Name: preparation, administration, and assessment of in vivo tissue-specific cellular uptake of fluorescent dye-labeled liposomes
Uploaded: 2020-07-30T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 44 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation, Administration, and Assessment of In Vivo Tissue-Specific Cellular Uptake of Fluorescent Dye-Labeled Liposomes at JoVE.com

Die Autoren bedanken sich bei Michael Solga und dem Rest des Kernpersonals der Durchflusszytometrie für die Bereitstellung von Schulungen und Dienstleistungen im Bereich der Durchflusszytometrie. Die Autoren danken auch Shiva Sai Krishna Dasa, Dustin K. Bauknight, Melissa A. Marshall, James C. Garmey, Chantel McSkimming, Aditi Upadhye und Prasad Srikakulapu für ihre Unterstützung bei der Liposomenpräparation (SSKD, DKB), der Gewebeentnahme (MAM, JCG) und der Durchflusszytometrie-Färbung und Probengewinnung (AU, PS, CM). Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse von AstraZeneca, R01HL 136098, R01HL 141123 und R01HL 148109, AHA 16PRE30770007 und T32 HL007284 unterstützt.

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Die Autoren haben nichts zu verraten.

Hier beschreiben wir ein dreiteiliges Protokoll zur (i) Herstellung von Liposomen, die mit einem fluoreszierenden Lipidfarbstoff markiert und mit einem Antidiabetikum, Tesaglitazar, beladen sind, (ii) Verabreichung von Liposomen an eine Maus durch retroorbitale Injektion und (iii) Ernte, Verarbeitung und Färbung von Geweben, um die Liposomenaufnahme auf zellulärer Ebene durch Durchflusszytometrie nachzuweisen. Dieses Protokoll überprüft die Herstellung von ca. 150-μm-Liposomen und die Beurteilung der Aufnahme in Fettgewebe, Blut und Milz. Die Liposomenpräparation ist skalierbar, wird meist bei Raumtemperatur durchgeführt und nutzt die Umkehrphasenverdampfung, um die Wirkstoffbeladung und die Entfernung organischer Lösungsmittel zu maximieren. Mit diesem Protokoll können bis zu 2 mg/ml Tesaglitazar-Konzentration in der gereinigten Liposomenprobe erreicht werden. Die hergestellten Liposomen können in HEPES-Puffer bei 4 °C über ein Jahr gelagert werden. Unserer Erfahrung nach zeigten sie eine minimale Variation der mittleren Partikelgröße. Weniger als 10 % des Verlusts des Wirkstoffgehalts wurden spektrophotometrisch nachgewiesen, nachdem die Ultrafiltration die Liposomen vom externen Arzneimittel mit einem 10 kDa Zentrifugalfilter getrennt hatte.
Bei der Herstellung von Liposomen sind einige wichtige Schritte und Faktoren zu berücksichtigen. Zunächst ist die Reihenfolge der Protokollschritte wichtig und muss eingehalten werden. Zweitens muss der pH-Wert der Lösung, die beim Laden von Tesaglitazar verwendet wird, bei 7,4 gehalten werden, um die Löslichkeit und effektive Beladung zu maximieren. Drittens stellt die ordnungsgemäße Montage von Geräten und Filtern sicher, dass die Leistung jedes Schritts die richtige Größe und Reinheit aufweist. Wenn beispielsweise 100- und 200-nm-Filter nicht richtig montiert werden, kann dies zu einer heterogeneren und falsch dimensionierten Charge von Liposomen führen. Viertens ist eine vollständige Entfernung von Ca-Acetat vor dem Beladen des Medikaments erforderlich, um den Transfer von Tesaglitazar in die Liposomen zu maximieren. Um die vollständige Entfernung von Ca-Acetat zu testen, verwenden Sie eine Hochgeschwindigkeitssedimentation, um die Liposomen zu entfernen, und messen Sie dann den Ca-Acetat-Gehalt in der nicht-liposomalen Lösung. Fünftens ist es wichtig, die Masse aller Materialien, die der Liposomenpräparation bei jedem Schritt zugesetzt werden, zu wiegen und aufzuzeichnen. Dadurch wird sichergestellt, dass die richtigen Konzentrationen berechnet werden können und die erforderlichen Materialverhältnisse eingehalten werden. Wenn die Technik nicht ordnungsgemäß ausgeführt wird, kann es zu einem unerwünschten Maß an Heterogenität kommen. Es ist wichtig, diesen Parameter mit DLS und anderen Ansätzen wie der Elektronenmikroskopie gründlich zu überprüfen. Um die Homogenität zu verbessern, sollten Sie die ausgewählte Filtergröße anpassen oder zwei Filter stapeln.
Darüber hinaus ist es von entscheidender Bedeutung, dass Kontrollen und ein Antikörperpanel für die Durchflusszytometrie geplant und optimiert werden, bevor dieses Protokoll vollständig durchgeführt wird (Tabelle 1, Tabelle 3). Antikörper sollten getestet werden, um sicherzustellen, dass die richtigen Konzentrationen für die Färbung verwendet werden und dass die Überlappung zwischen den Fluorophoren minimal ist. Auch die Anregung und Emission des bei der Liposomenpräparation verwendeten Farbstoffs muss bei der Plattenplanung berücksichtigt werden. In unseren Ergebnissen haben wir DiD verwendet, das eine ähnliche Anregung und Emission wie Fluorophore wie Allophycocyanin (APC) und AlexaFluor 647 aufweist. Daher haben wir in unserem Antikörper-Panel keine Antikörper ausgewählt, die an diese Fluorophore konjugiert sind. Darüber hinaus sind Isotypkontrollen in diesem Protokoll nicht enthalten. Dies liegt daran, dass es sich bei den für dieses Protokoll ausgewählten Antikörpern um gut validierte, kommerziell erhältliche Antikörper handelt. Wenn Sie jedoch daran interessiert sind, einen Antikörper zu verwenden, der zuvor nicht optimiert wurde, sollten Sie in Betracht ziehen, den Antikörper vor der Durchführung des vollständigen Experiments gegen eine Isotypkontrolle an den interessierenden Geweben zu testen.
Während dieses Protokoll zeigt, wie das Blut, die Milz, das Leistenfettgewebe und das Nebenhodenfettgewebe aus der Maus nach der Behandlung extrahiert und verarbeitet werden, kann dieser allgemeine Ansatz auf andere Gewebe angewendet werden. Abhängig vom interessierenden Gewebe müssen die Verarbeitungs- und Verdauungsprotokolle möglicherweise geändert werden, wie für die folgenden Gewebe veröffentlicht: Lunge21, Leber22, Peritonealhöhle 3, Knochenmark 3,23, Gehirn 24.
Eine wichtige Einschränkung dieser Methode besteht darin, dass die Aufnahme nur zu einem Zeitpunkt pro Tier bewertet werden kann. Daher kann es vorteilhaft sein, dieses Protokoll mit anderen nicht-invasiven bildgebenden Verfahren zu koppeln oder entsprechend zu planen, um ausreichende Ressourcen für die Durchführung der Beurteilung sicherzustellen. Der Zeitpunkt der Zellaufnahme und der Zellumsatz sind wichtige Faktoren, die es zu berücksichtigen gilt: Liposomen zirkulieren in den ersten 24 Stunden durch den Körper und je nach Lebensdauer der Zellen, die Liposomen aufnehmen, oder wie sie auf die Aufnahme reagieren, kann es zum Zelltod oder zu einer weiteren Phagozytose kommen. Unsere vorherige Studie zeigte Veränderungen in den Populationsmerkmalen von DiD+- Populationen zu verschiedenen Zeitpunkten3. Aus diesem Grund ist es wichtig, die Aufnahme zu früheren Zeitpunkten oder Zeitpunkten, die für die Biologie des interessierenden Mechanismus am relevantesten sind, zu bewerten. Während mit diesem Protokoll die Quantifizierung der Zellaufnahme im gesamten Gewebe durchgeführt werden kann, kann die Durchflusszytometrie keine Gewebelokalisation aufdecken. Die Kopplung dieses Ansatzes mit histologischen Methoden kann helfen, diese Einschränkung zu überwinden.
Im Allgemeinen ergänzt dieses Protokoll bestehende Methoden wie Histologie und Ganzkörperfluoreszenzbildgebung. Mit den kontinuierlichen Fortschritten bei den Instrumenten und Methoden der Durchflusszytometrie wird die Entwicklung größerer Panels für immer spezifischere Zellpopulationen möglich werden. Wir schlagen vor, dieses Protokoll zusätzlich zu den oben genannten Methoden zu verwenden, da dies die Bewertung der zellulären Aufnahme verbessert und auch die Möglichkeit bietet, die durch die Durchflusszytometrie beobachteten Ergebnisse zu validieren. Sollte sich beispielsweise herausstellen, dass ein Großteil der Partikel im Fettgewebe von Makrophagen durch Durchflusszytometrie aufgenommen wurde. Die Immunfluoreszenz eines zusätzlichen Aliquots desselben Fettgewebes konnte gespeichert, fixiert, geschnitten und für Makrophagenmarker gefärbt werden, um zu überprüfen, ob der Zelltyp tatsächlich Liposomen aufnimmt. Dieser Ansatz sollte die durchgeführten Assays zur Bioverteilung von Nanopartikeln präzisieren: Validierung des zellspezifischen Targetings, Quantifizierung der zellulären Aufnahme, Identifizierung der Off-Target-Aufnahme und hoffentlich Bereitstellung von Informationen zur Erstellung mechanistischer Hypothesen für beobachtete therapeutische Ergebnisse. Dieses Protokoll kann auch für zukünftige Studien mit verschiedenen Liposomen angepasst werden, um die Aufnahme in anderen Geweben zu untersuchen und neue Verbindungen im Zusammenhang mit Fettleibigkeit und Stoffwechselstörungen oder anderen Krankheiten zu testen, bei denen die Verabreichung von Nanopartikeln eine praktikable therapeutische Option ist.

Da das Interesse an der Entwicklung von Therapien mit Nanopartikeln wächst, müssen die Methoden zur Vorbereitung und Bewertung der Partikelverteilung und -aufnahme weiter vorangetrieben, erweitert und für die Forschungsgemeinschaft zugänglich gemacht werden 1,2. Dieses Protokoll wurde entwickelt, um die genauen Zelltypen zu bewerten, die Liposomen in vivo nach einer Behandlung mit DiD-markierten Liposomen aufnahmen, die mit Tesaglitazar, einem Peroxisom-Proliferator-aktivierten Rezeptor (PPAR)-α/γ-Agonistenbeladen waren 3,4. In diesen Studien konnten wir beurteilen, welche Zelltypen direkt von der liposomalen Tesaglitazar-Behandlung betroffen waren, die Wirksamkeit von Targeting-Einheiten und Hypothesen aufstellen, um die von uns beobachteten Behandlungsergebnisse zu erklären. Darüber hinaus deuten etablierte biologische Funktionen in einer Vielzahl von Zelltypen darauf hin, dass phagozytische Zellen wie Makrophagen, dendritische Zellen und leberspezifische Kupffer-Zellen den größten Teil der Liposomen einnehmen 5,6,7. Mit Hilfe dieses Protokolls konnten wir zeigen, dass auch nicht-klassische Fresszellen Liposomen 3,4 aufnehmen können.
Dieses Protokoll stellt eine optimierte Methode zur Solubilisierung von Tesaglitazar dar, die Herstellung von Liposomen durch Umkehrphasenverdampfung und die Verwendung von Calciumacetat als Lockstoff für die entfernte Wirkstoffbeladung. Die vorgestellten Methoden sind für viele Labore zugänglich und es fehlen schwer zu beschaffende Materialien und Schritte, die hohe Temperaturen erfordern. Das Protokoll erzeugt Liposomen in einer Größe, die für eine erhöhte Durchblutung in vivooptimal ist 8. Darüber hinaus wurden, wie von Su et al. zusammengefasst, bisher Methoden zur Bewertung der In-vivo-Liposomenverteilung und der Gewebeaufnahme untersucht und eingehend getestet9. Methoden der Positronen-Emissions-Tomographie (PET), der Magnetresonanztomographie (MRT) und der Fluoreszenz-Molekulartomographie (FMT) werden eingesetzt, um die gewebespezifische Bioverteilung und -aufnahme zuquantifizieren 9,10,11. Obwohl diese Methoden optimiert wurden, um die Detektion in vivo zu maximieren, fehlt ihnen immer noch die Fähigkeit, die Liposomenaufnahme in vivo mit zellulärer Auflösung zu quantifizieren. Das hier vorgestellte Protokoll zielt darauf ab, diesen Bedarf durch den Einsatz der Durchflusszytometrie zu erfüllen. Schließlich wurde für dieses Protokoll die zelluläre Aufnahme auf wenige Gewebe einschließlich Fettgewebe eingegrenzt. Es gibt eine wachsende Zahl von Literatur, die das Potenzial der Verwendung von Nanopartikeln zur Durchführung von Therapien im Zusammenhang mit Fettleibigkeit, Stoffwechselstörungen und Entzündungen untersucht 12,13,14,15,16,17. Daher hielten wir es für wichtig, ein Protokoll mit effektiven Methoden zur Verarbeitung und Analyse von Fettgewebe zu teilen – eines der Gewebe, das bei diesen Pathologien eine wichtige Rolle spielt.

<table><tbody><tr><td>1-mL syringe</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>10-mL syringe</td><td>BD</td><td>302995</td><td></td></tr><tr><td>25-gauge needle, sterile for retro-orbital injection</td><td>BD</td><td>305122</td><td></td></tr><tr><td>27-gauge needle, sterile for retro-orbital injection</td><td>BD</td><td>305620</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse B220 BV421</td><td>Biolegend</td><td>103251</td><td>Clone RA3-6B2</td></tr><tr><td>Anti-mouse CD115 PE</td><td>eBioscience</td><td>12-1152-82</td><td>Clone AFS98</td></tr><tr><td>Anti-mouse CD11b PerCP Cy5.5 antibody</td><td>BD Biosciences</td><td>550993</td><td>Clone M1/70</td></tr><tr><td>Anti-mouse CD11c APC ef780 antibody</td><td>eBioscience</td><td>47-0114-82</td><td>Clone N418</td></tr><tr><td>Anti-mouse CD19 PE CF594</td><td>BD Biosciences</td><td>562291</td><td>Clone 1D3</td></tr><tr><td>Anti-mouse CD3 FITC antibody</td><td>BD Biosciences</td><td>553061</td><td>Clone 145-2C11</td></tr><tr><td>Anti-mouse CD31 BV605</td><td>Biolegend</td><td>102427</td><td>Clone 390</td></tr><tr><td>Anti-mouse CD45 PerCP</td><td>BD Biosciences</td><td>557235</td><td>Clone 30-F11</td></tr><tr><td>Anti-mouse F4/80 PE Cy7</td><td>Biolegend</td><td>123114</td><td>Clone BM8</td></tr><tr><td>Bovine serum albumin</td><td>Gemini Bio-products</td><td>700-107P</td><td></td></tr><tr><td>Desalting spin-column</td><td>ThermoFisher</td><td>89889, 89890</td><td>Zeba spin column</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Dynamic Light Scattering, Nicomp 370</td><td>Particle Sizing System, Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FIX &amp;amp; PERM Cell Permeabilization Kit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>GAS004</td><td></td></tr><tr><td>Gauze sponges</td><td>Dermacea</td><td>441211</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Sigma</td><td>3393-1MU</td><td></td></tr><tr><td>Liposome extruder</td><td>Millipore Sigma</td><td>Z373400</td><td>LiposoFast</td></tr><tr><td>Live/Dead Aqua</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>L34957</td><td></td></tr><tr><td>Nanosight</td><td>Malvern Instruments Ltd</td><td>NS300</td><td></td></tr><tr><td>Ophthalmic lubricant</td><td>Optixcare</td><td></td><td>20g/70 oz Sterile</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde, 16% w/v aq. soln., methanol free</td><td>Alfa Aesar</td><td>433689L</td><td></td></tr><tr><td>Polyethylene vial for mincing</td><td>Wheaton</td><td>986701</td><td></td></tr><tr><td>Rotary evaporator</td><td>Buchi</td><td>Re111</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Misonix</td><td>XL2020</td><td></td></tr><tr><td>T/Pump Heat therapy pump and pad</td><td>Gaymer Industries</td><td>TP-500</td><td></td></tr><tr><td>Tesaglitazar</td><td>Tocris</td><td>3965</td><td></td></tr><tr><td>Track-etched polycarbonate membranes</td><td>Thomas Scientific</td><td>1141Z**</td><td>Whatman, Nuclepore Polycarbonate hydrophilic membranes</td></tr><tr><td>ZetaSizer/DLS-ELS system</td><td>Malvern Instruments Ltd</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

preparation, administration, and assessment of in vivo tissue-specific cellular uptake of fluorescent dye-labeled liposomes

Es besteht ein wachsendes Interesse an der Verwendung von Liposomen zur Verabreichung von Verbindungen in vivo, insbesondere für gezielte Behandlungsansätze. Abhängig von der Liposomenformulierung können Liposomen bevorzugt von verschiedenen Zelltypen im Körper aufgenommen werden. Dies kann die Wirksamkeit des therapeutischen Partikels beeinflussen, da das Fortschreiten verschiedener Krankheiten gewebe- und zelltypspezifisch ist. In diesem Protokoll stellen wir eine Methode zur Synthese und Fluoreszenzmarkierung von Liposomen unter Verwendung von DSPC, Cholesterin und PEG-2000 DSPE und dem Lipidfarbstoff DiD als Fluoreszenzmarkierung vor. Dieses Protokoll stellt auch einen Ansatz für die Abgabe von Liposomen in vivo und die Bewertung der zellspezifischen Aufnahme von Liposomen mittels Durchflusszytometrie vor. Dieser Ansatz kann verwendet werden, um die Zelltypen zu bestimmen, die Liposomen aufnehmen, und die Verteilung und den Anteil der Liposomenaufnahme über Zelltypen und Gewebe hinweg zu quantifizieren. Obwohl in diesem Protokoll nicht erwähnt, werden zusätzliche Assays wie Immunfluoreszenz und Einzelzell-Fluoreszenzbildgebung auf einem Zytometer alle Befunde oder Schlussfolgerungen verstärken, da sie die Beurteilung der intrazellulären Färbung ermöglichen. Möglicherweise müssen die Protokolle auch angepasst werden, je nachdem, welche(s) Gewebe(s) von Interesse sind.

Herstellung von Liposomen
Die hier veröffentlichten Ergebnisse ähneln denen unserer zuvor veröffentlichten Arbeit 3,4,20. Unter Verwendung des hier vorgestellten Protokolls erwarten wir, Liposomen mit einer Größe von etwa 150 bis 160 nm herzustellen. DLS zeigt einen durchschnittlichen Liposomendurchmesser von 163,2 nm und ein Zetapotential von -19,2 mV (Abbildung 1A). Die kryogene Elektronenmikroskopie (Kryo-EM) zeigt zirkuläre Liposomen (Abbildung 1B) und das DLS-Diagramm zeigt eine relativ kleine Standardabweichung vom durchschnittlichen Durchmesser (Abbildung 1C).
Eine positive Liposomenbindung erfordert eine PBS-behandelte Kontrolle
Frühere Studien unserer Gruppe, die dieses Protokoll verwendeten, untersuchten, welche Zellsubpopulationen in Fett-SVF, Milz und Blut nach einer Woche In-vivo-Verabreichung an Liposomen gebundenwaren 3,4. Mit einer PBS-behandelten Maus wurden Peritonealhöhle und Milzzellen mit demselben Antikörperpanel gefärbt, das auch bei Proben von mit Liposomen behandelten Mäusen verwendet wurde. Das Gewebe wurde nach einer Woche Behandlung entnommen (Abbildung 2A). Die Proben der PBS-behandelten Maus dienten als DiD-FMO, mit dem positive DiD-Gates erzeugt werden konnten (Abbildung 2B,C). Ein positives Gate kann mit einem DiD-positiven Signal erzeugt werden, aber Proben ohne DiD-Signal müssen auch verwendet werden, um zu überprüfen, ob das positive Gate keine DiD-negativen Samples enthält.
Titrationen sind erforderlich, um Fluoreszenzsignale zu optimieren
Vor der Durchführung eines vollständigen Experiments müssen verschiedene Bedingungen optimiert werden, einschließlich der Konzentration von fluoreszenzkonjugierten Antikörpern, die während der Zellfärbung verwendet werden, und von Lipidfarbstoffen, die bei der Liposomenherstellung verwendet werden. Durchflusszytometer haben eine obere Nachweisgrenze für die Fluoreszenzintensität, so dass zu viel Farbstoff, der in die Liposomen eingearbeitet ist, zu nicht quantifizierbaren DiD-Signalen in Proben führt, die durch das Zytometer laufen. Darüber hinaus kann eine zu hohe Menge an DiD in den Liposomen zu einem hohen Maß an unspezifischem Farbstofftransfer führen, was die Ergebnisse der zellulären Aufnahme verzerren könnte. Abbildung 3 zeigt die Ergebnisse eines Experiments, bei dem die Konzentrationen von Lipidfarbstoff titriert wurden, um die Konzentration zu ermitteln, die ein optimales Signal innerhalb des Nachweisbereichs des verwendeten Durchflusszytometers erzeugen würde. Dies wurde an den Geweben durchgeführt, die für das abschließende Experiment von Interesse waren: Blut (Abbildung 3A), Leistenfett-SVF (Abbildung 3B) und Nebenhoden-Fett-SVF (Abbildung 3C). Die für den Test ausgewählten Konzentrationen betrugen 10 mg DiD (hoch, rot), 1 mg DiD (mittel, blau) oder 0,1 mg DiD (niedrig, grau) pro 1 ml Liposomen. Die höchste Konzentration, die in den Liposomen verwendet wurde, war zu hoch und übertraf in allen drei Geweben den quantifizierbaren Bereich des Zytometers (Abbildung 3A\u2012C, rot). Die niedrigste DiD-Konzentration zeigte ein gewisses Signal (Abbildung 3 A\u2012C, grau), aber eine deutliche Population außerhalb der PBS-behandelten Zellen (Abbildung 3A\u2012C, schwarz) wurde nicht beobachtet. Bei der Quantifizierung zeigte das arithmetische Mittel des DiD-MFI für jedes Gewebe und jede Konzentration eine klare Unterscheidung zwischen PBS-Kontrollen und der mittleren DiD-Konzentration (Abbildung 3D). Daher wählten wir, wie im Protokoll angegeben, die mittlere Konzentration (Abbildung 3, blau) für unsere Liposomenpräparation aus.
Die Verwendung eines Multi-Antikörper-Panels ermöglicht die Identifizierung der Liposomenaufnahme durch verschiedene Zellsubpopulationen
Unter Verwendung des in Tabelle 3 beschriebenen Panels wurden die Zellen mit Antikörpern gegen Marker für a-Makrophagen, B-Zellen, T-Zellen, dendritische Zellen, Monozyten und Endothelzellen gefärbt (Abbildung 4). Für jeden Gewebetyp sind leicht unterschiedliche Gating-Strategien erforderlich, aber in jedem können die meisten der gleichen Zelltypen identifiziert werden. Einige Ausnahmen sind Endothelzellen, die normalerweise nicht im Blut vorkommen, und Monozyten, die typischerweise häufiger im Blut vorkommen als andere Gewebe. Sobald die Populationen identifiziert sind, kann die Gesamtgröße jeder Zellpopulation und die Häufigkeit, mit der sie DiD+ sind, quantifiziert werden. Weitere Berechnungen können durchgeführt werden, um die DiD+-Population zu charakterisieren: Wie viel Prozent der DiD+-Zellen sind Makrophagen, Endothelzellen usw. Bitte beachten Sie, dass dies Beispiele für Gating-Strategien sind, aber nicht die einzige Möglichkeit, die Proben zu analysieren. Die Analyse wird durch das ausgewählte Panel und das/die verfügbare(n) Durchflusszytometer(n) bestimmt.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61585/61585fig01.jpg"> Abbildung 1: Beispielhafte Eigenschaften von präparierten Liposomen. (A) Die Größe und das Zetapotenzial wurden wie oben beschrieben gemessen und in tabellarischer Form angegeben. Jeder Parameter wird als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt. (B) Kryo-EM wurde verwendet, um die präparierten Liposomen abzubilden. Der weiße Maßstabsbalken ist 50 nm lang. (C) DLS wurde verwendet, um ein Histogramm des Durchmessers der Liposomen in dieser Präparation zu erstellen. Diese Abbildung wurde von Osinski et al.3 übernommen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61585/61585fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61585/61585fig02.jpg"> Abbildung 2: Repräsentative DiD-Färbung von PBS- oder Liposomen-behandelten Mäusen. (A) Experimentelles Schema für PBS- und Liposomenbehandlungen. PBS oder Liposomen wurden innerhalb einer Woche dreimal injiziert. Das Gewebe wurde am 8. Tag der Behandlung entnommen. (B, C) Repräsentative Flussdiagramme zeigen eine positive DiD-Färbung bei mit Liposomen behandelten (C), aber nicht mit PBS behandelten (B) Mäusen. FSC, Vorwärtsstreuung. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61585/61585fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61585/61585fig03.jpg"> Abbildung 3: Titration von DiD in Liposomen. Liposomen wurden mit drei verschiedenen DiD-Konzentrationen präpariert und Mäusen injiziert. Grau zeigt die niedrige Konzentration bei 0,1 mg DiD pro 1 ml Liposomen an, Blau zeigt die mittlere Konzentration bei 1 mg DiD/ml Liposomen an und Rot zeigt die hohe Konzentration bei 10 mg DiD/ml Liposomen an. Als Negativkontrolle wurde eine PBS-behandelte Maus verwendet (schwarz). Blut (A, Kreis), Leistenfett (B, Triange) und Nebenhodenfett (C, Quadrat) wurden 24 Stunden nach der Injektion entnommen und verarbeitet, um eine einzellige Suspension zu isolieren. Diese Proben wurden auf einem Durchflusszytometer auf das Niveau des nachweisbaren DiD gebracht. Gewebespezifische Histogramme mit Überlagerungen jeder Behandlungsgruppe werden präsentiert, um die Fluoreszenzintensität pro Konzentration (A\u2012C) zu demonstrieren. Das arithmetische Mittel von DiD wurde ebenfalls für jedes Gewebe und jede Konzentration quantifiziert und aufgetragen (D). SSC = seitliche Streuung. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61585/61585fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61585/61585fig04v4.jpg"> Abbildung 4: Repräsentative durchflusszytometrische Analyse von Zellsubpopulationen in adipöser SVF, Blut und Milz. (A\u2012C) Schematische Darstellung der Gating-Strategie zur Identifizierung von Zelluntergruppen und DiD+- Zellen in adipösem SVF (A), Milz (B) und Blut (C). Abkürzungen: FSC = Vorwärtsstreuung; LD = lebend/tot; L-DCs = lymphatische dendritische Zellen; M-DCs = myeloische dendritische Zellen; SSC = seitliche Streuung. Diese Abbildung wurde von Osinski et al.3 übernommen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61585/61585fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Steuerung</td>
			<td>Zweck</td>
		</tr><tr><td rowspan="5">Maus, die mit PBS oder Kochsalzlösung behandelt wurde</td>
			<td>Verwenden Sie die Zellen dieser Maus für die folgenden Durchflusszytometrie-Kontrollen:</td>
		</tr><tr><td>1. Ungefärbte Zellen</td>
		</tr><tr><td>2. Lebende/tote Einzelfärbung</td>
		</tr><tr><td>3. Zellen, die mit dem vollständigen Panel gefärbt wurden, denen jedoch die Liposomenfluoreszenz fehlt, um ein positives Liposomensignal während der Analyse zu bestimmen</td>
		</tr><tr><td>Diese/diese Maus/Mäuse werden auch verwendet, um festzustellen, ob Liposomen in vivo irgendwelche Effekte haben, da Sie in Ihrem Experiment eine Nicht-Liposomenkontrolle haben.</td>
		</tr><tr><td>Entladene Liposomen</td>
			<td>Wenn Sie eine Verbindung in Ihre Liposomen laden, sollte ein Teil Ihrer Liposomencharge ohne die Verbindung synthetisiert werden. Dies erklärt allein die In-vivo-Effekte der Liposomen.</td>
		</tr><tr><td>DiD allein</td>
			<td>Da DiD auch von zellulären Membranen aufgenommen werden kann, hilft die Zuweisung einiger Mäuse, um freien Farbstoff in einer Menge zu erhalten, die der in den Liposomen enthaltenen Menge entspricht, die Hintergrundfärbung der Membran zu berücksichtigen.</td>
		</tr><tr><td>Fluoreszenz-Minus-Eins-Kontrollen (FMO)</td>
			<td>Dabei handelt es sich um Zellen, die mit allen bis auf einen der Antikörper in Ihrem Panel gefärbt sind. Wie # 3 im obigen Kasten hilft dies bei der Bestimmung eines wirklich positiven Signals für diesen Antikörper während der Analyse</td>
		</tr></tbody></table>Tabelle 1: Steuerelemente, die in diesem Protokoll verwendet werden sollen.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Lösung</td>
			<td>Komponenten</td>
			<td>Ungefähres Volumen, das pro Stapel/Maus benötigt wird</td>
		</tr><tr><td colspan="3">Liposomen-Präparation</td>
		</tr><tr><td>Calciumacetat</td>
			<td>1 M Calciumacetat inH2O</td>
			<td>50 ml</td>
		</tr><tr><td>HEPES-Puffer</td>
			<td>10 mM HEPES in H2O, pH 7,4</td>
			<td>50 ml</td>
		</tr><tr><td>Tesaglitazar in HEPES</td>
			<td>in 10 mM HEPES</td>
			<td>10 ml</td>
		</tr><tr><td colspan="3">Gewebeentnahme, -verarbeitung und -färbung</td>
		</tr><tr><td>Phosphatgepufferte Lösung (PBS)</td>
			<td>137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1,8 mMKH2PO4in destilliertemH2O</td>
			<td>2 ml</td>
		</tr><tr><td>PBS-Heparin</td>
			<td>0,1 mM Heparin in PBS</td>
			<td>10 ml</td>
		</tr><tr><td>HEPES-Puffer</td>
			<td>20 mM HEPES in PBS</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr><tr><td>Aufschluss-Puffer</td>
			<td>2 mg/ml Kollagenase Typ I in HEPES-Puffer</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr><tr><td>AKC-Lysepuffer</td>
			<td>0,158 M NH3Cl, 10 mMKHCO3, 0,1 mMNa2EDTA in ddH 2 O, pH7,2</td>
			<td>15 ml</td>
		</tr><tr><td>FACS-Puffer</td>
			<td>1 % BSA, 0,05 % NaN3 in PBS</td>
			<td>15 ml</td>
		</tr><tr><td>Fc-Block (verdünnt)</td>
			<td>1:50 Fc-Block im FACS-Puffer</td>
			<td>250 μL</td>
		</tr><tr><td>Fixierungs-Puffer</td>
			<td>2% Paraformaldehyd in PBS</td>
			<td>200 μL</td>
		</tr></tbody></table>Tabelle 2: Lösungen zur Vorbereitung.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Ein</td>
			<td>B</td>
			<td>C</td>
			<td>D</td>
		</tr><tr><td colspan="4">Extrazelluläre Färbung (2x Antikörper-Mix)</td>
		</tr><tr><td>Antigen</td>
			<td>Fluorophor</td>
			<td>Ab-Volumen pro 100 μL Test</td>
			<td>Benötigtes Gesamtvolumen:</td>
		</tr><tr><td>CD45</td>
			<td>PerCP</td>
			<td>0,5 μL</td>
			<td>Spalte C x 1,2 x Gesamt # Proben</td>
		</tr><tr><td>CD11b</td>
			<td>PerCP Cy5.5</td>
			<td>0,25 μL</td>
			<td>(0,5 μl/Test) x (1,2) x (# Proben)</td>
		</tr><tr><td>F4/80</td>
			<td>PE Cy7</td>
			<td>0,25 μL</td>
			<td>(0,25 μL/Test) x (1,2) x (# Proben)</td>
		</tr><tr><td>CD19</td>
			<td>PE-CF594</td>
			<td>1 μL</td>
			<td>(0,25 μL/Test) x (1,2) x (# Proben)</td>
		</tr><tr><td>CD3</td>
			<td>FITC</td>
			<td>1 μL</td>
			<td>(1,0 μL/Test) x (1,2) x (# Proben)</td>
		</tr><tr><td>CD31</td>
			<td>BV605</td>
			<td>0,25 μL</td>
			<td>etc...</td>
		</tr><tr><td>CD11c</td>
			<td>APC ef780</td>
			<td>1 μL</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>CD115</td>
			<td>PE</td>
			<td>1,5 μL</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td colspan="4">Um Ihre Antikörpermischung zu erstellen, kombinieren Sie die in Spalte D berechneten Antikörper mit FACS-Puffer oder Brilliant Violet Staining Buffer* zu einem Endvolumen von (50 μl x 1,2 x Gesamt # Proben)</td>
		</tr><tr><td colspan="4">Lebend-/Totfärbung (1x)</td>
		</tr><tr><td>Lebend/tot</td>
			<td>Fluorophor</td>
			<td>L/D-Volumen pro 200 μL-Test</td>
			<td>Benötigtes Gesamtvolumen:</td>
		</tr><tr><td>Lebend/tot</td>
			<td>Aqua</td>
			<td>0,67 μL</td>
			<td>Spalte C x 1,2 x Gesamt # Proben</td>
		</tr><tr><td colspan="4">Intrazelluläre Färbung (1x)</td>
		</tr><tr><td>Antigen</td>
			<td>Fluorophor</td>
			<td>Ab-Volumen pro 50 μl Test</td>
			<td>Benötigtes Gesamtvolumen:</td>
		</tr><tr><td>αSMA</td>
			<td>FITC</td>
			<td>0.125</td>
			<td>Spalte C x 1,2 x Gesamt # Proben</td>
		</tr><tr><td colspan="4">*Brilliant Violet Färbepuffer sollte verwendet werden, wenn mehr als ein Antikörper, der mit einem Brilliant Violet Fluorophor konjugiert ist, in Ihrem Panel verwendet wird.</td>
		</tr></tbody></table>Tabelle 3: Beispiel-Antikörper-Panel und Berechnungen von Färbemischungen, die für die Fließfärbung verwendet werden sollen.

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Preparation, Administration, and Assessment of In Vivo Tissue-Specific Cellular Uptake of Fluorescent Dye-Labeled Liposomes

Das Ziel dieses Protokolls ist es, fluoreszenzmarkierte Liposomen zu synthetisieren und die Durchflusszytometrie zu verwenden, um die In-vivo-Lokalisation von Liposomen auf zellulärer Ebene zu identifizieren.

Vorbereitung, Verabreichung und Bewertung der in vivo gewebespezifischen zellulären Aufnahme von fluoreszierenden farbstoffmarkierten Liposomen

There is a growing interest in using liposomes to deliver compounds in vivo particularly for targeted treatment approaches. Depending on the liposome ...

preparation-administration-assessment-vivo-tissue-specific-cellular

Research

JoVE Journal

Bioengineering

4.1K Aufrufe.  University of Virginia. Das Ziel dieses Protokolls ist es, fluoreszenzmarkierte Liposomen zu synthetisieren und die Durchflusszytometrie zu verwenden, um die In-vivo-Lokalisation von Liposomen auf zellulärer Ebene zu identifizieren.

Serie: Preparation, Administration, and Assessment of In Vivo Tissue-Specific Cellular Uptake of Fluorescent Dye-Labeled Liposomes

A Comprehensive Procedure to Evaluate the In Vivo Performance of Cancer Nanomedicines

Inspired by the success of previous cancer nanomedicines in the clinic, researchers have generated a large number of novel formulations in the past decade. However, only a small number of nanomedicines have been approved for clinical use, whereas the majority of nanomedicines under clinical development have produced disappointing results. One major obstacle to the successful clinical translation of new cancer nanomedicines is the lack of an accurate understanding of their in vivo performance. This article features a rigorous procedure to characterize the in vivo behavior of nanomedicines in tumor-bearing mice at systemic, tissue, single-cell, and subcellular levels via the integration of positron emission tomography-computed tomography (PET-CT), radioactivity quantification methods, flow cytometry, and fluorescence microscopy. Using this approach, researchers can accurately evaluate novel nanoscale formulations in relevant mouse models of cancer. These protocols may have the ability to identify the most promising cancer nanomedicines with high translational potential or to aid in the optimization of cancer nanomedicines for future translation.

A Comprehensive Procedure to Evaluate the In Vivo Performance of Cancer Nanomedicines

The poor understanding of the in vivo performance of nanomedicines stymies their clinical translation. Procedures to evaluate the in vivo behavior of cancer nanomedicines at systemic, tissue, single-cell, and subcellular levels in tumor-bearing immunocompetent mice are described here. This approach may help researchers to identify promising cancer nanomedicines for clinical translation.

Ein umfassendes Verfahren zur Bewertung der<em&gt; In Vivo</em&gt; Performance von Krebs Nanomedizin

Inspired by the success of previous cancer nanomedicines in the clinic, researchers have generated a large number of novel formulations in the past ...

Forschung

Krebsforschung

In Vivo Tracking of Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells in a Rat Knee Osteoarthritis Model with Fluorescent Lipophilic Membrane Dye

In order to support the clinical application of human adipose-derived mesenchymal stem cell (haMSC) therapy for knee osteoarthritis (KOA), we examined the efficacy of cell persistence and biodistribution of haMSCs in animal models. We demonstrated a method to label the cell membrane of haMSCs with lipophilic fluorescent dye. Subsequently, intra-articular injection of the labeled cells in rats with surgically induced KOA was monitored dynamically by an in vivo imaging system. We employed the lipophilic carbocyanines DiD (DilC18 (5)), a far-red fluorescent Dil (dialkylcarbocyanines) analog, which utilized a red laser to avoid excitation of the natural green autofluorescence from surrounding tissues. Furthermore, the red-shifted emission spectra of DiD allowed deep-tissue imaging in live animals and the labeling procedure caused no cytotoxic effects or functional damage to haMSCs. This approach has been shown to be an efficient tracking method for haMSCs in a rat KOA model. The application of this method could also be used to determine the optimal administration route and dosage of MSCs from other sources in pre-clinical studies.

In Vivo Tracking of Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells in a Rat Knee Osteoarthritis Model with Fluorescent Lipophilic Membrane Dye

This protocol describes an efficient way to monitor the cell persistence and biodistribution of human adipose-derived mesenchymal stem cells (haMSCs) by far-red fluorescence labeling in a rat knee osteoarthritis (KOA) model via intra-articular (IA) injection.

In Vivo Tracking der menschlichen Fettgewebe mesenchymalen Stammzellen in einem Rattenmodell Knie Arthrose mit fluoreszierenden lipophile Membran Farbstoff

In order to support the clinical application of human adipose-derived mesenchymal stem cell (haMSC) therapy for knee osteoarthritis (KOA), we examined the ...

Entwicklungsbiologie

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous number of imaging techniques currently available and the progress in instrumentation, there is still a need for highly sensitive probes that are suitable for in vivo imaging. One typical problem of available preclinical fluorescent probes is their rapid clearance in vivo, which reduces their imaging sensitivity. To circumvent rapid clearance, increase number of dye molecules at the target site, and thereby reduce background autofluorescence, encapsulation of the near-infrared fluorescent dye, DY-676-COOH in liposomes and verification of its potential for in vivo imaging of inflammation was done. DY-676 is known for its ability to self-quench at high concentrations. We first determined the concentration suitable for self-quenching, and then encapsulated this quenching concentration into the aqueous interior of PEGylated liposomes. To substantiate the quenching and activation potential of the liposomes we use a harsh freezing method which leads to damage of liposomal membranes without affecting the encapsulated dye. The liposomes characterized by a high level of fluorescence quenching were termed Lip-Q. We show by experiments with different cell lines that uptake of Lip-Q is predominantly by phagocytosis which in turn enabled the characterization of its potential as a tool for in vivo imaging of inflammation in mice models. Furthermore, we use a zymosan-induced edema model in mice to substantiate the potential of Lip-Q in optical imaging of inflammation in vivo. Considering possible uptake due to inflammation-induced enhanced permeability and retention (EPR) effect, an always-on liposome formulation with low, non-quenched concentration of DY-676-COOH (termed Lip-dQ) and the free DY-676-COOH were compared with Lip-Q in animal trials.

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

The use of fluorophores for in vivo imaging can be greatly limited by opsonization, rapid clearance, low detection sensitivity and cytotoxic effects on the host. Encapsulation of fluorophores in liposomes by film hydration and extrusion leads to fluorescence quenching and protection which enables in vivo imaging with high detection sensitivity.

Fluoreszenz-Abschrecken eines Liposomenverkapseltes NIR-Fluorophore als Instrument zur<em&gt; In-vivo-</em&gt; Optical Imaging

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous ...

Biotechnik

In Vivo Two-Color 2-Photon Imaging of Genetically-Tagged Reporter Cells in the Skin

Fibroblasts are mesenchymal cells that change their morphology upon activation, ultimately influencing the microenvironment of the tissue they are located in. Although traditional imaging techniques are useful in identifying protein interactions and morphology in fixed tissue, they are not able to give insight as to how quickly cells are able to bind and uptake proteins, and once activated how their morphology changes in vivo. In the present study, we ask 2 major questions: 1) what is the time-course of fibroblast activation via toll-like receptor-4 (TLR4) and lipopolysaccharide (LPS) interaction and 2) how do these cells behave once activated? Using 2-photon imaging, we have developed a novel technique to assess the ability of LPS-FITC to bind to its cognate receptor, TLR4, expressed on peripheral fibroblasts in the genetic reporter mouse line; FSP1cre; tdTomatolox-stop-lox&#160;in vivo. This unique approach allows researchers to create in-depth, time-lapse videos and/or pictures of proteins interacting with live cells that allows one to have an increased level of granularity in understanding how proteins can alter cellular behavior.

Morphological changes occur in immune responsive fibroblast cells following activation and promote alterations in cellular recruitment. Utilizing 2-photon imaging in conjunction with a genetically engineered Fibroblast-specific protein 1 (FSP1)-cre; tdTomato floxed-stop-floxed (TB/TB) mouse line and green fluorescently tagged lipopolysaccharide-FITC, we can illustrate highly specific uptake of lipopolysaccharide in dermal fibroblasts and morphological changes in vivo.

In Vivo Zwei-Farben 2-Photon Enzgebung von genetisch markierten Reporterzellen in der Haut

Fibroblasts are mesenchymal cells that change their morphology upon activation, ultimately influencing the microenvironment of the tissue they are located ...

Spatial Measurements of Perfusion, Interstitial Fluid Pressure and Liposomes Accumulation in Solid Tumors

The heterogeneous intra-tumoral accumulation of liposomes is a critical determinant of their efficacy. Both the chaotic tumor microcirculation and elevated IFP are linked to the heterogeneous intra-tumoral distribution of nanotechnology-based drug delivery systems such as liposomes. In the present study, the relationship between tumor microcirculation, elevated IFP, and accumulation of nanoparticles was investigated through in vivo experimentation. This was accomplished by evaluation of the tumor microcirculation using dynamic contrast enhanced computed tomography (DCE-CT) and measurement of tumor IFP using a novel image-guided robotic needle placement system connected to the micro-CT scanner. The intra-tumoral accumulation of liposomes was determined by CT image-based assessment of a nanoparticle liposomal formulation that stably encapsulate the contrast agent iohexol (CT-liposomes). CT imaging allowed for co-localization of the spatial distribution of tumor hemodynamics, IFP and CT-liposome accumulation in an individual subcutaneous xenograft mouse model of breast cancer. Measurements led to the discovery that perfusion and plasma volume fraction are strong mediators of the intra-tumoral distribution of liposomes. Furthermore, the results suggest that IFP plays an indirect role in mediating liposome distribution through modulating blood flow.

The heterogeneous intra-tumoral accumulation of liposomes has been linked to an abnormal tumor microenvironment. Herein methods are presented to measure tumor microcirculation by perfusion imaging and elevated interstitial fluid pressure (IFP) using an image-guided robotic system. Measurements are compared to the intra-tumoral accumulation of liposomes, determined using volumetric micro-CT imaging.

Räumliche Messungen der Perfusion, interstitielle Fluiddruck und Liposome Anreicherung in soliden Tumoren

The heterogeneous intra-tumoral accumulation of liposomes is a critical determinant of their efficacy. Both the chaotic tumor microcirculation and ...

Medizin

A Quantitative Fluorescence Microscopy-based Single Liposome Assay for Detecting the Compositional Inhomogeneity Between Individual Liposomes

Most research employing liposomes as membrane model systems or drug delivery carriers relies on bulk read-out techniques and thus intrinsically assumes all liposomes of the ensemble to be identical. However, new experimental platforms able to observe liposomes at the single-particle level have made it possible to perform highly sophisticated and quantitative studies on protein-membrane interactions or drug carrier properties on individual liposomes, thus avoiding errors from ensemble averaging. Here we present a protocol for preparing, detecting, and analyzing single liposomes using a fluorescence-based microscopy assay, facilitating such single-particle measurements. The setup allows for imaging individual liposomes in a massive parallel manner and is employed to reveal intra-sample size and compositional inhomogeneities. Additionally, the protocol describes the advantages of studying liposomes at the single liposome level, the limitations of the assay, and the important features to be considered when modifying it to study other research questions.

This protocol describes the fabrication of liposomes and how these can be immobilized on a surface and imaged individually in a massive parallel manner using fluorescence microscopy. This allows for the quantification of the size and compositional inhomogeneity between single liposomes of the population.

Ein quantitativer Fluoreszenzmikroskopie-basierter Single Liposome-Assay zum Nachweis der kompositorischen Inhomogenität zwischen einzelnen Liposomen

Most research employing liposomes as membrane model systems or drug delivery carriers relies on bulk read-out techniques and thus intrinsically assumes ...

Using In Vitro Live-cell Imaging to Explore Chemotherapeutics Delivered by Lipid-based Nanoparticles

Conventional imaging techniques can provide detailed information about cellular processes. However, this information is based on static images in an otherwise dynamic system, and successive phases are easily overlooked or misinterpreted. Live-cell imaging and time-lapse microscopy, in which living cells can be followed for hours or even days in a more or less continuous fashion, are therefore very informative. The protocol described here allows for the investigation of the fate of chemotherapeutic nanoparticles after the delivery of doxorubicin (dox) in living cells. Dox is an intercalating agent that must be released from its nanocarrier to become biologically active. In spite of its clinical registration for more than two decades, its uptake, breakdown, and drug release are still not fully understood. This article explores the hypothesis that lipid-based nanoparticles are taken up by the tumor cells and are slowly degraded. Released dox is then translocated to the nucleus. To prevent fixation artifacts, live-cell imaging and time-lapse microscopy, described in this experimental procedure, can be applied.

Using In Vitro Live-cell Imaging to Explore Chemotherapeutics Delivered by Lipid-based Nanoparticles

Live-cell imaging is a powerful tool to visualize dynamic processes. The examination of fixed cells provides only static pictures, which can lead to misinterpretation and confusion about the process. This work presents a method to study uptake, drug release, and intracellular localization of liposomal nanoparticles in living cells.

Verwendung von In-vitro- Live Cell Imaging zur Erkundung Chemotherapeutika geliefert durch Lipid-basierte Nanopartikel

Conventional imaging techniques can provide detailed information about cellular processes. However, this information is based on static images in an ...

Spatio-Temporal In Vivo Imaging of Ocular Drug Delivery Systems using Fiberoptic Confocal Laser Microendoscopy

Subconjunctival injection is an attractive route to administer ocular drugs due to easy trans-scleral access that bypasses anterior ocular barriers, such as the cornea and conjunctiva. While therapeutic effects and pharmacokinetics of the drugs upon subconjunctival injection have been described in some studies, very few assess the ocular distribution of drugs or drug delivery systems (DDS). The latter is critical for the optimization of intraocular DDS design and drug bioavailability to achieve the desired ocular localization and duration of action (e.g., acute versus. prolonged). This study establishes the use of fiberoptic confocal laser microendoscopy (CLM) to qualitatively study the ocular distribution of fluorescent liposomes in real-time in live mice after sub-conjunctival injection. Being designed for in vivo visual inspection of tissues at the microscopic level, this is also the first full description of the CLM imaging method to study spatio-temporal distribution of injectables in the eye after subconjunctival injection.

Spatio-Temporal In Vivo Imaging of Ocular Drug Delivery Systems using Fiberoptic Confocal Laser Microendoscopy

We present a protocol for the use of fiberoptic confocal laser microendoscopy (CLM) to non-invasively study the spatio-temporal distribution of liposomes in the eye after subconjunctival injection.

Räumlich-zeitliche In-vivo-Bildgebung von okulären Wirkstoffabgabesystemen mittels faseroptischer konfokaler Lasermikroendoskopie

Subconjunctival injection is an attractive route to administer ocular drugs due to easy trans-scleral access that bypasses anterior ocular barriers, such ...

The Use of Ex Vivo Whole-organ Imaging and Quantitative Tissue Histology to Determine the Bio-distribution of Fluorescently Labeled Molecules

Fluorescent labeling is a well-established process for examining the fate of labeled molecules under a variety of experimental conditions both in vitro and in vivo. Fluorescent probes are particularly useful in determining the bio-distribution of administered large molecules, where the addition of a small-molecule fluorescent label is unlikely to affect the kinetics or bio-distribution of the compound. A variety of methods exist to examine bio-distribution that vary significantly in the amount of effort required and whether the resulting measurements are fully quantitative, but using multiple methods in conjunction can provide a rapid and effective system for analyzing bio-distributions.
Ex vivo whole-organ imaging is a method that can be used to quickly compare the relative concentrations of fluorescent molecules within tissues and between multiple types of tissues or treatment groups. Using an imaging platform designed for live-animal or whole-organ imaging, fluorescence within intact tissues can be determined without further processing, saving time and labor while providing an accurate picture of the overall bio-distribution. This process is ideal in experiments attempting to determine the tissue specificity of a compound or for the comparison of multiple different compounds. Quantitative tissue histology on the other hand requires extensive further processing of tissues in order to create a quantitative measure of the labeled compounds. To accurately assess bio-distribution, all tissues of interest must be sliced, scanned, and analyzed relative to standard curves in order to make comparisons between tissues or groups. Quantitative tissue histology is the gold standard for determining absolute compound concentrations within tissues.
Here, we describe how both methods can be used together effectively to assess the ability of different administration methods and compound modifications to target and deliver fluorescently labeled molecules to the central nervous system1.

The Use of Ex Vivo Whole-organ Imaging and Quantitative Tissue Histology to Determine the Bio-distribution of Fluorescently Labeled Molecules

Ex vivo whole-organ imaging is a rapid method for determining the relative concentrations of fluorescently labeled compounds within and between tissues or treatment groups. Conversely, quantitative fluorescence histology, while more labor intensive, allows for the quantification of the absolute tissue levels of labeled molecules.

Die Verwendung von<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Whole-Orgel Imaging und Quantitative Tissue Histologie des Bio-Verteilung von fluoreszenzmarkierten Moleküle zu bestimmen

Fluorescent labeling is a well-established process for examining the fate of labeled molecules under a variety of experimental conditions both in vitro ...

Biologie

In Vivo Imaging of Transduction Efficiencies of Cardiac Targeting Peptide

Since the initial description of protein transduction domains, also known as cell penetrating peptides, over 25 years ago, there has been intense interest in developing these peptides, especially cell-specific ones, as novel vectors for delivering diagnostic and therapeutic materials. Our past work involving phage display identified a novel, nonnaturally occurring, 12 amino acid-long peptide that we named cardiac targeting peptide (CTP) due to its ability to transduce normal heart tissue in vivo with peak uptake seen in as little as 15 min after an intravenous injection. We have undertaken detailed biodistribution studies by injecting CTP labeled with fluorophore cyanine5.5, allowing it to circulate for various periods of time, and euthanizing, fixing, and sectioning multiple organs followed by fluorescent microscopy imaging. In this publication, we describe these processes as well as ex vivo imaging of harvested organs using an in vivo imaging system in detail. We provide detailed methodologies and practices for undertaking transduction as well as biodistribution studies using CTP as an example.

We describe protocols for assessing the degree of transduction by cell-penetrating peptides utilizing ex vivo imaging systems followed by paraffin embedding, sectioning, and confocal fluorescent microscopy using cardiac targeting peptide as an example. In our protocol, a single animal can be used to acquire both types of imaging assessment of the same organs, thereby cutting the number of animals needed for studies by half.

In Vivo Imaging von Transduktionseffizienzen des Kardialen Peptids

Since the initial description of protein transduction domains, also known as cell penetrating peptides, over 25 years ago, there has been intense interest ...

Vorbereitung, Verabreichung und Bewertung der in vivo gewebespezifischen zellulären Aufnahme von fluoreszierenden farbstoffmarkierten Liposomen

Zusammenfassung

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Ein umfassendes Verfahren zur Bewertung der