Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine immunologique humain, telles que la façon dont la communication entre les leucocytes se produit au niveau moléculaire et cellulaire. Le principal avantage de cette technique est que les cellules T humaines non purifiées peuvent être analysées ex vivo dans un laps de temps relativement court. Henning Kirchgessner, technicien de notre laboratoire, démontrera cette procédure.
Commencez par mélanger un millilitre de sang périphérique humain fraîchement prélevé avec 30 millilitres de tampon de lyse ACK dans un tube conique de 50 millilitres. Après huit minutes à température ambiante, remplissez le tube de PBS pour un lavage centrifugation et réutilisez la pastille en deux millilitres de milieu de culture pour une incubation de 60 minutes à 37 degrés Celsius. À la fin de l’incubation, ajouter cinq fois 10 aux cinquièmes cellules Staphylococcus aureus enterotoxin B ou Raji chargées ou déchargées de SEB dans 500 microlitres de milieu de culture dans des tubes FACS individuels, suivis de 650 microlitres de pan-leukocytes.
Faites tourner les co-cultures et réutilisez les granulés dans 150 microlitres de milieu de culture frais pour une incubation de 45 minutes à 37 degrés Celsius. Ensuite, vortex doucement les cellules pendant 10 secondes à 100 rpm tout en ajoutant 1,5 millilitres de 1,5% paraformaldéhyde. Après 10 minutes à température ambiante, arrêter la fixation avec un millilitre de PBS complété par 1%BSA et recueillir les cellules par centrifugation.
Resuspendez les granulés dans 100 microlitres de PBS plus BSA et 0,1% de saponine, et ajoutez les échantillons de cellules à deux puits individuels d’une plaque de 96 puits en U-fond. Après 15 minutes à température ambiante, centrifugez la plaque et réutilisez les granulés dans 50 microlitres de PBS plus BSA et saponine contenant les anticorps ou composés conjugués au fluorophore pour une incubation de 30 minutes dans l’obscurité à température ambiante. À la fin de l’incubation, laver les cellules trois fois dans 150 microlitres de PBS plus BSA et saponine et résuspendre les granulés dans 60 microlitres de PBS.
Pour imager les cellules par cytométrie de flux, ouvrez le logiciel d’analyse, vérifiez le niveau liquide et cliquez sur Démarrage dans le menu Instrument. Ensuite, cliquez sur Chargez et chargez les échantillons dans le port lorsque cela est demandé. Sous l’onglet Illumination, modifiez la puissance laser d’excitation aux longueurs de nanomètre appropriées.
Ensuite, ajustez les portes pour les canaux quatre et 11, et ajustez la zone pour le canal un. Pour évaluer les réglages de puissance du gating et du laser, passez le menu View à la porte respective et ajustez les barrières et les pouvoirs laser jusqu’à ce que les cellules et les couples cellulaires soient visibles. Ensuite, dans l’onglet Acquisition de fichiers, définissez le nom de l’échantillon et le nombre d’images à acquérir et la porte appropriée pour la coloration CD3 et cliquez sur Acquérir pour commencer l’acquisition.
Pour analyser les images cellulaires acquises, ouvrez le logiciel d’analyse approprié. En suivant les instructions de la baisse de rémunération, produire une matrice de compensation et enregistrer la matrice comme comp date ctm. Ensuite, ouvrez un fichier d’image brute d’échantillon et appliquez le ctm de date comp dans la fenêtre pour générer l’image compensée et les fichiers d’analyse de données par défaut.
Après avoir ouvert les fichiers d’images compensés, convertissez les images en mode couleur. Ajustez les tables de recherche pour obtenir des couleurs visibles optimales dans la barre d’outils Image Gallery Properties. Ouvrez le gestionnaire de masque dans le menu Analyse, et définissez les cellules T en sélectionnant un masque seuil de 60% pour le canal cinq et en remplissant le masque pour créer le masque de cellule T.
Ensuite, sélectionnez le masque valley pour le canal deux avec une largeur de trois pixels pour créer le masque valley, et combinez les masques T et Valley pour créer le masque synapse de cellule T. Pour calculer l’expression totale du CD3 dans les lymphocytes T, ouvrez le gestionnaire de fonctionnalités et créez la fonctionnalité Intensité, Cellule T, canal 5. Pour calculer la quantité totale de F-actine dans les cellules T, créez la fonctionnalité Intensité, Cellules T, canal six.
Pour évaluer la quantité de CD3 dans les synapses immunitaires, créez la fonctionnalité Intensité, synapse des lymphocytes T, canal 5. Pour déterminer la quantité de F-actine dans la synapse immunitaire, créez la fonctionnalité Intensité, synapse des cellules T, canal six. Enfin, pour définir l’enrichissement f-actine et CD3, calculer les ratios de F-actine ou de CD3 dans la synapse immunitaire et l’expression totale de la protéine sélectionnée, respectivement.
Dans ces graphiques, un aperçu de la stratégie critique de gating pour quantifier l’enrichissement de protéine dans la synapse immunisée entre les cellules antigène-présentation de substitution, ou APCs, et les cellules de T dans les pan-leukocytes non purifiés pris à partir d’un échantillon humain de sang de faible volume est montré. Ici, des images représentatives de T-cell-APC conjuguées avec de faibles niveaux de CD3 et F-actine dans leurs synapses immunitaires en l’absence de SEB sont montrées, tandis que ces conjugués de T-cellule-APC démontrent un fort enrichissement de CD3 et de F-actin en présence de SEB. En l’absence de superantigène, 15% des lymphocytes T présentaient un enrichissement de CD3 et de F-actine à la synapse immunitaire, tandis qu’un enrichissement de 29% est observé en présence de superantigen.
En effet, en l’absence de superantigène, moins de 20% de la F-actine totale dans les cellules s’accumule à la synapse immunitaire, avec plus de 30% observé à la synapse en présence de superantigen. Notamment, le CD3 s’accumule à la synapse immunitaire même en l’absence de superantigène, bien que cette accumulation soit également significativement augmentée par l’ajout de superantigen, démontrant l’aptitude de cette méthode pour quantifier l’accumulation de protéine à la synapse immunisée de T-cellule-APC. Une fois maîtrisée, cette technique peut être complétée en six à sept heures si elle est effectuée correctement.
Tout en essayant cette procédure, il est important de se rappeler d’inclure tous les contrôles pertinents, y compris les échantillons sans superantigène, comme l’enrichissement des protéines se produit également si apcs sans SEB sont utilisés. Après cette procédure, d’autres méthodes comme la microscopie à super résolution peuvent être effectuées pour répondre à des questions supplémentaires sur la structure fine de la synapse immunitaire. Après son développement, cette technique a ouvert la voie à des chercheurs dans le domaine des communications cellulaires pour explorer la synapse immunitaire chez l’homme pour la recherche fondamentale, les essais cliniques et la science translationnelle.
Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’analyser la zone conjonctive T-cellule-APC et la synapse immunitaire dans les cellules T humaines ex vivo. N’oubliez pas que le travail avec les matières humaines primaires peut être dangereux et que des précautions telles que le port de gants ou le travail en biosécurité de niveau deux conditions doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.
