Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo imunológico humano, como como a comunicação entre leucócitos ocorre no nível molecular e celular. A principal vantagem dessa técnica é que as células T humanas não purificadas podem ser analisadas ex vivo em um período de tempo relativamente curto. Demonstrando este procedimento estará Henning Kirchgessner, um técnico do nosso laboratório.
Comece misturando um mililitro de sangue periférico humano recém-desenhado com 30 mililitros de tampão de lise ACK em um tubo cônico de 50 mililitros. Depois de oito minutos em temperatura ambiente, encha o tubo com PBS para uma lavagem de centrifugação e resuspense a pelota em dois mililitros de cultura para uma incubação de 60 minutos a 37 graus Celsius. No final da incubação, adicione cinco vezes 10 ao quinto Staphylococcus aureus enterotoxin b ou células Raji carregadas ou descarregadas de SEB em 500 microliters de meio de cultura em tubos FACS individuais, seguido por 650 microliters de pan-leucócitos.
Gire as co-culturas e resuspenja as pelotas em 150 microliters de meio de cultura fresca para uma incubação de 45 minutos a 37 graus Celsius. Em seguida, suavemente vórtice as células por 10 segundos a 100 rpm enquanto adiciona 1,5 mililitros de 1,5% paraformaldeído. Após 10 minutos em temperatura ambiente, pare a fixação com um mililitro de PBS suplementado com 1%BSA e colete as células por centrifugação.
Resuspenque as pelotas em 100 microlitadores de PBS mais BSA e 0,1% saponina, e adicione as amostras de células a dois poços individuais de uma placa de fundo U de 96 poços. Após 15 minutos em temperatura ambiente, centrifugar a placa e resuspensar as pelotas em 50 microliters de PBS mais BSA e saponina contendo os anticorpos conjugados fluorophore ou compostos de interesse para uma incubação de 30 minutos no escuro à temperatura ambiente. No final da incubação, lave as células três vezes em 150 microliters de PBS mais BSA e saponina e resuspenja as pelotas em 60 microliters de PBS.
Para imaginar as células por citometria de fluxo, abra o software de análise, verifique o nível líquido e clique em Iniciar no menu Instrumento. Em seguida, clique em Carregar e carregue as amostras na porta quando solicitado. Sob a guia Iluminação, altere a potência do laser de excitação para os comprimentos de nanômetros apropriados.
Em seguida, ajuste os portões para os canais quatro e 11, e ajuste a área para o canal um. Para avaliar os ajustes de alimentação de gating e laser, mude o menu Exibir para o respectivo portão e ajuste os portões e os poderes de laser até que as células e casais de células sejam visíveis. Em seguida, na guia Aquisição de Arquivos, defina o nome da amostra e o número de imagens a serem adquiridas e o portão apropriado para coloração de CD3 e clique em Adquirir para iniciar a aquisição.
Para analisar as imagens celulares adquiridas, abra o software de análise adequado. Seguindo as instruções na compensação, produza uma matriz de compensação e salve a matriz como data comp ctm. Em seguida, abra um arquivo de imagem bruta de amostra e aplique a data comp ctm na janela para gerar os arquivos de análise de imagem e dados padrão compensados.
Depois de abrir os arquivos de imagem compensados, converta as imagens em modo de cor. Ajuste as tabelas de procuração para obter cores visíveis ideais na barra de ferramentas Image Gallery Properties. Abra o gerenciador de máscaras no menu Análise e defina as células T selecionando uma máscara limiar de 60% para o canal cinco e preenchendo a máscara para criar a máscara de célula T.
Em seguida, selecione a máscara do Valley para o canal dois com uma largura de três pixels para criar a máscara do Vale, e combine as máscaras de célula T e Vale para criar a máscara de sinapse de células T. Para calcular a expressão cd3 total em células T, abra o Gerenciador de Recursos e crie o recurso Intensidade, célula T, canal cinco. Para calcular a quantidade total de F-actin nas células T, crie o recurso Intensidade, Células T, canal seis.
Para avaliar a quantidade cd3 em sinapses imunológicas, crie o recurso Intensidade, Sinapse de células T, canal cinco. Para determinar a quantidade de F-actin na sinapse imunológica, crie o recurso Intensidade, Sinapse de células T, canal seis. Por fim, para definir o enriquecimento F-actin e CD3, calcule as razões de F-actin ou CD3 na sinapse imunológica e a expressão total da proteína selecionada, respectivamente.
Nestes gráficos, uma visão geral da estratégia crítica de gating para quantificar o enriquecimento de proteínas na sinapse imunológica entre as células que apresentam antígenos substitutos, ou APCs, e as células T em pan-leucócitos não purificados retiradas de uma amostra de sangue humano de baixo volume é mostrada. Aqui, são mostradas imagens representativas de conjugados T-cell-APC com baixos níveis de CD3 e F-actin dentro de suas sinapses imunológicas na ausência de SEB, enquanto estes conjugados T-cell-APC demonstram um forte enriquecimento de CD3 e F-actin na presença de SEB. Na ausência de superantígeno, 15% das células T apresentaram enriquecimento tanto do CD3 quanto do F-actin na sinapse imunológica, enquanto um enriquecimento de 29% é observado na presença de superantígeno.
De fato, na ausência de superantígeno, menos de 20% do total de F-actin nas células se acumula na sinapse imunológica, com mais de 30% observados na sinapse na presença de superantígeno. Notavelmente, o CD3 acumula-se na sinapse imunológica mesmo na ausência de superantígeno, embora esse acúmulo também seja significativamente aumentado pela adição de superantígeno, demonstrando a aptidão deste método para quantificar o acúmulo de proteínas na sinapse imunológica T-cell-APC. Uma vez dominada, essa técnica pode ser completada em seis a sete horas se realizada corretamente.
Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de incluir todos os controles relevantes, incluindo amostras sem superantígeno, pois o enriquecimento de proteínas também ocorre se os APCs sem SEB forem usados. Após este procedimento, outros métodos como microscopia de super resolução podem ser realizados para responder a perguntas adicionais sobre a estrutura fina da sinapse imunológica. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores do campo das comunicações celulares explorarem a sinapse imunológica em humanos para pesquisas básicas, ensaios clínicos e ciência translacional.
Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como analisar a zona conjuntiva T-cell-APC e a sinapse imune em células T humanas ex vivo. Não se esqueça que trabalhar com materiais humanos primários pode ser perigoso e que precauções como usar luvas ou trabalhar sob o nível de biossegurança dois devem ser sempre tomadas durante a realização deste procedimento.
