Dieses Protokoll ermöglicht die konsistente Erstellung von High-Fidelity-Protein-Mikromustern in beliebiger Form, insbesondere isolierte Musterinseln für die Untersuchung von Zellclustern. Diese Technik kann verwendet werden, um isolierte Inselmikromuster jeder Form und Größe in nur einem Schritt herzustellen, während die Herstellung solcher Muster zuvor zwei separate Schritte erforderte. Beginnen Sie mit dem Mischen von PDMS im richtigen Härter-zu-Basis-Verhältnis, wie in den Anweisungen des Herstellers beschrieben.
15 Minuten bei Raumtemperatur und -druck inkubieren und dann 15 Minuten lang unter Vakuum entgast werden. Gießen Sie das PDMS in die Masterform und übertragen Sie es in einen auf 37 Grad Celsius eingestellten Inkubator, um über Nacht auszuhärten. Entfernen Sie die Masterform aus dem Inkubator und lassen Sie sie auf Raumtemperatur abkühlen.
Während die Masterform abkühlt, beschallen 25 Millimeter Deckgläser in Ethanol für 10 Minuten. Verwenden Sie so viele Deckgläser wie die Anzahl der Prägungen, die vorbereitet werden. Spülen Sie die Deckgläser gründlich mit DI-Wasser ab und trocknen Sie sie mit einer gefilterten Luftpistole.
Behandeln Sie die Deckgläser eine Minute lang mit dem Plasmareiniger unter Hochvakuum. Lassen Sie das Vakuum nach der Behandlung langsam los, um zu verhindern, dass sich die Deckgläser in der Kammer bewegen. Beschichten Sie jedes Deckglas mit 100 Mikrolitern der fluoreszierend markierten Proteinlösung in einem Raum ohne direkte Sonneneinstrahlung oder Deckenbeleuchtung.
Decken Sie die Proben für zusätzlichen Schutz vor Licht ab und inkubieren Sie sie 20 Minuten lang bei Raumtemperatur. Spülen Sie jedes Deckglas gründlich mit DI-Wasser ab. Entfernen Sie überschüssiges Wasser von der Oberfläche, indem Sie die Seiten jedes Deckglases vorsichtig auf ein Papiertuch oder ein ähnliches saugfähiges Material klopfen.
Lassen Sie die Deckgläser vollständig trocknen, indem Sie sie mindestens 30 Minuten lang unbedeckt im Dunkeln lassen. Während die proteinbeschichteten Deckgläser trocknen, entfernen Sie den PDMS-Stempel von der Masterform, indem Sie ihn mit einem Skalpell oder einer scharfen Klinge schneiden. Behandeln Sie die PDMS-Stempel zwei Minuten lang mit Plasma unter einem Hochvakuum.
Legen Sie die Stempel in einen Behälter mit einem Deckel unter dem Abzug und beschichten Sie dann jeden Stempel mit einer dünnen Schicht von 10% 3-APTMS, die in 100% Ethanol verdünnt ist. Den Behälter mit den Stempeln abdecken und bei Raumtemperatur fünf Minuten inkubieren. Spülen Sie jeden Stempel auf beiden Seiten gründlich mit DI-Wasser ab.
Legen Sie die Stempel in einen sauberen Behälter und beschichten Sie sie mit 2,5% Glutaraldehyd, das in DI-Wasser hergestellt wurde. Decken Sie die Stempel ab und inkubieren Sie sie bei Raumtemperatur für 30 Minuten. Spülen Sie die Stempel gründlich mit DI-Wasser ab.
Entfernen Sie überschüssiges Wasser wie zuvor beschrieben von der Oberfläche und lassen Sie die Stempel 30 Minuten lang unbedeckt trocknen. Wenn nach 30 Minuten die proteinbeschichteten Deckgläser oder die Stempel nicht vollständig trocken sind, verwenden Sie eine gefilterte Luftpistole, um sie vollständig zu trocknen. Drücken Sie die Musterseite der Stempel mit genügend Druck auf die Deckgläser, damit sie einen vollständigen Kontakt herstellen können.
Lassen Sie es 15 Minuten lang ungestört. Dann ziehen Sie die PDMS-Stempel vorsichtig von den Deckgläsern ab. Überprüfen Sie mit einem fluoreszierenden Mikroskop mit dem entsprechenden Filter die Treue der gemusterten Deckgläser.
Verwenden Sie die gemusterten Deckgläser sofort oder bewahren Sie sie bis zum weiteren Gebrauch vor direktem Licht geschützt auf. Bevor Sie den PAA-Hydrogel-Vorläufer vorbereiten, entfernen Sie den Acrylsäure-NHS-Ester aus dem Kühlschrank, um Raumtemperatur zu erreichen, bevor er geöffnet wird. Bereiten Sie ein austauschbares Deckglasgeschirr vor, indem Sie es mit 70% Ethanol sterilisieren, und inkubieren Sie es dann mindestens 30 Minuten lang unter UV-Licht in einem Biosicherheitsschrank vor dem Gebrauch.
Unter dem Abzug 1,25 Milliliter 40% Acrylamid in DI-Wasser zu einem 15 Milliliter konischen Rohr hinzufügen. Zu demselben Röhrchen fügen Sie 175 Mikroliter Bis-Acrylamid-Lösung hinzu, die in DI-Wasser hergestellt wurde. Dann fügen Sie 500 Mikroliter 10X PBS hinzu, gefolgt von 2.915 Millilitern DI-Wasser.
969 Mikroliter dieser Vorstufe in ein 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenröhrchen pipettieren und den Rest bei vier Grad Celsius bis zu zwei Wochen lagern. Messen Sie 50 bis 100 Milligramm APS in einem frischen Mikrozentrifugenröhrchen und verdünnen Sie es auf 100 Milligramm pro Milliliter in DI-Wasser. Öffnen Sie den NHS-Ester in der Haube und messen Sie vorsichtig bis zu drei Milligramm NHS in einem Mikrozentrifugenröhrchen.
Verdünnen Sie den NHS-Ester auf ein Milligramm pro Milliliter in 1X PBS. Unter dem Abzug zwei Mikroliter TEMED in das Mikrozentrifugenröhrchen geben, das das 969-Mikroliter-Aliquot des PAA-Vorläufers enthält. Fügen Sie 15 Mikroliter eines molaren HCL hinzu, um den pH-Wert der Hydrogellösung zu senken und die Hydrolyse des NHS-Esters zu vermeiden.
Fügen Sie 10 Mikroliter der NHS-Esterlösung in die Tube hinzu. Führen Sie die folgenden Schritte in einer Biosicherheitskabine aus. Legen Sie den 30 Millimeter Deckglas vorsichtig in den mittleren Teil des Deckglas-Schalensets mit der 3-APTMS und Glutaraldehyd-behandelten Seite nach oben und schrauben Sie den Kunststoffring darauf.
Stellen Sie den gemusterten Deckglas mit minimaler Lichteinwirkung auf, um sich auf den nächsten Schritt vorzubereiten. Fünf Mikroliter APS-Lösung in das aliquote PAA-Vorläuferröhrchen pipettieren, dann umdrehen und mischen. Pipettieren Sie sofort 35 Mikroliter dieser Lösung auf das 30-Millimeter-Deckglas.
Legen Sie den gemusterten Deckglas mit der Proteinseite nach unten auf die Lösung. Achten Sie darauf, keine Luftblasen im Hydrogel zu erzeugen. Schützen Sie das Hydrogel vor Licht und lassen Sie es 90 Minuten lang polymerisieren.
Sobald das Hydrogel polymerisiert ist, verwenden Sie eine Rasierklinge oder ein Skalpell, um das obere Deckglas zu entfernen, stellen Sie sicher, dass das Deckglas nach dem Entfernen nicht zurückfällt oder vom Gel rutscht, um das Muster auf der Oberfläche des Gels nicht zu ruinieren. Um den verbleibenden NHS-Ester im Hydrogel zu passivieren, fügen Sie zwei Milliliter steriles PBS zum Gel hinzu und inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius für 45 Minuten. Bereiten Sie die Gele sofort für Experimente vor oder lagern Sie sie über Nacht in sterilem PBS bei vier Grad Celsius bis zur weiteren Verwendung.
Die Hydrogele wurden indirekt mit fluoreszierendem Fibronektin gemustert, um zelluläre Zugkräfte innerhalb von Clustern zu visualisieren und zu messen und Inselmuster von vorgegebener Größe und Form zu erzeugen. Die Musterqualität stand in direktem Zusammenhang mit der Wiedergabetreue der Masterform, aus der der PDMS-Stempel gegossen wurde. Diese Methode könnte isolierte, gut definierte Inselmuster von vorgegebener Form herstellen.
Die Fibronektin-Adhäsionspunkte waren nur innerhalb des gewünschten Bereichs der Insel vorhanden. Diese isolierten Inseln von Adhäsionspunkten ermöglichten eine bessere Kontrolle der Clusterform. Die Beschichtung von PDMS-Stempeln mit zwei kleinen 3-APTMS ist von entscheidender Bedeutung, da dies die Wirksamkeit der Entfernungsmethode einschränkt, während zu viel einen orangefarbenen Rückstand auf der Stempeloberfläche erzeugt.
Die hier erzeugten Muster können verwendet werden, um zelluläre Zugkräfte sowohl in einzelnen Zellen als auch in Clustern zu bestimmen, was einen Einblick in ihre Fähigkeit gibt, die mechanische Homöostase aufrechtzuerhalten.
