Bu yöntem, lökositler arasındaki iletişimin moleküler ve hücresel düzeyde nasıl oluştuğu gibi insan immünolojik alanındaki temel soruların yanıtlatIlmesine yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, saflaştırılmamış insan T hücrelerinin nispeten kısa bir süre içinde ex vivo analiz edilebilmektedir. Bu prosedürü gösteren Henning Kirchgessner, bizim laboratuvar bir teknisyen olacaktır.
50 mililitrelik konik tüp içinde 30 mililitre ACK lysis tampon ile taze çekilmiş insan periferik kan bir mililitre karıştırarak başlayın. Oda sıcaklığında sekiz dakika sonra, bir santrifüj yıkama için PBS ile tüp doldurun ve 37 santigrat derece 60 dakikalık kuluçka için kültür orta iki mililitre pelet resuspend. Kuluçka sonunda, beş kez 10 beşinci Staphylococcus aureus enterotoxin B veya SEB yüklü veya boşraji hücreleri kültür ortamının 500 mikrolitre bireysel FACS tüpleriçine ekleyin, pan-lökosit 650 mikrolitre takip.
Ortak kültürlerden aşağı dön ve 150 mikrolitre taze kültür ortamındaki peletleri 37 santigrat derecede 45 dakikalık bir kuluçka için yeniden askıya alın. Daha sonra, 100 rpm'de 10 saniye boyunca hücreleri hafifçe girdap ederken 1,5 mililitre lik 1,5 paraformaldehit ekleyin. Oda sıcaklığında 10 dakika sonra, pbs bir mililitre ile fiksasyon durdurmak 1% BSA ile takviye ve santrifüj ile hücreleri toplamak.
PBS artı BSA ve % 0.1 saponin 100 mikrolitre pelet resuspend ve 96-iyi, U-alt plaka iki ayrı kuyuiçin hücre örnekleri ekleyin. Oda sıcaklığında 15 dakika sonra, plakayı santrifüj edin ve oda sıcaklığında karanlıkta 30 dakikalık bir kuluçka için florofofor konjuge antikorlar veya ilgi bileşikleri içeren PBS artı BSA ve saponin 50 mikrolitre pelet resuspend. Kuluçka sonunda, pbs artı BSA ve saponin 150 mikrolitre hücreleri üç kez yıkayın ve PBS 60 mikrolitre pelet resuspend.
Akış sitometrisine göre hücreleri görüntülemek için analiz yazılımını açın, sıvı seviyesini kontrol edin ve Enstrüman menüsünde Başlangıç'ı tıklatın. Ardından, Yükle'yi tıklatın ve istendiğinde örnekleri bağlantı noktasına yükleyin. Aydınlatma sekmesi altında, uyarma lazer gücünü uygun nanometre uzunluklarına değiştirin.
Ardından, 4 ve 11 numaralı kanallar için kapıları ayarlayın ve alanı kanal bir için ayarlayın. Gating ve lazer güç ayarlamalarını değerlendirmek için, Görünüm menüsünü ilgili kapıya geçin ve hücreler ve hücre çiftleri görünene kadar kapıları ve lazer güçlerini ayarlayın. Daha sonra, Dosya Edinme sekmesinde, örnek adı ve elde etmek için görüntü sayısını ve CD3 boyama için uygun kapıyı tanımlayın ve edinmeye başlamak için Edinme'yi tıklatın.
Edinilmiş hücre görüntülerini analiz etmek için uygun analiz yazılımını açın. Tazminat açılır durumdaki yönergeleri izleyerek, bir telafi matrisi üretin ve matrisi comp tarih ctm olarak kaydedin. Ardından, örnek bir ham resim dosyasını açın ve telafi edilmiş görüntü ve varsayılan veri analizi dosyalarını oluşturmak için penceredeki comp tarih ctm'sini uygulayın.
Telafi edilen resim dosyalarını açtıktan sonra, görüntüleri renk moduna dönüştürün. Resim Galerisi Özellikleri araç çubuğunda en uygun görünür renkleri elde etmek için arama tablolarını ayarlayın. Çözümleme menüsünde Maske Yöneticisi'ni açın ve kanal beş için %60 Eşik maskesi seçerek ve T hücre maskesi oluşturmak için maskeyi doldurarak T hücrelerini tanımlayın.
Ardından, Vadi maskesioluşturmak için üç piksel genişliğinde kanal iki için Vadi maskesini seçin ve T hücresi ve Vadi maskelerini birleştirerek T hücre sinaps maskesini oluşturun. T hücrelerindeki toplam CD3 ifadesini hesaplamak için Özellik Yöneticisi'ni açın ve Yoğunluk, T hücresi, kanal beş özelliğini oluşturun. T hücrelerindeki toplam F-aktin miktarını hesaplamak için Yoğunluk, T hücreleri, kanal altı özelliğini oluşturun.
Bağışıklık sinapslarında CD3 miktarını değerlendirmek için Yoğunluk, T hücre sinaps, kanal beş özelliğini oluşturun. Bağışıklık sinapstaki F-aktin miktarını belirlemek için Yoğunluk, T hücre sinaps, kanal altı özelliğini oluşturun. Son olarak, F-aktin ve CD3 zenginleştirme tanımlamak için, f-aktin veya CD3 oranını bağışıklık sinaps ve seçilen proteinin toplam ifade, sırasıyla hesaplamak.
Bu grafiklerde, vekil antijen sunan hücreler veya AAP'ler arasındaki immün sinapsprotein zenginleştirme ölçmek için kritik gating stratejisinin bir bakış, veya AAP'ler, ve düşük hacimli insan kan örneğinden alınan saflaştırılmamış pan-lökositler T hücreleri gösterilmiştir. Burada, SEB yokluğunda bağışıklık sinapsları içinde CD3 ve F-actin düşük seviyelerde T-hücre-APC conjugates temsili görüntüler gösterilir, bu T-hücre-APC konjugatseb SEB varlığında güçlü bir CD3 ve F-actin zenginleştirme gösterirken. Süperantijen yokluğunda, T hücrelerinin %15'i immün sinapsta hem CD3 hem de F-aktin zenginleştirme sergilerken, süperantijen varlığında %29'luk bir zenginleştirme gözlenmiştir.
Gerçekten de, süperantijen yokluğunda, hücrelerdeki toplam F-aktinin %20'sinden azı immün sinapsta birikir ve %30'dan fazlası süperantijen varlığında sinapsta gözlenir. Özellikle, CD3 süperantijen yokluğunda bile bağışıklık sinaps birikir, Bu birikimi de önemli ölçüde superantigen eklenmesi ile artar rağmen, T-hücre-APC bağışıklık sinaps protein birikimini ölçmek için bu yöntemin uygunluğunu gösteren. Bir kez hakim, bu teknik düzgün yapılırsa altı ila yedi saat içinde tamamlanabilir.
Seb'siz AKIK'lar kullanıldığında protein zenginleştirme de meydana geldiğinden, bu yordamı denerken, süperantijen içermeyen numuneler de dahil olmak üzere ilgili tüm kontrolleri eklemeyi unutmamak önemlidir. Bu işlemden sonra, süper çözünürlüklü mikroskopi gibi diğer yöntemler immün sinaps ince yapısı hakkında ek sorulara cevap için yapılabilir. Bu teknik, geliştirildikten sonra hücresel iletişim alanındaki araştırmacıların temel araştırmalar, klinik çalışmalar ve çeviri bilimi için insanlardaki bağışıklık sinapsını keşfetmelerinin önünü açmıştır.
Bu videoyu izledikten sonra, insan T hücreleri ex vivo T-hücre-APC bağ bölgesi ve bağışıklık sinaps analiz etmek için nasıl iyi bir anlayışa sahip olmalıdır. Birincil insan malzemeleriile çalışmanın tehlikeli olabileceğini ve eldiven takmak veya biyogüvenlik seviyesi altında çalışmak gibi önlemlerin her zaman bu işlemi gerçekleştirirken alınması gerektiğini unutmayın.
