Ingenieurwesen Fibrin-basierten Tissue Konstrukte von Myofibroblasten und Anwendung von Constraints und abseihen to Cell und Collagen (Re) Organisation Induce

Collagen content and organization in developing collagenous tissues can be influenced by local tissue strains and tissue constraint. Tissue engineers aim ...

Forschung

Biotechnik

Surgical Retrieval, Isolation and In vitro Expansion of Human Anterior Cruciate Ligament-derived Cells for Tissue Engineering Applications

Injury to the ACL is a commonly encountered problem in active individuals. Even partial tears of this intra-articular knee ligament lead to biomechanical deficiencies that impair function and stability. Current options for the treatment of partial ACL tears range from nonoperative, conservative management to multiple surgical options, such as: thermal modification, single-bundle repair, complete reconstruction, and reconstruction of the damaged portion of the native ligament. Few studies, if any, have demonstrated any single method for management to be consistently superior, and in many cases patients continue to demonstrate persistent instability and other comorbidities.
The goal of this study is to identify a potential cell source for utilization in the development of a tissue engineered patch that could be implemented in the repair of a partially torn ACL. A novel protocol was developed for the expansion of cells derived from patients undergoing ACL reconstruction. To isolate the cells, minced hACL tissue obtained during ACL reconstruction was digested in a Collagenase solution. Expansion was performed using DMEM/F12 medium supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS) and 1% penicillin/streptomycin (P/S). The cells were then stored at -80 &#186;C or in liquid nitrogen in a freezing medium consisting of DMSO, FBS and the expansion medium. After thawing, the hACL derived cells were then seeded onto a tissue engineered scaffold, PLAGA (Poly lactic-co-glycolic acid) and control Tissue culture polystyrene (TCPS). After 7 days, SEM was performed to compare cellular adhesion to the PLAGA versus the control TCPS. Cellular morphology was evaluated using immunofluorescence staining. SEM (Scanning Electron Microscope) micrographs demonstrated that cells grew and adhered on both PLAGA and TCPS surfaces and were confluent over the entire surfaces by day 7. Immunofluorescence staining showed normal, non-stressed morphological patterns on both surfaces. This technique is promising for applications in ACL regeneration and reconstruction.

Surgical Retrieval, Isolation and In vitro Expansion of Human Anterior Cruciate Ligament-derived Cells for Tissue Engineering Applications

For future applications as a patch to repair partial tears of the Anterior Cruciate Ligament (ACL), human ACL derived cells were isolated from tissue obtained during reconstructive procedures, expanded in vitro and grown on tissue engineered scaffolds. Cellular adhesion and morphology was then performed to confirm biocompatibility on scaffold surface.

Chirurgische Retrieval, Isolierung und<em&gt; In-vitro-</em&gt; Erweiterung des menschlichen vorderen Kreuzbandes abgeleiteten Zellen für Tissue Engineering Anwendungen

Injury to the ACL is a commonly encountered problem in active individuals. Even partial tears of this intra-articular knee ligament lead to biomechanical ...

Athymic Rat Model for Evaluation of Engineered Anterior Cruciate Ligament Grafts

Anterior cruciate ligament (ACL) rupture is a common ligamentous injury that often requires surgery because the ACL does not heal well without intervention. Current treatment strategies include ligament reconstruction with either autograft or allograft, which each have their associated limitations. Thus, there is interest in designing a tissue-engineered graft for use in ACL reconstruction. We describe the fabrication of an electrospun polymer graft for use in ACL tissue engineering. This polycaprolactone graft is biocompatible, biodegradable, porous, and is comprised of aligned fibers. Because an animal model is necessary to evaluate such a graft, this paper describes an intra-articular athymic rat model of ACL reconstruction that can be used to evaluate engineered grafts, including those seeded with xenogeneic cells. Representative histology and biomechanical testing results at 16 weeks postoperatively are presented, with grafts tested immediately post-implantation and contralateral native ACLs serving as controls. The present study provides a reproducible animal model with which to evaluate tissue engineered ACL grafts, and demonstrates the potential of a regenerative medicine approach to treatment of ACL rupture.

Animal models are important tools for the evaluation of tissue-engineered grafts. This paper presents the protocol for preparing an electrospun biodegradable polymer graft for use in anterior cruciate ligament tissue engineering, as well as a surgical protocol for implantation in a rat model.

Athymischen Rattenmodell für die Bewertung von Engineered vorderen Kreuzbandes Grafts

Anterior cruciate ligament (ACL) rupture is a common ligamentous injury that often requires surgery because the ACL does not heal well without ...

Engineering 3D Cellularized Collagen Gels for Vascular Tissue Regeneration

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. Collagen has been extensively used for a wide range of biomedical applications and is considered a valid alternative to synthetic materials due to its inherent biocompatibility (i.e., low antigenicity, inflammation, and cytotoxic responses). However, the limited mechanical properties and the related low hand-ability of collagen gels have hampered their use as scaffold materials for vascular tissue engineering. Therefore, the rationale behind this work was first to engineer cellularized collagen gels into a tubular-shaped geometry and second to enhance smooth muscle cells driven reorganization of collagen matrix to obtain tissues stiff enough to be handled.
The strategy described here is based on the direct assembling of collagen and smooth muscle cells (construct) in a 3D cylindrical geometry with the use of a molding technique. This process requires a maturation period, during which the constructs are cultured in a bioreactor under static conditions (without applied external dynamic mechanical constraints) for 1 or 2 weeks. The &#8220;static bioreactor&#8221; provides a monitored and controlled sterile environment (pH, temperature, gas exchange, nutrient supply and waste removal) to the constructs. During culture period, thickness measurements were performed to evaluate the cells-driven remodeling of the collagen matrix, and glucose consumption and lactate production rates were measured to monitor the cells metabolic activity. Finally, mechanical and viscoelastic properties were assessed for the resulting tubular constructs. To this end, specific protocols and a focused know-how (manipulation, gripping, working in hydrated environment, and so on) were developed to characterize the engineered tissues.

In this work, we present a technique for the rapid fabrication of living vascular tissues by direct culturing of collagen, smooth muscle cells and endothelial cells. In addition, a new protocol for the mechanical characterization of engineered vascular tissues is described.

Engineering 3D cellularized Kollagengele für Gefäßgeweberegeneration

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. ...

A Novel Tenorrhaphy Suture Technique with Tissue Engineered Collagen Graft to Repair Large Tendon Defects

Surgical management of large tendon defects with tendon grafts is challenging, as there are a finite number of sites where donors can be readily identified and used. Currently, this gap is filled with tendon auto-, allo-, xeno-, or artificial grafts, but clinical methods to secure them are not necessarily translatable to animals because of the scale. In order to evaluate new biomaterials or study a tendon graft made up of collagen type 1, we have developed a modified suture technique to help maintain the engineered tendon in alignment with the tendon ends. Mechanical properties of these grafts are inferior to the native tendon. To incorporate engineered tendon into clinically relevant models of loaded repair, a strategy was adopted to offload the tissue engineered tendon graft and allow for the maturation and integration of the engineered tendon in vivo until a mechanically sound neo-tendon was formed. We describe this technique using incorporation of the collagen type 1 tissue engineered tendon construct.

In this paper, we present an in vitro and in situ protocol to repair a tendon gap of up to 1.5 cm by filling it with engineered collagen graft. This was performed by developing a modified suture technique to take the mechanical load until the graft matures into the host tissue.

Eine neuartige Tenorrhaphy-Nahttechnik mit tissue engineered Collagen Graft zur Reparatur großer Sehnendefekte

Surgical management of large tendon defects with tendon grafts is challenging, as there are a finite number of sites where donors can be readily ...

Evaluation of Stem Cell Therapies in a Bilateral Patellar Tendon Injury Model in Rats

Regenerative medicine provides novel alternatives to conditions that challenge traditional treatments. The prevalence and morbidity of tendinopathy across species, combined with the limited healing properties of this tissue, have prompted the search for cellular therapies and propelled the development of experimental models to study their efficacy. Umbilical cord matrix-derived mesenchymal stem cells (UCM-MSC) are appealing candidates because they are abundant, easy to collect, circumvent the ethical concerns and risk of teratoma formation, yet resemble primitive embryonic stem cells more closely than adult tissue-derived MSCs. Significant interest has focused on chitosan as a strategy to enhance the properties of MSCs through spheroid formation. This paper details techniques to isolate UCM-MSCs, prepare spheroids on chitosan film, and analyze the effect of spheroid formation on surface marker expression. Consequently, creation of a bilateral patellar tendon injury model in rats is described for in vivo implantation of UCM-MSC spheroids formed on chitosan film. No complication was observed in the study with respect to morbidity, stress rising effects, or tissue infection. The total functional score of the operated rats at 7 days was lower than that of normal rats, but returned to normal within 28 days after surgery. Histological scores of tissue-healing confirmed the presence of a clot in treated defects evaluated at 7 days, absence of foreign body reaction, and progressing healing at 28 days. This bilateral patella tendon defect model controls inter-individual variation via creation of an internal control in each rat, was associated with acceptable morbidity, and allowed detection of differences between untreated tendons and treatments.

This paper describes the preparation and evaluation of umbilical cord matrix-derived mesenchymal stem cells spheroids with a bilateral patellar tendon defect model in a rat. This model was associated with an acceptable morbidity and was found to detect differences between untreated and treated tendons, and between the two treatments tested.

Bewertung von Stammzelltherapien in einem bilateralen Patellasehne Verletzungen Modell bei Ratten

Regenerative medicine provides novel alternatives to conditions that challenge traditional treatments. The prevalence and morbidity of tendinopathy across ...

Medizin

Herstellung von Maussehnen-Assembloiden zur Untersuchung zellulärer Wechselwirkungen bei Krankheiten

Engineering Tendon Assembloids to Probe Cellular Crosstalk in Disease and Repair

Tendons enable locomotion by transferring muscle forces to bones. They rely on a tough tendon core comprising collagen fibers and stromal cell populations. This load-bearing core is encompassed, nourished, and repaired by a synovial-like tissue layer comprising the extrinsic tendon compartment. Despite this sophisticated design, tendon injuries are common, and clinical treatment still relies on physiotherapy and surgery. The limitations of available experimental model systems have slowed the development of novel disease-modifying treatments and relapse-preventing clinical regimes. 
In vivo human studies are limited to comparing healthy tendons to end-stage diseased or ruptured tissues sampled during repair surgery and do not allow the longitudinal study of the underlying tendon disease. In vivo animal models also present important limits regarding opaque physiological complexity, the ethical burden on the animals, and large economic costs associated with their use. Further, in vivo animal models are poorly suited to systematic probing of drugs and multicellular, multi-tissue interaction pathways. Simpler in vitro model systems have also fallen short. One major reason is a failure to adequately replicate the three-dimensional mechanical loading necessary to meaningfully study tendon cells and their function. 
The new 3D model system presented here alleviates some of these issues by exploiting murine tail tendon core explants. Importantly, these explants are easily accessible in large numbers from a single mouse, retain 3D in situ loading patterns at the cellular level, and feature an in vivo-like extracellular matrix. In this protocol, step-by-step instructions are given on how to augment tendon core explants with collagen hydrogels laden with muscle-derived endothelial cells, tendon-derived fibroblasts, and bone marrow-derived macrophages to substitute disease- and injury-activated cell populations within the extrinsic tendon compartment. It is demonstrated how the resulting tendon assembloids can be challenged mechanically or through defined microenvironmental stimuli to investigate emerging multicellular crosstalk during disease and injury.

Autor im Rampenlicht: Förderung der Sehnenforschung durch die Entwicklung von Maus-Assembloiden zum Verständnis zellulärer Mechanismen

Here, we present an assembloid model system to mimic tendon cellular crosstalk between the load-bearing tendon core tissue and an extrinsic compartment containing cell populations activated by disease and injury. As an important use case, we demonstrate how the system can be deployed to probe disease-relevant activation of extrinsic endothelial cells.

Entwicklung von Sehnen-Assembloiden zur Untersuchung zellulärer Wechselwirkungen bei Krankheit und Reparatur

Tendons enable locomotion by transferring muscle forces to bones. They rely on a tough tendon core comprising collagen fibers and stromal cell ...

Dreistufiges Organoid-Modell für die Sehnenforschung und -technik

Demonstration of Self-Assembled Cell Sheet Culture and Manual Generation of a 3D Tendon/Ligament-Like Organoid by using Human Dermal Fibroblasts

Tendons and ligaments (T/L) are strong hierarchically organized structures uniting&#160;the&#160;musculoskeletal system. These tissues have a strictly arranged collagen type&#160;I-rich extracellular matrix (ECM) and T/L-lineage cells mainly positioned in parallel rows. After injury, T/L require a long time for rehabilitation with high failure risk and often unsatisfactory repair outcomes. Despite recent advancements in T/L biology research, one of the remaining challenges is that the T/L field still lacks a standardized differentiation protocol that is able to recapitulate T/L formation process in vitro. For example, bone and fat differentiation of mesenchymal precursor cells require just standard two-dimensional (2D) cell culture and the addition of specific stimulation media. For differentiation to cartilage, three-dimensional (3D) pellet culture and supplementation of TGF&#223; is necessary. However, cell differentiation to tendon needs a very orderly 3D culture model, which ideally should also be subjectable to dynamic mechanical stimulation. We have established a 3-step (expansion, stimulation, and maturation) organoid model to form a 3D rod-like structure out of a self-assembled cell sheet, which delivers a natural microenvironment with its own ECM, autocrine, and paracrine factors. These rod-like organoids have a multi-layered cellular architecture within rich ECM and can be handled quite easily for exposure to static mechanical strain. Here, we demonstrated the 3-step protocol by using commercially available dermal fibroblasts. We could show that this cell type forms robust and ECM-abundant organoids. The described procedure can be further optimized in terms of culture media and optimized toward dynamic axial mechanical stimulation. In the same way, alternative cell sources can be tested for their potential to form T/L organoids and thus undergo T/L differentiation. In sum, the established 3D T/L organoid approach can be used as a model for tendon basic research and even for scaffold-free T/L engineering.

Autor im Rampenlicht: Weiterentwicklung des Tendon Tissue Engineering mit 3D-Organoidmodellen

Herein, we demonstrate a three-step organoid model (two-dimensional [2D] expansion, 2D stimulation, three-dimensional [3D] maturation) offering a promising tool for tendon fundamental research and a potential scaffold-free method for tendon tissue engineering.

Demonstration einer selbstorganisierten Zellblattkultur und manuelle Generierung eines 3D-Sehnen-/Ligamenten-ähnlichen Organoids unter Verwendung humaner dermaler Fibroblasten

Tendons and ligaments (T/L) are strong hierarchically organized structures uniting&#160;the&#160;musculoskeletal system. These tissues have a strictly ...

Behandlung von Ligamentenkonstrukten mit ausüberschüssigem Serum: Ein Translations-Gewebe-Engineering-Modell

Zusammenfassung

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Ingenieurwesen Fibrin-basierten Tissue Konstrukte von Myofibroblasten und Anwendung von Constraints und abseihen to Cell und Collagen (Re) Organisation Induce

Chirurgische Retrieval, Isolierung und

Athymischen Rattenmodell für die Bewertung von Engineered vorderen Kreuzbandes Grafts

Engineering 3D cellularized Kollagengele für Gefäßgeweberegeneration

Eine neuartige Tenorrhaphy-Nahttechnik mit tissue engineered Collagen Graft zur Reparatur großer Sehnendefekte

Bewertung von Stammzelltherapien in einem bilateralen Patellasehne Verletzungen Modell bei Ratten

Entwicklung von Sehnen-Assembloiden zur Untersuchung zellulärer Wechselwirkungen bei Krankheit und Reparatur

Entwicklung von Sehnen-Assembloiden zur Untersuchung zellulärer Wechselwirkungen bei Krankheit und Reparatur

Entwicklung von Sehnen-Assembloiden zur Untersuchung zellulärer Wechselwirkungen bei Krankheit und Reparatur

Demonstration einer selbstorganisierten Zellblattkultur und manuelle Generierung eines 3D-Sehnen-/Ligamenten-ähnlichen Organoids unter Verwendung humaner dermaler Fibroblasten